DE1907732A1

DE1907732A1 - Geschichtete Folie zum Auswerten von Diffusions-Vorgaengen

Info

Publication number: DE1907732A1
Application number: DE19691907732
Authority: DE
Inventors: Paine Richard Alton; Dwyer James Lawrence; Souza Charles William
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1968-03-25
Filing date: 1969-02-15
Publication date: 1969-10-09
Also published as: GB1254933A; DE1907732B2; FR2004626A1; US3553067A

Description

OR.-INQ, DIPL.-INQ. M. SC. DIPL.'PHVS. DR. DfPL.-PHVS.

HÖGER - STELLRECHT - G Rl ESSBACH - HAECKER

PATENTANWiLTE IN STUTTGART

A 37 0T5 m

4.Februar 1969

ly-35 -

Mil lip ο re Corρ ora ti on Bed f ο r d, Ma s s a ehu s e 11. s

G-esehiciitete IOIi e zum Auswerten νοϊϊ D iff us ions ■

Vorgängen,

Die Erfindung betrifft eine geschichtete Folie zum Auswerten von DiffusIonsvorgängeTL oder Diffusions-Reaktionen,

Für elektrophoretische Analysen sind zahlreiche Arten pö~ - röser Folien vervrendet worden,: wie z,B, Fapier und mikroporöse Kunststoffolien,: die ::so dünn und flexibel sind, daß sie einen Träger brauchen. Diese Folien machen Schwierig- ' fceiten beim Gebrauch und sie sind nicht stabil genug., um .Aufzeichnungen herzustellen und aufzubewahren. Für Tmmuno-Verfahren wurden verschiedene (reis verwendet, die auf Glas»

BAD ORfGINAt

A 37 015 m - 2 -

4.Februar 1969 ■ " ■ ""

platten o.dgl, aufgebracht -waren. Eine Wanderung und Diffusion kann z._;, B.., In Stärke, G¹SIs₁, Ägär-Λ Gels und Aerylamld—Gels erfolgen, Fachteilig feei der Verwendung dieser Materialien"ist, daß sie sehr sorgfältig Vorbereitet werden müssen, dass das Trocknen des G-els vermiieden . werden muß, ferner die langsame Diffusion und die·Bildimg von Präzlpitin-lögeni außerdem Ipt das Auswaschen ,des:; aalciht reagierten Materials mit Schwierigkeiten verbunden ixnä, es _: ; treteiT 7er färbung en und ■ Fleekenbildung auf, .-■'■".: .

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine geschichtete Polie zn schaffen, die nicht mit den iHacht.eil.en der bekannten Folie behaftet ist. ..

Erfindungsgemäß wird dies erreicht durch; eine Gründfölle ' aus Kunststoff, die flexibel, aber steif genug ist, Äaß sie selbsttragend ist, eine mikroporöse Kunst st© ff membran, die eine Fielzahl kleiner Poren aufweist_vJund;die mit einer . Seite der Grrundfolie verbunden ist, ferner durch eine .sehr dünne, flexible Folie, die mit der anderen Seite, der .Membran verbunden ist, wobei die flexible Folie wenigstens eine Öffnung aufweist, durch welche die Membran freigelegt, 1st. ... Die Membran besteht zweckmäßigerweise, weitgehend, aus .Poren;, die an der Außenfläche-geöffnet sind., um eine elektrolythi—._v ache Lösung und das durch Elektrophorese zu-analysierende Material aufzunehmen.

Bei den bisher für Immun-Elektrophore3e; verwendeten feeten ZweikompQnenten--Fqlien wurde eine perforierte .oder ijchlxtzte Modell-Folie, d.h. eine Schablone auf'dia Kunststoffmembran gepreßt, .um eine Struktur für die ; auswertung zu schaff en. Dies erfordert eine sorgfältig β teilte gleichmaßige Drucker teilung, um eine Beschädigung dor porösen. Kunststoffmembran zu verhinderit und um

- 3—

BAD ORIQINAt

A 37 015 m ■■■- 3 -

ly-35 ■ "

forderte Gleichmäßigkeit der Diffusion zu erreichen. Eine durch die Praxis gegebene Beschränkung liegt darin, daß das Schichtraaterial nicht vorbereitet und für sofortigen Gebrauch trocken aufbewahrt werden kann, wenn Versuche durchzuführen sind. ·

Die erfindungsgemäße geschichtete Folie ist dagegen kräftig und dauerhaft ausgeführt. Sie kann im voraus, hergestellt, gelagert und transportiert werden,· und zwar für spätere Verwendung und sie hat außerdem technische Vorteile, auf die später noch eingegangen wird. ■'..."

