DE19513540A1 - Verwendung von Propolis - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Propolis als Antiphlogistikum und Strahlen- bzw. Lichtschutzmittel mit systemischer Wirkung

Die topische Verwendung eines Casein enthaltenden Propolis- Extraktes gegen entzündliche Erkrankungen im Hals-, Nasen- und Ohrenbereich ist aus der DE-A-43 20 316 bekannt.

Ausgehend von der Tatsache, daß z. B. Entzündungen der Atemwege aufgrund einer Reizung und Verletzung der Schleimhäute und des Epithelgewebes einer schonenden Behandlung zur Hemmung der Entzündungsreaktion bedürfen, bestand ein Bedarf nach einem milden, natürlichen Arzneimittel, welches sowohl die Entzündungsreaktion hemmt als auch einen Schutz für Schleimhäute und Epithelgewebe bietet.

Es ist heute bekannt, daß Entzündungsreaktionen biochemisch einen komplexen Mechanismus darstellen, an dem eine Reihe von Substanzen beteiligt ist. Zu diesen Substanzen gehören insbesondere die entzündungsfördernden Eicasonoide, insbesondere das Prostaglandin E₂ (PGE₂), Prostaglandin I₂ oder Prostacyclin.

Im Falle einer akuten Entzündung wird die Biosynthese von Prostaglandin stark angeregt. Dies ist zurückzuführen auf Störungen der Zellmembran, dem erhöhten Einströmen von Ca-Ionen in die Zelle sowie insbesondere auf die Wirkung von Entzündungsmediatoren, wie z. B. Bradykinin. Entzündungsmediatoren lösen selbst Entzündungsvorgänge aus, erhöhen die Gefäßpermeabilität, stimulieren sensible Nervenenden und regen die Prostaglandin-Biosynthese in erhöhtem Maße an. Im Falle von Bradykinin wird Phospholipase A₂ aktiviert, was zu einer Abspaltung von Arachidonsäure von Membranphospholipiden führt. In der Folge wird Arachidonsäure durch Cyclooxygenase oder Lipoxygenase sowie Folgeenzymen zu den verschiedenen Eicosanoiden metabolisiert. Je nach Zelltyp entstehen dabei vorzugsweise die Substanzen PGE₂, PGI₂, Thromboxan A₂ (TXA₂), Hydroxyfettsäuren, Leukotriene, etc. Von den genannten Substanzen verstärkt insbesondere PGE₂ die Wirkung von Bradykinin, so daß es dadurch zu einer Intensivierung der Entzündung kommt.

Im Lungengewebe kommt es zu einer erhöhten Synthese der Leukotriene, was zur Bronchokonstriktion und Asthma bronchiale führt. Abhängig vom Zelltyp kann es auch zu einer erhöhten Bildung von TXA₂ kommen, wodurch die Thrombocyten-Aggregation angeregt wird, was wiederum zu Verschlüssen von Arteriolen führt.

Die vorstehend genannten Vorgänge, wie sie bei Entzündungen beobachtet werden, stellen oxidative Reaktionen dar. Diese oxidativen Reaktionen können zum Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies führen, wie z. B. dem Superoxidradikalanion (O₂^.-), Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikal (OH^.) sowie Singulettsauerstoff (¹O₂). Diese reaktiven Sauerstoffspezies stehen unter Normalbedingen im Gleichgewicht mit den Antioxidantien, die sowohl enzymatischer als auch nicht-enzymatischer Natur sein können. Im Falle einer Entzündung ist dieses Gleichgewicht gestört und es kommt zu einer Anhäufung oxidativ bedingter Schäden.

Um den Entzündungsvorgang zu hemmen, ist es daher erforderlich, die Elektronentransportkette zu unterbrechen sowie die reaktiven Sauerstoffradikale abzufangen. Während es bekannt ist, als Inhibitoren der Prostaglandin-Biosynthese nicht-steroide entzündungshemmende Arzneimittel, wie Indomethacin, Salicylsäure, Iboprofen, etc., einzusetzen, wird gemäß DE-A-43 20 315 ein natürliches Substanzgemisch, nämlich Propolis, zur Verfügung gestellt, um bei topischer Anwendung eine Unterbrechung der Elektronentransportkette herbeizuführen. Im weiteren ist es vorgesehen, Casein als Zusatz dem Arzneimittel zuzugeben, um Schleimhäute und Epithelgewebe zu schützen, aber insbesondere auch um die Eisenverfügbarkeit für die ablaufenden enzymatischen Vorgänge und für die bakterielle Verfügbarkeit zu verändern.

Propolis und Casein sind vorzugsweise in einem Verhältnis von 10 zu 1 bis 500 zu 1 in dem Extrakt enthalten, der in erster Linie eine wässerige oder wässerig-alkoholische Lösung darstellt. Dem Extrakt kann als weiterer Zusatz (vzw. 1 mM) KMB zugegeben werden. Eine Ausführungsform weist z. B. folgende Zusammensetzung auf:
Propolis 1-10%, Casein 0,5-10 g, Alkohol 0-20%, mit Wasser aufgefüllt auf 100 ml.

Die Applikation erfolgt z. B. in Form von Ohrentropfen, Augentropfen, Nasentropfen, Halstropfen, als Präparation zum Gurgeln, Lösung zum Einnehmen oder als Lingualtabletten; in der Formulierung als Lösung oder Spray gegen Hals- und Nasenentzündungen; als Kaugummi zur Behandlung von Zahnfleischerkrankungen und Mundfäule.

Es ist bekannt, daß die Eisenionen eine wichtige Rolle bei der Sauerstoffaktivierung spielen, wobei sie die sogenannte "Haber-Weiss"-Reaktion katalysieren. Der Zusatz von Casein zu dem erfindungsgemäßen Arzneimittel soll bewirken, daß Eisenionen gebunden werden, und somit für den bakteriellen Stoffwechsel nicht mehr zur Verfügung stehen.

Um die biochemischen Grundvorgänge, nach welchen das Arzneimittel gemäß DE-A-43 20 315 einwirkt, aufzuklären, wurden Versuchsreihen an einem Modellsystem beschrieben, welches als eine "Nachbildung" eines Teils der Elektronentransportkette angesehen werden kann. Dabei handelt es sich um das Diaphorase-NADH-System. Während für Modellreaktionen an dem genannten Diaphose-NADH-System verschiedene Nachweisreaktionen angewendet werden können, sollen die nachfolgenden Versuche am Beispiel der KBM-Spaltung die Hemmwirkung von Propolis bzw. der Kombination von Propolis und Eisen demonstrieren.

Außerdem ist es bevorzugt, bei dem Arzneimittel gemäß DE-A-43 20 315 einen wäßrigen Propolis-Extrakt anzuwenden, dessen Herstellung ebenfalls beschrieben wird. Die Konzentration von Propolis in dem genannten Extrakt kann im Bereich von 0,1% bis 20% liegen. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich liegt zwischen 0,5% und 5%. Die Caseinkonzentration im Arzneimittel kann vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.-% betragen. Als Caseinpräparation kann kommerziell erhältliches Casein eingesetzt werden, welches für die pharmazeutische Anwendung geeignet ist. Sofern es gewünscht ist, das Arzneimittel als wäßrig/ethanolische Lösung anzuwenden, soll die Alkoholkonzentration ca. 10 bis 20% nicht übersteigen. Im allgemeinen richtet sich die Alkoholkonzentration nach der Caseinkonzentration und soll dabei in einem Bereich liegen, der nicht zu einer Ausfällung von Casein führt.

Die von der Anmelderin durchgeführten Untersuchungen sind sowohl in den nachfolgenden Tabellen als auch in Fig. 1 bis 18 wiedergegeben, wobei die Abbildungen betreffen:

Fig. 1 die Hemmung der KMB-Spaltung bei 0,3 U Disphorase i.A. durch verschiedene Propolis-Konzentrationen. Dabei zeigt sich, daß die 50%-Hemmwerte für PEE bei etwa 0,7% i.A., PWEB bei etwa 0,6% i.A., PWEU bei etwa 0,6% i.A. liegen. Die vorstehenden Abkürzungen werden im Text näher erläutert.

Fig. 2 die Hemmung der KMB-Spaltung bei 2,2 U Diaphorase i.A. durch verschiedene Propolis-Konzentrationen. Dabei zeigt sich, daß die 50%-Hemmwerte für PEE bei etwa 0,9% i.A., PWEB bei etwa 17% i.A., PWEU bei etwa 4,6% i.A. liegen.

Fig. 3 die Aktivität von 0,3 U Diaphorase bei der KMB-Spaltung in Abhängigkeit von der NADH-Konzentration.

Fig. 4 die Hemmung der KMB-Spaltung durch Propolis in Abhängigkeit von der NADH-Konzentration.

