DE19628705A1 - Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe - Google Patents
Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als BlutersatzstoffeInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Sauerstoff-Transport-
Mittel, die Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate enthalten,
sowie Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft
ferner die Verwendung der Sauerstoff-Transport-Mittel als Blut
ersatzstoff, Plasma-Expander, Perfusionsmittel, Hämodilutions
mittel und/oder kardioplegische Lösung.
Die Entwicklung von stromafreien Hämoglobin-Lösungen, sogenann
ten "Hämoglobin-Based-Oxygen Carriers" (HOBC′s), die als Blut
ersatzstoff verwendbar sind, ist seit langem ein vordringliches
Ziel der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung.
Blutverlust, beispielsweise als Folge eines Unfalls oder einer
Operation, wird in den meisten Fällen mit einer allogenen Blut
spende behandelt. Die damit assoziierten Probleme des unkontrol
lierten Transfers von pathogenen Organismen, insbesondere von
Viren wie HIV oder Hepatitis-Erregern, sowie die Notwendigkeit
der Blutgruppentypisierung vor der Transfusion sind dem Fachmann
seit langem bekannt und in der Literatur umfassend beschrieben.
Ein als vollwertiger Blutersatz verwendbares HBOC-Produkt würde
nicht nur diese Probleme lösen, sondern könnte darüber hinaus
als Plasma-Expander, Perfusionsmittel, Hämodilutionsmittel und/-
oder kardioplegische Lösung verwendet werden.
Obgleich der Bedarf an einem derartigen Produkt bereits frühzei
tig erkannt wurde (vgl. Rabiner, J. Exp. Med. 126, (1967) 1127),
hat bisher keines der bekannten HBOC-Produkte den Status eines
zugelassenen Arzneimittels erreicht.
Das natürliche Sauerstoff-Transport-Mittel ist der Blutfarbstoff
Hämoglobin, ein Chromoprotein mit einem Molekulargewicht (MG)
von 64 Kilodalton (kDa). Das Protein besteht aus zwei α- und β-
Peptidketten, die als prosthetische Gruppe jeweils ein Häm ge
bunden haben. Dabei handelt es sich um einen Porphyrin-Ring mit
zentralem Eisen-Atom. Isolierte Hämoglobin-Moleküle sind sehr
instabil und zerfallen rasch in die stabileren α,β-Dimere (MG
32 kDa). Die biologische Halbwertszeit von isoliertem Hämoglobin
im Blutkreislauf liegt bei etwa 1 Stunde, da die Dimere schnell
über die Nieren ausgeschieden werden. Dabei erzeugen die Dimere
nephrotoxische Nebenwirkungen (vgl. Bunn & Jandl, J. Exp. Med.
129, (1967) 925-934).
Die zunächst entwickelten HBOC-Produkte besaßen zudem ein
nephrotoxisches Potential, das auf Verunreinigungen der Produkte
mit zellulären Bestandteilen zurückgeführt wurde (vgl. Relihan,
Ann. Surg. 176, (1972) 700).
Ferner fehlt einer isolierten Hämoglobin-Zusammensetzung das
2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG), welches den natürlichen, allo
sterischen Aktivator der Sauerstoffbindung darstellt. Daraus
resultiert eine gesteigerte Sauerstoff-Bindungsaffinität des
isolierten Hämoglobins und, damit einhergehend, ein verringertes
Sauerstoff-Freisetzungsvermögen derartiger Zusammensetzungen.
Entwicklungsarbeiten an derivatisierten Hämoglobin-Molekülen
waren daher in erster Linie darauf gerichtet, deren Sauerstoff
übertragungseigenschaften zu verbessern, sowie die nephrotoxi
schen Symptome zu umgehen. Dabei wurde Hämoglobin intramolekular
vernetzt, zur Bildung von polymeren HBOC-Formen intermolekular
verknüpft und/oder an Polymere gekoppelt, um konjugierte HBOC-
Formen zu schaffen.
Die Vernetzung von Hämoglobin mittels bi- oder polyfunktionaler
Vernetzungsmittel kann selektiv oder nicht-selektiv erfolgen.
Bei einer Form der selektiven Vernetzung werden zwei Protein
ketten des Hämoglobins intramolekular miteinander verbunden,
wodurch die natürliche tetramere Form des isolierten Hämoglobin-
Moleküls stabilisiert wird. Durch Auswahl eines geeigneten Ver
netzungsmittels kann die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins
ferner so eingestellt werden, daß vernetztes Hämoglobin unter
physiologischen Bedingungen Sauerstoff reversibel binden kann.
Beispiele für derartige Vernetzungsmittel sind Pyridoxalphosphat
und Diaspirin sowie deren Derivate. Verfahren zur Vernetzung von
Hämoglobin werden beispielsweise in Benesch (Meth. Enzymol.,
Vol. 231 (1994), 267-274), Keipert et al. (Transfusion, Vol. 29
(1989), 767-773), Snyder et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84
(1987), 7280-7284) und in Rogers et al. (Biochim. et Biophys.
