DE1618598C

DE1618598C - Verfahren zur Herstellung von 17alpha-Acyloxy-21-hydroxy-steroiden der Pregnan-Reihe

Info

Publication number: DE1618598C
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Koninklijke Nederlandsche Gist en Spiritusfabriek BV
Current assignee: DSM Delft BV
Publication date: 1972-08-24

Description

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sators, wobei etwa vorhandene andere Hydroxyl- und mit Methylisobutylketon gewaschen und ge-

gruppen ebenfalls verestert werden. So kann die trocknet. Das auf diese Weise erhaltene kristalline

Methode, wie sie in J. Am. Chem. Soc, 75, S. 3489 Produkt (39,8 g) wird durch Lösen in 200 ml warmen

bis 3492 (1953), beschrieben ist, angewendet werden, Aceton, Behandeln der Lösung mit Ig Aktivkohle

wobei die Verwendung von Säurechloriden oder 5 und Eindampfen auf etwa 80 ml umkristallisiert.

Anhydriden mit Toluolsulfonsäure als saurer Kataly- Auf diese Weise werden 35,4 g reinen 17a-Mono-

sator zu empfehlen ist. acetate der Verbindung S erhalten.

Während der Inkubation des Ausgangssteroids Aus der Mutterlauge können noch 7,4 g der Ver-

mit dem Enzym muß Sorge dafür getragen werden, bindung S-17«-Monoacetat isoliert werden, wodurch

daß der pH-Wert kleiner als etwa 6,5 ist, da sonst io die Ausbeute auf 94,8% der Theorie steigt. Der

eine Umesterung des 17«-Acylats in das 21-Acylat Schmelzpunkt beträgt 203 bis 206⁰C; [<x]d=+40,8°

vor sich gehen kann. Die Konzentration des Substrats (c = 1 in Dioxan), Elü, bei 241 ηιμ in .Methanol

wird aus wirtschaftlichen Gründen so hoch wie möglich = 432.

S^ewählt· Beispiel2

Mit Vorzug wird die Umwandlung mit Hilfe von 15

Dünnschichtchromatographie oder Papierchromato- In der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben,

graphie verfolgt. Die Inkubation findet bei Tempera- wird eine Impfkultur von Flavobacterium dehydro-

turen zwischen 20 und 40⁰C während 5 bis 70 Stunden genans hergestellt, wonach wiederum zehn Portionen

statt. Sobald das gesamte Substrat umgewandelt von je 1 Liter des erwähnten Mediums in zehn Schüttel-

worden ist, wird die Kultur mit einem organischen 20 trichtern von einer Kapazität von 2 Litern inokuliert

Lösungsmittel extrahiert, wie z. B. Methylenchlorid, werden.

Chloroform, Äthylacetat oder Methylisobutylketon. Nach 18stündigem Wachsenlassen werden 10 g

Der Extrakt wird konzentriert und das Produkt kri- 3^,17«-21-Trihydroxy-5-pregnen-3,20-dion-3,17,21-tri-

stallisiert. Durch Umkristallisieren z.B. aus Aceton acetat, suspendiert in 200 cm³ Wasser, zu jedem der

kann das gewünschte Produkt in reiner Form erhalten 25 Kolben zugegeben, wonach der pH-Wert auf 6,2

werden. mit Phosphatpuffer eingestellt und die Inkubation

Die nach der Erfindung herzustellenden 17a-Acyl- in gleicher Weise fortgeführt wird.
oxy-21-hydroxysteroide der Pregnan-Reihe sind wert- Aus den Papierchromatpgrammen sieht man, daß

volle Produkte, die als Therapeutika verwendet werden nach 24 Stunden das gesamte Substrat in das 17«-

können. Sie zeigen eine lokale antiphlogistische Wir- 30 Monoacetat der Verbindung umgewandelt worden

kung, die länger andauert als die der entsprechenden ist, wobei eine sehr geringe Menge der Verbindung S

I7a-Hydroxy-Verbindungen. und Spuren von Verunreinigungen vorliegen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch Die Kulturen werden durch 17₂stündiges kräftiges

die folgenden Beispiele veranschaulicht. Rühren mit einer gleichen Menge warmen Methyl-

