DE1813997B2

DE1813997B2 - Mikrobiologisches verfahren zur herstellung 11,15-oxygenierter 5 alpha, 6 alpha-epoxy-steroide

Info

Publication number: DE1813997B2
Application number: DE19681813997
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr.; Kosmol Horst Dr.; Petzoldt Karl Dr.; 1000 Berlin Kieslich
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1968-12-06
Filing date: 1968-12-06
Publication date: 1978-01-26
Also published as: DE1813997C3; DE1813997A1

Description

worin

OH

oder = O bedeutet, dadurch gekennzeich- 25 net, daß man ein Ausgangssteroid der allgemeinen Formel

CH₁ C=O

JO

RO

CH₃

(Π)

worin R ein Wasserstoffatom oder einen Acylrest 40 bedeutet, mit Curvularia lunata fermentiert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung 11-oxygenierter Steroide der allgemeinen Formel

^r)0

HO

(D

OH

X<

bO

b5 ein Ausgangssteroid der allgemeinen Formel
CH,
C=O

-CH₃

10

15

20

oder = O bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man

worin R ein Wasserstoffatom oder einen Acylrest bedeutet, mit Curvularia lunata fermentiert.

Die mikrobiologische 15j3-Hydroxylierung ist an sich bekannt. Als geeignete Mikroorganismen wurden beispielsweise beschrieben

Absidia regnieri, Aspergillus nidulanus,
Bacillus megaterium.Cercospora melonis,
CorioJus versicolor, Diplodia tubericola,
Helminthosporium sativum, Leucites abietina,
Nigrospora oryzae, Penicillium diversum,
Penicillium rugulosum, Penicillium spec,
Phoma see, Poria cocos,
Sclerotinia libertiana,
Sclerotinia hydrophilum,
Spicaria simplicissima,
syncephalastrum racemosum

(vgl. W. Charney, H. L. Herzog: Microbial Transformations of Steroids, Academic Press 1967). Aus der Fachliteratur ist weiter bekannt, daß diese 15j3-Hydroxylierung nicht einheitlich verläuft. In mehr oder weniger großem Umfang erfolgt gleichzeitig Hydroxylierung an anderen Stellen des Ausgangssteroids, wobei als Nebenprodukt di- und häufig sogar tri-hydroxylierte Verbindungen entstehen. Neben der gewünschten 15)3-Hydroxylgruppe werden zusätzliche Hydroxylgruppen, insbesondere in z. B. 2ß-, 6ß-, 7oc- oder Herstellung, eingeführt.

Bemerkenswerterweise wurde eine gleichzeitige Il,15j9-Dihydroxylierung mittels Mikroorganismen bisher nicht beschrieben. Wenn man dazu noch berücksichtigt, daß — wie in eigenen, bisher unveröffentlichten Versuchen festgestellt wurde — bei Einwirkung von Curvularia lunata(NRRL 2380) auf 3j3-Hydroxy-21-acetoxy-5(X,6iX-epoxy-16a-methyl-pregnan-20-on allein in Ilj3-Stellung Hydroxylierung erfolgt, war die gleichzeitige Oxygenierung in 11- und 15-Stellung bei Verwendung eines Ausgangssteroids der obengenannten Formel II überraschend.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt nach den dem Fachmann dafür bekannten Arbeitsmethoden. So werden in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Reaktionsbedingungen für die aerobe, submerse Fermentation ermittelt. Die Umwandlung des als Lösung oder Suspension zugesetzten Substrates wird durch dünnschichtchromatographische Analyse von Probenextrakten verfolgt. Dazu werden dem Fermentationsgemisch etwa alle 3 — 4 Stunden Proben entnommen. Diese werden mit Methyl-isobutylketon extrahiert und dann in üblicher Weise im Dünnschichtchromatogramm bezüglich der Abnahme des Ausgangsproduktes und bezüglich der Art des eingeführten 1 !ständigen Substituenten analysiert

Im Verlauf der erfindungsgemäßen Umsetzung erfolgt zunächst Hydroxylierung in 110- und 15j3-Stellung, und anschließend wird die primär eingeführte 1 ^-Hydroxylgruppe weiter zur 11-Ketogruppe oxydiert. )e nach dem letztlich gewünschten Verfahrenspro- "> dukt wird die Fermentation nach erfolgter 11,15-Dihydroxylierung abgebrochen oder bis zum Vorliegen der 11-Ketogruppe weitergeführt. Nach beendeter Fermentation wird das Verfahrensprodukt mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aus der in Kulturbrühe extrahiert und aus dem Extrakt, z. B. durch Eindampfen und weitere bekannte Aufarbeitungsmethoden beispielsweise durch Umkristallisieren und/oder Chromatographie an Silicagel gereinigt.