Mit der erfindungsgemäßen Folie können verschiedene Diffusionsarbeiten leistungsfähig durchgeführt werden, wie z.B. ■ Immun-Diffusion, Elektrophorese, Immun-Elektrophorese und. die Analyse von Serum.

Die poröse Kunststoffmembran liegt bei der erfindungsgemäßen Folie zwischen der Grundfolie und der dünnen flexiblen Folie. Die dünne flexible Folie hat eines oder mehr Löcher oder Schlitze, um die zu untersuchend en^v Chemikalien auf die poröse Kunststoffolie aufzubringen. Die Verbindung der Folien miteinander wird durch einen thermoplastischen Klebstoff erreicht, ohne den Kapillartransport der Flüssigkeiten in den Poren zu beeinträchtigen.

Die Grundfolie oder Txägerfolie besteht vorzugsweise aus einer klaren, steifen, aber flexiblen Kunststoffolie, die die notwendige chemische Stabilität aufweist, d.h. sie ist inert gegenüber den zu untersuchenden Chemikalien und sie ist gut mit der porösen Kunststoffmembran verbindbar. Die Poren der porösen Membran sollten so liegen, daß die Verbindung mit der Trägerfolie und der dünnen Kunststoffolie bewerkstelligt werden kann, ohne die Poren zu beeinträchtigen,

;■■■.■.: ■".-..;■- 4 -^:

841/ 12 90

A 37 015 m ■ . - 4 -

4.Februar 1969

wobei diese solche Oberflächeneigenschaften haben sollten, .daß sie eine Diffusion eines fließfähigen Mediums und auch eine elektrophoretische Bewegung ermöglichen. .

Die aiitme, flexible Kunststoffolie wird vor der Verbindung mit den anderen Folien geschlitzt öder in geeigneter Weise mit Löchern versehen und sie hat eine sehr wichtige Funktion, Sie beschränkt die Diffusion der Flüssigkeiten, die auf die poröse Kunststoffmembran durch die Öffnungen innerhalb der Poren der Kunststoffmembran aufgegeben werden, und sie verhindert, was sehr wichtig ist, das Eintrο denen der Flüssigkeiten und sie kann entfernt werden, um nicht reagierte Chemikalien herauszuwaschen, so daß die nicht löslichen reagierten Chemikalien untersucht werden können. Die Kunst-. stoffolie ist ausreichend dünn* daß sie von" der Membran in einem so scharfen Winkel abgezogen bzw. abgeschält werden kann, daß der Radius des Bogens an der Abziehkante so klein ist, daß die Trennung effektiv längs einer Linie erfolgt, äo daß die dünne Folie abgezogen werden kann, ohne"daß eine merkliche Menge des Materials der porösen Kunststoffmemhran daran haftet.

Die erfindungsgemäße geschichtete Folie kann für verschiedene elektrophoretische Vorrichtungen verwendet werden. In der Praxis der Immun-Diffusion wird eine Probe des Serums des Patienten auf eine poröse Matrix, wie z.B. die poröse Kunststoffmembran aufgebracht oder auf ein Gel, wie z.B. ein Stärke-Gel oder ein Agar-Gel. nahebei wird eine Probe eines Pferde-Antiserums aufgebracht, das in bekannter:. Weise hergestellt worden ist. Diese Stoffe können dann in einer feuchten Umgebung eine geeignete Zeit lang inkubieren. Das Serum des Patienten und das Antiserum des Pferdes beginnen von den Punkten, an denen sie aufgebracht worden?