Fig. 5 die Hemmung der KMB-Spaltung im Diaphorase-NADH-System durch Ethanol. Dabei zeigte sich, daß 50% Hemmung erhalten werden bei 0,028% Ethanol i.A.

Fig. 6 der Einfluß von Propolis und Fe²⁺ mit und ohne Casein auf die KMB-Spaltung im Diaphorase-System.

Fig. 7 Abhängigkeit der Indolessigsäure (IES)-Oxidation von der PEE-Konzentration in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Peroxidase im Ansatz.

Fig. 8 Abhängigkeit der Indolessigsäure (IES)-Oxidation von der PWEB-Konzentration in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Peroxidase im Ansatz.

Fig. 9 Abhängigkeit der Indolessigsäure (IES)-Oxidation von der PWEU-Konzentration in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Peroxidase im Ansatz.

Propolis ist eine dunkelgelbliche bis hellbraune, harzartige, zwischen den Fingern erweichende Masse mit würzig­ balsamartigem Geruch, einer Dichte von 1.2 und einem Schmelzpunkt von 50 bis 70°C, die von Bienen besonders von den Knospen der Pappeln, der Birken und anderen Bäumen gesammelt und im Bienenstock als Überzug der Wände und zum Befestigen der Waben benutzt wird; es wird deshalb auch als Bienenleim oder Bienenharz bezeichnet. Propolis enthält ca. 10 bis 20% Wachs, größere Anteile an Harz, etherischen Ölen und an Flavonoiden, die für die anti-mikrobiellen Eigenschaften von Propolis verantwortlich gemacht werden; den ebenfalls in Propolis enthaltenen Kaffeesäure-Derivaten werden dagegen besonders die virostatischen Eigenschaften von Propolis zugeschrieben. Aufgrund dieser Eigenschaften werden ethanolische und wässerige Extrakte des "Bienenleims" Propolis deshalb in der Volksheilkunde insbesondere als Einreibmittel gegen Rheuma und Gicht sowie als Räuchermittel verwendet (vgl. Römpp Chemielexikon, 9. Auflage, 1992, Seite 3640). Bevorzugt werden erfindungsgemäß wäßrige Extrakte eingesetzt, die wie nachfolgend angegeben hergestellt werden:

I. Herstellung eines wäßrigen Propolis-Extraktes

Der wachshaltige, ethanolische Extrakt, wie er üblicherweise kommerziell erhältlich ist, muß für seine Einsatzfähigkeit als Arzneimittel zunächst in eine wäßrige Lösung überführt werden. Als Ausgangsmaterial kann hierfür PEE-40-Extrakt dienen, der kommerziell von Salomon, Kopenhagen, erhalten wird.

Ein weiteres Ausgangsmaterial kann unbehandelter, partikelhaltiger Propolis-Rohextrakt darstellen, wie er beispielsweise als PWE-13-Rohextrakt (erhältlich durch Salomon) bekannt ist. Auch dieser Rohextrakt wird den nachfolgenden Aufarbeitungsschritten unterzogen. Die Herstellung des wäßrigen Propolis-Extraktes erfolgt zunächst durch Gefriertrocknen des Ausgangsextraktes, wobei aufgrund des Trockengewichtes auf das Ausgangsvolumen zurückgerechnet wird. Für den wäßrigen Extrakt ergibt sich eine Ausbeute von 12,9 ± 0,2 mg Trockensubstanz pro 1 ml PWE-13-Rohextrakt und analog für den ethanolischen Extrakt 3,4 ± 0,1 mg Trockensubstanz pro 1 ml PEE-40. Die Reextraktion beider Propolis-Rückstände mit 13,0 ml destilliertem Wasser pro 1 mg Trockengewicht erfolgt für 30 Minuten bei 37°C. Dabei wird die ursprüngliche PWE-13-Konzentration wieder hergestellt und aus der PEE-40-Trockensubstanz eine wäßrige Lösung mit vergleichbarer Konzentration gewonnen. Letztere unterscheidet sich grundlegend vom ethanolischen Extrakt und besitzt nur noch dessen wasserlösliche Inhaltsstoffe, die jedoch nicht mit denjenigen des PWE-13-Extraktes übereinstimmen müssen.

Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 27.000 g werden die unlöslichen Rückstände durch Filtrieren über eine Glasfritte vollständig entfernt. Auf diese Weise ergeben sich drei Propolis-Extrakte, die an der KMB-Modell-Reaktion durchgetestet werden, nämlich

• 1. PEE: lyophilisierter, wäßriger PEE-40-Extrakt,
• 2. PWEB: behandelter, d. h. lyophilisierter und partikelfreier PWE-13-Extrakt,
• 3. PWEU: unbehandelter, partikelhaltiger PWE-13-Rohextrakt.

II. Standardisierung des Propolis-Extraktes

Propolis-Extrakte weisen einen beträchtlichen Gehalt an mono- und diphenolischen Inhaltsstoffen auf. Das Peroxidase-Indolessigsäure-System stellt einen empfindlichen Nachweis für diese mono- und diphenolischen Inhaltsstoffe dar. Dabei wird Peroxidase durch Monophenole aktiviert, während sie durch Diphenole gehemmt wird. Enthält ein zu untersuchendes Gemisch beide Komponenten, nämlich Mono- und Diphenole, so ergibt sich durch Addition dieser beiden Kurven zunächst in Abhängigkeit von der Konzentration des Propolis-Extraktes ein Anstieg der Indolessigsäure-Oxidation, der dann durch die sich überlagernde Hemmung der Diphenole abrupt abbricht und bis auf den Wert absinkt, der in Abwesenheit von Peroxidase erhalten wird. Daraufhin steigt die Indolessigsäure-Oxidation bei zunehmender Konzentration des Propolis-Extraktes wieder an.

Um nun Propolis-Extrakte standardisieren zu können, wurde gefunden, daß hierfür der Wert für die 50%ige Indolessigsäure-Oxidation im abfallenden Teil der Kurve als Standardwert gesetzt werden kann. Auf der Basis dieses Standardwertes sind dann die Konzentrationen von Propolis-Extrakten, welche nicht bekannt sind, zu ermitteln.

In den Abb. 7, 8 und 9 sind als Basiskurven die Werte eingetragen, die für unterschiedlich behandelte Propolis-Extrakte (PEE, PWEB und PWEU) bei einer Konzentration von 0,3 mM Indolessigsäure in Abwesenheit von Peroxidase erhalten werden.

Außerdem ist in den Kurven 7 bis 9 die Aktivierung der Indolessigsäure der Propolis-Extrakte PEE, PWEB und PWEU in Gegenwart von Indolessigsäure und Peroxidase aufgezeigt. Durch Überlagerung der Aktivierungskurve infolge von monophenolischen Verbindungen und der Inhibierungskurve durch die diphenolischen Verbindungen ergibt sich ein steiler Abbruch des Kurvenverlaufes. Setzt man den Wert für die 50%ige Indolessigsäure-Oxidation in diesem abbrechenden Kurvenverlauf als Standardwert, so erhält man unter den gegebenen Bedingungen für:
PEE eine 50%ige Indolessigsäure-Oxidation bei etwa 2% im Ansatz (i.A.),
PWEB einen Wert zwischen 0,25 und 0,29% i.A., und
PWEU einen Wert zwischen 0,14 und 0,16% i.A.

III. Modellreaktion mit Hilfe der KMB-Spaltung

Durch die Diaphorase wird aus Juglon ein Semichinonradikal gebildet, dessen Autoxidation zur Entstehung von O₂^.- H₂O₂ und OH^. führt. Letzteres kann KMB spalten und daraus Ethylen freisetzen, weiches im Gaschromatographen nachgewiesen werden kann. Diese Testreaktion erfaßt deshalb sowohl eine mögliche Hemmwirkungen der Propolis-Extrakte auf das Enzym und dessen Elektronenübertragung, als auch deren

Radikalfängereigenschaften.

Testansatz:
1 ml Phosphat-Puffer, pH 7,4, 100 mM (50 mM i.A.) ad 2 ml H₂O
100 µl NADH, 2 mM (100 µM i.A.)
100 µl Juglon, 1 mM (50 µM i.A.)
100 µl Propolis, 5% i.A.
100 µl KMB, 25 mM (1,25 mM i.A.)
Start: 100 µl Diaphorase, 3 U/ml (0,3 U i.A.).

Vor der Gasentnahme wird der Reaktionsansatz für 30 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert.

Propolis-Konzentrationsreihen mit 0,3 U Diaphorase und 100 µM NADH im Ansatz werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Die vorstehende Tabelle 1 zeigt deutlich, daß bei zunehmender Propolis-Konzentration bei sämtlichen Propolis-Extrakten ein deutlicher Anstieg der prozentualen Hemmung der Diaphorase-Aktivität zu beobachten ist. Dies ist schematisch in Fig. 1 dargestellt.

