DE1810892A1

DE1810892A1 - Verfahren zum Abschwaechen von Viren

Info

Publication number: DE1810892A1
Application number: DE19681810892
Authority: DE
Inventors: Gray Oscar Samuel
Original assignee: Gray Industries Inc
Current assignee: Gray Industries Inc
Priority date: 1967-12-01
Filing date: 1968-11-26
Publication date: 1969-08-21
Also published as: NL6817163A; BR6804417D0; FR1593685A; GB1223768A; CH507370A; IL31138A0; DK122824B; BE724479A; NO126955B; AT279046B; ES360827A1; IL31138A

Description

Dr. Ing. E. BERKENFELD · Dipl.-lng. H. BERKENFELD, Patentanwälte, Köln

Anlage Aktenzeichen

zur Eingabe vom 25« November 1968 SCh Nome d. Anm. GRAY INDUSTRIES, INC.

Verfahren zum Abschwächen von Viren.

Die Geschichte der Vakzination ist gleichzeitig eine Darstellung von Forschungen nach einem abgeschwächten Mittel, das in einem Wirtsorganismus, dem es verabreicht wurde, während einer langen Zeit spezifische Antikörper erzeugt. Derartige Stoffe wurden zufällig als genetische Abweichungen, wie beispielsweise im Fall der Kuhpocken, oder durch aufwendige, zeitraubende Verfahren der genetischen SelektFlon, wie im Fall der Poliovirus-Vakzine des Sabintyps, oder durch ausgedehnte Passagen durch das Ei oder den Tierkörper, wie im Fall von Gelbfieber, gefunden. Die Suche nach geeigneter Abschwächung ist durch zahlreiche Fehlschläge gekennzeichnet. Das Auffinden eines geeigneten Grads der Abschwächung stellt ein großes Verdienst dar, denn es bestehen keine Anzeichen dafür, daß eine abgetötete Virusvakzine einen ebenso wirkungsvollen Grad der Immunität erzeugt wie das Serum eines lebenden, abgeschwächten Virus. Durch zahlreiche Tests mit verschiedenen chemischen und biologischen Methoden an zahlreichen Infektionserregern ist es während der letzten Jahre klar geworden, daß die wirkungsvollste Virusvakzine eine lebende, abgeschwächte Form des Virus darstellt, die in einem von dem zu immunisierenden Wirtsorganis-

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mus verschiedenen Wirtsorganismus, vorzugsweise keinem Säugetier, eine Krankheit hervorruft. Bei Viruskrankheiten zeigen geschwächte Vakzine die größte Erfolgsaussicht, wie aus der Geschichte der Virusiramunisierung hervorgeht, die vor allem durch die Entwicklung der Vakzine gegen Pocken, Gelbfieber , Poliomyelitis und Masern hervorgeht.

Obwohl eine Abschwächung sehr erwünscht ist, war sie bisher in vielen Fällen nicht vorhersehbar und sogar nicht reproduzierbar. Infolgedessen wird die Mehrzahl der zur Zelt verwendeten Vakzine durch Abtöten des Virus mit Formalin hergestellt. Diese Art des Abtötens ist zwar nicht völlig aifriedenstellend, hat sich jedoch in der Praxis als vernünftig erwiesen, obwohl Fachleute auf dem Gebiet der Immunisierung übereinstimmen, daß diese Vakzine keinesfalls vollkommen sind.

Es wird daher ständig nach Mitteln zum Abschwächen von Viren gesucht, insbesondere nach Mitteln, die einfach, zuverlässig und reproduzierbar sind»

Ziel der Erfindung ist daher ein neues Verfahren zum Schwächen ^ von Viren.