^: . - 5 - ■■■■':■ ■

A 37 015 m - 5 -

4. Februar t969t

sind, wegzudiffundieren.. Hierbei diffundieren das menschliche Serum und: das Pf erde-Antiserum durcheinander hindurch. An den Stellen, art denen dies^ erfolgt, werden Antikörper-Aus*- . fällungen gebildet* Wenn, das Präparat ram gespült wird, um, das nicht reagierte Serum, und Antiserum zu entfernen, und wenn es dann mit einer · ... .Protein-

Farbe ' ..--λ"--, gefärbt wird:,.. wird die Antigen-Antikörper-Ausfällung als deutliche Linie oder als eine Anzahl von Linien_sichtbar, die av/ischen den beiden Punkten liegen, an denen die Proben aufgebracht wurden. Das Vorhandensein dieser Linien zeigt dem Immunologen an, dass tatsächlich Fraktionen des Serums, die auf das Pferde-Anbiserum ansprechen, in dem Serum des Patienten vorhanden sind.

Bei der Untersuchung einer Probe des Serums des Patienten kann man entsprechend de_n verschiedenen Stärken'eines bekannten Antiserums quantitativ die Menge eines speziellen in einer Probe vorhandenen Stoffes angeben. Es gibt eine große Anzahl von verschiedenen Techniken und Methoden bei der Immundiffusion, und bei der Interpretation der Ergeb- . nisse, die sich jedoch alle auf den oben beschriebenen fundamentalen Mechanismus stützen. Wenn in einem Tier ein Antiserum erzeugt wird, sollte es Antikörper von jeder Fraktion erhalten, die in dem menEhlichen Serum enthalten waren, das dem Tier eingespritzt wurde. Mit Hilfö der Elektrophorese kann man merectiliches Serum höchstens in sechs oder sieben Bestandteile fraktionieren. Jeder der Bestandteile oder Fraktionen, die durch Elektrophorese erzeugt wurden, kann jedoch eine Anzahl spezifischer Strukturen enthalten^ die dieselbe elektroptioretische. Beweglichkeit haben können. Bei Verwendung der Bmnuno-Elektrophorese kann man zeigen, daß Ti el mehr, einzelne Praktrionen innerhalb ä^e^ sechs oder- sieben durch die Elektrophorese entwickelten, Hauptfraktionen^vorhanden sind.

■-·■.." . ■■ ■■"- 6■'■-

BAD ORIGINAL

A 37 Q-T5 m- . ■ *■ ' - β -

Bei des InimUn-Elektrophoresewird folgendermaßeii; vorgegangen: . - - - ^; · ^;" "■"---■-_ ■: ■·_"- .- . "■"-. .. . "-"."

Auf ein elektrophoretisehes Material oder Mittel wird ein Serum punktförmig aufgetragen und die Komponenten elelctro-' phoretisch getrennt. Nach der Elektrophorese wird nan.e Bei '.; dem fraktionierten Serum ein Band aus Antiserum auf ge— /> bracht. Das Band stellt eine gerade linie dar,- die parai-*- IeI zu der Richtung der elektrophoretiscnen Wanderung verläuft. Die Komponenten des Serums und des Äntiserums können, dann aufeinanderzu wandern* Der spezifische Antikörper in dem Antiserum fällt mit jedem der Serümkomponente.n- a.us> die auf ihn zu diffundieren* Das Ergebnis isfc eine Anzanl von Präzipitin-Bögen, , d.h.. Ausfällungsbögen, die zwiscliendem ursprünglichen Punkt, an dem das Serum, aufgebracht worden ist und der Linie des Äntiserums liegen. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein irgendwelcher spezifischer Präzipitin-Bögen . zeigt das Vorhandensein oder Ui/cirfcVorhandensein der entsprechenden Praktion im Serum des'Patienten: an. Durch Ausbreiten der Serumkomponenten längs der Achse _. der elektrophoretischen Wanderung können die verschiedenen Komponenten getrennt werden, wodurch nach einem einzigen. Versuch eine ganze Anzahl von Bögen individuell sichtbar, wird, Bei der Immun-Diffusion neigen ,diese Bögen dazu^. daß einer auf der Spitze oder dem Scheitel des anderen_; liegt, ,. da Serum und Antiserum von Punktquellen ausgehen. Die Iinmuno-Elektrophorese führt daher zu besseren Informationen als die einfacheünmuno-Diffusion.-V-. -V

Bei-beiden Methoden wird ein Träger benötigt, der . T* gegenüber dem Serunt und dem Antiserum passiv

2. der eine freie und gleichmäßige Diffusionsi-: Wanderung sämtlicher Komponenten erlaubt!