Eine Zunahme der Hemmung, wenn auch nicht für die drei untersuchten Propolis-Extrakte in gleichem Masse, ist auch dann zu beobachten, wenn im Testansatz jeweils 2,2 g Diaphorase und 375 µM NADH verwendet wurden. Hierzu sind die Ergebnisse in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

Die Werte von Tabelle 2 werden in Fig. 2 schematisch wiedergegeben.

Der Einfluß der NADH-Konzentration ist den in Tabelle 3 durchgeführten Versuchsreihen zu entnehmen, wobei in Fig. 3 die Abhängigkeit der Aktivität von 0,3 U Diaphorase bei der KMB-Spaltung in Korrelation zur NADH-Konzentration wiedergegeben ist.

Tabelle 3

Die Hemmwerte beziehen sich auf den 100%-Wert der jeweiligen NADH-Verdünnung ohne Propolis im Testansatz.

Fig. 4 zeigt die Hemmung der KMB-Spaltung durch Propolis in Abhängigkeit von der NADH-Konzentration.

Der Einfluß auf die Hemmwirkung des Modellsystems durch Alkohol wird in der nachfolgenden Versuchsreihe untersucht.

Rechnet man mit nur 99%iger Ethanol-Entfernung durch die Lyophile, so würde sich 1% Rest-Ethanol in der PEE-Trockensubstanz (= 0, 01 ml/mg TG) befinden. Bei der Reextraktion mit 13 ml H₂O/mg Trockengewicht würde dieser Restgehalt auf 0,077% absinken, so daß bei einer 10%igen PEE-Konzentration im Ansatz 0,0077% Ethanol vorhanden wären.

In diesem Konzentrationsbereich ergeben sich meßbare Quencheffekte von 20 bis 30%. Dies bedeutet, daß maximal 20% bis 30% der Hemmwirkung von 10% PEE i.A. auf Ethanol zurückgeführt werden können, wenn man annimmt, daß sich etwa 1% bis 2% Rest-Ethanol im PEE-Trockenpulver befinden.

Bei weiteren PEE-Verdünnungen spielen Ethanol-Rückstände keine Rolle mehr.

Die ungewöhnlich hohen Hemmeffekte durch den PEE-Extrakt bei der KMB-Spaltung beruhen demnach auf Inhaltsstoffen mit guten Radikalfängereigenschaften, die keinen Einfluß auf die Diaphotase und die vorher beschriebenen Testsysteme haben.

Die Hemmung der KMB-Spaltung im Diaphorase-NADH-System durch Ethanol ist in der nachfolgenden Tabelle 4 sowie in Fig. 5 gezeigt.

IV. Einfluß eines Casein-enthaltenden Propolis-Extraktes auf die KMB-Spaltung

Abgesehen von der Schutzwirkung des Caseins auf die Schleimhäute und das Epithelgewebe, übt Casein auch einen Einfluß auf den Ablauf der KMB-Spaltung im Diaphorase-System aus. Um dies experimentell nachzuweisen, wurde die Grundrate der Ethylenbildung aus KMB in Abhängigkeit von der Propolis-Konzentration bestimmt. Hierzu diente folgender Ansatz:

Phosphatpuffer pH 7,4|0,1 M i.A.
H₂O	ad 2 ml
Juglon	0,05 mM i.A.
NADH	0,1 mM i.A.
Casein	0 mg i.A. bzw. 0,2 mg i.A.
Propolis	verschiedene Konzentrationen
Diaphorase	0,3 U i.A.
KMB	1,25 mM i.A.
Inkubation:	30 Minuten bei 37°C im Dunkeln.

Ohne Zusatz der Testsubstanzen Propolis und Casein werden 4.368 ± 108 pmol Ethylen/Ansatz gebildet. Dieser Wert wird als 100%-Wert definiert.

In Fig. 6 ist der Einfluß von Propolis und Fe²⁺ mit und ohne Casein auf die KMB-Spaltung im Diaphorase-System gezeigt. Aus Fig. 6 ergibt sich, daß Casein die Propolis-Aktivität nicht negativ beeinflußt. Auf der anderen Seite reagiert Casein mit niedrigen Fe-Konzentrationen (1 µ Molar), was durch Stimulierung der Fe-abhängigen KMB-Spaltung dokumentiert wird (Tabelle 5a und 5b). Ohne Fe-Zusätze wird jedoch die KMB-Spaltung durch Propolis und Casein kooperativ gehemmt (Tabelle 6a und 6b).

Tabelle 5a

Fe²⁺ ohne Casein

Tabelle 5b

Fe²⁺ mit Casein (0,2 mg i.A.

Tabelle 6a

Propolis ohne Casein

Tabelle 6b

Propolis mit Casein (0,2 mg i.A.)

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen somit deutlich, daß die Kombination von Propolis und Casein eine verstärkte Hemmwirkung auf die KMB-Spaltung bewirkt. Es wird angenommen, daß der Einfluß von Casein insbesondere auf der komplexierenden Wirkung intrinsischer bzw. proteingebundener Eisenionen besteht, was wiederum eine veränderte Verfügbarkeit zur Folge hat.

Die deutsche Patentanmeldung P 43 36 169.2 beschreibt die topische Verwendung von Propolis-Extrakten.

Es ist bekannt, daß Lichtstrahlen der Wellenlänge zwischen 280 und 400 nm eine Bräunung der menschlichen Haut bewirken; es ist ebenfalls bekannt, daß Strahlen der Wellenlänge zwischen 280 und 320 nm, die als UV-B-Strahlung bezeichnet wird, daneben auch Erytheme und Hautverbrennungen verursachen, die die Entwicklung einer Bräune nachteilig beeinflussen. UV-B- Strahlung der Wellenlänge zwischen 280 und 320 nm, die die Bildung von Sonnenerythemen verursacht, muß daher filtriert werden; daneben ist aber auch zu berücksichtigen, daß auch UV- A-Strahlung mit einer Wellenlänge zwischen 320 und 400 nm, die eine Bräunung der Haut bewirkt, auch eine Veränderung der Haut hervorruft, und zwar insbesondere bei empfindlicher Haut oder bei einer der Sonnenstrahlung ständig ausgesetzten Haut. Die UV-A-Strahlung verursacht insbesondere einen Verlust der Elastizität der Haut und das Auftreten von Falten, und führt damit zu einem vorzeitigen Altern. UV-A-Strahlung begünstigt außerdem auch das Auslösen der erythematösen Reaktion, kann diese Reaktion in gewissen Fällen verstärken, und ebenfalls auch die Ursache für phototoxische oder photoallergische Reaktionen sein. Vorteilhafterweise sollte deshalb ein insbesondere auch für eine empfindliche Haut gut verträgliches Sonnenschutzmittel den gesamten Wellenlängenbereich zwischen 280 und 400 nm filtrieren.

Gemäß P 43 36 169.2 wird ein Sonnenschutzmittel bereitgestellt, das die menschliche Haut gegenüber UV-Strahlung in einem breiten Spektrum, und insbesondere gegenüber UV-A- und gegenüber UV-B-Strahlung schützt, das auf natürlicher Basis beruht, und das ein sehr mildes und für die Haut auch bei längerer Anwendung gut verträgliches Mittel darstellt. Dies kann durch die Verwendung eines Propolis- Extraktes erreicht werden. Vorzugsweise liegt der Propolis- Extrakt in Form eines wässerigen oder alkoholisch-wasserigen Propolis-Extraktes vor.

Die Sonnenschutzmittel gemäß P 43 36 169.2 enthalten Propolis (bezogen auf den lyophilisierten, trockenen Extrakt) in einer Menge von 0.5 bis 20 Gewichtsprozent, insbesondere in einer Menge von 1.0 bis 10 Gewichtsprozent, bezogen auf das gesamte Sonnenschutzmittel.

Zweckmäßigerweise enthalten die Sonnenschutzmittel zusätzlich Casein. Aufgrund seiner Eigenschaften, z. B. als Schutzkolloid, oder seiner schützenden Eigenschaften gegenüber Schleimhäuten und Epithelgewebe kann sich ein Zusatz von Casein vorteilhaft auf die Hautverträglichkeit, insbesondere bei empfindlicher Haut, auswirken. Der Caseingehalt beträgt vorzugsweise 0.5 bis 10 Gewichtsprozent, bezogen auf das gesamte Mittel.

Das Sonnenschutzmittel liegt vorzugsweise in Form einer Öl-in- Wasser-Emulsion vor.

Der pH-Wert dieser Emulsionen liegt im allgemeinen zwischen 4 und 9, und vorzugsweise zwischen 5.5 und 8; wenn erforderlich, kann die Emulsion mit Hilfe eines üblichen alkalisierenden oder ansäurenden Mittels auf diesen Bereich eingestellt werden.