Das erTindungsgemäß angestrebte neue Verfahren zum Schwächen von Viren ist einfach, wirtschaftlich, schnell und reproduzier« bar. ,

Das erfindungs,gemäße Verfahren zum Sqhwltcheri von -Viren hat den Vorteil, daß es ohne Verwendung zugesetzter Chemikalien arbeitet. ■ ,

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Abschwächen von Viren, das dadurch gekennzeichnet ist., daß man die in einem abgeschlossenen Raum mit mindestens einer für Mikrowellen permeablen Wand befindlichen Viren in einer Behandlungszone mindestens 10 Sekunden bis kurze Zeit vor der völligen Inaktivierung mit Mikrowellen behandelt und Gleichzeitig die Wände des die Viren enthaltenden abgeschlossenen Raums in direkter Berührung mit einer unter Überatmosphärendruck stehenden Kühlgasatmosphäre einer Eintrittstemperatur von unter etwa 15.,6⁰C hält, ohne daß ein direkter Kontakt zwischen den Viren und der Kühlgasatmosphäre besteht.

Vorzugsweise wird die Zirkulation des Kühlgases nach Beendigung der Behandlung mit Mikrowellen so lange fortgesetzt, bis das Virus auf eine Temperatur abgekühlt ist, die unter seiner während der Mikrowellenbehandlung erreichten Temperatur liegt.

j2s wurde festgestellt, daß durch dis erfindungsgemäße Behandlung ein Abschwächen der Viren erzielt wird. Insbesondere konnte fe&tgestellt werden, daß die beschriebene Behandlung ein lebendes pathogene₃ ViitE in eine lebende, gegenüber Säugetieren

I nicht pathogene Form überführt. In dieser abgewandelten Form ist ^ das abgeschwächte Virus nach Verabreichung an einen lebenden Organismus unfähig, den Wirtsorganismus mit der Krankheit zu infizieren, Ue das nicht abgeschwächte Virus bekannter Weise hervorruft, e besitzt jedoch die Fähigkeit, die Bildung von Antikörpern in dem Wirtsorganismus hervorzurufen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher angewendet werden, um ein iäDendes pathogenes Virus in eine weniger virulente jedoch lebende Form überzuführen und stellt daher ein wertvolles Hilfs-

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mittel zur Untersuchung von Viren, Virusinfektionen, möglichen immunogenen Formen geschwächter Viren, von Mechanismen der Immunitätsbildung und ähnlichen dar.

Das Abschwächen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt schnell, in einigen Sekunden und gleichzeitig auf einfache und wirtschaftliche Weise. Darüberhinaus können die Bedingungen für jedes spezielle Virus standardisiert wer.den, um beliebig oft reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. So kann jede Probe oder Ansatz durch für jeden Antigentyp spezifische Verfahren getestet werden. Andererseits wird bei bekannten Methoden zum Schwächen von Viren, durch Mutation, das durch Mutation geschwächte immunisierende Mittel als solches durch kontinuierliche Passage in vitro oder in vivo gehalten und es ist nicht gewährleistet, daß nicht die Abschwächung durch menschlichen Irrtum oder genetische Veränderung verloregen gehen kann.

Soweit bisher bekannt ist, ist jede* RNS-oder DN3-Virüs gegenüber der erfindungsgemäßen Abschwächung empfindlich einschließlich -Picorla-Viren, wie der Maul- und Klauensäurevirus, Polioviren, Coxsackie- und Echo-Viren, Tollwutviren, Arboviren, wie das Virus der Schlafkrankheit, Myxoviren, wie die Erreger der Influenza, Masern und Newcastle disease, Reoviren, die Erreger des Hämmorrhagischen Fiebers und ähnlichen. Diese Viren sind pathogene Viren, da sie in Tieren und bei Menschen Krankheiten hervorrufen.

Die etfflndungsgemäß zu schwächenden Viren können in Form einer Kultur vorliegen. Die Herstellung von Viruskulturen ist bekannt und in der Literatur beschrieben, wie in "Viruses of Vertebrates,

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Sir Christopher Andrews, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1964, und "Cultivation of Viruses", A.M.A. Archives of Pathology, Murray Sanders et al., Vol. 56, S. 148-255, 1953· Zwei grundsätzliche Arten zur Herstellung von Viruskulturen sind folgende:

1) Infizieren der verschiedenen Membranen des bebrüteten Eis, wie die Ch£orioallantoj?is-Membran-Technik(CA) und