Acta, 1248 (1995), 135-142) beschrieben.
Bei einer nicht-selektiven Vernetzung entstehen intermolekular
vernetzte, polymere HBOC-Produkte. Entsprechende Vernetzungs
mittel und Verfahren zu deren Verwendung werden beispielsweise
in DE-26 07 706, EP-0 646 130 und Hai et al. (Art. Cells, Blood
Subs. and Immob. Biotech, 22(3) (1994), 923-931) beschrieben.
Einen Überblick über verschiedene Hämoglobin-Derivate und die
mit dem klinischen Einsatz verbundenen Probleme geben die Veröf
fentlichungen von Gould et al., Transfus. Sci. 16, (1995) 5-17,
und Chang et al., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 20,
(1992) 159-179.
Bekannte Hämoglobin-Konjugate werden umfassend in Xue und Wong
(Meth. in Enzymol., 231 (1994), S. 308-322) und beispielsweise
in DE 26 16 086 oder DE 26 46 854 beschrieben. Letztere offen
bart Verfahren mittels derer Hämoglobin an Hydroxyethylstärke
gebunden wird, indem Hydroxyethylstärke zunächst mit Natriumpe
riodat umgesetzt wird. Dabei entstehen Dialdehyde, an die Hämo
globin gebunden wird. Demgegenüber beschreibt die DE 26 16 086
die Kopplung von Hämoglobin an Hydroxyethylstärke nach einem
Verfahren, bei dem zunächst ein Vernetzungsmittel (z. B. Bromcy
an) an die Hydroxyethylstärke gebunden wird und anschließend
Hämoglobin an das Zwischenprodukt gebunden wird.
Die Sauerstoff-Bindungsaffinität der Hämoglobin-Derivate hängt
neben der Auswahl von geeigneten Vernetzungs- und/oder Polymeri
sationsmitteln auch vom Liganden der Häm-Gruppe während der
Vernetzung und/oder Polymerisation ab. Oxy-Hämoglobin oxidiert
schnell zu Met-Hämoglobin (Fe-III), welches eine zu hohe Sauer
stoff-Bindungsaffinität besitzt, um als Sauerstoff-Transport-
Mittel geeignet zu sein. Daher wurden die genannten Verfahren
zur Herstellung von HBOC-Derivaten auch mit Desoxy-Hämoglobin
durchgeführt (vgl. Benesch, R. E. a.a.O.).
Die bisherigen Verfahren zur Herstellung von vernetzten und/oder
konjugierten HBOC-Produkten ermöglichten jedoch keine selektive
Bindung von Hämoglobin an das jeweilige Polymer. Es entstand in
allen Verfahren ein Gemisch von Co-Polymeren, dessen Bestand
teile unterschiedliche biologische Aktivitäten aufwiesen. Das
Reaktionsprodukt, bzw. die Zusammensetzung der Mischung konnte
bislang nur grob charakterisiert werden. Sowohl die höhermole
kularen Produkte (MG < 500 kDa) als auch residuale, tetramere
Formen führten zu toxischen Nebenwirkungen. Die Entfernung der
jeweiligen nieder- und/oder hochmolekularen Anteile aus den
HBOC-Produkten, zum Beispiel durch zusätzliche Filtra
tionsschritte, bedingt beträchtliche Ausbeuteverluste, wodurch
die Wirtschaftlichkeit der Herstellungsverfahren erheblich ver
schlechtert wird.
Die bisher getesteten HBOC-Produkte wiesen zusätzlich vaskuläre
Nebenwirkungen auf, die nach neuesten klinischen Studien auf
niedermolekulare, d. h. im wesentlichen tetramere HBOC-Formen
zurückzuführen sind (vgl. Gould et al., a.a.O., und Alayash &
Cashon, Molecular Medicine Today, 1, (1995) 122-127). Diese
niedermolekularen HBOC-Formen sind in der Lage, aus dem Blut
kreislauf in die endothelialen Zellagen der Blutgefäße überzu
treten. Die hohe Bindungsaffinität des Hämoglobin für das Stick
oxid (NO, auch bekannt als Endothelial-Derived Relaxing Factor,
EDRF) führt dazu, daß sich die frei verfügbare NO-Menge in die
sem Gewebe nach Applikation von HBOC-Derivaten drastisch redu
ziert. Als Folge der lokalen Verringerung der NO-Konzentration
entsteht eine systemische Vasokonstriktion, die zu Hypertonie
führt.
Jia et al. (Nature, 380, (1996) 221-226) schreiben dem Hämoglo
bin sogar eine zentrale Rolle in der Regulation des NO-Kreis
laufs zu. Demnach wird Hämoglobin in der Lunge kooperativ oxyge
niert und S-nitrosiliert. Die NO-Gruppe wird während des arte
rio-venösen Übergangs auf andere Proteine übertragen, welche da
durch eine NO-ähnliche, gefäßerweiternde Aktivität erlangen.