Diese Sonnenschutzmittel, insbesondere in Form von Öl-in- Wasser-Emulsionen, besitzen außerdem den Vorteil, daß sie thermisch und photochemisch stabil sind, nicht toxisch sind, und sich gegenüber der Haut, auch bei längerer Anwendung, als unschädlich erweisen.

Die Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten vorzugsweise ca. 10 bis 60% Fettphase und ca. 90 bis 40% wässerige oder alkoholisch- wässerige Phase. Als Fettphase (Fettkörper) können für derartige Zusammensetzungen übliche Stoffe verwendet werden, wie z. B.

• - mineralische Ölen, wie Vaselinöl,
• - pflanzliche oder tierische, gegebenenfalls modifizierte Öle, wie Öl von süßen Mandeln, Avocadoöl, Calophyllumöl, Rizinusöl, Olivenöl, Lanolin und dessen Derivaten, Perhydrosgualen, Erdnußöl, Weizenkeimöl, Leinöl, Jojobaöl, Aprikosenkernöl, Nußöl, Palmöl, Pistazienöl, Sesamöl, Rüböl, Kaddigöl, Maiskeimöl, Pfirsichkernöl, Mohnöl, Kinöl, Sojaöl, Carthamöl, Coprahöl, Haselnußöl, Traubenkernöl, sowie Sonnenblumenöl;
• - Ester von gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren oder synthetischen Ölen, wie Ethylpalmitat oder Isopropylpalmitat, Alkylmyristate, wie Isopropyl, Butyl- und Cetylmyristat, Hexylstearat, Triglyceride von Fettsäuren mit C8-C18, Cetylricinoleat, Stearyloctanoat (Purcellinöl), Ketostearyl-2- ethyl-hexanoat, Ester von Fettsäuren und Glycerin, hydriertes Polyisobuten.

Die Ölphase der erfindungsgemäßen Emulsionen kann auch bestimmte Wachse enthalten, insbesondere Carnaubawachs, Bienenwachs, Ozokerit, Candelillawachs und mikrokristalline Wachse oder Siliconöle, wie z. B. Dimethylpolysiloxan, sowie außerdem Fettsäuren und Fettalkohole mit C12-C18.

Wenn die wässerige Phase eine alkoholisch-wässerige Phase ist, so enthält sie vorzugsweise bis zu 20 Volumenprozent Alkohol. Als Alkohol werden insbesondere Monoalkohole und Polyalkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen eingesetzt; besonders bevorzugte Monoalkohole oder Polyalkohole sind Ethanol, Isopropanol, Propylenglycol und in erster Linie Glycerin.

Die Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten vorzugsweise einen geeigneten Emulsionsbildner bzw. Emulgiermittel, das entweder in der Fettphase oder in der wässerigen Phase, oder gleichzeitig in beiden Phasen vorliegen kann. Der Anteil der Emulsionsbildner bzw. Emulgiermittel (Emulgatoren) liegt vorzugsweise zwischen 1 bis 15%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Emulsion. Als Emulgatoren können die für derartige Zusammensetzungen üblichen Emulgatoren verwendet werden, z. B. ein oder mehrere der folgenden Mittel:

• - polyoxyethylenierte Alkyl(C8-C18)phenole mit 9 bis 15 Mol Ethylenoxid;
• - polyoxyethylenierte Fettalkohole mit C12-C18, welche mindestens 4 und vorzugsweise 4 bis 35 Ethoxygruppen aufweisen;
• - polyglycerinierte Fettalkohole mit C10-C18, welche 4 bis 10 Glyceringruppen aufweisen;
• - polyethoxylierte und polyglycerinierte Fettsäureester mit C12-C18;
• - polyoxyethylenierte Fettsäureester mit C12 bis C18 von Sorbitan, welche 10 bis 20 Mol Ethylenoxid aufweisen;
• - Copolymere von Propylenoxid/Ethylenoxid;
• - Lecithin aus Soja oder Eigelb;
• - Fettsäureester mit C12-C18 von Polyethylenglykol, welche mindestens 2 Ethoxygruppen und vorzugsweise 4 bis 20 Ethoxygruppen aufweisen;
• - polyoxyethyleniertes Rizinusöl mit 10 bis 60, Mol Ethylenoxid;
• - Sucroglyceride;
• - Seifen;
• - Phosphorsäureester von Fettalkohole;
• - gegebenenfalls oxyethylenierte Fettalkoholsulfate;
• - polyoxyethylenierte Lanolinalkohole, welche mindestens 4 Ethoxygruppen aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten vorzugsweise auch Verdickungsmittel, lindernde Mittel anfeuchtende Mittel, oberflächenaktive Mittel, Konservierungsmittel, Antischaummittel, Parfüme, Farbstoffe und/oder Pigmente, wodurch das Mittel selbst und/oder die Haut gefärbt werden kann, Vitamine, etherische Öle, sowie gegebenenfalls weitere in derartigen Sonnenschutz- und kosmetischen Zusammensetzungen verwendete übliche Bestandteile.

Die Sonnenschutzmittel in Form von Öl-in-Wasser-Emulsionen können in verschiedenen Formen, wie sie auf diesem Gebiet üblich sind, vorliegen, wie z. B. als Milch, Creme, oder sie können z. B. auch als Aerosol konditioniert sein.

Außer dem Propolis-Extrakt können die Sonnenschutzmittel der P 43 36 169.2, insbesondere in Form einer Öl-in-Wasser- Emulsion, gegebenenfalls weitere wasserlösliche und/oder öllösliche, an sich bekannte UV-Filter enthalten, wie z. B. Kaffeeöl, Derivate von Salicylsäure, Derivate von Zimtsäure, Ester und Derivate von p-Aminobenzoesäure, Anthranilate, Benzophenonderivate, Campherderivate, wie z. B. p- Methylbenzyliden-campher, Derivate von Dibenzoylmethan, Benzotriazolderivate, Benzoxazolderivate und/oder Benzimidazolderivate.

In den nachfolgenden experimentellen Untersuchungen werden folgende Abkürzungen verwendet:
WSD = wasserlösliche Derivate;
ESD = ethanollösliche Derivate;
RB = Rose Bengal;
RF = Riboflavin;
HP = Hematoporphyrin;
KMB = 2-Ketomethylthiobuttersäure.

In den Fig. 10 bis 18 zeigen

Fig. 10 die photodynamische Aktivität von Propolis als Inkubation des aus KMB als Indikatorsubstanz gebildeten Ethylens;

Fig. 11 die Inhibierung der Riboflavin-induzierten Ethylenbildung aus Ketomethylthiobuttersäure (KMB) durch Propolis;

Fig. 12 die Wirkung von Propolis auf die Riboflavin-abhängige Bleichung von Crocin;

Fig. 13 die zeitabhängige Stimulierung und Inhibierung der durch Riboflavin verursachten Crocin-Bleichung durch Propolis;

Fig. 14 die Wirkung von Propolis auf die durch Rose Bengal katalysierte Ethylenbildung aus KMB (ca. 5300 pMol Ethylen entspricht 100%);

Fig. 15 zeigt die Crocin-Bleichung durch Rose Bengal unter Einwirkung von Propolis;

Fig. 16 zeigt den Einfluß von Propolis auf die FMB-Spaltung durch Hämatoporphyrin;

Fig. 17 zeigt den Einfluß von Propolis auf die Crocin- Bleichung durch Hämatoporphyrin;

Fig. 18 die Wirkung von Propolis auf die durch Hämatoporphyrin katalysierte Ethylenbildung aus KNB.

Belichtungsversuche

in diesen Versuchen bedeutet "Propolis" einen der 3 vorstehend bei der Herstellung der Extrakte beschriebenen Propolis- Extrakte PEE, PWE und PWEU.

Die Inkubation photodynamischer Reaktionen erfolgt in einem auf 37°C thermostatisierten Wasserbad unter Schütteln, wobei die Belichtungsstärke etwa 30 kLux beträgt.

1. photodynamische Aktivität von Propolis

Belichtet man die verschiedenen Propolis-Extrakte mit KMB als Indikatorsubstanz, so zeigen sich deren schwache photodynamische Eigenschaften.

Testansatz:
1 ml Phosphat-Puffer, pH 7.4, 100 mM (50 mM i.A.) ad 2 ml H₂O
100 ml Propolis
100 ml KMB, 25 mM (1.25 mM i.A.)
Die Reaktion wird durch Belichtung gestartet und die Inkubationszeiten betragen 30, 60 und 90 min.

Die Ergebnisse sind in Fig. 10 graphisch dargestellt.

