DE19543252A1 - Verfahren zum Vorbereiten von zellhaltigen Bronchialsekreten für eine zytologische Diagnostik - Google Patents

Verfahren zum Vorbereiten von zellhaltigen Bronchialsekreten für eine zytologische Diagnostik

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vorbereiten von zellhaltigen Bronchialsekreten und/oder Sputum für eine zytologische Diagnostik.
Abgehustetes, durch Absaugung oder Bürstung gewonnenes Sekret aus den Bronchien enthält von der Bronchialschleimhaut abge­ schilferte Zellen. Diese Zellen lassen sich zu diagnostischen Zwecken untersuchen. Beispielsweise werden beim Vorliegen eines Bronchialkarzinoms oder seiner Vorstufen Tumorzellen bzw. deren Vorläufer abgegeben, an denen eine mikroskopische Analyse des Karzinoms oder seiner Vorstadien möglich ist. Die mikroskopische Diagnostik erfolgt entweder am Lichtmikroskop manuell durch Pathologen, Pulmologen, Pathologie- bzw. Zytologieassistenten oder aber automatisiert durch Zytoautomaten.
Im Bronchialsekret bzw. Sputum sind die zu untersuchenden Zellen von Schleim umgeben, der eine Diagnostik erschwert, da er zu einer Überlagerung mehrerer Zellen führen kann und eine Abtrennung von Fragmenten abgestorbener Zellen, die die Diagnostik stören, nicht möglich ist.
Es ist daher vorgeschlagen worden, das durch eine Alkohollö­ sung fixierte Bronchialsekret mit einem Küchenmixer oder Ultraturrax bei hoher Umdrehungszahl zu homogenisieren. Durch diesen Vorgang sollen die Schleimfäden mechanisch in kurze Bruchstücke zerschnitten werden, die die anschließende Zelldiagnostik weniger stören. Es ist auch vorgeschlagen worden, nach dem mechanischen Zerkleinern der Schleimfäden einen Zentrifugationsschritt durchzuführen. Jedoch führt eine solche Zentrifugierung nicht zu einer Trennung der Zellen von den gekürzten Schleimfäden, vielmehr erhält man eine aufkon­ zentrierte Mischung von Zellen und Schleim. Die Zerkleinerung des Schleims vermindert zwar das Auftreten von Zellüberlage­ rungen beim Ausstreichen auf einem Objektträger, jedoch wird bei dem für die Zytodiagnostik in der Regel notwendigen Anfärben der Zellen der Schleim mit angefärbt und stört daher die Diagnose. Dieses sogenannte Saccomanno-Verfahren ist detailliert beschrieben in Leopold G. Koss, "Diagnostic Cytology", 4. Edition, Volume 2, Chapter 33, J.B. Lippincott Company. Ein weiterer schwerwiegender Nachteil dieses Verfah­ rens liegt darin, daß das mechanische Zerkleinern des Schleims mit schnellaufenden Zerkleinerungsinstrumenten zur Bildung eines infektiösen Aerosols führen kann.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und sicher anwendbares Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, mit dem sich eine weitgehende Trennung der Zellen im Sekret vom Schleim erreichen läßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist die folgenden Schritte auf:
  • a) Zugabe eines Mukolytikums und chemische Mukolyse des Schleims,
  • b) differentielles Zentrifugieren in einem flüssigen Medium, dessen Dichte zwischen der Dichte der Zellen in dem Bronchialsekret bzw. dem Sputum und der Dichte des Schleims liegt,
  • c) Abtrennen der sedimentierten Zellen vom schleimhaltigen Zentrifugat.
Die im Bronchialsekret bzw. Sputum enthaltenen Schleimfäden enthalten Disulfidbrücken in Längsrichtung eines Schleimfadens und sind über solche Brücken untereinander vernetzt. Disulfid­ brücken bilden sich in der Regel zwischen den Schwefelatomen von Cystein aus, zwei Cysteinreste gehen dabei in einen Cystinrest über. Im Rahmen der Erfindung wird unter dem Begriff Mukolytikum jedes Reagenz verstanden, das in der Lage ist, in einem solchen Bronchialsekret Disulfidbrücken aufzu­ spalten. Besonders vorteilhaft sind zu diesem Zweck thiolgrup­ penhaltige Substanzen verwendbar. Die chemische Mukolyse führt sowohl zu einer Verkürzung der Schleimfäden als auch zu einer weitgehenden Auflösung des Netzwerks der Schleimfäden unter­ einander.
Es ist daher möglich, durch anschließendes differentielles Zentrifugieren in einem flüssigen Medium mit einer Dichte zwischen der Dichte der Zellen und der Dichte des Schleims bzw. der Schleimreste die Zellen vom Schleim zu trennen, da der nicht mehr vernetzte Schleim beim Zentrifugieren die Zellen freigibt. Nach Abtrennen der sedimentierten Zellen vom Zentrifugat bzw. Überstand können diese Zellen entweder manuell oder mittels eines Zytoautomaten einer Zytodiagnostik unterworfen werden.