2) Infizieren lebender Zellen, wie die Technik der Gewebekultur (TC). Bei der ersteren Technik wird das Virus in der Allantoisflüssigkeit der Allantoishöhle von Embryonen enthaltenden Eiern gezüchtet. Diese Technik läßt sich besonders zur Herstellung von Kulturen der meisten Myxo-Viren, wie Viren der In- ti fluenza und Newcastle disease sowie Tollwutviren anwenden. Bei der Gewebekulturtechnik züchtet man die Kultur auf tierischen Zellen, wie Hühnerembryogewebe oder N&?engewebe von Primaten. Diese Technik läßt sich besonders gut bei Viren der Maul- und Klauenseuche und Poliomyelitisvirus anwenden«

Zur erfindungsgemäßen Behandlung geeignete Viren können außerdem in Orsganen infizierter lebender Tiere erzeugt werden. So wachsen beispielsweise das Virus des Rift Valley-Fiebers und eini- M ge der Arboviren in solchen Organen besser als in Kulturmedien. Das infizierte Organ kann aus dem Tier entfernt, emulgiert und zentrifugiert werden und die oben stehende Flüssigkeit als das enthaltende Medium verwendet werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelte Virusmaterial kann in Form einer Suspension in einem flüssigen Medium oder in fester Form vorliegen. So kann beispielsweise eine mit

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Hilfe der TC-Technik erzeugte Viruskultur als solche, beispielsweise durch Behandeln des virushaltigen Gewebes, vorzugsweise nach Überführen in feinverteilte Form z.B. durch. Zerhacken, behandelt werden. Ebenso können die infizierten Kulturflüssigkeiten aus befruchteten Eikulturen direkt verwendet werden. Infektiöse Kulturen können vor der Behandlung verdünnt werden. In Abhängigkeit von der speziellen Viruskultur kann als Verdünnungsmittel jedes geeignete Medium wie destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Serum, Phosphatpufferlösung nach Sorensen und ähnliche verwendet werden. Gewünschtenfalls kann die Suspension, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtration, geklärt werden, um Feststoffe zu entfernen

Die Konzentration des Virus in dem zu behandelnden Medium scheint nicht besonders kritifech zu sein. Aus praktischen Gründen ist es jedoch nicht wünschenswert, große Volumina des Ausgangsmaterials zu behandeln, in welchem das aktive Prinzip nur zu einem geringen Anteil vorliegt, und die Ergebnisse sind da-•her um so besser, je konzentrierter d as Virus in dem Behandlungsmedium ist. Die Konzentration des Virus in dem zu behandelnden Medium ist im allgemeinen nicht geringer als etwa 75 000 Teile pro Millionenteile und vorzugsweise rieht geringer als etwa 1000000 Teile pro Millionentelle.

Mikrowellenenergie ist bekanntlich die Energie elektromagnetischer Wellen einer Wellenlänge, die im MikrowellenbereiQh des elektromagnetischen Spektrums liegt. Die "Federal Communications Commission" hat gegenwärtig für Mikrowellen anwendende Verfah-

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ren Mikrowellenbandbereiehe zwischen etwa 400 und etwa 20 000 megahertz mit einer Wellenlänge von etwa 33 cm für die niedrigeren Frequenzen bis etwa 1,8 cm für die höchsten Frequenzen bei Seite gestellt, speziell Frequenzen von etwa 890-940 mit einer Wellenlänge von etwa 33 cm, Frequenzen von etwa 2400-2500 mit einer Wellenlänge von etwa 10-13 cm und Frequenzen von 17 850-18 000 mit einer Wellenlänge von etwa 1,8 cm. Die bevorzugte:. Mikrowellenenergie zur erfindungsgemäßen Anwendung stellt ■ einen mittleren Bereich mit einer Frequenz von etwa 1000 bis etwa 5000 , insbesondere von etwa 200 bis etwa 3OOO megahertz dar. Die Mikrowellenenergie wird mit Hilfe einer geeigneten Hochfrequenzwelle, beispielsweise einem Magnetron erzeugt.