2. KMB-Spaltung durch Riboflavin

Testansatz:
1 ml Phosphat-Puffer, pH 7.4, 100 mM (50 mM i.A.) ad 2 ml H₂O
100 ml Propolis
100 ml KMB, 25 mM (1.25 mM i.A.)
100 ml Riboflavin, 20 mm (1 mM i.A.)
Der Reaktionsstart erfolgt durch Belichtung und der Ansatz wird für 5 min im Schüttelbad inkubiert.

Der Propolisextrakt besitzt zwar schwache photodynamische Aktivität (vgl. Punkt 1), doch spielt diese im Vergleich zur Riboflavinaktivität mit nur etwa 1% keine Rolle.

Die Ergebnisse sind in Fig. 11 graphisch dargestellt.

3. Crocinbleichung durch Riboflavin

Crocin ist ein wasserlöslicher Digentiobiose-Diester von Crocetin. Es stellt eine Modellsubstanz für polyungesättigte Verbindungen, wie z. B. Fettsäuren dar (W. Bors, M. Saran und E.F. Elstner, Modern Methods of Plant Analysis (H.F. Linskens, und J.F. Jackson, Eds.), New Series, vol. 13, 277-295, Springer Verlag, Berlin (1992)).

Keine der getesten Konzentrationen der 3 Extrakte von Propolis beeinträchtigten die lichtabsorbierenden Eigenschaften von Crocinlösungen im Dunkeln oder nach Inkubation (45 Min.) im Licht (diese Daten sind nicht angegeben). Nach dieser Inkubationszeit wird Crocin zu ca. 0.40 E in Gegenwart von 5 mM Riboflavin gebleicht.

Testansatz:
1 ml Phosphat-Puffer, pH 7.4, 100 mM (50 mM i.A.) ad 2 ml H₂O
100 ml Propolis
100 ml Crocinlösung (E440 = 1,0)
100 ml Riboflavin, 100 mm (5 mM i.A.)
Der Reaktionsansatz wird 45 min im Belichtungsbad inkubiert und anschließend die Bleichung bei 440 nm im Photometer bestimmt.

Die Propolis-Extrakte selbst sind kaum in der Lage bei Inkubation im Licht oder im Dunkeln mit Crocin zu reagieren; die Bleichrate liegt im Bereich der Standardabweichungen.

Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 12 dargestellt.

4. Zeitkinetik der Crocinbleichung durch Riboflavin

Als Testansatz wurde der vorstehend unter Punkt 3 angegebene verwendet.

Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 13 dargestellt.

Unter 1 Volumenprozent beeinträchtigt keines der 3 Propolis- Extrakte merklich die Crocin-Bleichung durch RF innerhalb von 45 Minuten. Im Gegensatz dazu inhibierten höhere Konzentrationen an WSD (PWEB oder PWEU) die Reaktion, während höhere Konzentrationen an ESD (PEE) die Bleichungsreaktion leicht stimulierten (vgl. Fig. 12). Aufgrund dieses Unterschiedes zwischen PEE und PWEB oder PWEU wurde die Inkubationszeit von 5 Minuten auf 45 Minuten variiert. Da in der RF-katalysierten Fragmentierung von KMB die wässerigen Extrakte ca. 2 mal so wirksam sind wie der primäre ethanolische Extrakt, wurden die Wirkungen von 5 Volumenprozent partikelfreier (PWEB) und partikelhaltiger (PWEU) Extrakte mit 10 Volumenprozent PEE verglichen. Wie die Fig. 13 zeigt, stimulierten alle Präparate die Crocin-Bleichung nach kurzer Inkubationszeit (bis zu 10 Minuten). Nach längeren Inkubationszeiten ging diese Stimulierung in eine Inhibierung über, wobei nur die wässerigen Derivate eine Nettoinhibierung von ca. 40%, im Vergleich zu den Riboflavin- Kontrollen, zeigten.

Dieses Ergebnis zeigt, daß Propolis mit dem Photoaktivator RF und polyungesättigten Verbindungen, wie z. B. Crocin, in Wechselwirkung tritt. Nach dem zeitabhängigen Verbrauch oder Abbau der stimulierenden Verbindungen scheinen die wässerigen Propolis-Extrakte als "Schutzfaktoren" zu wirken. Für diese Extrakte scheint das Gleichgewicht zwischen den stimulierenden und inhibierenden Eigenschaften nach Bestrahlung während 30 Minuten in Gegenwart von RF terminiert zu sein. Im Gegensatz dazu ist der ethanolische Propolis-Extrakt im Hinblick auf die Scavenger-Funktion gegenüber reaktivem Sauerstoff und RF sogar bei längeren Inkubationszeiten weniger wirksam.

5. KMB-Spaltung durch Rosa Bengal

Testansatz:
1 ml Phosphat-Puffer, pH 7.4, 100 mM (50 mM i.A.) ad 2 ml H₂O
100 ml Propolis
100 ml KMB, 25 mM (1.25 mM i.A)
100 ml Rose Bengal, 20 mm (1 mM i.A.)
Die Reaktion wird durch Belichtung gestartet und für 30 min bei 37°C inkubiert.

Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 14 dargestellt.

Im Gegensatz zu Riboflavin ist der Photoaktivator Rose Bengal (RB) ein relativ spezifischer Singlett-Sauerstoff (102) Generator (E.F. Elstner: Der Sauerstoff: Biochemie, Biologie, Medizin (E.F. Elstner, ed.), BI-Wiss.-Verlag, Mannheim, Wien, Zürich (1990)). Die RB-katalysierte Fragmentierung von KMB wird durch den ethanolischen Extrakt im Konzentrationsbereich zwischen 0.01 und 1.0 Volumenprozent merklich stimuliert, während die durch Riboflavin induzierte Ethylen-Freisetzung nicht beeinträchtigt wird. Bei Konzentrationen von höher als 1 Volumenprozent geht die Stimulierung in eine Inhibierung über, die bei 5.0 Volumenprozent 60% erreicht. Keiner der PWEB- oder PWEU-Extrakte stimulierte die durch RB induzierte Ethylenfreisetzung. PWEB wirkt von ca. 0.2 Volumenprozent aufwärts inhibierend, und PWEU bei geringfügig geringeren Konzentrationen (vgl. Fig. 14).

Die Ergebnisse in Fig. 14 zeigen, daß die in ethanolischem Extrakt vorhandenen Verbindungen durch ¹O₂-erzeugende Derivate aktiviert werden, die die Fragmentierung von KMB unterstützen. Bei höheren ESD-Konzentrationen werden angeregte Zustände von 1 O₂ durch vorhandene Inhibitoren entweder gequencht, oder diese Inhibitoren reagieren mit den aktivierenden Derivaten von umgewandeltem ESD. Im Gegensatz dazu weisen beide wässerigen Extrakte keine Komponenten auf, die durch ¹O₂ aktiviert werden können. Es werden deshalb nur die Quench- oder Radikalfänger- Eigenschaften zur Geltung.

Nach 10 Minuten wird Crocin durch RB um ca. 0.31 E gebleicht. Diese Reaktion wird durch Propolis nicht merklich beeinflußt, was anzeigt, daß die Wechselwirkung zwischen Crocin und RB schneller ist als die Umsetzungen zwischen Propolis und den aktiven Zwischenprodukten, die für die Crocin-Bleichung verantwortlich sind (die entsprechenden Daten sind nicht angegeben).

6. Crocin-Bleichung durch Rose Bengal

Testansatz:
1 ml Phosphat-Puffer, pH 7.4, 100 mM (50 mM i.A.) ad 2 ml H₂O
100 ml Propolis
100 ml Crocinlösung (E440 = 1,0)
100 ml Rose Bengal, 100 mm (5 mM i.A.)
Die Belichtungszeit beträgt 10 min bei 37°C.

Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 15 dargestellt.

7. KMB-Spaltung durch Hämatoporphyrin

Testansatz:
1 ml Phosphat-Puffer, pH 7.4, 100 mM (50 mM i.A.) ad 2 ml H₂O
100 ml Propolis
100 ml EMB, 25 mM (1.25 mM i.A.)
100 ml Hämatoporphyrin, 20 mm (1 mM i.A.)
Die Reaktion wird für 45 min im Belichtungswasserbad inkubiert.

Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 16 dargestellt.

8. Crocin-Bleichung durch Hämatoporphyrin

Testansatz:
1 ml Phosphat-Puffer, pH 7.4, 100 mM (50 mM i.A.) ad 2 ml H₂O
100 ml Propolis
100 ml Crocinlösung (E440 = 1,0)
100 ml Hematoporphyrin, 100 mm (5 mM i.A.)
Die Inkubationszeit im Belichtungsbad beträgt 45 min.

Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 17 dargestellt.