90984 1/ 1 2 9 0

BAD ORIGINAL

A 37 015 m -7 - '

iy-35 ■··■-■.■

• · ,-■ ■ ,3. aus dem nicht reagierte Komponenten ausgewaschen werden können;

4. und der in irgendeiner Weise gefärbt werden kann, "so daß die Präzipitin-Bögen sichtbar werden.

Unabhängig davon, was für ein Trägermaterial verwendet wird,' muß jegliche Verdampfung von Flüssigkeit während der Diffusion vermieden werden. Wenn Wasser aus dem Substrat herausverdampft, insbesondere bei einem ungleichförmigen Verlauf (was unvermeidbar der PaH sein wird), entsteht eine Strömung der Restflüssigkeit in dem Material, da die Flüs- ™ sigkeit die neigung hat, sich selbst gleichmäßig in der Matrix zu verteilen. Diese Strömung würde den Diffusionsweg der Komponenten verzerren, wodurch die entstehenden Präzipitln-Iiinien entweder ernsthaft verformt oder sogar ausgelöscht werden. Die Inkubation wird daher gegenwärtig in Kammern mit gesättigter Feuchtigkeit durchgeführt. Bei einer Methode wird sogar die nasse, poröse Kunststoffmembran nach der Elektrophorese und nach dem Aufbringen des Anti-" • serums in ein Ölbad eingetaucht. Das Öl verhindert die Verdampfung der Flüssigkeit.. Hierbei muß jedoch große Sorgfalt aufgewendet werden, daß die Membran in einer derartigen Vorrichtung absolut eben liegt. Außerdem ist dieses Verfahren ziemlich schmutzig. -

4 -v- ■ _

Beispielsweise Ausführungsformen der Erfindung« werden nachfolgend anhand der Zeichnung erläutert, in der

Fig. 1 eine Draufsicht auf eine geschichtete erfindungsgemäße Folie zeigt, die in Streifenform ausgebildet und gebrauchsfertig ist.

: '■-■·■ - 8 ■ -

A 37 015 m ' - 8 -

ly-35 """ . · .

Pig* 2 ist ein vergrößerter Schnitt längs der Linie .2-2 von Tig. I.

Fig. 3 ist ein vergrößerter; Schnitt von— Fig. 1 und zeigt die obere dünne flexible Folie in teilweise abgezogenem Zustand.

Die i.n der Zeichnung dargestellte geschichtete . erfindungsgemäße Folie besteht aus einer klaren Kunststofffolie B, einer mikroporösen/stoffmembran 2, die durch ein thermoplastisches Klebmittel 3 mit der Folie 1 verbunden ist, und aus einer dünnen Kunststoffolie 4, die durch ein thermoplastisches Klebmittel 5 mit der Membran 2 verbunden ist. Aus Gründen der Darstellung ist der Schnitt stark vergrößert und die Poren sind ·unverhältnismäßig stark vergrößert worden. .

Die geschichtete Folie wird vorzugsweise wie folgt stellt: Die Trägerfolie ist ein Kunststoffmaterial, das die notwendigen physikalischen und chemischen Eigenschaften besitzt. Sie ist vorzugsweise klar und steif und doch elastisch, so daß, wenn sie zur Elektrophorese .verwendet wird, sie die gebogene Stellung beibehält, wobei ihre Dicke im Bereich von etwa 0,15 bis etwa- 0,3 mm (6 bis 12 mil), vorzugsweise bei etwa 0,25 mm (10 mil) liegt. Sie sollte unter den Bedingungen ihrer Verwendung ein elektrischer Nichtleiter sein. -..'.■'-.

Chemisch gesehen, sollte die Trägerfolie durch die in dem Behälter verwendete Pufferlösung nicht beeinflußt werden. Zahlreiche Kunststoffmaterialien erfüllen die obigen Forderungen, z.B. Polyester (Mylar 1000 D, ein Produkt von Dupont), das besonders geeignet ist, ferner Polyamide

oder Polykarbonate. ,

SQ9841/1290

A 57 015 m - 9 -

4. Februar 1969 Ί

ly-35 t

Die mikroporöse Kunststoffmembran 2 kann aus einem Gemisch aus Zellulosenitrat und Zelluloseacetat oder vollständig aus Zelluloseacetat hergestellt sein,, und zwar gemäß der USA-Patentschrift 1 421 341 oder der USA-Patentschrift 2 944- 017,

Vorzugsweise wird die Folie aus Zelluloseacetat hergestellt. Eine .leistungsfähige Folie ist etwa 0,125 mm dick (5 Mil), während die durchschnittliche Porengröße im Bereich you . 0,5 bis etwa 1,5/L· liegt. Bei der Elektrophorese transportiert die Folie die Pufferlösung durch die Kapillarwirkung und ermöglicht den elektrophoretischen Transport.

