DE1642689A1 - Verfahren zum Zurueckgewinnen von Mikroorganismen - Google Patents

Description

IB42689

13. Jan. 1967

Esso Research and
Engineering Company

Beschreibung

Esso Research and Engineering Company-Elizabeth, N. J. (V.St.A.)

Verfahren zum Zurückgewinnen von Mikroorganismen

Pur diese Anmeldung wird die Priorität vom I7. Januar 1966 der USA-Patentanmeldung Serial No. 520 858 in Anspruch genommen .

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, mit dem die Zurückgewinnung von Mikroorganismen aus einem wässrigen Medium vereinfacht wird. Gegenstand der Erfindung ist ein solches Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein wässriges Medium, das Mikroorganismen enthält, mit einer damit nicht mischbaren organischen Flüssigkeit extrahiert und dabei eine wässrige Phase und eine organische Phase bildet, und die extrahierten Mikroorganismen aus der organischen Phase isoliert. Man kann dabei den Ertrag eines wässrigen

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Mediums an Mikroorganismen vorteilhafter als bisher und auf einfache Weise gewinnen dadurch, dass man aus dem wässrigen Medium mittels einer vorzugsweise flüchtigen chlorierten organischen Flüssigkeit die Mikroorganismen bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 55 °C extrahiert, und dann die extrahierten Mikroorganismen aus der resultierenden organischen Phase isoliert. Voraussetzung beim erfindungsgemässen Verfahren ist es, dass man Mikroorganismen auf einem wässrigen Kulturmedium sich entwickeln lässt, wobei das wässrige Kulturmedium mit Zellen der Mikroorganismen beimpft ist und eine Kohlenstoffquelle, Wasserstoff und Sauerstoff sowie essentielle Zell-Nahrungsstoffe enthält. Von einem solchen, die Zellen der Mikroorganismen enthaltenden Kulturmedium zieht man einen Teil ab und extrahiert diesen mit der erfindungsgemäß verwendeten damit nicht mischbaren organischen Flüssigkeit, wobei die Zellen der Mikroorganismen aus dem die organische Phase bildenden Extrakt isoliert werden.

Es ist bekannt, dass derzeit zu wenig für den Verbrauch durch Menschen und Tiere erforderliches Protein, insbesondere billiges tierisches Eiweiß, vorhanden ist. In der Absicht, diese Eiweiß-Knappheit zu beheben, sind in der letzten Zeit verschiedene biosynthetische Verfahren entwickelt worden, durch die lebendes Protein durch Züchtung von Hefen, Pilzen und/oder Bakterien auf verschiedenen kohlenstoffhaltigen Substraten zur Verfugung gestellt werden. Eines dieser Verfahren besteht darin, dass man verschiedene Mikroorganismen

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auf Kohlenhydrat-Substraten züchtet. Die meisten dieser Verfahren erfordern jedoch aufwendige Vitamine oder sonstige kostspielige Wachstumsmedien, wenn die gewünschte Mikroorganismen-Vermehrung sichergestellt sein soll.

Eine andere kürzlich entwickelte und mehr erfolgversprechende Methode zur biosynthetisohen Herstellung von für die Ernährung brauchbarem Eiweiß besteht darin, dass man Mikroorganismen auf Erdöl-Substraten züchtet. Diese letztgenannte Protein-Synthese wird gewöhnlich auf einem wässrigen Kulturmedium durchgeführt, das Kohlenwasserstoffnährboden, eine Animpfung mit den zu züchtenden Mikroorganismen, Sauerstoff und essentielle Zellen-Nährstoffe enthält. Bei dieser Art der Proteinsynthese kann man Kohlenwasserstoffnährböden verwenden, die weniger aufwendig sind als Kohlenhydrate und die im allgemeinen keine aufwendigen Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise Vitamine, Aminosäuren und dergleichen zur Sicherstellung eines ausreichenden Wachstums der Mikroorganismen benötigen.

Einer breiten Anwendung dieser biosynthetischen Technik, bei der Kohlenwasserstoffe als Nährquellen verwendet werden, steht jedoch der schwerwiegende Nachteil entgegen, dass die dabei gewonnenen Mikroorganismen-Zellen häufig sehr geringe (Jrösse haben, beispielsweise zwischen etwa 0,5 und etwa 5*0 Mikron und sogar noch kleiner sind. Wenn die Mikroorganismen-Zellen derart klein sind, ist es schwierig und meist sehr aufwendig, diese Mikro-Zellen zurückzugewinnen. Einer der '

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Schwierigkeitsfaktoren bei der Zurückgewinnung solcher Mikroorganismen-Zellen-Produkte ist die Schwierigkeit, diese Zellen aus dem wässrigen Kulturmedium, in dem sie enthalten sind, abzutrennen, denn die Zellen sind im allgemeinen in niedriger Konzentration, d.h. in Mengen von etwa 0,5 bis etwa 5 Gewichtsprozent vorhanden. Ein anderer bedeutender Paktor, der die Gewinnung dieser Mikrozellen sehr aufwendig macht, liegt darin, dass man vergleichsweise grosse Wassermengen entfernen muss, die von den Zellen aufgenommen und darin festgehalten werden, einschliesslich desjenigen Wassers, das sich in den Zwischenräumen zwischen den Zellwänden der Mikroorganismen befindet. Es kommt hinzu, dass es schwierig ist, die Mikroorganismen und das wässrige Kulturmedium durch Zentrifugieren zu trennen, denn die Dichten sind sehr ähnlich; dadurch, dass die Mikroorganismen klebrig sind, ist es nicht möglich, durch Filtration zum Ziele zu kommen. Diese und andere damit zusammenhängende Faktoren tragen dazu bei, dass die Rückgewinnung von gezüchteten Mikroorganismen technisch schwierig und aufwendig ist.

Es kann vorkommen, dass die für die Abtrennung und Entwässerung erforderlichen technischen Maßnahmen kostenmässig 25 % oder mehr, bezogen auf die Gesamtkosten bei der Herstellung der Mikroorganismen in Form von für die Verwendung

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von hocheiweißhaltigen Nahrungsmitteln oder Nahrungsergänzung sst of fen, ausmachen. Demzufolge besteht ein Bedürfnis, die Abtrennung und Entwässerung von Mikroorganismen-Zellen aus diese enthaltenden wässrigen Phasen zu verbessern und damit diese Verfahren zur Herstellung von hochproteinhaltigen Nahrungsmitteln und Nahrungsergänzungsstoffen technisch vorteilhafter und weniger aufwendig zu machen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren in Vorschlag zu bringen, mit dem die Abtrennung von in relativ ä geringer Konzentration vorliegenden Mikroorganismen-Zellen aus einer vergleichsweise grossen Menge an wässrigem Medium, in dem diese Zellen enthalten sind, einfacher und leichter durchgeführt werden kann.