9. Wirkung von Propolis auf durch Hämatopophyrin katalysierte Photoreaktionen

Hematoporphyrin (HP)-Derivate werden häufig als Aktivatoren in der photodynamischen Therapie verwendet (E.F. Elstner in: Der Sauerstoff: Biochemie, Biologie, Medizin (E.F. Elstner, ed.), BI-Wiss.-Verlag, Mannheim, Wien, Zürich (1990)). Analog zur Wirkung von Riboflavin ergeben sich die Produkte der Lichtaktivierung von HP aus verschiedenen Reaktionen, die die beiden photodynamischen Reaktionen vom Typ I und II umfassen. Die Fragmentierung von KMB durch HP ergibt nach einer Bestrahlungszeit von 45 min. ca. 2600 pMol Ethylen. Diese Reaktion wird, ähnlich wie bei Rose Bengal beobachtet, durch geringe Konzentrationen des ethanolischen Propolis-Extrakts (0.02 bis 1 Volumenprozent) stark stimuliert. Nur bei den höchsten Konzentrationen von 5 und 10 Volumenprozent wird eine inhibierende Wirkung beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen PWEB und PWEU stimulierende Wirkungen bei geringen Konzentrationen (zwischen 0.002 und 0.1 Volumenprozent) und bessere inhibitorische Wirkungen oberhalb von 0.2 Volumenprozent (vgl. Fig. 18).

Aus den vorstehenden Versuchen ergibt sich, daß das verschiedene Verhalten des ethanolischen Propolis-Extraktes in den Rose Bengal- und Hämatoporphyrin-Systemen im Vergleich zu den wässerigen Extrakten klar die Gegenwart von photoaktivierbaren Verbindungen in ESD anzeigen. Diese Substanzen treten mit den entsprechend Photoaktivatoren, RB bzw. HP in Wechselwirkung. Die verringerte Aktivität von ESD im Vergleich zu PWEB und PWEU zeigt in allen Systemen die Abwesenheit von Radikalfängern an.

Die Ergebnisse der Belichtungsversuche belegen somit, daß Propolis ("Bienenleim") eine Mischung von phenolischen Verbindungen enthält, die starke antioxidative Eigenschaften einschließlich des Quenchens von angeregten Zuständen besitzen, wodurch ihre gute Eignung für die Verwendung als Sonnenschutzmittel gegenüber UV-A- und UV-B-Strahlung resultiert.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Propolis bei einer nicht-topischen Applikation eine systemische Wirkung besitzt, und zwar insbesondere eine ausgeprägte systemische antiphlogistische und systemische Strahlen- und Lichtschutzwirkung zeigt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Propolis als Antiphlogistikum und Strahlen- und Lichtschutzmittel mit systemischer Wirkung.

Unter einem antiphlogistisch wirkenden Mittel wird erfindungsgemäß ein Antiphlogistikum im weitesten Sinne verstanden, also auch Antiarthritika, Antirheumatika, Analgetika und Antipyretika.

Unter einem Strahlen- bzw. Lichtschutzmittel wird erfindungsgemäß insbesondere ein Mittel verstanden, das Schutz gegenüber schädlichen Wirkungen von UV-A, UV-B, Röntgen- und radioaktiven Strahlen (ionisierenden Strahlen) bietet.

Insbesondere ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels auf den Schutz von Organgeweben gegen Entzündungen und/oder Strahlenschäden, wie sie insbesondere bei einer Krebsvorsorge, Krebstherapie und/oder Krebsnachsorge in den den Ort des Krebses umgebenden Organen und/oder Geweben entstehen können, gerichtet. Solche Schäden sollen mit der erfindungsgemäßen Verwendung vom Propolis als systemisch wirkendes Mittel vermieden oder doch weitgehend reduziert werden.

Es ist bekannt, daß ionisierende Strahlung, wie z. B. α- Strahlen, β-Strahlen, Neutronen- oder Photonenstrahlen und radioaktive Strahlen Gewebsschäden hervorrufen kann, vermutlich durch die Bildung von Sauerstoffradikalen, die die Peroxidation biologischer Membranen initiiert. Es wurde nun gefunden, daß die Anwendung von Propolis, insbesondere in Form eines wässerigen oder wässerig-alkoholischen Extraktes, wie er in den vorstehenden genannten Deutschen Patentanmeldungen P 43 20 315.9 und P 43 36 169.2 beschrieben wird, bei einer oralen Verabreichung vor oder nach einer Bestrahlung mit ionisierender Strahlung das Ausmaß der durch die Strahlung hervorgerufenen entzündlichen Erscheinungsformen wesentlich verringert.

Werden Versuchstiere z. B. einer Gamma-Strahlung ausgesetzt, so werden sie im Vergleich zu normalen, nicht Strahlen-belasteten Tieren gegenüber Entzündungen hervorrufenden Vorgängen sehr viel empfindlicher (vgl. El-Ghazaly et al., Brit. J. Pharmacol. 85 (1985) 45 bis 50). Es ist bekannt, daß sich eine solche gesteigerte Empfindlichkeit durch nichtsteroide antiinflammatorische Mittel (NSAID) wie z. B. Dichlofenac und Piroxicam, wirksam unterdrücken läßt; diese Mittel wirken durch Inhibierung des Cyclooxygenase-Enzyms und damit der Synthese von Prostaglandin (El-Ghazaly et al., Pharma. Res. Commun. 18 (1986) 563-580; Khayyal et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 298 (1989) 247-263). Es wurde jedoch gefunden, daß das übermäßige Ansprechen gegenüber Entzündungen nicht nur mit einer verstärkten Freisetzung von Prostaglandin (PGs) verbunden ist, sondern auch von Leukotrienen (vgl. Eisen und Walker, Brit. J. Pharmacol. 57 (1976) 527-530; Khayyal et al., 1989, l.c.). Außerdem ist es bekannt, daß Strahleneinwirkung aufgrund der Freisetzung von Sauerstoffradikalen schädliche Wirkungen auf das Gewebe zeigt (Gerschman et al. Science 119 (1954) 623- 626; Czapski, Annu. Rev. Phys. Chem. 22 (1971) 171-208; Krizala et al., Rad. Res. 91 (1982) 507 bis 515.

Es wurde nun gefunden, daß z. B. ein wässeriger Propolis- Extrakt, wie er in einer der vorstehend genannten Deutschen Patentanmeldungen 43 20 315.9 und 43 36 169.2 beschrieben wird, gute antiinflammatorische Eigenschaften besitzt, die mit einer starken Inhibierung von PGs und LTs verbunden sind.

In den folgenden Versuchen wurden die antiinflammatorische Eigenschaften von wässerigem Propolis-Extrakt zur Linderung oder Verhinderung einer überhöhten Empfindlichkeit gegenüber Entzündungen, die durch Gamma-Bestrahlung von Versuchstieren induziert wurde, untersucht.

1: Wirkung gegenüber Carrageen-Rattenpfoten-Ödem (1) Verwendete Tieren

Es wurden männliche Albinoratten mit einem Gewicht von 120 bis 130 g verwendet, die statistisch in Gruppen von je 8 Tieren unterteilt wurden. Sie erhielten Standarddiät und Wasser nach Belieben, und wurden 7 bis 10 Tage vor den Versuchen gehalten. Insgesamt wurden 13 Gruppen verwendet, d. h. 104 Ratten.

(2) Bestrahlung der Tiere

Die Bestrahlung der Tiere wurde unter Verwendung eines Gamma Cell 40 Biological Irradiator mit einer Caesium-137-Quelle (Atomic Energy of Canada Ltd.) durchgeführt.

Abhängig von der Art des Experimentes wurden die Tiere einer Bestrahlungsdosis von entweder 2 oder 6 Gy als akute Einzelbestrahlung, oder 6 Bestrahlungen pro Woche mit jeweils 1 Gy unterworfen; die Bestrahlungsdosis betrug 0.018 Gy/sec.

(3) A. Untersuchungen zur Wirkung von Proplis nach der Bestrahlung (i) Wirkung der niedrigen Strahlungsdosis

6 Gruppen von je 8 Ratten wurden mit einer Strahlendosis von 2 Gy bestrahlt. Die Tiere wurden gleichmäßig wie folgt unterteilt:

• (a) 3 "Kontroll"-Gruppen, die vor der Carrageen-Injektion 2 Stunden, 3 Tage oder 7 Tage nach der Bestrahlung nicht behandelt wurden;
• (b) 3 "behandelte"-Gruppen, die wässerigen Propolis-Extrakt oral in einer Dosis von 5 ml/kg 1 Stunde vor der Carrageen-Injektion und nach der Bestrahlung zu den gleichen Zeiten wie vorstehend unter (a) beschrieben erhielten.

Die Gruppen wurden mit einer Gruppe normaler nicht bestrahlter Tiere (n=8) verglichen, die bloß der Ausbildung des Carrageen- Ödems unterworfen wurden.