Vernetzte HBOC-Produkte besitzen jedoch in der Regel keine ko
operativen Eigenschaften mehr.
Eine weitere toxische Aktivität der bisher getesteten HBOG-Pro
dukte wurde u. a. von Alayash und Cashom beschrieben (vgl. Molec.
Med. Today, (1995) a.a.O.). Demnach sind Hämoglobin-Moleküle au
ßerhalb der Erythrozyten an Redoxreaktionen beteiligt, in deren
Verlauf hochreaktive Hämoglobin- und Sauerstoff-Spezies entste
hen, die u. a. für Lipid-Peroxidation verantwortlich gemacht
werden.
Um die toxischen Nebenwirkungen der bislang getesteten HBOC-
Produkte zu unterbinden, wurden Applikationsformen entwickelt,
bei denen Hämoglobin in Liposomen verpackt wird, wodurch künst
liche, Erythrozyten-ähnliche Transportorganellen für Hämoglobin
entstehen (vgl. Rudolph et al., Crit. Care Med. 22, (1994) 142-150).
Der hohe Eintrag von Phospholipiden in den Blutkreislauf
ist jedoch mit einem weiteren Risiko für die Patienten verbun
den.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, daß die bisher gete
steten HBOC-Produkte keine Arzneimittelzulassung erhalten haben,
da deren klinische Verwendung als Sauerstoff-Transport-Mittel
bisher durch eine unzureichende Verträglichkeit verhindert wur
de.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Sauerstoff-
Transport-Mittel zur Verfügung zu stellen, welches als Bluter
satzstoff klinisch verwendbar ist. Eine weitere Aufgabe dieser
Erfindung liegt in der Bereitstellung eines geeigneten Herstel
lungsverfahrens für das erfindungsgemäße Sauerstoff-Transport-
Mittel.
Diese Aufgabe wird durch ein Sauerstoff-Transport-Mittel gelöst,
welches ein Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat enthält, in
dem Hämoglobin und die Hydroxyethylstärke selektiv über Amidbin
dungen zwischen freien Aminogruppen des Hämoglobins und in oxi
dierter Form vorliegenden reduzierenden Endgruppen der Hydroxy
ethylstärke miteinander verknüpft sind.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß erfindungsgemäße
Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate hervorragend als Sauer
stoff-Transport-Mittel geeignet sind, da diese besonders gut
verträglich sind. Das Mittel weist eine Sauerstoffbin
dungsaffinität auf, die eine reversible Sauerstoff-Bindung unter
physiologischen Bedingungen ermöglicht (P₅₀ von 20 bis 50 mm Hg).
Das Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat ist zu groß, um in
die endothelialen Zellagen der Blutgefäße einzudringen, und
verursacht daher keine hypertonischen Nebenwirkungen. Das Sauer
stoff-Transport-Mittel enthält weder antigene noch pyrogene
Bestandteile und verursacht auch keine nephrotoxischen Nebenwirkungen.
Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, daß die
vorteilhaften rheologischen Eigenschaften, die Hydroxyethylstär
ke zu einem bevorzugten Mittel für die Hämodilution und zum
Volumenersatz gemacht haben (vgl. Weidler et al., Arzneim.-For
schung/Drug Res., 41, (1991) 494-498), in dem Konjugat erhalten
bleiben. Die gute Verträglichkeit des Sauerstoff-Transport-Mit
tels begründet sich somit auch durch eine überraschende Kombina
tion der vorteilhaften Sauerstoff-Transport-Eigenschaften des
Hämoglobins und der Hämodilutions-Eigenschaften der Hydroxyet
hylstärke.
Das Sauerstoff-Transport-Mittel weist eine lange vaskuläre Per
sistenz auf und die Moleküloberfläche des Hämoglobins wird durch
Substituenten abgeschirmt. Überraschenderweise wurde festge
stellt, daß das Hämoglobin im erfindungsgemäßen Hämoglobin-Hy
droxyethylstärke-Konjugat durch diesen Abschirmeffekt daran
gehindert wird, an toxischen Redoxreaktionen teilzunehmen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Sauerstoff-Transport-
Mittels besteht darin, daß Hydroxyethylstärke und Hämoglobin als
Konjugat gleichzeitig in hohen Konzentrationen verabreicht wer
den können, ohne daß dadurch der kolloid-osmotische Druck erhöht
wird.