Bei einer gebräuchlichen Biosynthese wird ein Mikroorganismus auf einem wässrigen Kulturmedium, das mit diesem Mikroorganismus beimpft ist und eine Kohlenstoffquelle, Wasserstoff und Sauerstoff sowie essentielle Zeil-Nährstoffe enthält, gezüchtet. Wenn das Zellenwachstum das gewünschte Ausmaß erreicht hat, wird ein Teil des wässrigen Kulturmediums abgezogen, und daraus wird das Zeil-Produkt abgetrennt, abgetötet und getrocknet. Die zurückbleibende Flüssigkeit wird im allgemeinen in den Permentationsbehälter, in dem weiter gezüchtet wird, zurückgeleitet. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird der wässrige Anteil, der aus dem Permentationsbehälter entnommen wird, mit einer damit nicht mischbaren organischen Flüssigkeit extrahiert, bevor das Zellenprodukt abgetrennt wird. Dabei bringt man die wässrige Flüssigkeit und die damit nicht mischbare organische Flüssig-

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keit in innigen Kontakt miteinander. Als Ergebnis dieser Extraktion agglomerieren die Zellen der Mikroorganismen, und es hat den Anschein, als bildeten sie eine Art stabilisierter Ausfällung in Form einer Emulsion mit der organischen Flüssigkeit. Es ist jedoch die Art und Weise noch nicht sicher, in der die Agglomeration vonstatten geht. Da die organische Flüssigkeit mit der wässrigen Phase nicht mischbar ist, lässt sich der Extrakt leicht abtrennen, denn die Gesamtmasse setzt sich zu einer wässrigen und einer organischen Phase ab. Die beiden Phasen können beispielsweise durch Zentrifugieren oder Dekantieren in einfacher Weise voneinander getrennt werden, und das Mikroorganismen-Zellen-Produkt lässt sich aus der organischen Phase isolieren, beispielsweise dadurch, dass man das organische Lösungsmittel verdampft und die Zellen trocknet.

Beim erfindungsgemässen Verfahren verwendet man vorteilhaft als organische Flüssigkeit eine mit Wasser nicht mischbare organische Flüssigkeit, die die Mikroorganismen-Zellen benetzt. Fernerhin ist es zweckmässig, jedoch nicht unbedingt erforderlich, dass die organische Flüssigkeit eine grössere Dichte hat als die wässrige Phase, aus der extrahiert wird, d.h. die organische Flüssigkeit sollte eine Dichte von mehr als 1,0 (Du q); und es ist ferner vorteilhaft, wenn die organische Flüssigkeit leicht flüchtig ist. Diese zusätzlichen Bedingungen bieten eine Erleichterung bei der Abtrennung der organischen Phase von der wässrigen Phase und beim Trocknen des Mikroorganismen-Zellen-Produktes. Für die Zwecke des

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erfindungsgemässen Verfahrens kann man eine organische Flüssigkeit dann als flüchtig bezeichnen, wenn deren Verdampf ungswär me niedriger liegt als diejenige von Wasser. Obwohl die Verdampfungswärme der organischen Flüssigkeit lediglich niedriger zu sein braucht als diejenige von Wasser, ist es vorteilhaft, wenn die Verdampfungswärme der organischen Flüssigkeit beträchtlich niedriger liegt als diejenige von Wasser, denn wenn die Verdampfungswärme nur gering ist, so benötigt man weniger Wärme zum Abdampfen der organischen Flüssigkeit. Je weniger Wärme erforderlich ist, desto weniger aufwendig wird das Verfahren zur Rückgewinnung der Zellen. So liegt beispielsweise die Verdampfungswärme von Wasser bei 595,9 Kalorien je Gramm. Die Verdampfungswärme von Tetrachlorkohlenstoff liegt im Vergleich dazu bei 46,4 Kalorien je Gramm.

Zwar kann man beim erfindungsgemässen Verfahren irgendeine beliebige mit Wasser nicht mischbare organische Flüssigkeit verwenden, zweckmässig eine solche, mit der die Mikroorganismen-Zellen benetzt werden, jedoch haben sich einige organische Flüssigkeiten besonders vorteilhaft erwiesen. Dazu gehören beispielsweise halogenierte C,-Ch-Aliphaten (Paraffine und Olefine), vorzugsweise mehrfach halogenierte C,-C^-Aliphaten, Schwefelkohlenstoff und Toluol. Spezielle Beispiele für halogenierte Paraffine, wie sie beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden können, sind beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid, Tetraehlorkohlen-

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stoff, Methylenbromid, Trichlorfluormethan, Dichlorfluormethan, l-Brom-2-chloräthan, 1,1-Dibromäthan, 1,1-Dichloräthan, 1,2-Dichloräthan, 1,1-Dichloräthen, 1,2-Dichloräthen, Pentachloräthan, 1,1,1,2-Tetrabromäthan, 1,1,1,2-Tetraehloräthan, 1,1,2,2-Tetraohloräthan, l,l,2_>2-Tetrachlor-l,2-difluoräthan, Äthylbromid, !,l-Dichlorpropan, 1,2-Dichlorpropan, 1,5-Dichlorpropan, 2,2-Dichlorpropan, Bromtrichlormethan, 1,1,2-Tribromäthan, 1,1,1-Trichloräthan, 1,1,2-Trichloräthan, l,l,2-Trichlor-l,2,2-trifluoräthan, l-Brom-2-chlorpropan, 2-Brom-l-ohlorpropan, 1,2-Dibrompropan, 1,3-Dlbrorapropan, 2,2-Dibrompropan, 1,2,3-Trichlorpropan, 1-Chlorbutan, 2-Brombutan, 2-Brom-2-methylpropan, und dergleichen. Zu den zuvor erwähnten halogenierten Paraffinen gehören demzufolge auch solche Substanzen, die ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Halogenatome, wie Brom, Chlor und Fluor, aufweisen.