Es ist ein wesentliches Merkmal der Erfindung, daß das zu behandelnde Virus während der Behandlung in einem abgeschlossenen Raum gehalten wird. Die Wände des abgeschlossenen Raums können aus üblichen, im wesentlichen gasundurchlässigen Verpackungsmaterialien, wie Glas , Polymethylmethacrylat, Polystyrol und Polyäthylen, wie in Flaschen, Kolben, Rohren und Beuteln, bestehen. Ein Teil der Verpackung oder des Behälters kann aus Material bestehen, das für Mikrowellen undurchlässig ist, wie Aluminium und Stahl, sofern die der Quelle für die Mikrowellenenergie zugewandte Wandung des Behälters durchlässig für Mikrowellen ist. Der abgeschlossene Raum ist im wesentlichen gasdicht.

Der den Virus enthaltende abgeschlossene Raum, der entweder ein Behälter oder eine Rohrleitung etc. ist, befindet sich in einer größten Behandlungskammer, in welche die Mikrowellenener-

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gie gerichtet ist, um die für Mikrov/ellen durchlässige Wandung des abgeschlossenen Raums und das Virus zu durchdringen.

Ein anderes wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß ein Kühlgas unter Uberatmosphärendruck durch die Behandlungskammer und um die Wandungen des das ι Virus enthaltenden abgeschlossenen Raumes zirkuliert·' Das verwendete Kühlgas kann ein beliebiges im wesentlichen inertes (in Gegenwart von Mikrowellenenergie nicht mit den umgebenden Materialien reagierendes) Gas sein, das bei den angewendeten Temperaturen in Gasform vorliegt, insbesondere Stickstoff oder Kohlendioxid. Gas, wie Argon, Helium, Neon, Krypton, Xenon, Äthylenoxid und ■ Gemische dieser Gase sind zwar geeignet, gegenwärtig jedoch wegen ihrer Kosten weniger erwünscht.

Die Temperatur des in die Behandlungszone eintretenden KUhI-gases sollte unter etwa 15,6⁰C und vorzugsweise unter etwa 13#3°C liegen. Diese Temperatur kann zwar auf -17,B⁰C erniedrigt werden; es wird Jedooh mit niedrigeren Temperaturen ale etwa «6,7⁰C kein Vorteil ereielt* und es können bei diesen niedrigeren Temperaturen Schwierigkeiten durch Einfrieren auftreten, wenn eine Virussuspension lange Zeit nach Abschalten der Quelle für Mikrowellenenergie in der Behandlungszone belassen wird« die das kalte Gas enthält. Als besonders geeignet hut sieh eine Temperatur des eintretenden Gases zwischen. etwa -1 und etwa + 1O⁰C erwiesen. Das Kühlgas erwärmt sich, witer#n<S des Pftssierens der Behänd lungs ζ one» insbesondere durch Berührung mit den Wandungen der abgeschlossene^ den Virus ent- AiiUB* und das erwärmte. Gas wird aus der Behandlungs-

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zone entfernt,um Platz für das eintretende Kühlgas zu schaffen. Wenn das Gas zur Wiederverwendung rückgeführt wird, muß seine Temperatur vor Einführung in die Behandlungszone wieder auf den gewünschten Wert verringert werden.

Der Druck des Kühlgases in der Behandlungszone liegt über Atmosphärendruck. Da die Hauptfunktion des Kühlgases darin besteht, die Wandungen des abgeschlossenen Raums bei einer Temperatur unter der des zu behandelnden Virus zu halten, wird eine wirkungsvollere Kühlung an allen Stellen der Behandlungszone ohne ungenügende Abkühlung eines Teils oder Teile der Wandungen erzielt, wenn man das Kühlgas in die Behandlungskammer und gegen die Wandungen des abgeschlossenen Raumes preBt. Dazu wurde ein Druck von so wenig wie O, Oj55 atü verwendet und ein hoher Druck wie 3*52 atü kann wünschenswert sein. Im allgemeinen haben sich als besonders geeignet Drücke von etwa 0,14 bis etwa 2,81 atü erwiesen.