Das Sauerstoff-Transport-Mittel enthält das Hämoglobin-Hydroxy
ethylstärke-Konjugat in einer Konzentration zwischen 2 und 20
g/dL, bevorzugt in einer Konzentration zwischen 5 und 15 g/dL
und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 10 g/dL. Das
Sauerstoff-Transport-Mittel kann ferner bekannte physiologisch
verträgliche Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten enthal
ten.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung des
Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugates bevorzugt stroma-frei
es, gereinigtes und pasteurisiertes Hämoglobin verwendet, das
nach im Stand der Technik umfassend beschriebenen Verfahren
gewonnen werden kann. Das Hämoglobin kann vernetzt und/oder
polymerisiert sein. Das Hämoglobin kann menschlichen, tierischen
oder rekombinanten Ursprungs sein. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Ab
schirmeffekte der Hydroxyethylstärke immunologische Komplika
tionen verhindern, die bei der Verwendung von tierischem Hämo
globin zu erwarten wären. Eine bevorzugte Ausführungsform der
Erfindung betrifft daher ein Sauerstoff-Transport-Mittel, wel
ches ein Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat enthält, in dem
das Hämoglobin tierischen Ursprungs ist. Das Hämoglobin kann
beispielsweise bovinen, porcinen oder equinen Ursprungs sein.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
wird für die Herstellung des Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Kon
jugates bovines Hämoglobin verwendet, das in isolierter Form
auch ohne Vernetzung die bevorzugte Sauerstoff-Bindungsaffinität
aufweist.
Sofern humanes Hämoglobin verwendet wird, sollte dieses mittels
Vernetztung und/oder Polymerisation in der tetrameren Form sta
bilisiert werden. Durch Vernetzung und/oder Polymerisation wird
humanes Hämoglobin gleichzeitig zur reversiblen Sauerstoff-Bin
dung unter physiologischen Bedingungen befähigt. Dem Fachmann
sind eine Vielzahl von Verfahren zur Vernetzung oder Polymerisa
tion bekannt. Erfindungsgemäß kann ein beliebiges Verfahren ver
wendet werden, sofern das Hämoglobin dabei stabilisiert wird und
die gewünschte Sauerstoff-Affinität (P₅₀ von 20 bis 50 mm Hg)
erhält. Bevorzugte Vernetzungsverfahren umfassen die intramole
kulare Vernetzung mit bis-pyridoxal-Tetraphosphat (vgl. Keipert
et al., Transfusion, Vol. 29 (1989), 767-773) oder Diaspirin
(vgl. Snyder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987),
7280-7284) oder eine Vernetzung und Polymerisation mit Raffinose
(vgl. EP-0 646 130).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
liegt das Hämoglobin vor der Kopplung an die Hydroxyethylstärke
in desoxygenierter oder teilweise desoxygenierter Form vor. Bei
teilweise desoxygenierten Formen sind Zusammensetzungen bevor
zugt, die zu 50 bis 80% aus Desoxy-Hämoglobin und zu 20 bis 50%
aus Oxy-Hämoglobin bestehen.
Für die Herstellung des Konjugates wird vorzugsweise Hydroxy
ethylstärke verwendet, die ein mittleres Molekulargewicht von 5
bis 40 kDa aufweist, wobei Hydroxyethylstärke mit einem mitt
leren Molekulargewicht von 5 bis 20 kDa besonders bevorzugt ist.
Bevorzugte Hydroxyethylstärke ist ferner durch einen molaren
Substitutionsgrad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis von C₂:C₆-
Substitution im Bereich von 2 bis 20 charakterisiert.
Erfindungsgemäß bevorzugte Hydroxyethylstärke kann durch Säure
hydrolyse, beispielsweise mit HCl, aus einer im Handel (Sigma)
erhältlichen Hydroxyethylstärke mit vergleichsweise höherem
Molekulargewicht gewonnen werden. Die Hydroxyethylstärke wird
anschließend mittels Acetonfällung gereinigt.
Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Hämoglobin-Hydroxy
ethylstärke-Konjugates hängt von dem Molekulargewicht oder der
Molekulargewichtsverteilung des eingesetzten Hämoglobins, der
Molekulargewichtsverteilung der eingesetzten Hydroxyethylstärke
und der Auswahl der Reaktionsbedingungen ab. Erfindungsgemäß
werden Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate bevorzugt, deren
Molekulargewicht zwischen 100 und 700 kDa liegt, wobei ein Mole
kulargewicht zwischen 200 und 300 kDa besonders bevorzugt ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß die
bekanntermaßen stabilisierende Wirkung von Sacchariden auf Hämo
globin (vgl. Rudolph, Cryobiology, 25, (1988) 1-8) auch von der
Hydroxyethylstärke des Konjugates ausgeht, wenn kurzkettige Hy
droxyethylstärke verwendet wird. Erfindungsgemäße Sauerstoff-
Transport-Mittel weisen gegenüber unmodifizierten HBOC-Produkten
somit eine verbesserte Lagerstabilität bei 4°C und bei Raum
temperatur auf. Damit ist das Sauerstoff-Transport-Mittel über
raschenderweise selbst zum Träger der vorteilhaft stabilisieren
den Eigenschaften der Saccharide geworden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Verfahren
zur Herstellung der Sauerstoff-Transport-Mittel, die ein Hämo
globin-Hydroxyethylstärke-Konjugat enthalten. Diese Verfahren
ermöglichen erstmals eine selektive Bindung von Hämoglobin an
Hydroxyethylstärke, wodurch ein Sauerstoff-Transport-Mittel ent
steht. Das Konjugat wird in einem mehrstufigen Verfahren herge
stellt, bei dem man die reduzierenden Endgruppen von Hy
droxyethylstärke zunächst oxidiert und anschließend Hämoglobin
über freie Aminogruppen mittels Amidbindungen an die oxidierten
Endgruppen der Hydroxyethylstärke koppelt.