Das Klebemittel 3 muß ebenfalls; bestimmte Bedingungen erfüllen. Es ist vorzugsweise ein thermoplastisches Material, vorzugsweise ein solches, das keinen Katalysator und kein Härtemittel erfordert und dessen Siegelungstemperatur unter der Terforraungs temp eratur der porösen Kunststoffmembran 2 liegt. Ein Material der Firma DuBont das als modifizierter, synthetischer Grummiklebstoff bekannt ist (DuPort 5601 6) hat sich als sehr geeignet erwiesen»

Die.Dicke, des fertigen trockenen Klebstoffüberzugs auf der Trägerfolie sollte innerhalb enger Grenzen liegen, Die optimale Dicke liegt im Bereich von 0,006 bis 0,009 mm (0,25 Ms 0,35 Mil). Wenn weniger als etwa. 0,006 mm auf die Trägerfolie aufgebracht werden, reicht diese Menge nicht aus, um die poröse Membran anzukleben» Wenn mehr als etwa 0,012 mm (0,5 liil) aufgebracht werden_y wird · ein Teil des Klebstoffes, yt&xm. er erwärmt wird, um die beiden Folien zu verbinden, in den Poren absorbiert, wodurch die Diffusionseigenschaften beeinflußt werden»

10

BAD ORIGINAL

A 37 015 m , - 10 -

Die Folie 4 ist vorzugsweise eine klare, nicM poröse,, undurchlässige Kunststoffolie, ζ,Β, aus Polyester, und ,sie .. ist vorzugsweise etwa 0,05 mm dick (0,002 Zoll) und sie ist. mit der Membran 2, "wie oben beschrieben durch einen thermo-; plastischen Klebstoff 5 verbunden, Ypr dem Verbinden werden löcher 6 oder Schlitze 7 oder Öffnungen anderer geometrischer Form in der Folie ausgeschnitten, so daß die auszuwertenden Stoffe direkt auf die frei liegenden Teile, der Folie 10 aufgebracht werden können, ----'.'

Bei der Herstellung der geschichteten Folie wird Vorzugs- ' weise eine Trägerfolie 1 unbegrenzter Länge mit einem Klebstoff 3 überzogen unter Verwendung beispielsweise eines Abstreichmessers, wobei die Dicke etwa 0,009 mm (0,35 Mil), beträgt, worauf die überzogene Fläche in.Berührung mit einer sich bewegenden, ebenfalls endlosen· porösen Membran 2 ge- - ■ bracht wird. Die dünne,'endlose Kunststoffolie 4 wird ebenfalls mit einem Klebstoff mit einer Dicke von etwa 0,009 mm (0,35 Mil) überzogen und in Berührung mit der gegenüberliegenden Seite der Membran 2 gebracht. Die beschichtete Fo- - -"^: lie wird über ein endloses Metallband und zwisehen dem Band und einer erwärmten Druckwalze hindurchgeführt, in

welcher sie auf etwa 121° C (250° F) für eine Zeit von

2 etwa 1,5 Min. und bei einem Druck von .etwa 4,2 kg/cm (60; psig) erwärmt wird» Hierdurch werden die drei Folien -. ohne Verstopfungen und ohne die Poren zu beeinträchtigen miteinander verbunden,

Das Aufsehichten der undurchlässigen Folie 1 und der Folie 4 auf beide Flächen der mikroporösen Membran 2 dient dazu, den Durchgang von Flüssigkeit zu oder von diesen Flächen zn sperren. Die Flüssigkeit kann jedoch frei durch die poröse Struktur der Membran 2. zwischen, den .. Schicht flächen hindurebaif fundier en, Durch die Öffnungen:

■ - ti ~

■0.098,4-1/1-2 SO

BAD ORIGINAL

in der oberen dünnen Folie können die Flüssigkeiten eingeführt werden, um eine gesteuerte Wanderung zu erreichen, wie z.B. eine Diffusion, eine Chromatographie oder- eine ". Elektrophorese. Die obere Deckschicht verhindert sicher die Verdampfung irgendwelcher Komponenten aus der mikroporösen Membran 2 an irgendeinem Punkt an den Öffnungen in der oberen Folie 4.