Die
/genaue Dauer der Behandlung mit Mikrowellenenergie gemäß der Erfindung kann in gewisser Weise von dem speziellen, zu behandelnden Virus abhängen. Es wurde festgestellt, daß die Exposifeitionszeit in jedem Fall mindestens etwa 10 Sekunden betragen sollte. Es wurde außerdem festgestellt, daß eine Überexposition zur vollständigen Inaktivierung des Virus führt. Da dies unerwünscht ist, soll die Gesamtexpositionszeit um weniges geringer als die Zeit sein, die diese vollständige Inaktivierung zur Folge hat. Da diese Zelt mit der Art des Virus variiert, kann es erforderlich sein, einen Vorversuch oder Vorversuche durchzuführen, um festzustellen, zu welchem Ausmaß daf spezielle der Behandlung unterworfene VirU3

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der Mikrowellenenergie ausgesetzt werden kann, ohne vollständig inaktiviert zu werden. Für jedes Virus existiert ein besonderer biologischer Test, so daß man leicht feststellen·kann, ob eine behandelte Probe des Virus vollständig inaktiviert worden ist oder nicht. Ein bevorzugter angestrebter Grad der Schwächung ist der mit der höchst möglichen Wirksamkeit im biologischen Test, jedoch unterhalb der Schwelle der Säugetierinfektion. Das Virus kann erfindungsgemäß einmal oder mehrere Male der Mikrowellenenergie ausgesetzt werden.

Nach der gewünschten Einwirkungszeit der Mikrowellenenergie auf das Virus wird die Quelle für Mikrowellenenergie abgeschaltet und da3 Virus kann aus der Behandlungszone entfernt werden. Es wird jedoch bevorzugt, nach Beendigung des Einwirkens der Mikrowellenenergie das Kühlen mit Hilfe des Kühlgases fortzu-

setzen, um das geschwächte. Virus, vorzugsweise mindestens auf Raumtemperatur, abzukühlen«, Dies kann dadurch erreicht werden, daß man den Behälter mit dem abgeschwächten Virus in der Behandlungszone beläßt, durch die das Kühlgas zirkuliert, nach dem die Quelle für Mikrowellenenergie abgeschaltet wurde. Wenn man bei der Behandlung das virenhaltige Medium kontinuierlich durch ein Rohr oder durch Rohre fließen läßt, kann man das Medium außerhalb des Gebiets der direkten Mikrowelleneinwirkung in oder außerhalb der Behandlungszone weiterströmen lassen, während ein Kühlgasstrom in Berührung mit den Rohrwandungen steht.

Anschließend an die erfindungsgemäße Behandlung wird das abgeschwächte Virus auf die übliche dem Paohmann geläufige Weise behandelt. In vielen Fällen kann das Material al* solches als

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Hilfsmittel für die Forschung und zu Studienzwecken benutzt werden. Es kann wünschenswert sein, ein Konservierungsmittel zuzusetzen, welches dem geschwächten Virus nicht schadet. Wenn das Material Peststoffe als Verunreinigungen enthält, was beispielsweise dann der Fall ist, wenn es vor der Behandlung nicht geklärt wurde, kann es durch Zentrifugleren, Filtrieren etc. geklärt werden.

Die folgenden Beispiele und Daten dienen zur Veransohaulichung der Erfindung, sollen diese jedoch nloht beschränken.

Beispiel

Dieses Beispiel verdeutlicht die Anwendung des erfindungsgemÄßen Verfahrens auf Influenzavirus Typ A (American Type Culture Collection, Rookville, Maryland, VR. No. 95, Stammt PR-8).