Als Ausgangsmaterial für das Verfahren wird vorzugsweise Hy
droxyethylstärke mit einem mittleren Molekulargewicht von 5 bis
40 kDa verwendet, besonders bevorzugt ist Hydroxyethylstärke mit
einem mittleren Molekulargewicht von 5 bis 20 kDa. Bevorzugte
Hydroxyethylstärke ist ferner durch einen molaren Substitutions
grad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis von C₂:C₆-Substitution
im Bereich von 2 bis 20 charakterisiert.
Im Rahmen der Erfindung wird für die Herstellung des Sauerstoff-
Transport-Mittels bevorzugt stroma-freies, gereinigtes, pasteu
risiertes, vernetztes und/oder polymerisiertes Hämoglobin ver
wendet. Das Hämoglobin kann dabei menschlichen, tierischen oder
rekombinanten Ursprungs sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfin
dung wird bovines Hämoglobin bevorzugt, da es in isolierter Form
eine Sauerstoff-Bindungsaffinität aufweist, die eine reversible
Sauerstoff-Bindung unter physiologischen Bedingungen ermöglicht.
Nach einem bevorzugten Verfahren der Erfindung werden die redu
zierenden Endgruppen der Hydroxyethylstärke oxidiert, indem man
die Hydroxyethylstärke zunächst mit einer Iod enthaltenden Lö
sung vermischt und danach Kaliumhydroxyd-Lösung dazugibt.
Nach einem weiteren bevorzugten Verfahren der Erfindung wird das
Hämoglobin in einem zweiten Schritt an die oxidierten Endgruppen
von Hydroxyethylstärke gebunden. Die Reaktion kann bei
spielsweise durch Vermischen der Einzelkomponenten bei 40°C
durchgeführt werden. Dabei kommt es zu einer nukleophilen Sub
stitutionsreaktion zwischen einer freien Aminogruppe des Hämo
globins und dem Lacton der Hydroxyethylstärke, wobei eine Amid
bindung entsteht, durch die Hämoglobin an die oxidierte reduzie
rende Endgruppe der Hydroxyethylstärke gebunden wird.
Erfindungsgemäß hat es sich demgemäß überraschenderweise ge
zeigt, daß nach dem Verfahren von Hashimoto et al. (Kunststoffe,
Kautschuk, Fasern, 9, (1992) 1271-1279) zur Herstellung von
Block-Copolymeren aus Polysacchariden und Polyamiden, Hämoglobin
so an oxidierte Hydroxyethylstärke gebunden werden kann, daß ein
besonders verträgliches Sauerstoff-Transport-Mittel entsteht.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lehre läßt sich die Syn
these eines Hämoglobin-Konjugates erstmals soweit kontrollieren,
daß tetramere Hämoglobin-Formen an Hydroxyethylstärke gebunden
werden, ohne daß ein nennenswerter Anteil an hochmolekularen
Hämoglobin-Formen entsteht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die
Reaktionsbedingungen so ausgewählt, daß ein Hämoglobin-Hydroxy
ethylstärke-Konjugat entseht, das ein Molekulargewicht zwischen
100 und 500 kDa aufweist, wobei ein Molekulargewicht zwischen
200 und 300 kDa besonders bevorzugt ist.
Nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erfolgt eine
annähernd quantitative Umsetzung des Hämoglobins mit der Hy
droxyethylstärke. Es verbleiben somit auch kaum niedermolekulare
Hämoglobin-Formen im Reaktionsansatz, wobei ein Gehalt von weni
ger als 5% an nicht konjugierten Hämoglobin-Formen bevorzugt
ist. Demgemäß werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungs
form der Erfindung nach der Kopplung von Hämoglobin und Hydroxy
ethylstärke keine aufwendigen Reinigungsverfahren benötigt, um
das gewünschte Reaktionsprodukt zu isolieren.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
liegt das Hämoglobin vor der Kopplung an die Hydroxyethylstärke
entweder in vollständig desoxygenierter oder teilweise desoxyge
nierter Form vor. Bei einer teilweise desoxygenierten Form sind
Zusammensetzungen bevorzugt, die zu 50 bis 80% aus Desoxy-Hämo
globin und zu 20 bis 50% aus Oxy-Hämoglobin bestehen. Die De
soxygenierung des Hämoglobins kann mittels beliebiger chemischer
oder physikalischer Verfahren erfolgen. Dabei wird Hämoglobin
entweder mit chemischen Reduktionsmitteln wie Na-Ascorbat, Glu
tation, N-Acetyl-Cystein oder N-Acetyl-Methionin versetzt oder
mittels einer Gas-durchlässigen Membran gegen inertes Gas, wie
N₂, He oder Ar, zirkuliert.