Die Verwendung dieser geschichteten Folie in geeigneten Streifenabmessungen wird anhand der Immuno-Elektrophorese erläutert. Die obere flexible Folie 4 ist-etwas kürzer als die Gesamtlänge des geschichteten Streifens, wie in Fig.1 gezeigt, so daß jedes Ende der porösen Membran 2 für den Anschluß an Elektroden frei liegt, die für die elektrophoretische Wanderung notwendig sind. Wenn ein derartiger Streifen in einer Einrichtung, wie derjenigen der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, werden die Enden in eine Pufferlösung eingetaucht und in Kontakt mit den Elektroden gebracht. Der Streifen kann zuerst auch in einer flachen Wanne oder einer Pufferlösung auf den Rand gestellt werden. Da die mikroporöse Membran an den Rändern des Streifens frei liegt,-gag^gagu,/zwischen den beiden undurchlässigen Folien zu bewegen oder durch Chromatographie zu trennen. Wenn der Streifen vollständig von der Pufferlösung durchdrungen ist, wird ein Mikroliter des Serums durch das Loch 6 in der Folie 4 auf das Zelluloseacetat aufgebracht. Der Streifen wird in eine Elektrophorese-Zelle gebracht und es wird an seine Enden eine Spannung angelegt. Das;Serum läuft zwischen den beiden undurchlässigen Folien während der Wanderung, und zwar in einer Richtung parallel zur Längsabmessung des Streifens. Das Serum wird so lange elektrophoretisch behandelt bis eine geeignete Trennung erreicht worden ist,

- 12 -

909841/1230

A 37 015 m " - 12 - ^::: .

Nachdem die Elektrophorese eine geeignete Zeitdauer durch-■ geführt worden ist, wird der Streifen aus der Zelle herausgenommen. Eine geeignete Menge eines Antiserums _: wird gleichmäßig in jeden der langen Schlitze 7 eingege- -".-.bett· Die optimale Menge, die in jeden der Schlitze einge-■ geben wird, beträgt bei den meisten handelsüblichen Anti—

seren etwa 40 Mikroliter. Diese Menge variiert natürlich " ' mit der Stärke des Antiserums, der Menge des in die .Mit- :;

telöffnung 6 eingegebenen Serums und anderen Besonderheiten der Trennung. Es. wurde festgestellt, daß durch Einbringen des Antiserums in die Schlitze oder Wannen mit

P. . Hilfe einer hypodermischen Spritze eine ausreichend ' gleichmäßige Konzentration des Antiserums längs der . Schlitze erreichbar ist, Hachdem das Antiserum in dieser Weise aufgebracht worden ist, wird der Streifen sofort in eine Kammer, deren Luft mit Feuchtigkeit gesättigt . ist, gebracht, um eine Verdampfung an den frei liegenden *\ Flächen der Membran 2 zu verhindern. Die" Diffusion der Serumkomponenten und der Antiserumkomponenten aufeinander— zu beginnt und sie wird für eine geeignete Zeitspanne* im allgemeinen etwa 24 bis 48 Stunden, fortgesetzt· Während dieser Zeit beginnen, sich Präzipitin-Bögen oder Ausfällungs-Bögen 8 zu bilden, und zwar dort wo Komponenten des Serums und des Antiserums miteinander reagieren. Da . das Serum und das Antiserum relativ farblos sind, sind diese Präzipitin-Bögen durch die durchsichtige obere Folie 4 hindurch nicht sichtbar.