Das als Ausgangsprodukt geeignete 30-Acetoxy- r> 5Ä,6fc-epoxy-16«-methyl-pregnan-20-on (F. 167 bis 169⁰C) erhält man beispielsweise gemäß US-Patent 3133 058. Durch Verseifung der 30-Acetoxygruppe erhält man dann das entsprechende 3j3-Hydroxy-5a,c«- epoxy-16c:-methyl-pregnan-20-on. 21)

Beispiel 1

Ein 2-1-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei 120⁰C im Autoklav sterilisierten Nährlösung aus 1% Cornsteep liquor, 1% Sojapuder und 0,005% Sojaöl, eingestellt auf pH 6,2, enthält, wird mit einer Lyophilkultur von Curvularia lunata (NRRI. 2380) beimpft und 72 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Mit dieser Vorkultur wird dann ein 20-l-Fermenter aus rostfreiem Stahl, der mit 151 eines bei 121⁰C und 1,1 atü sterilisierten Mediums aus 1% Cornsteep liquor, 0,5% Stärkezucker und 0,005% Sojaöl, eingestellt auf pH 6,2, enthält, beimpft. Unter Zugabe von Silicon 5H als Antischaummittel wird bei 29° C unter Belüftung (10 l/min.) 0,7 atü Druck und r> Rühren (220 U/Min.) 24 Stunden germiniert. I I der Kulturbrühe wird unter sterilen Bedingungen in 14 1 eines wie oben sterilisierten Mediums aus 1% Cornsteep liquor, 1,25% Sojapuder und 0,005% Sojaöl überführt und unter gleichen Bedingungen angezüchtet. Nach 12 Stunden wird eine Lösung von 7,5 g 3ß-Hydroxy-5ix,6«-cpoxy-16a-methyl-pregnan-20-on in 120 ml Methylcellosolve zugegeben.

Der Ablauf der Umwandlung wird durch dünnschichtchromatographische Analyse der Methyl-isobu- 4^r> tyl-ketonextrakte von Fermenterproben verfolgt. Nach vollständiger Umwandlung (32 Stunden) wird der Fermenterinhalt zweimal mit je 101 Methylisobutylketon ausgerührt und der Extrakt bei 50⁰C Badtemperatur im Vakuum eingedampft. Der Rückstand (6,7 g) wird aus Essigester-Isopropyläther umkristallisiert, wobei 4,6 g

3/3,15/?- Dihydroxy-5«,6«-epoxy-16«-methylpregnan-11,20-dion erhalten werden (55% d. Theorie); F. 232-234° C.

Beispiel 2

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 7,5 g 30-Acetoxy-5a,6«-epoxy-16«-methyl-pregnan-20-on 36 Stunden fermentiert und aufgearbeitet. Nach Umkristallisation des isolierten Rohproduktes erhält man ca. 6 g

//yypyy 11,20-dion, das bei 230-231⁰C schmilzt und im Mischschmelzpunkt mit dem nach Beispiel 1 erhaltenen Produkt keine Depression zeigt.

Beispiel 3

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 7,5 g 3/}-Hydroxy-5a,6«-epoxy-l6a-metriyl-pregnan-20-on 20 Stunden fermentiert (Kontaktzeit 8 Stunden) und aufgearbeitet. Das erhaltene Rohprodukt wird über eine Silicagelsäure Chromatographien, wobei mit einem linearen Gradienten (Hexan : Aceton 1:1) eluiert wird. Aus den polaren Fraktionen werden 3 g rohes 3ß, \\ß,\ 50-Tt ihydroxy-5«,6a-epoxy-16a-methy l-pregnan-20-on isoliert, das nach mehrmaligem Umkristallisieren aus Essigester-Isopropyläther bei 202/205-210°C schmilzt.

Beispiel 4

Unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen werden 7,5 g 3/?-Hydroxy-5«,6Ä-epoxy-16a-methylpregnan-20-on mit einer Kultur von Curvularia lunata CBS 18 748 umgesetzt.

Nach erfolgter Umsetzung wird der Fermentationsansatz aufbereitet, wie im Beispiel 1 beschrieben, und man erhält 3,9 g 3j9,15/3-Dihydroxy-5a,6a-epoxy-16<xmethyl-pregnan-11,20-dion vom Schmelzpunkt 229-233° C.

Beispiel 5

Unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen werden 7,5 g 3/?-Hydroxy-5«,6&-epoxy-16a-methylpregnan-20-οίΐ mit einer Kultur von Curvularia lunata ATCC 14 678 umgesetzt.

Man arbeitet den Fermentationsansatz auf, wie im Beispiel 1 beschrieben und erhält 4,3 g 3/J,15/?-Dihydroxy-5«,6«-epoxy-16«-methyl-pregnan-11,20-dion vom Schmelzpunkt 231-234⁰C.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung 11-oxygenierter Steroide der allgemeinen Formel

HO

(D

OH