In einem besonders bevorzugten Verfahren wird Cystein als Reduk
tionsmittel verwendet. Die Reduktion wird durchgeführt, bis der
Oxy-Hämoglobin-Gehalt weniger als 5% beträgt, wobei ein Gehalt
von weniger als 1% bevorzugt ist. Der Gehalt an Met-Hämoglobin
sollte weniger als 3% betragen, wobei ein Gehalt von weniger als
0,5% bevorzugt ist.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung wird für die Herstellung des Hämoglobin-Hydroxyethyl
stärke-Konjugates eine Hämoglobin-Lösung verwendet, in der das
Hämoglobin zu 50 bis 80% aus Desoxy-Hämoglobin und zu 20 bis 50%
aus Oxy-Hämoglobin besteht. Zur Herstellung einer derartigen
Hämoglobin-Lösung kann Oxy-Hämoglobin teilweise desoxygeniert
werden oder Desoxy-Hämoglobin teilweise oxygeniert werden. Der
Gas-Austausch kann dabei nach beliebigen Stand der Technik be
schriebenen Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugte Verfahren
umfassen die Begasung einer Desoxy-Hämoglobin-Lösung mit Sauer
stoff oder mit einem Gas, das Sauerstoff enthält, oder eine
chemische Teil-Reduktion des Oxy-Hämoglobins mit einem Reduk
tionsmittel, wie beispielsweise Na-Dithionat, Na-Ascorbat oder
Na-Bisulfith.
Nach Abschluß der Reaktion kann das Reduktionsmittel beispiels
weise durch Ultrafiltration abgetrennt werden. In einer bevor
zugten Ausführungsform der Erfindung wird die Ultrafiltration
mittels einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von 30 bis 50
kDa durchgeführt, so daß gleichzeitig mit dem Cystein dimeri
sierte Hämoglobin-Moleküle entfernt werden.
Nach einem besonders bevorzugtem Verfahren der Erfindung wird
das Hämoglobin anschließend unter N₂-Begasung lyophilisiert.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung wird Hydroxyethylstärke an den reduzierenden Endgrup
pen selektiv oxidiert, indem eine wäßrige Lösung aus fraktio
nierter Hydroxyethylstärke (MG 10 kDa) zunächst mit einer 0.1
N Iodlösung versetzt wird. Anschließend wird bei Raumtemperatur
(RT) 0.1 N KOH Lösung zugegeben, bis die vom Jod stammende Farbe
verschwindet. Dieser Schritt wird einmal wiederholt und die Mi
schung anschließend für weitere 30 min gerührt. Danach wird die
Lösung einer Dialyse unterworfen, wobei die Dialysemembran ein
Ausschlußvolumen von etwa 9 kDa aufweist. Nach chromatographi
scher Reinigung durch eine Kationen-Austauscher Säule wird die
Lösung lyophilisiert.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung erfolgt die Bindung des Hämoglobins an die selektiv
oxidierte Hydroxyethylstärke, indem Hämoglobin zunächst in DMSO
aufgenommen und in eine Dreihals-Rundbodenflasche überführt
wird. Dazu wird bei 40°C langsam eine in DMSO aufgenommene Lö
sung zu einer nach obigen Verfahren oxidierten Hydroxyethylstär
ke gegeben. Nach 25-stündigem Rühren bei 40°C wird der Rückstand
über Gelpermeationschromatographie (GPC) und Ultrafiltration
gereinigt und so vom Lösungsmittel befreit. Die MG-Zunahme der
Hämoglobinpräparationen wurde mit Hilfe der GPC anhand von ge
bräuchlichen Standards dokumentiert.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Sauerstoff-Transport-Mittel,
die Hydroxyethylstärke-Hämoglobin-Konjugate und Albumin enthal
ten. Das Albumin kann dabei menschlichen, tierischen oder rekom
binanten Ursprungs sein und wird bevorzugt als wäßrige Lösung
eingesetzt. Das Sauerstoff-Transport-Mittel enthält Albumin
bevorzugt in einer Konzentration von zwischen 2 und 20 g/dL,
wobei Konzentrationen zwischen 5 und 15 g/dL bevorzugt sind.
In erfindungsgemäß bevorzugten Sauerstoff-Transport-Mitteln kann
das Gewichtsverhältnis von dem Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-
Konjugat zu Albumin von 1 : 10 bis 4 : 1 betragen. Da das Albumin
wesentlich preiswerter ist als das Konjugat und zur Erzielung
des gewünschten osmotischen Druckes in dem Sauerstoff-Transport-
Mittel verwendet werden kann, sind Sauerstoff-Transport-Mittel
mit einem vergleichsweise hohen Anteil an Albumin und einem
geringen Anteil an Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugaten be
sonders bevorzugt.