Die Extraktion der die Mikroorganismen enthaltenden wässrigen Phase mit der damit nicht mischbaren organischen Flüssigkeit kann bei einer Temperatur stattfinden, die bei oder oberhalb der Wachstumstemperatur der Mikroorganismen-Zellen liegt, wie sie üblicherweise in einem geeigneten Fermentationsbehälter eingestellt wird. Es können Temperaturen, die oberhalb der Zellen-Wachstumstemperatur liegen, eingesetzt werden, jedoch sollten sie unterhalb einer solchen Temperatur liegen, bei dem merkliche Denaturierung der Proteine auftritt. Beispielsweise kann man die organische Flüssigkeit bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und etwa 55 C, vorzugsweise

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bei etwa 35 bis etwa 45°C, und insbesondere bei etwa 4o°C zumischen. Dabei kann man die Extraktion in einem oder mehreren Mischbehältern vornehmen und dann in einem weiteren oder mehreren weiteren Behältern das Gemisch absetzen lassen, und man kann sich zusätzlich üblicher Arbeitsweisen bedienen, beispielsweise kann man rühren und dergleichen. Man kann auch die wässrige Plüssigkeit unter Verwendung von Gegenstromkolonnen oder unter Verwendung von rotierende Kontaktböden aufweisenden Kolonnen mit der organischen Flüssigkeit extrahieren.

Die Denaturierung von Protein tritt ein, wenn die Moleküle des Zeil-Eiweißes und der essentiellen Aminosäuren in Teile mit geringerem Molekulargewicht und/oder Nebenprodukte mit geringerem Nährgehalt zerbrechen, z.B. durch Säurehydrolyse. Solche Beiprodukte bringen keinen Beitrag zu dem Nährwert der Eiweißstoffe und/oder Aminosäuren der nicht mehr lebenden Mikroorganismen-Zellen oder anderen für die Ernährung wertvollen Produkten, die in solchen Zellen enthalten sind.

Die Verweilzeit, d.h. die Zeitdauer, während der die (

mit Wasser nicht mischbare Plüssigkeit in Kontakt mit der wässrigen Plüssigkeit ist, beträgt im allgemeinen etwa 1 Minute bis 1 Stunde oder mehr, vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 30 Minuten. Man erhält keine wesentlich verbesserten Resultate, wenn man die Verweilzeit über eine Zeitdauer von mehr als 30 Minuten ausdehnt, jedoch kann man solche verlängerten Zeiten gewUnschtenfalls ohne weitere» verwenden, da solche Verweilzeiten nicht kritisch sind.

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Die Menge an mit Wasser nicht mischbarer Flüssigkeit, die zum Extrahieren der wässrigen Flüssigkeit eingesetzt wird, kann über einen weiten Bereich variieren. Im allgemeinen beträgt das Mengenverhältnis von organischer Flüssigkeit zu wässriger Flüssigkeit zwischen etwa 1:20 und etwa 100:1. Vorzugsweise setzt man ein Mengenverhältnis an organischer Flüssigkeit zu wässriger Flüssigkeit zwischen etwa 1:10 und etwa 10:1, insbesondere zwischen etwa 1:3 und etwa 3:1 ein. Die Menge an eingesetzter organischer Flüssigkeit ist nicht kritisch und variiert mit deren physikalischen Eigenschaften.

Wie zuvor ausgeführt agglomerieren die Mikroorganismen-Zellen in der organischen Flüssigkeit und bilden eine stabilisierte Ausfällung oder Emulsion, wenn die wässrige Flüssigkeit mit der organischen Flüssigkeit zusammengebracht wird. Je nach der verwendeten organischen Flüssigkeit schwimmen die Agglomerate oder sie sinken nach unten. In den meisten Fällen verbleiben 60 bis 70 % des in der ursprünglichen wässrigen Flüssigkeit vorhandenen Wassers in der wässrigen Phase, und die restlichen 30 bis 40 # bilden eine Suspension mit den Mikroorganismen-Zellen und der organischen Flüssigkeit. Wenn die Verweilzeit länger als 15 Minuten dauert, dann bricht die Suspension, und im Zusammenhang damit geht noch weiteres Wasser in die wässrige Phase über. Jedoch wurde gefunden, dass praktisch alle Zellen, die in der anfänglichen wässrigen Flüssigkeit vorhanden sind, sofort nach dem Zusammenmischen der organischen Flüssigkeit mit der wässrigenPhase und nach a&m

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Absetzen in zwei Phasen in die organische Phase übergegangen sind.

Da die organische Flüssigkeit mit der wässrigen Flüssigkeit nicht mischbar ist, bilden sich bei der Extraktion eine wässrige Phase und eine organische Phase. Diese Phasen trennen sich schnell voneinander ab, nachdem das Zusammenmischen erfolgt ist, und sie können demzufolge leicht mit üblichen Arbeitsmethoden, beispielsweise durch Dekantieren voneinander getrennt werden. Die organische Flüssigkeit, die die Mikroorganismen-Zellen enthält, wird dann einer weiteren Abtrennung (Filtration, Zentrifugation) und/oder einem Abdampfen unterworfen, wobei übliche Arbeitsweisen eingesetzt werden, beispielsweise in einem Gefrierbehälter, einem Trommeltrockner, einer Sprühtrocknungsanlage, einem Heißtrockner usw. gearbeitet wird, und dabei werden die Zellen der Mikroorganismen zurückgewonnen. Das verdampfte organische Lösungsmittel kann gewünschtenfalls in üblicher Weise wiedergewonnen und gewaschen oder, falls notwendig, aufgearbeitet und dann für neuen Einsatz wieder verwendet werden. . i

Nachdem die Mikroorganismen-Zellen von der organischen Flüssigkeit abgetrennt worden sind, kann man die Zellen in eine übliche Trockeneinrichtung, beispielsweise einem Sprühtrockner, geben und darin die Zellen trocknen und Jegliches Leben der Zellen unterbinden. Das getrocknete Zeil-Produkt kann als Nahrungsmittelzusatz verwendet werden. Es ist Jedoch nicht unbedingt notwendig, dass man die Zellen trocknet, denn man kann auch die abgetrennten Zellen als solche direkt für andere als Nahrungsmittelzwecke verwenden, beispielsweise für

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die Gewinnung von Intereellular-Chemikalien, wie beispielsweise Ester. Ferner kann man das Leben in den Zellen durch andere Mittel als Trocknen unterbinden und dann das Produkt für Nahrungsmittelzwecke verwenden.