(ii) Wirkung einer hohen Strahlungsdosis

Es wurden 2 Gruppen von Ratten (jeweils 8 Tiere) mit einer Dosis von 6 Gy bestrahlt. Eine Gruppe wurde sofort nach der Bestrahlung oral mit wässerigem Propolis-Extrakt (5 ml/kg) behandelt, und dann eine Stunde später Carrageen injiziert. Die andere Gruppe erhielt kein Propolis und diente als Kontrollgruppe.

(B) Untersuchungen zur Wirkung von Propolis vor der Bestrahlung

Es wurde untersucht, ob die Verabreichung von Propolis vor der Bestrahlung eine schützende Wirkung gegen die schädlichen Strahlungswirkungen besitzt.

Als Propolis-Extrakt wurde ein wässeriges (13%) Extrakt bezogen von der Fa. Salomon, Kopenhagen, DK, verwendet.

(i) Prophylaktischer Wert gegenüber einer einzigen Bestrahlung mit hoher Dosis

Eine Gruppe von Ratten (8 Tiere) erhielt Propolis-Extrakt in einer Dosis von 5 ml/kg täglich während einer Woche vor der Einzelbestrahlung mit einer Dosis von 6 Gy. Die Bestrahlung wurde 1 Stunde nach der letzten Verabreichung vom Propolis durchgeführt und danach erfolgte sofort die Carrageen- Injektion.

Eine andere Gruppe von Ratten (8 Tiere) wurde als unbehandelte Kontrollgruppe verwendet, und der Carrageen-Injektion sofort nach der Bestrahlung mit 6 Gy unterworfen.

(ii) Prophylaktischer Wert gegenüber unterbrochener Bestrahlung

2 Gruppen von Ratten (je 8 Tiere) wurden mit einer Dosis von 1 Gy einmal pro Woche bis zu einer Gesamtbestrahlung mit 6 Gy bestrahlt. Eine Gruppe enthielt während dieses Zeitraums kein Propolis-Extrakt, während die andere Gruppe jeweils eine Stunde vor jeder Bestrahlung wässerigen Propolis-Extrakt oral in einer Dosis von 5 ml/kg enthielt. Nach der letzten Bestrahlung wurden die Tiere dem Carrageen-Rattenpfoten-Ödemtest unterworfen.

(C) Carrageen-Rattenpfoten-Ödemtest (Winter et al., Proc. Exp. Biol. Med. 111 (1962) 544

Carrageen (British Drug Houses) wurde unter die Fußsohle der rechten Hinterpfote der Ratte injiziert (0.05 ml einer 1%igen Suspension). Das Volumen der injizierten Pfote wurde sofort nach der Injektion (Vi), und dann 3 Stunden später (Vf) gemessen.

Das Ödem der Rattenpfote wurde als Prozent des ursprünglichen Pfotenvolumens gemäß der folgenden Formel berechnet:

II: Untersuchungen der Wirkung gegenüber Adjuvans-induzierter Arthritis (1) Verwendete Tiere

Es wurden männliche Albinoratten mit einem Gewicht von 120 bis 150 g verwendet. Sie erhielten eine Standard-Pelletnahrung und Wasser nach Belieben und wurden 1 bis 2 Wochen vor den Untersuchungen gehalten. Die Gesamtzahl an verwendeten Ratten betrug ca. 50.

(2) Bestrahlung der Tiere

Die Bestrahlung wurde wie vorstehend unter 1 beschrieben durchgeführt. In Experimenten, die die Behandlung mit Freundschem komplettem Adjuvans (FCA), wie nachfolgend beschrieben, umfaßte, wurde eine Strahlendosis von 2 Gy verwendet.

(3) (i) Auslösung von Adjuvans-Arthritis (Pearson, Arthritis Rheum. 7 (1964) 80)

In die rechte Hinterpfote der Ratten wurde ein einzige subkutane Injektion von 1 ml Freundschem komplettem Adjuvans (FCA) (Behringwerke AG, Narburg/Lahn, Deutschland) subkutan injiziert. Das Volumen der injizierten Pfote wurde sofort nach der Injektion (Vi) und am fünften Tag nach der Injektion (Vf) gemessen. Die akute Phase des Ödems wurde als Differenz zwischen Vf und Vi bemessen.

(ii) Prophylaktischer Wert von Propolis

Eine Gruppe von Tieren (n=8) wurde mit wässerigem Propolis- Extrakt in einer Dosis von 5 ml/kg oral täglich während einer Woche behandelt. Die Tiere wurden dann mit 2 Gy bestrahlt und dann sofort FCA injiziert. Die Behandlung mit Propolis wurde dann weitere 4 Tage lang durchgeführt, bevor die Tiere am 5. Tag getötet wurden. Wie vorstehend unter (i) beschrieben wurden Vi und Vf gemessen.

(iii) Wirkung von Propolis nach der Bestrahlung

Eine Gruppe von Tieren (n=8) wurden mit 2 Gy bestrahlt, und dann sofort mit FCA beimpft. Die Tiere wurden dann 4 Tage lang mit Propolis behandelt und am 5. Tag getötet. Es wurden wieder Vi und Vf gemessen.

(iv) Kontrolltiere

Es wurden 3 Gruppen von Tieren (jeweils 8) als verschiedene Kontrollen verwendet:

• (a) normale unbehandelte Kontrolle, die überhaupt keiner Behandlung unterworfen wurde.
• (b) mit FCA behandelte Tiere
• (c) mit 2 Gy bestrahlte und danach sofort mit FCA beimpfte Tiere.

Für alle Tiere dieser Gruppen wurden Vi und Vf gemessen.

III. Ergebnisse

Wie die nachfolgenden Tabelle 1 und 2 zeigen, wiesen die Ratten der Kontrollgruppe, die einer Gamma-Strahlung unterworfen wurden, eine wesentlich größere Empfindlichkeit gegenüber durch Carrageen induzierter Entzündung als normale nicht bestrahlte Tiere auf, wobei der Prozentsatz des Ödems bei nachfolgender akuter Bestrahlung mit 2 Gy um nahezu 50% erhöht wurde, und um nahezu 100% nach Bestrahlung mit 6 Gy. Ähnliche Effekte wurden in der akuten Phase der Adjuvans-induzierten Arthritis (AIA) nach Bestrahlung mit 2 Gy gefunden; unter dem Einfluß von FCA erhöhte sich der Grad des Ödems bei den bestrahlten Tieren um das Doppelte (Tabelle 4).

Im Carrageen-Modell verringerte die Behandlung der Tiere mit wässerigem Propolis-Extrakt (APE) 2 Stunden nach Bestrahlung mit 2 Gy die Entzündung um 73% (Tabelle 1). Wenn der Extrakt jedoch nach der Bestrahlung verabreicht wurde, d. h. 3 oder 7 Tage danach, fiel die Wirkung auf ca. 55% ab. Trotzdem wurde das Carrageen-Ödem allmählich normalisiert, d. h. der Grad (%) an Ödem fiel allmählich auf den Grad ab, den die Kontrollgruppe nicht bestrahlter Tiere zeigte.

Die Ergebnisse waren denen des AIA-Modells (Tabelle 4) sehr ähnlich, wobei der Ödemgrad (%) nach Behandlung mit APE auf 51% abfiel.

Die Tiere, die der hohen Strahlendosis von 6 Gy unterworfen wurden und sofort danach mit APE 1 Stunde vor Injektion mit Carrageen behandelt wurden, zeigte ebenfalls eine beträchtliche Verringerung des Pfotenödems um 64% (Tabelle 2). Die gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber Entzündungen bei dieser hohen Strahlungsdosis war in der gleichen Größenordnung, unabhängig davon, ob diese Strahlendosis als Einzelbestrahlung (Tabelle 2) oder als unterbrochene Bestrahlung (Tabelle 3) verabreicht wurde.

APE zeigte, prophylaktisch vor der Bestrahlung verabreicht, eine starke unterdrückende Wirkung der überhöhten Empfindlichkeit gegenüber strahlungsinduzierter Entzündung, und zwar sowohl in den Carrageen-induzierten als auch in den AIA induzierten Modellversuchen.

Im Carrageen-Modellversuch inhibierte die Verabreichung von APE vor der Bestrahlung mit 6 Gy (entweder als Einzelbestrahlung oder als unterbrochene Bestrahlung) die gesteigerte Empfindlichkeit um über 80% (vgl. Tabellen 2 und 3).

Im AIA-Modell verringerte die Verabreichung von APE eine Woche vor der Bestrahlung und Beimpfung mit FCA das Ödem auf ca. 25% des Ödems, das Tiere zeigten, die kein APE enthielten. Die Schutzwirkung von APE wurde außerdem durch die Tatsache bestätigt, daß das Ausmaß des Ödems nur die Hälfte des Ödems betrug, das bei normalen nicht bestrahlten Tieren, die nur mit FCA behandelt wurden, festgestellt wurde (Tabelle 4).