Die Erfindung betrifft ferner Sauerstoff-Transport-Mittel, die
Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate und Albumin enthalten,
und eine besonders gute vaskuläre Verträglichkeit aufweisen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
werden dafür die beschriebenen Konjugate mit Albumin, vorzugs
weise mit humanem Serumalbumin vermischt, welches zuvor mit
Stickstoffmonoxid gesättigt wurde. Hämoglobin und Albumin be
sitzen die Eigenschaft NO in N-Nitroso-Form zu komplexieren
(vgl. Keaney et al., J. Clin. Invest., 91, (1993) 1582-1589).
Vernetzte HBOC-Produkte besitzen in der Regel keine kooperativen
Eigenschaften mehr. Daher fehlt ihnen die Fähigkeit zur koopera
tiven NO-Bindung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde
überraschenderweise gefunden, daß dieser Mangel der Hämoglobin-
Hydroxyethylstärke-Konjugate kompensiert werden kann, indem ein
Sauerstoff-Transport-Mittel verwendet wird, das neben dem Kon
jugat eine Albuminlösung enthält, die NO komplexiert hat. Dabei
erfolgt die Sättigung von Albumin mit NO durch Begasen einer
Albuminlösung mit NO unter Sauerstoff-Ausschluß. Die vaskuläre
Verträglichkeit des Produkts wird dadurch weiter verbessert.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung
der erfindungsgemäßen Sauerstoff-Transportmoleküle und der Zu
sammensetzungen aus den Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugaten
und Albumin als Blutersatzstoff, Plasma-Expander, Perfusions
mittel, Hämodilutionsmittel und/oder als kardioplegische Lösung.
Zu einer in weniger als 3 ml deionisiertem Wasser aufgenommenen
Lösung fraktionierter Hydroxyethylstärke (MG 10 kDa; ca. 5 g)
wurden zunächst tropfenweise 2 ml einer 0.1 N Iodlösung gegeben.
Anschließend wurde bei Raumtemperatur (RT) 0.1 N KOH Lösung
zugegeben, bis die vom Jod stammende Farbe verschwand. Durch
Wiederholung des o.a. Schrittes wurden 14 ml Jodlösung und 23 ml
KOH-Lösung zu dem Reaktionsansatz gegeben und die Mischung an
schließend für weitere 30 min gerührt. Danach wurde die Lösung
einer Dialyse mit einem Ausschlußvolumen der Dialysemembran von
etwa 9 kDa unterworfen. Nach chromatographischer Reinigung an
einer Kationen-Austauscher Säule (Amberlite IR-120) wurde die
Lösung lyophilisiert. Die Ausbeute lag in einer Größenordnung
von 85%.
Bovines Hämoglobin (Biopure, Boston, USA) in einer Konzentration
von 6 g/dL in 0,5 M NaCl, 0,1 M Na₂HPO₄ und 0,05 M NaHCO₃ wurde
durch Begasen desoxygeniert. Das Hämoglobin lag zunächst zu 94
bis 96% in Form von Oxy-Hämoglobin vor. Die Desoxygenierung
erfolgte in einem geschlossenen Behälter, in dem die Hämoglobin-
Lösung über einen Gasaustauscher zirkuliert wurde, während die
Membran kontinuierlich mit N₂ bei einem Druck von 10 p.s.i.
begast wurden. Bei einem Gehalt von 70% Desoxy-Hämoglobin wurde
die Desoxygenierung beendet. Anschließend wurde das Hämoglobin
unter N₂-Begasung lyophilisiert.
Bovines Hämoglobin (Biopure, Boston, USA) in einer Konzentration
von 6 g/dL in 0,5 M NaCl, 0,1 M Na₂HPO₄ und 0,05 M NaHCO₃ wurde
chemisch reduziert. Dafür wurde die Hämoglobin-Lösung mit 100 mM
Na-Disulfit versetzt. Nach einer Stunde bestand die resultieren
de Lösung zu 75% Desoxy-Hämoglobin. Das Na-Disulfit wurde mit
tels Ultrafiltration bei einer Membran-Ausschlußgrenze von 50
kDa abgetrennt. Anschließend wurde das Hämoglobin unter N₂-Bega
sung lyophilisiert.
Jeweils etwa 1 g des in den Schritten B.1 und B.2 hergestellten
Hämoglobins wurde in 15 ml DMSO aufgenommen und in eine 100 ml
Dreihals-Rundbodenflasche überführt. Hierzu wurde bei 40°C lang
sam eine in 0.5 ml DMSO aufgenommene Lösung von gemäß A. oxi
dierter Hydroxyethylstärke gegeben. Nach 25-stündigem Rühren bei
40°C wurde der Rückstand über Gelpermeationschromatographie
(GPC) und Ultrafiltration aufgereinigt und damit vom Lösungs
mittel befreit. Die MG-Zunahme der Hämoglobinpräparationen wurde
mit Hilfe der GPC anhand von gebräuchlichen Standards dokumen
tiert.