Wenn man die Fermentation zur Herstellung von eiweißreichen Mikroorganismen für Nahrungsmittelzwecke durchführt, muß man jegliches Leben in den Zellen, bevor man sie für diese Zwecke einsetzt, vollständig abtöten. Gewöhnlich werden die Zellen durch Erhitzen, in Sprühtrocknern, bei geeigneten Temperaturen über die erforderlichen Zeitspannen abgetötet. Spezielle Temperaturen und Zeiten, die unter bestimmten Bedingungen eingesetzt werden müssen, hängen von den spezifischen zu tötenden Mikroorganismen ab, von dem Ausmaß der gewünschten Pasteurisierung und so weiter. Jedoch sollte sorgfältig darauf geachtet werden, dass keine so hohen Temperaturen angewendet werden, bei denen das Zeil-Eiweiß abgebaut wird.

Die Abtotungstemperaturen können zwischen etwa 65 und 235 C während Zeitspannen zwischen einer Sekunde und etwa 2 Stunden liegen, und wenn kürzere Zeiten angewendet werden, können auch höhere Temperaturen eingesetzt werden, und umgekehrt. Im allgemeinen sieht man dafür Temperaturen zwischen etwa 115 und etwa 195⁰C über Zeiten von 5 Sekunden bis etwa 15 Minuten vor, und unter diesen Bedingungen lassen sich die meisten Mikroorganismen vollständig abtöten. Man kann auch überatmosphärischen Druck, beispielsweise 2 bis 50 Atmosphären verwenden, und setzt solche Drücke im allgemeinen dann ein, wenn die Pasteurisierung bei den niedrigen Temperaturen, beispielsweise 115 bis 120 C und den dazu gehörigen Zeitspannen

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durchgeführt wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren zum Zurückgewinnen von Mikroorganismen-Zellen lasst sich im Anschluss an jedes Permentations-Verfahren, das man zur Züchtung von Mikroorganismen auf Kohlenstoff enthaltenden Substraten, beispielsweise Kohlenhydrat- und Erdöl-Substraten, einsetzt, verwenden. Besonders geeignet ist das erfindungsgemässe Rückgewinnungsverfahren für solche Permentationsprozesse, in denen Kohlenwasserstoff nährböden verwendet werden. Die vorliegende Beschreibung enthält demzufolge vielfach Hinweise auf eine solche Permentation.

Kohlenwasserstoff-Beschickungen, die bei mikrobiologischen Fermentationen verwendet werden können, sind ^ci~^C35 Erdölbeschickungen, vorzugsweise Gasöle, die einen Siedebereich zwischen etwa 190 und etwa 400°C, vorzugsweise zwischen 190 und etwa 520⁰C haben. Andere geeignete Beschickungen sind geradkettige und verzweigte C₁-C-,^ Paraffine, Cycl oparaff ine, Monoolefine, Diolefine, aromatische Substanzen und Mischungen dieser. Beschickungen, die in grossen Mengen zur Verfügung stehen und sich besonders eignen, sind geradkettige C₁₁-C^₀ Paraffine aus Gasölen, niedrigsiedendem Naphtha und übliche gasförmige Beschickungen, wie beispielsweise Methan, Ä"than, und Propan sowie Mischungen dieser, wie Naturgas. Wenn unter Normalbedingungen gasförmige Beschickungen eingesetzt werden, so leitet man diese natürlich direkt als Gase in das wässrige Kulturmedium ein, beispielsweise durch Verteilköpfe. Weiterhin ist eine vorteilhafte Beschickung eine'solohe, die einen er-

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heblichen Gewichtsanteil, beispielsweise 70 Gewichtsprozent an geradkettigen Paraffinkohlenwasserstoffen mit 1 bis 35 C-Atome enthält. Man kann zwar die Anwesenheit von verzweigten, nicht aromatischen Kohlenwasserstoffen in Mengen bis zu 30 Gewichtsprozent der Kohlenwasserstoffbeschickung tolerieren, Konzentrationen von mehr als 10 Gewichtsprozent von nicht geradkettigen, nicht aromatischen Kohlenwasserstoffen sollten jedoch im allgemeinen vermieden werden, da die nachstehend beschriebenen Mikroorganismen vorzugsweise selektiv auf geradkettige Kohlenwasserstoffe, speziell kurzkettige (^cip"^cP0 η-Paraffine eingestellt sind.

Eine besonders bevorzugte Kohlenwasserstoffbeschickung ist eine C/r-C,- Beschickung, die gereinigt worden ist, so dass der Anteil an sowohl polycyclischen als monoeyclischen Aromaten auf weniger als 0,5 Gewichtsprozent, vorzugsweise weniger als 0,1 Gewichtsprozent und insbesondere weniger als etwa 100 ppm vermindert ist.

Man reinigt die Kohlenwasserstoffbeschickung vorzugsweise

so, dass man die geradkettigen Kohlenwasserstoffe, vorzugs-

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weise Paraffine, an 5 A-Molekularsieben adsorbiert und anschliessend desorbiert, und dann die desorbierten geradkettigen Kohlenwasserstoffen an 13 X-Sieben oder Silikagel aufarbeitet, um die noch verbliebenen Uhreinigkeiten, insbesondere Aromaten, zu adsorbieren. Bei diesem Verfahren werden die geradkettigen Kohlenwasserstoffen an den Molekularsieben selektiv adsorbiert und demzufolge vollständig von Aromaten gereinigt.

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Ein Verfahren zur Durchführung dieses Reinigungs-Prozesses ist in dem amerikanischen Patent 3,070,542 beschrieben« Die Aufarbeitung der desorbierten geradkettigen Kohlenwasserstoffe kann so durchgeführt werden, wie dies in den amerikanischen Patenten 3,228,995 und 3,233,003 beschrieben ist.