Eine Kultur des Virus wird in der Allantoisflüssigkeit der Allantdahöhle von befruchteten Hühnereiern entsprechend der AUantoisflüasigkeit-Technik gezüchtet. Die erhaltene Suspension des Virus in ÄliantoisflUsslgkeit wird gewonnen und in Anteilen von Je 100 ml in verschlossene sterile Glasflaschen gegeben« Eine Flasche wird als Vergleich verwendet und die übrigen Anteile,wie unten angegeben,während unterschiedlicher Behandlungezeiten der folgenden Behandlung unterworfen. Die Behandlung erfolgt in einer Druckkammer, die mit einem an eine 220 Volt Wechselstroequelle angeschlossenen 1 KW-Magnetron ver» sehen ist, das Mikrotrellenenergle von etwa 2450 t &5 BtithertE einer Wellenlänge von etwa 12,2 cm in die Behandlungikamer abgibt. Gekühlter Stickstoff wird der Kammer zugfführt, puilert diese und wird wieder daraus abgezogen. Die Klötrittgttmpemtu*

des Kühlgases beträgt etwa 8,9°* seine Austrittstemperatur etwa 26,7°C. Der Druck des Gases beträgt 0,7 atü. Naoh Jeder Exposition werden die Flaschen in der Kammer belassen, während der gekühlte Stickstoff weiter zirkuliert, bis die Flaschen und ihr Inhalt wieder auf 21⁰G abgekühlt sind. Alle Proben werden dann eingefroren, bevor man sie prüft. Die Expoeitionszeiten der einzelnen Proben sind folgende"»

Anteil Zeit (Sekunden)

Vergleich 0

A 20

B 30

C 35

D 40

E *5

F 50

α 55

H 60

X s ' 90

Eine Probe aus Jedem der Anteile, aowohl dee Vergleiohennteils als auch der behandelten Anteile, wiri Embryonen ent haltenden Hühnereiern eingeimpft und der Hämaggutlnation:!- hemmungstest (HI) festgestellt. Beirr, ersten Durchgang beträgt der HI-Titer bei allen Proben, einschließlich der Vergleichsprobe* etwa 1 t 2000 und Im zweiten Durchgang eben» falls 1 t 2000. Dies® Ergebnisse seigen* daß in allen Proben ein lebende» Yirua vorliegt.

Di® Anteile w®r<5tn daran flätif ihr® Vlrulens unter Verwendung von

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0,25 ml wird Jeder Maus dadurch applizlert, daß man aus einer dünnen Injektionsspritzennadel Tröpfchen zur Inhalation in die Nüstern einbringt. Nach 10 Tagen waren 14 der 20 Mäuse, die die Vergleichsprobe erhalten hatten, eingegangen, während keine Maus eingegeangen war, die das behandelte Material erhalten hatte. Während der nächsten 20 Tage traten keine weiteren Todesfälle auf.

Es ist möglich, das erfindungsgemäße Verfahren hinsichtlich der Auswahl des zu behandelnden Virus und der speziellen Techniken und Verfahrensdetails zu modifizieren, ohne daß,der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

P at e η t an s pr üche

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Claims

Dr. Ing. E. BERKENFELD · Dipl.-lng. H. BERKENFELD, Patentanwälte, Köln Anlage Aktenzeichen zur Eingabe vom 25. NOVetflber 1968 Sch Named.Anm. GRAY INDUSTRIES, INC. Patentansprüche - -

1. Verfahren zum AbschwächenVon Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man die in einem abgeschlossenen Raum mit mindestens einer für Mikrowellen durchlässigen Wand befindlichen Viren in einer Behandlungszone mindestens 10 Sekunden bis kurze Zeit vor der völligen Inaktivierung mit Mikrowellen behandelt und gleichzeitig die Wände des die Vieren enthaltenden abgeschlossenen Raums in direkter Berührung mit einer unter Uberatmosphärendruck stehenden Kühlgasatmosphäre einerEintrittstemperatur unter etwa 15,6 C hält, ohne daß ein direkter Kontakt zwischen den Viren und der Kühlgasatmosphäre besteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als abgeschlossenen Raum einen die Viren enthaltenden verschlossenen Behälter verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als abgeschlossenen Raum einen abgegrenzten Weg verwendet, durch den die Viren fließen.

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4, Verfahren nach einem der Ansprüche 1-j5, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikrowellen einer Frequenz von 1000 bis 5000 megahertz, vorzugsweise 2000 bis JOOO megahertz anwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man nach beendigter Behandlung der Viren mit Mikrowellenenergie die Einwirkung der Kühlgasatmosphäre auf den die Viren enthaltenden abgeschlossenen Raum fortsetzt.

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