Am Ende der Diffusionsperiode wird der Streif en aus der Inkubationskammer herausgenommen. Mit einem scharf en -\ : Gegenstand wird eine Ecke der Folie 4 angehoben, so daß man dieses Stück mit den Fingern erfassen und von der Membran abziehen kann. Die flexible Folie 4 wird in einem

84171290

A .37 015 m - 13 - ■

scharfen Winkel nach rückwärts abgezogen, so daß die durch das Abziehen entstehenden Spannungen an der Verbindungsfläche zwischen Folie 4 und Membran 2 konzentriert werden. Hierdurch bleibt / relativ empfindliche Zelluloseacetat, aus dem die Membran 2 besteht, gleichmäßig an Ort und Stelle zurück und wird nicht mit der Folie 4 abgezogen. V/ird die dünne flexible Folie 4 dicker ausgeführt, so könnte sie nicht so gut abgezogen werden, oder das Abziehen er- · folgt unregelmäßig, wobei Klumpen aus Zelluloseacetat mit der steiferen Folie zusammen .abgerissen werden.

.Uach dem Abziehen liegt die ganze Fläche der aus Zelluloseacetat bestehenden Membran frei. Ausfällungs-Bögen, wie sie in Fig.1 gezeigt sind, liegen innerhalb der porösen Matrix der Membran 2 ebenso wie nicht reagierte Komponenten des Serums und des Antiserums. Diese nicht in Reaktion getretenen Komponenten werden zunächst aus der Membran herausgespült, indem diese in eine warme Salzlösung getaucht wird. Die Porosität der mikroporösen Membran erleichtert ein viel schnelleres Auswaschen dieser nicht in Reaktion getretenen Komponenten als es mit Gel-Trägern möglich ist, die für die Immuno-Elektrophorese verwendet werden. Es genügen eine oder zwei Stunden, um die nicht in Reaktion getretenen Komponenten vollständig herauszuwaschen.

Der ausgewaschene Streif en wird dann in eine Farblösung gebracht, in welcher das ausgefällte Protein gefärbt wird. Die Fär.bezeit reicht aus, daß sich die Farbmoleküle mit den Protein-Komplexen verbinden. Dies kann einige Minuten bis mehrere Stunden dauern, abhängig von der speziellen verwendeten Farbe.

Nach dem Färben wird der Streifen in einem geeigneten Spülmittel gespült. Die Farbmoleküle, die sich nicht mit dem

. 90984 I / 1 2'9Q

A 37 015 m ·"- .. -■ 14 — ^; „ ■.-*"„■* w*- ^' '

Protein verbunden haben, werden aus der mikroporösen Mem- ' bran herausgespült, so. daß ein auffallendes'und unterseheidungskräftiges Muster aus. Ausfällungsbögen gegen einen re^· lativ klaren- weißen Hintergrund der Zellulosea'cetat-Membran zurückbleibt. Wenn gesünscht, kann der Streifen durchsichtig gemacht werden, etwa in der Art, wie sie für die fotografische Dichtemessung des, Zweikomponenten-Schichts.tof f es;. der vorliegenden Anmeldung angewandt wird. Die Ausfällungsbögen haben jedoch eine äußerst feine Struktur und der Verlust an Schärfe, der mit diesem Verfahren verbunden ist, ist weder notwendig noch erwünscht. Deswegen werden immuno-™ elektrophoretische Muster im allgemeinen nicht durchsichtig gemacht, sondern direkt beobachtet. ·

Obwohl die erfindungsgemäße geschichtete Folie zweckmäßig auf dem Gebiet der Immuno-Elektrophorese und der Immuno-Diffusion.angewandt wird, eignet sie sich auch für andere analytische Verwendungszwecke, z.B. für andere Diffusionsverfahren oder für Qbjromatografische Verfahren.

. -= - So können beispielsweise bestimmte

Bereiche der mikroporösen Kunststoff-Membran mit speziellen Chemikalien imprägniert werden, ehe die obere Deckschicht aufgebracht wird. Substanzen, die durch die Kunststoff-Membran: getrennt werden, können durch diese impräg-" nierten Schichten geleitet werden, so daß Reaktionen entstehen und sich Farben oder andere geeignete Anzeichen entwickeln. Durch Sperren bestimmter Bereiche innerhalb der porösen Kunststoffmembran können die Wege der Diffüsionswanderurig definiert werden.

Es können eine Vielzahl undurchlässiger Folien oder Filme- und Klebstoffe zur Herstellung der beschichteten Folie verwendet werden. Wie oben ausgeführt, ergibt die Verwen-

909 84 17 12

A 57 015 m ■ - 15 - ^:-_λΧγ,γ,~^

dung einer dünnen flexiblen Folie für die eine Schicht und einer dicken, relativ steifen Folie für die andere Schicht Vorteile beim Abziehen der dünnen Folie. Obwohl etwas von dem Zellulose-Acetat in Form einer sehr dünnen Haut^%an der dünnen Folie anhaften kann, wird hierdurch die Leistungsfähigkeit und die Wirksamkeit des Hauptteiles des Zellulose-Acetats, das in Verbindung mit der Trägerfolie bleibt, nicht beeinträchtigt.