Die gereinigte Kohlenwasserstoffbeschickung enthält im allgemeinen etwa 90+ Gewichtsprozent an C₁-CL₅₁- n-Paraffinen und bis zu etwa 10 Gewichtsprozent an n-01efinen. Man bevorzugt eine solche gereinigte Kohlenwasserstoffbeschickung, die etwa 95+ Gewichtsprozent an C₁₁-C₅₁- η-Paraffinen und bis zu etwa 5 Gewichtsprozent an geradkettigen Olefinen, die 11 bis 30 Kohlenstoffatome enthalten, aufweist. Als C₁₁-O^₀ n-Paraffinbeschickung kann man Erdölbeschickungen, z.B. Gasöle, die im Bereich zwischen etwa I90 und etwa 400 C, insbesondere zwischen etwa I90 und etwa 320 C sieden, einsetzen.

Die Menge an zugegebener Kohlenwasserstoffbeschickung liegt zwischen etwa 0,5 und etwa 10 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 1 und etwa 5 Gewichtsprozent und insbesondere zwischen etwa 0,5 und 2 Gewichtsprozent, bezogen auf die GeT samtmenge an eingesetztem wässrigem Nährmedium, wenn gewöhnliche Luft als das Sauerstoff tra-gende Medium verwendet wird. Wenn man mit Sauerstoff angereicherte Gase, z.B. Gase mit 7Of Gewichtsprozent Sauerstoff einsetzt, so liegt eine bevorzugte Menge an Kohlenwasserstoffbeschickung in dem Behälter zwischen etwa 2 und etwa 5 Gewichtsprozent, berechnet auf die Gesamtmenge an wässrigem Nährmedium. Der Gewichtsanteil an beispielsvfeise geradkettigen Ο,,-Ο-.« Kohlenwasserstoffen

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der in der Schlammzone des Permentationsbehälters während des Zellwachstums und der Zellaktivität tatsächlich vorliegt, kann zwischen etwa 0,01 und etwa 1,0 Gewichtsprozent betragen, befindet sich jedoch in der Regel zwischen etwa 0,01 und etwa 0,1, vorzugsweise zwischen etwa 0,01 und etwa 0,05 Gewichtsprozent, berechnet auf die Gesamtmenge an flüssigem Nährmedium.

Das erfindungsgemässe verbesserte Verfahren zur Zurüekgewinnung von Mikroorganismen lässt sich auf alle mikrobiologischen Züchtungen anwenden. So können beliebige Mikroorganismen, die für mikrobiologische Züchtungen eingesetzt werden, mittels des erfindungsgemassen Verfahrens zurückgewonnen werden. Dazu gehören Bakterien, Pilze und Hefen. Bezogen auf die unter Verwendung von Kohlenwasserstoffbeschickungen arbeitenden biosynthetischen Prozesse können alle Mikroorganismen erfindungsgemäss behandelt werden, die fähig sind, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren.

Obwohl das erfindungsgemässe Verfahren für einen breiten Bereich verschiedener Mikroorganismen arbeitsfähig ist, gibt es neun Mikroorganismen, die sich ganz speziell für die Kohlenwasserstoff-Assimilation eignen. Diese Mikroorganismen sind nachstehend zusammen mit der entsprechenden A.TCC-Registriernummer aufgeführt, die festgelegt wird^ dadurch, dass Proben bei der American Type Culture Collection in Washington, D.C. hinterlegt werden.

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BAD ORIGINAL Name des Mikroorganismus ATCC-Nummer

Micrococcus cerificans 14987

Pseudomonas ligustri 15522

Pseudomonas pseudomallei 1552J5

Pseudomonas orvilla 15524

Alcaligenes sp. 15525

Cellumonas galba 15526

Brevibacterium lnsectiphilium 15528

Corynebacterium sp. 15529

Corynebacterium pourometabolum 15530

Es versteht sich, dass die spezielle Klasse und Unterklasse der verwendeten Bakterien sich nach der im Einzelfall eingesetzten Beschickung richtet. Beispielsweise verwendet man bevorzugt Mikroorganismen der Klasse Pseudomonadaceae, wie beispielsweise Pseudomonas methanica, wenn man die Mikroorganismen auf Methan oder anderen gasförmigen Paraffin-Beschickungen züchtet. Wenn die Biosynthese unter Verwendung von niedrig siedender Naphtha-BeSchickung durchgeführt wird, dann setzt man als bevorzugte Gruppe von Mikroorganismen Pseudomonadaceae und Arthrobacter, wie beispielsweise Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas desmolyticum, Pseudomonas aeruginosa und Arthrobacter globiforme ein.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Biosynthese in der Weise durchgeführt, dass man mit Bakterien beimpft, insbesondere mit gram negativen coccus bacterien; man kann auch Hefen verwenden, beispielsweise Torulopsis magnolia, Candida

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albicans oder Sacchoromyces sp.

Zwar kann man beliebige aerobe Bakterien-Zellen, die geradkettige C, bis CUf- Kohlenwasserstoffbesehickungen zu assimilieren vermögen, einsetzen, jedoch sind folgende Bakterien zu bevorzugen: Microoocous cerificans (Arthrobacter ureafaciens), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Nocardia opaca, Nocardia rubra, Nocardia coralina, Pseudomonas methanica, Pseudomonas desmolyticum und P^ycobacterium phlele.

Ganz speziell bevorzugt ist der Mikroorganismus Microooccus cerificans, wie er von Dr. R. E. Kallio und Mitarbeitern isoliert und identifiziert worden ist, beschrieben im Journal of Bacteriology, Vol. 78, Nr. 3, Seiten 441-448 (September 1959). Kulturen dieses Organismus sind in der American Type Culture Collection, 212 M Street, Northwest, Washington 7, D.C. hinterlegt und haben die Nummer 14987. erhalten. Die vollständige Beschreibung dieses Materials lautet wie folgt:

Morphologie: Die Zellen sind klein, sphärisch, neigen dazu, in alten Kulturen und in Medien mit hohem Stickstoffgehalt elliptische Formen anzunehmen. Zellen auf gereinigten Medien haben durchschnittlich Durchmesser von 0,5 bis 1,0/U, auf komplexen Medien Zellendurchmesser von 1,0 bis 2,fyu. Die Zellen erscheinen einzeln oder in Haufen. Immotile, Metachromatische Körner und sudanophile Körner werden nicht beobachtet.

Gram-Reaktion: negativ

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Kolonien auf gereinigtem Agar sind klein (1 mm), rund, konvex und haben vollständige Kanten. Kolonien auf Nähragar bilden grossere (2 bis 5 mm) erhöhte Schleime, die im allgemeinen rund sind.