Das in Merkmal c) des Anspruchs 1 genannte Abtrennen der sedimentierten Zellen vom Zentrifugat bzw. Überstand beinhal­ tet nicht notwendigerweise eine vollständige Trennung der Zellen von jeglichen Resten des flüssigen Mediums. Für den Erfolg der Erfindung ist es lediglich notwendig, das derjenige Teil des Zentrifugats abgenommen wird, der die Schleimrück­ stände bzw. -reste enthält. "Schleimhaltiges Zentrifugat" im Sinne der Erfindung ist derjenige Teil des Zentrifugats, der die Zytodiagnostik störende Anteile von Schleim und/oder mukolysierten Schleimrückständen enthält.
Ein besonders vorteilhaft verwendbares Mukolytikum ist Thio­ glykolsäure oder deren Salze, die Thioglykolate. Zweckmäßiger­ weise wird die Thioglykolsäure auf einen pH-Wert von etwa 6,3 bis 8,3 gepuffert. Dieser Bereich entspricht dem pH-Wert des Bluts (7,3 + 1,0). Als Puffer kann Ammoniak bzw. eine Ammoni­ ak/Ammoniumchloridlösung verwendet werden.
Es ist vorteilhaft, wenn der Schleim durch die chemische Mukolyse auf eine Schleimfadenlänge von höchstens 30 µm zerkleinert wird. Häufig ist die Mukolyse so vollständig, daß eine Fadenstruktur des Schleims im Lichtmikroskop nicht mehr erkennbar ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann unmittelbar mit abgehuste­ ten Bronchialsekreten bzw. Sputum durchgeführt werden. In der Regel wird jedoch das Sekret vor der Zugabe des Mukolytikums mit einem alkoholhaltigen Fixativ fixiert. Eine solche Fixie­ rung ist insbesondere dann sinnvoll bzw. erforderlich, wenn der Patient die Probennahme durch Abhusten selber Zuhause durchführt. Er wird dann ein Fixativ zu der Probe geben und die fixierte Probe an das zytodiagnostische Labor einsenden.
Ein zweckmäßigerweise im Rahmen des Verfahrens verwendbares Fixativ enthält erfindungsgemäß folgende Bestandteile:
  • - 40-60 Gew.-% Ethanol
  • - 1-3 Gew.-% Polyethylenglykole mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 14 000
  • - Rest auf 100 Gew.-% Wasser.
Die genannte Aufzählung der Bestandteile des Fixativs ist nicht abschließend, es können ggf. zusätzliche Bestandteile enthalten sein. Zur Verminderung der Infektionsgefahr kann bspw. ein Antibiotikum wie Rifampizin beigefügt werden.
Polyethylenglykole im genannten Molekulargewichtsbereich sind kommerziell erhältlich unter dem Handelsnamen Carbowax®.
Besonders bevorzugt ist eine Zusammensetzung, die 50 Gew.-% Ethanol und 2 Gew.-% Polyethylenglykole enthält.
Die nach der chemischen Mukolyse erhaltene Lösung, die das Zell-Schleimgemisch enthält, kann unmittelbar der differen­ tiellen Zentrifugierung gemäß Merkmal b) des Anspruchs 1 unterzogen werden. Häufig ist es jedoch vorteilhaft, das Zell- Schleimgemisch zunächst durch Zwischenzentrifugieren der Mukolyselösung zu sedimentieren und damit aufzukonzentrieren. Dieses Zwischenzentrifugieren unterscheidet sich vom differen­ tiellen Zentrifugieren gemäß dem genannten Merkmal b) darin, daß beim Zwischenzentrifugieren sowohl die Zellen als auch der Schleim eine höhere Dichte als die Mukolyselösung aufweisen und sich daher gemeinsam sedimentieren.
Als flüssiges Medium zur differentiellen Zentrifugierung ist eine wäßrige Saccharoselösung besonders geeignet. Eine solche Saccharoselösung ist preisgünstig und toxikologisch unbedenk­ lich. Zur Erzielung der gewünschten Dichte der Saccharoselö­ sung wird deren Konzentration in der Regel auf 40 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 45 Gew.-% Saccharose in Wasser eingestellt. Statt einer Saccharoselösung kann auch jede andere Lösung verwendet werden, die sich gegenüber dem Sekret und den verwendeten Reagenzien chemisch inert verhält.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden beschrieben:
1. Herstellung eines Mukolytikums
In 50 ml destilliertes Wasser werden 8,242 ml 25%ige wäßrige Ammoniaklösung (ϕ = 0,91 g/ml, entspricht 0,11 Mol NH₃) und 3,89 ml 97%ige Thioglykolsäure (ϕ = 1,325 g/ml, entspricht 0,055 Mol Thioglykolsäure) gegeben. Durch Zugabe von 4 molarer Salzsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 6,5 eingestellt. Anschließend wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt. Man erhält so eine wäßrige Thioglykolsäurelösung mit einer Konzentration von etwa 5 Gew.-% bezogen auf die Thioglykol­ säure, die mit einem Ammoniak/Ammoniumchloridpuffer auf pH 6,5 gepuffert ist.