Claims (27)
1. Sauerstoff-Transport-Mittel enthaltend ein Hämoglobin-Hy
droxyethylstärke-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß das
Hämoglobin und die Hydroxyethylstärke in dem Konjugat selek
tiv über Amidbindungen zwischen freien Aminogruppen des
Hämoglobins und in oxidierter Form vorliegenden reduzieren
den Endgruppen der Hydroxyethylstärke miteinander verknüpft
sind.
2. Sauerstoff-Transport-Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat im
Sauerstoff-Transport-Mittel in einer Konzentration zwischen
2 und 20 g/dL vorliegt.
3. Sauerstoff-Transport-Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat im
Sauerstoff-Transport-Mittel in einer Konzentration zwischen
5 und 15 g/dL vorliegt.
4. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin menschlichen,
tierischen oder rekombinanten Ursprungs ist.
5. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin bovinen Ur
sprungs ist.
6. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
5, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin vor der Kopp
lung an die Hydroxyethylstärke als Desoxy-Hämoglobin vor
liegt.
7. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
6, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin vor der Kopp
lung an die Hydroxyethylstärke als Mischung von Desoxy-Hämo
globin und Oxy-Hämoglobin vorliegt, wobei der Anteil von
Desoxy-Hämoglobin 50 bis 80% und der Anteil von Oxy-Hämoglo
bin 20 bis 50% beträgt.
8. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
7, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin vernetztes
und/oder polymerisiertes Hämoglobin ist.
9. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke ein
mittleres Molekulargewicht von 5 bis 40 kDa aufweist.
10. Sauerstoff-Transport-Mittel nach Anspruch 10, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke ein mittleres Mole
kulargewicht von 5 bis 20 kDa aufweist.
11. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke einen
molaren Substitutionsgrad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis
von C₂:C₆-Substitution im Bereich von 2 bis 20, jeweils
bezogen auf die Hydroxyethylgruppen aufweist.
12. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
11, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel ferner Albumin
enthält.
13. Sauerstoff-Transport-Mittel nach Anspruch 12, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Albumin Serumalbumin menschlichen,
tierischen oder rekombinanten Ursprungs ist.
14. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 12 oder
13, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin in einer Konzen
tration zwischen 2 und 20 g/dL vorliegt.
15. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 12 bis
14, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von
dem Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat zu Albumin im
Bereich von 1 : 10 bis 4 : 1 liegt.
16. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 12 bis
15, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin vor Zugabe zu
dem Konjugat in wäßriger Lösung mit Stickstoffmonoxid (NO)
gesättigt vorliegt.
17. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis
16, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel als wäßrige
Lösung oder als Lyophilisat vorliegt.
18. Verfahren zur Herstellung eines Sauerstoff-Transport-Mittels
enthaltend ein Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat, da
durch gekennzeichnet, daß man die reduzierenden Endgruppen
von Hydroxyethylstärke zunächst oxidiert und anschließend
Hämoglobin über freie Aminogruppen mittels Amidbindungen an
die oxidierten Endgruppen der Hydroxyethylstärke koppelt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Oxidation der reduzierenden Endgruppen der Hydroxyethyl
stärke durchführt, indem man Hydroxyethylstärke zunächst mit
einer Iod enthaltenden Lösung vermischt und danach Kaliumhy
droxyd-Lösung zugibt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch ge
kennzeichnet, daß man die Verknüpfung der freien Aminogrup
pen des Hämoglobins mit den in oxidierter Form vorliegenden
reduzierenden Endgruppen der Hydroxyethylstärke durchführt,
indem man die Einzelkomponenten bei 40°C vermischt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Hämoglobin menschlichen, tierischen
oder rekombinanten Ursprungs ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Hämoglobin bovinen Ursprungs ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Hämoglobin vor der Kopplung an die
Hydroxyethylstärke als Desoxy-Hämoglobin vorliegt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Hämoglobin vor der Kopplung an die
Hydroxyethylstärke als Mischung von Desoxy-Hämoglobin und
Oxy-Hämoglobin vorliegt, wobei der Anteil von Desoxy-Hämo
globin 50 bis 80% und der Anteil von Oxy-Hämoglobin 20 bis
50% beträgt.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Hämoglobin vernetztes und/oder poly
merisiertes Hämoglobin ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke ein mittleres Mole
kulargewicht von 5 bis 40 kDa, einen molaren Substitutions
grad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis von C₂:C₆-Substitu
tion im Bereich von 2 bis 20, jeweils bezogen auf die Hy
droxyethylgruppen, aufweist.
27. Verwendung eines Sauerstoff-Transport-Mittels nach den An
sprüchen 1 bis 17 oder hergestellt nach den Ansprüchen 18
bis 25 als Blutersatzstoff, Plasma-Expander, Perfusionsmit
tel, Hämodilutionsmittel und/oder kardioplegische Lösung.
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