Pigmentation: weiß, beige oder gelbbraun verschiedener Variationen.

Stets aerob. Eine grosse Vielzahl von Nährboden-Materialien; Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, langkettige Alkohole und Säuren, langkettige geradkettige Alkane und Olefine.

Kohlenhydrat-Fermentation: Es werden keine Kohlenhydrate fermentiert. Unter aeroben Bedingungen werden zahlreiche Kohlenhydrate assimiliert. Dazu gehören Glucose, Maltose, Mannitol, Sucrose, Lactrose, Arabinose, Rhamnose, Sorbitol, Dulcitol und Inulin. Unter aeroben Bedingungen erfolgt Säurebildung beim Einsatz von Glucose. Es wurde Glucon-Säure identifiziert.

Nitratreduktion: Negativ

Gelatine-Verflüssigung: Allgemein negativ. Bei einigen Stämmen kann langsame Verflüssigung vorkommen.

Harnstoffhydrolyse: Negativ oder langsame Hydrolyse Es wiI'd Katalase gebildet.

Wasserstoff wird nicht benötigt.

Die optimale Temperatur beträgt 25°c.

Der optimale pH-Wert für das ./achstum liegt bei 7*0 bis

Fundort: Boden aus Iowa
Vorkommen: Böden

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Es sei darauf hingewiesen, dass eine weiter zurückliegende Identifizierung zeigt, dass dieser Organismus eher ein Arthrobacter als ein Micrococcus ist und sehr ähnlich ist dem Arthrobacter ureafaciens. Die folgende Zusammenstellung bringt die Gründe, warum die Identifizierung dieses Organismus als ein Arthrobacter zu bevorzugen ist:

Micrococcus

Stets gram positiv
in den Anfängen der
Fermentation

Zellen in unregelmässigen Massen

Keine Grössenveränderung

Tritt niemals in
Stabform auf.

Kohlenhydrate
werden häufig
fermentiert.

"M.Cerificans"

Stets gram negativ

wie Arthrobacter

wie Arthrobacter

wie Arthrobacter

wie Arthrobacter

Arthrobacter

Gram negativ oder verschieden

Es kann kurze Padenbildung mit einigen rudimentären Sprossen erfolgen.

Manchmal können grussere als die üblichen coccoidalen Zellen auftreten.

Grosse coccoidale Zellen begünstigen das Anwachsen zu stabförmigen Zellen.

Geringe oder keine Säurenbildung aus Kohlenhydraten.

Dem Kulturmedium wird Sauerstoff in irgendeiner beliebigen Form, in der er von den aufgeimpften Mikroorganismen leicht assimiliert werden kann, zugegeben. Man kann alle Sauerstoff enthaltenden Verbindungen benetzen, sofern diese das Wachstum der Zellen der Mikroorganismen und die Umsetzung der Kohlenwasserstoffbeschickung zu Mikroorganismen-Zellen nicht schädigen. Im allgemeinen wird Sauerstoff in Form eines Sauerstoff enthaltenden Gases, beispielsweise Luft, die

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zwischen etwa I9 und etwa 22 Gewichtsprozent Sauerstoff enthält, zugeführt. Zwar ist die Benutzung von Luft bevorzugt, man kann jedoch auch mit Sauerstoff angereicherte Luft, die einen höheren Gehalt als 22 Gewichtsprozent Sauerstoff hat, einsetzen. Gewöhnlich führt man zwischen 0,1 und etwa 10, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 und 4,0 und insbesondere zwischen 0,8 und etwa 2,5 Volumina an Luft je Minute pro Volumen der Fermentationsbad-Flüssigkeit in dem Behälter zu.

PUr die Biosynthese ist Stickstoff wichtig. Man kann als Stickstoffquelle eine beliebige organische oder anorganische Stickstoff enthaltende Verbindung einsetzen, aus der Stickstoff in einer zur Verwendung durch die Mikroorganismen geeigneten Form freigesetzt wird. Unter den organischen Substanzen können die folgenden Verbindungen als Beispiele für zu verwendende Stickstoff enthaltende Stoffe zusammengestellt werden: Proteine, saurehydrolysierte Proteine, enzymatisch aufgeschlossene Proteine, Aminosäuren, Hefeextrakte, Asparagin, Harnstoff usw. Im allgemeinen ist es zweckmässig, weil wenig aufwendig, anorganische Verbindungen, wie beispielsweise Ammoniak, Ammoniumhydroxyd oder dessen Salze, wie beispielsweise Ammoniumphosphat, Ammoniumeitrat, Ammoniumsulfat, saures Ammoniumphosphat und dergleichen einzusetzen. Eine sehr einfache und ausreichende Methode der Stickstoffzugabe besteht darin, dass man Ammoniumhydroxyd, Ammoniumphosphat oder saures Ammoniumphosphat einsetzt, das als Salz direkt zugegeben werden oder in dem wässrigen Permentationsmedium in der Weise herge-

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stellt werden kann, dass man Ammoniakgas durch die Nährbrühe, zu der man zuvor Phosphorsäure zugegeben hat, hindurchperlen lässt und dabei saures Ammoniumphosphat bildet. Auf diese Weise hält man den pH-Bereich zwischen 5,0 und 8,5 und führt den erforderlichen Stickstoff zu. Man kann Ammoniumhydroxyd dem Biosynthese-Bad in Mengen zwischen etwa 0,01 und etwa 1,0 Gewichtsprozent, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 0,15 Gewichtsprozent Stickstoff, berechnet auf die Gesamtmenge des Fermentationsbades, beigeben.

•Pur gutes Wachstum der Mikroorganismen ist es auch noch notwendig, die erforderlichen Mengen an bestimmten Mineralnährstoffen dem Biοsynthese-Bad zuzugeben. So werden dem wässrigen Nährmedium Kalium, Natrium, Eisen, Magnesium, Calcium, Mangan, Phosphor und sonstige Nährstoffe zugefügt. Diese notwendigen Stoffe können in Form ihrer Salze, vorzugsweise ihrer wasserlöslichen Salze beigegeben werden. Beispielsweise setzt man Kalium als Kaliumchlorid, -phosphat, -sulfat, -citrat, -acetat, -nitrat usw. zu. Eisen und Phosphor können in Form der Sulfate und Phosphate, insbesondere als Eisensulfat und Eisenphosphat beigefügt werden. Im allgemeinen setzt man die Hauptmenge des Phosphors in Form von Ammoniumphosphat zu. Wenn man Ammoniumphosphat oder saures Ammoniumphosphat verwendet, so kann diese Verbindung gleichzeitig als Stickstoff- und Phosphor-Quelle (Phosphation) für das Wachstum der Mikroorganismen dienen. Die folgende Tabelle enthält eine Zusammenstellung der mineralischen Nährstoff-Ionen und ihrer üblicherweise in wässrigen Kulturmedien eingesetzten Mengen.