2. Herstellung des Fixativs
50 g Ethanol p.a., 48 g destilliertes Wasser und 2 g Carbowax® 1540 werden miteinander vermischt.
3. Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
Das von einem Patienten abgehustete Bronchialsekret bzw. Sputum wird mit 50 bis 100 ml Fixativ versetzt und ver­ mischt. In der Regel wird dieser Fixierschritt vom Patien­ ten Zuhause durchgeführt, die so fixierte Probe wird an das zytodiagnostische Labor eingesandt.
Zu 10 ml der fixierten Sputumlösung wird 1 ml des unter 1. hergestellten Mukolytikums zugesetzt, die Mischung wird auf einem Schüttler 30 s lang durchmischt und bei Raumtem­ peratur 30 min stehengelassen. Anschließend wird die Probe 10 min lang bei 1600 g zentrifugiert. Es handelt sich hierbei um das Zwischenzentrifugieren zum Aufkonzentrieren des Zell-Schleimgemischs in der Probe.
Nach dem Zwischenzentrifugieren wird der Überstand bis auf 2 ml abpipettiert, das Sediment wird in dem verbleibenden Rest 30 s lang aufgeschüttelt. 120 µl der aufgeschüttelten Probe werden auf 10 ml 45%ige Saccharoselösung aufge­ schichtet und 30 min bei 1500 g zentrifugiert. Bei diesem differentiellen Zentrifugieren werden die Zellen aufgrund ihrer höheren Dichte vom mukolysierten Schleim und sonsti­ gen störenden, extrazellulären Beimengungen getrennt, sie lagern sich als Sediment ab.
Nach Abpipettieren der überstehenden Saccharoselösung, die den Schleim und sonstige störende Bestandteile enthält, kann das Zellsediment auf Objektträgern ausgestrichen, eingefärbt und mit dem Lichtmikroskop zytodiagnostiziert werden. Man erhält eine einschichtige und dichte Lagerung der diagnostisch relevanten Zellen. Zum Färben kann bspw. die Hämatoxylin-Eosin-Färbung oder die Papanicolaou-Fär­ bung verwendet werden.
Alternativ oder zusätzlich kann das Zellsediment in einem bekannten zytodiagnostischen Automaten untersucht werden. Bspw. kann das Cyto-Rich®-System der Firma Roche Image Analy­ sis Systems Verwendung finden (siehe James W. Geyer et al., Diagnostic Cytopathology 1993, Vol. 9, No. 4, 417-422).

Claims (13)

1. Verfahren zum Vorbereiten von zellhaltigen Bronchialsekre­ ten und/oder Sputum für eine zytologische Diagnostik, mit den folgenden Schritten:
  • a) Zugabe eines Mukolytikums und chemische Mukolyse des Schleims,
  • b) differentielles Zentrifugieren in einem flüssigen Medium, dessen Dichte zwischen der Dichte der Zellen in dem Bronchialsekret bzw. dem Sputum und der Dichte des Schleims liegt,
  • c) Abtrennen der sedimentierten Zellen vom schleimhaltigen Zentrifugat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mukolytikum Thioglykolsäure verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Thioglykolsäure auf einen pH-Wert von 6,3 bis 8,3 gepuf­ fert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer Ammoniak verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Schleim durch die chemische Mukolyse auf eine Schleimfadenlänge von max. 30 µm zer­ kleinert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bronchialsekrete und/oder der Sputum vor der Zugabe des Mukolytikums mit einem alkohol­ haltigen Fixativ fixiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixativ folgende Bestandteile enthält:
  • - 40-60 Gew.-% Ethanol
  • - 1-3 Gew.-% Polyethylenglykole mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 14 000
  • - Rest auf 100 Gew.-% Wasser.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß nach der chemischen Mukolyse und vor der differentiellen Zentrifugierung das Zell-Schleimge­ misch in der Mukolyselösung durch Zwischenzentrifugieren aufkonzentriert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als flüssiges Medium zur differentiel­ len Zentrifugierung eine wäßrige Saccharoselösung verwen­ det wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Saccharose in der Lösung 40 bis 50 Gew.-% beträgt.
11. Mukolytikum zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es Thioglykolsäure enthält.
12. Mukolytikum nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Thioglykolsäure auf einen pH-Wert von 6,3 bis 8,3 gepuffert ist.
13. Mukolytikum nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer Ammoniak verwendet wird.
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