Eine parallel zu den Versuchen mit Adjuvans-induzierter Arthritis durchgeführte Untersuchung einiger biochemischer Parameter (Plasma-Maleinsäureanhydrid (MDA) -Konzentration; Superoxid-Dismutase (SOD)-Aktivität im Gesamtblut; Säurephosphatase (APE)-Aktivität im Serum und Gesamtplasmaproteingehalt) ergab die folgenden Ergebnisse: die Beimpfung normaler Tiere mit FCA ergab eine deutliche Erhöhung in MDA und SOD (um nahezu das zweifache), sowie an AP-Aktivität (nahezu dreifach), beeinflußte aber nicht den Grad an Gesamtproteinen (Tabelle 5).

Eine Bestrahlung der Tiere vor der Beimpfung mit FCA zeigte ein noch stärkere Wirkung auf die MDA-Konzentration und SOD- Aktivität, die nahezu um das dreifache der normalen Werte stiegen. Die AP-Aktivität und die Gesamtproteine waren nicht wesentlich verschieden von denen, die bei nicht bestrahlten, mit FCA-behandelten Tieren auftraten.

Die Verabreichung von Propolis (APE) zeigte eine deutliche Schutzwirkung gegenüber die Veränderung in der MDA- Konzentration und in der AP-Aktivität, insbesondere, wenn das APE bereits eine Woche vor der Bestrahlung verabreicht wurde. Die SOD-Aktivität war jedoch um mindestens 400% erhöht (Tabelle 5).

Tabelle 1

Wirkung von oral verabreichten wässerigen Propolis- Extrakten (5 ml/kg) auf Ratten zu verschiedenen Zeiten nach Bestrahlung mit 2 Gy

Die Ergebnisse sind als Mittelwert von 8 Tieren ± Standardabweichung angegeben

Tabelle 2

Wirkung von wässerigem Propolis-Extrakt auf Carrageen-induziertes Ödem in mit 6 Gy bestrahlten Ratten

Tabelle 3

Wirkung von wässerigem Propolis-Extrakt auf das Carrageen-induzierte Pfotenödem bei Ratten, die einer unterbrochenen Gamma-Bestrahlung (1 Gy/Woche während 6 Wochen) unterworfen wurden

Tabelle 4

Wirkung von wässerigem Propolis-Extrakt auf Adjuvans-induzierte Arthritis in bestrahlten Ratten (2 Gy)

Tabelle 5

Wirkung von wässerigem Propolis-Extrakt auf verschiedene biochemische Parameter bei der Adjuvans­ induzierten Arthritis bestrahlter Ratten (2 Gy)

Die Ergebnisse sind als Mittelwert von 6 Tieren ± Standardabweichung angegeben

Die vorstehenden Versuche und deren Ergebnisse zeigen, daß Propolis bei nicht-topischer Verabreichung sehr gute Wirkungen, insbesondere entzündungshemmende und Strahlenschutzwirkungen, zeigt.

Propolis eignet sich deshalb sehr gut bei der Verwendung zur Vorbeugung oder Behandlung von Entzündungen, insbesondere im Zusammenhang mit einer Bestrahlung. Im Zusammenhang mit einer Bestrahlung kommt Propolis deshalb insbesondere auch eine hohe Bedeutung bei der Krebsvorsorge, Krebstherapie und Krebsnachsorge in Verbindung mit einer Strahlentherapie zu; durch die Verabreichung von Propolis ist es möglich, das den eigentlichen Krebsort umgebende gesunde Gewebe weitgehend vor Strahlenschäden zu schützen.

Im weitern hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße Verabreichung von Propolis, insbesondere einem wäßrigen Propolis-Extrakt, gegebenenfalls auch in Kombination mit Casein systemisch zu einer bakteriziden Wirkung führt. Aus diesem Grunde ist die nicht-topische Anwendung von Propolis bzw. der Kombination von Propolis und Casein geeignet, um bakterielle Entzündungen zu kurieren bzw. diesen vorzubeugen.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von Propolis als Antiphlogistikum und/oder Strahlenschutzmittel durch nicht-topische Applikation.

Bevorzugte Ausführungsformen davon sind Gegenstand der Ansprüche 2 und 3.

Weiterer Gegenstand ist die Verwendung von Propolis zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Entzündungen und/oder Strahlenschäden durch nicht-topische Applikation.

Bevorzugte Ausführungsformen hiervon sind Gegenstand der Ansprüche 5 bis 7.

Die Verabreichungsform, Art und Menge der Verabreichung der Propolis enthaltenden Mittel richtet sich insbesondere nach der beabsichtigten Verwendung (Verabreichung als vorbeugende Maßnahme, z. B. zum Schutz vor Strahlenschäden, oder Verwendung als therapeutische Maßnahme), aber auch nach der Art und Schwere der Erkrankung und dem Allgemeinbefinden des Patienten.

Vorzugsweise wird ein Propolis-enthaltendes Mittel verwendet, wie es vorstehend im Zusammenhang mit den Deutschen Patentanmeldungen 43 29 315.9 und 43 36 169.2 beschrieben wird, wobei sich die Wahl der geeigneten Darreichungsform (z. B. als wässeriges oder alkoholisch-wässeriges Extrakt, oder als Wasser-in-Öl-Suspension usw.) insbesondere nach der beabsichtigten Applikation, z. B. oral, als Injektion, intraperitoneal usw., richtet. Besonders bevorzugt wird eine orale Verabreichung in Form eines alkoholisch-wässerigen und in erster Linie eines wässerigen Propolis-Extraktes.

Daneben ist aber auch eine Verabreichung in festen Zubereitungsformen, z. B. als Tabletten, Dragees, Kapseln, Zäpfchen usw. möglich, deren Herstellung auf an sich üblichem Weg unter Verwendung von derartige Darreichungsformen üblicher Träger und/oder Verdünnungsmittel erfolgen kann.

Als feste Darreichungsformen kann z. B. ein Lyophilisat eines Propolis-Extraktes verwendet werden, vorzugsweise zusammen mit geeigneten pharmazeutischen Trägern.

In einigen Fällen kann es auch zweckmäßig sein, Propolis zusammen mit Casein zu verwenden, z. B., wie in der Deutschen Patentanmeldung P 43 20 315.9 beschrieben, als Casein enthaltenden Propolis-Extrakt.

Bei Mitverwendung von Casein beträgt die Caseingehalt vzw. 0.5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das gesamte Mittel, z. B. den wässerigen Propolis-Extrakt.

Das Mittel kann ggf. auch noch weitere mit Propolis kompatible, Wirkstoffe, insbes. Antiphlogisitika und/oder Strahlenschutzmittel, enthalten.

Die zu verabreichende Dosierung richtet sich insbesondere nach der beabsichtigten Verwendung (vorbeugend oder therapeutisch), der Art und Schwere der Erkrankung und dem Allgemeinbefinden des Patienten, aber auch nach der Art der Verabreichung (oral, als Injektion, als Infusion usw.). Die Dosierung beträgt in der Regel 1 bis 20 ml/kg Körpergewicht/Tag, bezogen auf einen standardisierten 10%­ igen wässerigen Propolis-Extrakt); diese Dosis, die auch geringer oder größer als die angegebene Dosierung sein kann, kann auch in mehreren Einzeldosen über den Tag verteilt verabreicht werden; die genaue Dosierung und Verabreichungsart ist dabei, abhängig von der Art und Schwere der Erkrankung, dem Zustand des Patienten und der Applikationsart im Einzelfall vom Arzt festzulegen.

Claims (9)

1. Verwendung von Propolis als Antiphlogistikum und/oder Strahlenschutzmittel durch nicht-topische Applikation.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen wäßrigen oder alkoholisch-wäßrigen Propolis- Extrakt verwendet.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein wäßriger, unbehandelter Rohextrakt (PEE-40- Extrakt), ein wäßriger, unbehandelter, partikelhaltiger Rohextrakt (PWEU-13-Extrakt) oder ein wäßriger, behandelter und partikelfreier Extrakt (PWEB-13-Extrakt) verwendet wird.

4. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zu Propolis Casein verwendet.

5. Verwendung von Propolis zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Entzündungen und/oder Strahlenschäden durch nicht­ topische Applikation.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel ein wäßriger oder alkoholisch- wäßriger Proplis-Extrakt ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein wäßriger, unbehandelter Rohextrakt (PEE-40- Extrakt), ein wäßriger, unbehandelter, partikelhaltiger Rohextrakt (PWEU-13-Extrakt) oder ein wäßriger, behandelter und partikelfreier Extrakt (PWEB-13-Extrakt) eingesetzt wird.

8. Verwendung nach Anspruch 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel zusätzlich zu Propolis Casein enthält.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel das Casein in einer Menge von 0,5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das gesamte Mittel enthält.