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Mineral

H3PO4	P S &	Na
KCl	K &	Cl
MgSO4 CaCl2	Mg Ca
PeSO4	Pe
MnSO4	Mn

Gewichtsprozent an dem wässrigen Medium zugesetzten Salzen, berechnet für das Wachstum von 1 Gewichtsprozent Zellen-Konzentrat i on

0,01 -	1,0
0,01 -	0,5
0,01 -	0,5
0,005 -	0,5
0,005 -	0,5
0,001 -	0,1
0,001 -	0,1

In allen vorstehend aufgeführten Fällen können die angegebenen Ionen in Form von anderen Salzen in entsprechenden stöchiometrischen Mengen zugefügt werden.

Die Temperatur, bei der die mikrobiologische Züchtung vorgenommen wird, kann zwischen etwa 20 und etwa 55 C variieren, je nach der speziellen Art des verwendeten Mikroorganismus, jedoch arbeitet man gewöhnlich bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 45°C Besonders zweckmässig ist es, die Fermentation bei Temperaturen zwischen 25 und etwa 40°C vorzunehmen .

Der pH-Wert des wässrigen Kulturmediums wird im allgemeinen zwischen etwa 5*0 und etwa 8,5 gehalten. Wenn der pH-Wert zu hoch vrird, so kann man ihn dadurch wieder erniedrigen, dass man eine geeignete Säure, beispielsweise H^PO₄ dem Fermentationsmedium zugibt. In ähnlicher Weise kann man, wenn der pH-Wert zu niedrig wird, diesen durch Zugabe einer geeigneten Base, z.B. Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd, erhöhen.

1 0 H ^r— -. /

9 7

BAD ORIGINAL

Beim Ansatz der Kultur wird das Kulturmedium mit dem verwendeten Mikroorganismus beimpft, beispielsweise mittels einer Teilmenge eines gleichen Mediums, in dem zuvor der gleiche Mikroorganismus gezüchtet worden ist. Das Beimpfen kann man auch so vornehmen, dass man beispielsweise eine Impfmenge eines unterschiedlichen Mediums, in dem dieser Mikroorganismus zuvor gezüchtet worden ist, abnimmt und dem Fermentationsbehälter bzw. den Behältern, zugibt.

Während der Biosynthese kann durch gebräuchliche Einrichtungen, beispielsweise mit einem Schaufelrührer, einem Propellerrührer, einer Vibratoreinrichtung oder sonstiger Bewegungseinrichtungen in dem Reaktor gerührt werden, damit der Sauerstoff, der Kohlenwasserstoff, der Mikroorganismus und die essentiellen Zellen-Nährstoffe vollständig dispergiert werden. Man kann beispielsweise einen Schaufelrührer einsetzen, der 1 bis 100, vorzugsweise 5 bis 30 PS je etwa 3785 Liter an flüssigem Reaktionsmedium hat. Bevorzugte Rührgeschwindigkeiten mit einem Schaufelrührer liegen bei mehr als 1000 UpM, vorzugsweise mehr als 1500 UpM.

Die Verweilzeit der Flüssigkeit bei Bakterien, wie Micrococcus cerificans (Arthrobacter ureafaciens) liegt im allgemeinen bei 1 bis 10 Stunden, vorzugsweise 1 bis 3 Stunden und insbesondere 1,5 bis 2,5 Stunden. Das erfindungsgemässe Verfahren kann entweder ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.

Beispiel 1

In einem wässrigen Biosynthese-Bad, das 1,0 Gewichtsprozent n-Hexadekan als Kohlenwasserstoffbeschickungsmedium ent-

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hält, wurde kontinuierlich Micrococcus cerificans gezüchtet. In einen 7*5 Liter Biosynthese-Behälter wurden 4 Liter des wässrigen Nährmediums, das mit 1,0 Gewichtsprozent Micrococcus cerificans Bakterien beimpft worden war, eingefüllt. Durch den beimpften Slurry wurde so ausreichend Luft hindurchperlen gelassen, dass der Sauerstoffbedarf der Bakterien gedeckt war, bevor die aus Kohlenwasserstoff und anorganischen Salzen bestehende Nähr-BeSchickung (die Phosphorsäure und Ammoniumhydroxyd enthielt) zugegeben wurde. Eine typische Zusammensetzung für das Biosynthese-Bad in einem gegebenen typischen Stadium einer kontinuierlichen Biosynthese ist folgende:

Bestandteile g/Liter

n-Hexadekan 10

H₃PO₄ 5

KCl 1

CaCl₂ 0,5

MgSO₄.7 H₂O 0,2 {

PeSO₄.7 H₂O 0,2

NaCl 0,2

NH₄OH, in ausreichender Menge
zur Aufrechterhaltung eine's
pH-Wertes von 7»0 zugegeben

Die Temperatur in dem Biosynthese-Bad wurde während des Wachstums bei 35°C + 2°C gehalten und der pH-Wert wurde im wesentlichen neutral, d.h. bei etwa 7,0 + 0,1 während der gesamten Biosynthese-Zeit einreguliert. Die Umsetzung der Kohlenwasser stoffbeSchickung zu Zellen wurde bei 90 % und höher ge-

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halten. Nach einer Verweilzeit von etwa 2 Stunden wurde kontinuierlich ein Strom des wässrigen Slurry-Produktes aus dem Biosynthese-Bad abgezogen. Dieser Strom des wässrigen Slurry-Produktes enthielt etwa 1 Gewichtsprozent Bakterienzellen neben unumgesetztem Kohlenwasserstoff, anorganischen Salzen, Nährstoffen usw.