- 16 -

1/129

Claims

A 37 015 m .■■'-■■ - 16 - ■"■..-■ ly-35 ' : -.'. P a t e η t a η s ρ r ü c h e r

1. Geschichtete Folie zur Untersuchung von-!Diffusions-Vorgängen, gekennzeichnet durch eine Trägerfolie (1) aus Kunststoff, die flexibel, aber genügend steif ist* daß sie sich selbst tragt, eine mikroporöse Kunststoffmembran (2), die eine Vielzahl kleiner Poren aufweist, und die mit einer Seite der Trägerfolie verbunden ist, ferner eine sehr dünne, flexible Folie (4), die mit der anderen Seite der Membran (2) verbunden ist und die mit wenigstens einer Öffnung versehen ist, durch welche die Membran (2) freigelegt ist*

2. Geschichtete Folie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerfolie (1) genügend elastisch ist, daß sie in einer Versuchseinrichtung in einer gebogenen Stellung bleibt. .

3. Geschichtete Folie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerfolie (1) und die dünne, flexible Folie (2) mit Hilfe eines thermoplastischen Klebemittels (3» 5) mit der porösen Kunststoffmembran (2) verbunden ist, und daß der Klebstoff sich mit den festen Teilen der porösen Kunststoffmembran verbindet und einen sehr wesentlichen Teil der Poren zur Aufnahme von Flüssigkeit offen läßt. . · .

4. Geschichtete Folie nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ; zeichnet, daß die Poren der Kunststoff-Membran (2) einen mittleren Durchmesser von etwa 0,5 bis etwa 1,5/6 haben, und daß sie praktisch offen sind für die Aufnahme einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe_o

1290'

A 37 015 m - 17 - '

5» Geschichtete Folie nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerfolie aus Polyester besteht, und daß ihre Dicke etwa 0,25 mm (10 Mil) beträgt und daß die Dicke des Klebmittels nicht mehr als etwa 0,012 mm (0,5 Mil) beträgt und daß die dünne, flexible Folie (4) eben-* falls aus Polyester besteht und ihre Dicke etwa 0,05 mm (0,002 Zoll) beträgt.

6· Geschichtete Folie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Kunststoff-Membran (2) aus Zelluloseacetat besteht»

7. Geschichtete Folie in Form eines Streifens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch .eine Trägerfolie, die den Streifen stützt, eine mikroporöse Kunststoff-Membran, fieren eine Seite mit der Tragerfolie verbunden ist und eine flexible, nicht poröse, undurchlässige obere Deckfolie, die mit der anderen Seite der Kunststoff-Membran verbunden ist, deren Dicke etwa 0,05 mm (0,002 Zoll) beträgt, so daß die flexible Folie in einem scharfen Winkel abgezogen werden kann, um sie von der mikroporösen Kunststoff-Membran zu trennen, ohne Teile dieser Membran mitzuentfernen oder zu beeinträchtigen.

8. Geschichtete Folie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Kunststoff-Membran (2) im wesentlichen aus Zelluloseacetat besteht und daß ihre Poren einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 0,5 bis 1,5 £t>aufweisen und daß die dünne, flexible Folie (4) eine oder mehr öffnungen besitzt, durchweiche die Kunststoff-Membran freigelegt ist. ~ ■ ■ -

• - 18 -

A 37 015 m -18- ■ _ - ____

iy-35 ■■-

9. Geschichtete Folie nach Anspruch 7, dadurchvigekerinzeichnet, daß die Trägerfolie und die dünne, flexible Folie mit Hilfe eines thermoplastischen Klebstoffes mit der porösen Membran verbunden sind.

10. Geschichtete Folie nach Anspruch 7·, dadurch gekennzeichnet, daß die dünne, flexible Folie kurzer ist als die poröse Membran, so daß Endteile der letzteren für elektrische Anschlüsse frei bleiben.

I0&84 1/123 0