Beispiel 2

Ansatz 1:

In eine schmale Glaskolonne, die in der Mitte einen Eingang für die Beschickung und oben und am Boden Auslässe aufwies, wurden 30 ecm des wässrigen Slurry-Produktes aus dem Biosynthese-Behälter des Beispiels 1 eingefüllt. Dann wurden der Glaskolonne 10 ecm Methylenchlorid (Dichlormethan) zugegeben, und es wurde mit dem wässrigen Slurry durchgemischt. Die Temperatur betrug bei der Zumischung etwa 21,1°C. Spontan trat bei Einführung von Methylenchlorid eine Agglomeration der Mikroorganismen-Zellen in dem Methylenchlorid auf. Man liess dann das Gemisch etwa 30 Minuten lang absitzen. Der Hauptteil der wässrigen Phase verblieb als überstehende Schicht. Die resultierende organische Phase wurde von der wässrigen Phase abgetrennt, und die Mikroorganismen-Zellen wurden durch Abstrippen zwecks Entfernung des Methylenchlorides und des eingeschlossenen Wassers isoliert. Es wurde praktisch die Gesamtmenge der in dem eingesetzten wässrigen Slurry-Produkt enthaltenen Mikroorganismen-Zellen zurückgewonnen. In dem agglomerierten Produkt waren etwa 40 $ des ursprünglichen wässrigen Slurrys enthalten.

Ansatz 2:

Das Verfahren des Ansatzes 1 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, dass 30 ecm Methylenchlorid verwendet wurden.

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Es wurden praktisch alle Mikroorganismen-Zellen aus dem wässrigen Slurry gewonnen, und etwa 42 % des eingesetzten wässrigen Slurrys waren in dem agglomerierten Produkt enthalten.

Ansatz 3:

Es wurde die Arbeitsweise des Ansatzes Nr. 1 wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, dass 90 ecm Methylenchlorid verwendet wurden. Alle Zellen Hessen sich aus dem wässrigen Slurry entfernen, und etwa 50 % des ursprünglichen wässrigen Slurrys waren in dem agglomerierten Produkt vorhanden. ™

Beispiel 3

Es wurde wie im Beispiel 2, Ansatz 1, beschrieben gearbeitet, jedoch wurden 10, 30 bzw. 90 ecm Methylenchlorid bei einer Temperatur von etwa 38 C dem wässrigen Slurry zugegeben. In jedem der drei Ansätze wurd31 praktisch alle Zellen aus dem xtfässrigen Slurry entfernt. Die Menge an ursprünglichem wässrigem Slurry, die in dem agglomerierten Produkt vorhanden war, betrug etwa 20, 23 bzw. 30 Gewichtsprozent für die unter Verwendung von 10, 30 bzw. 90 ecm Methylenchlorid durchgeführten j Ansätze.

Beispiel 4

Es wurde wie in Beispiellbeschrieben gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, dass als organische Flüssigkeiten in unterschiedlichen Ansätzen Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Schwefelkohlenstoff und Toluol eingesetzt wurden. Bei allen in diesem Beispiel verwendeten Lösungsmitteln waren die Ergebnisse etwa die gleichen, wie sie in den Beispielen 2 und 3 erzielt" worden waroii.

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BAD ORIGINAL

Beispiel 5

Wiederum wurde wie in Beispiel 2, Ansatz 1, beschrieben gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, dass Aceton, Äthanol, Hexan und Varsol (ein aliphatisches Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel) eingesetzt wurden. Keine dieser organischen Flüssigkeiten führte zur Agglomerierung des Mikrobakterien-Zellen-Produktes und gab daher bei der Abtrennung der Zellen von dem wässrigen Slurry keinen Effekt. Aceton und Äthanol sind mit dem wässrigen Slurry mischbare Flüssigkeiten, wohingegen Hexan und Varsol die Mikroorganismen nicht bevorzugt benetzen.

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Claims (1)

1. Esso Research and
   Engineering Company

   Patentansprüche

   Patentansprüche

   1. Verfahren zum Zurückgewinnen von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässrigen Medium enthaltene Mikroorganismen mit einer mit dem wässrigen Medium nicht mischbaren organischen Flüssigkeit, vorzugsweise einer solchen, die die Mikroorganismen benetzt, extrahiert und aus dem organischen Extrakt die Mikroorganismen isoliert.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass έ man das Extrahieren bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und

   etwa 55⁰C durchführt.

   j5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine organische Flüssigkeit verwendet, die eine grössere Dichte hat als das wässrige Medium.

   4, Verfahren nach Anspruoh 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, dass man als organische Flüssigkeit eine aliphatische halogenier- · te C₁ bis Cj,-Verbindung einsetzt.

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   I b 4 ^ 6 8 9

   5. Verfahren naoh Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als organische Flüssigkeit Chloroform, Methylenehlorid, Tetrachlorkohlenstoff, Schwefelkohlenstoff oder Toluol einsetzt.

   6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Gattung Micrococcus cerificans zurückgewinnt.

   7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine organische Flüssigkeit verwendet, deren Verdampf ungswarme niedriger ist als die Verdampfungswärme von Wasser.

   8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7* dadurch gekennzeichnet, dass man die organische Flüssigkeit in einem Volumenverhältnis zu dem wässrigen Medium in der Grössenordnung zwischen etwa 1:20 und etwa 100:1 verwendet.

   9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die organische Flüssigkeit in einem Volumenverhältnis zu dem wässrigen Medium von etwa 1:3 verwendet.

   10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Extraktion mit der organischen Flüssigkeit während einer Kontaktdauer der organischen Flüssigkeit mit dem wässrigen Medium zwischen etwa 1 Minute und etwa 1 Stunde durchführt.

   11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismen enthaltendes wässriges Medium einen von einem wässrigen Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, Wasserstoff, Sauerstoff und essentielle Zeil-Nährstoffe enthält, und worin Mikroorganismen gezüohtet worden sind, abge-

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   zogenen wässrigen Slurry verwendet,

   12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismen Micrococcus cerificans, als organische Flüssigkeit Methylenchlorid verwendet, bei einer Temperatur von etwa 45⁰C extrahiert und dabei das Methylenchlorid in einem Volumverhältnis zu dem wässrigen Medium zwischen etwa 1:5 und etwa 5*1 verwendet.

   15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5 und 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen solchen des unter der Nummer 14987 in der American Type Culture Collection hinterlegten Stammes verwendet.

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