... 35 isobutylketons extrahiert. Der Extrakt wird unter

e 1 s ρ 1 e vermindertem Druck auf ein kleines Volumen ein-

Es wird eine Kulturlösung hergestellt aus 10 g gedampft. Das kristallisierte Produkt wird abfiltriert, Hefeextrakt (Difco), 4,5 g Na₂HPO₄, 3,4 g KH₂PO₄ mit Methylisobutylketon gewaschen und getrocknet, und Wasser bis auf lOCOml. Nach der Einstellung Erhalten werden 68,4 g Produkt; dieses wird umdes pH-Wertes mittels 2n-Natriumhydroxydlösung 40 kristallisiert durch Lösen in 300 cm³ warmen Aceton, auf 6,2 wird das Gemisch während 20 Minuten bei Behandeln der Lösung mit 1 g Aktivkohle und Ein-120⁰C sterilisiert. Die Kulturlösung wird dann an- dampfen des Fütrats auf etwa 130 cm³. Auf diese geimpft mit einer Kultur von Flavobacterium de- Weise werden 61,6 g reine Verbindung-S-17a-Acetat hydrogenans, die auf Agar gezogen worden ist (das erhalten, die identisch ist mit dem Produkt des Beiobige Medium mit 2°/₀ Agar); das Gemisch wird 45 spiels I.

während 32 Stunden bei 30⁰C in zwei Schüttelkolben Aus der Mutterlauge können noch weitere 12,15 g

mit einer Kapazität von 2 Litern auf einer rotierenden dieser Verbindung-S-17«-Acetat isoliert werden, wo-

Schüttelmaschine (250 Umdrehungen pro Minute) durch die Ausbeute auf 90,1 % der Theorie steigt,
geschüttelt. . .

Jedem von zehn Schülteikolben mit einer Kapazität 50 Beispiele

von 2 Litern, die 1 Liter des obenerwähnten Mediums In der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben,

enthalten, wird dann 50 ml der Impfkultur, herge- wird eine Impfkultur von Flavobacterium dehydro-

stellt wie oben beschrieben, zugegeben. Die zehn genans hergestellt. 5 ml der Animpfkultur werden

Flaschen werden während 18 Stunden unter den oben jedem von zwei Schüttelkolben mit einer Kapazität

angegebenen Bedingungen geschüttelt. 55 von 500 ml, enthaltend ICO ml des obenerwähnten

Es wird dann 5 g des 17a,21-Diacetats der Verbin- Mediums, zugegeben. Die beiden Kolben werden dung S, suspendiert in 100 ml Wasser, zu jedem der während 18 Stunden unter den obenerwähnten BeKolben zugegeben, wonach die Kultur mit 0,1 molarem dingungen geschüttelt.

Phosphatpuffer auf pH 6,2 gebracht wird, wonach Dann werden 5C0 mg des 17«,21-Diacetats von

die Inkubation in gleicher Weise fortgesetzt wird. 60 6a-Fluor-16(X-methyl-17a,21-dihydroxy-4-pregnen-

Aus den Papierchromatogrammen sieht man, daß 3,20-dion, suspendiert in 10 ml Wasser, jedem der

nach 8 Stunden das gesamte Substrat in das 17a-Mono- Kolben zugegeben, wonach die Kultur mit O.lmolarem

acetat der Verbindung umgewandelt worden ist. Phosphatpuffer auf pH 6,2 gebracht wird und die

Die Kulturen werden durch heftiges Rühren während Inkubation in der gleichen Weise fortgeführt wird.

I¹Ii Stunden mit dem gleichen Volumen warmen 65 Aus Papierchromatogrammen ersieht man, daß nach

Methylisobutylketons extrahiert. Der Extrakt wird 8 Stunden das gesamte Substrat umgewandelt ist.
unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen Die Kulturen werden durch H^stündiges kräftiges

konzentriert, das kristallisierte Produkt wird abfiltriert Rühren mit gleichem Volumen von warmem Methyl-

isobutylketon extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingedampft, das kristallisierte Produkt wird abfiltriert, mit Methylisobutylketon gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise werden 436 mg reinen 17a-Acetats von 6«-Fluor-16«-methyl-17a,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion erhalten.

Aus der Mutterlauge können noch weitere 416 mg der gleichen Verbindung isoliert werden, wodurch die Ausbeute auf 93,7% der Theorie steigt.

Schmelzpunkt: 188 bis 190⁰C;
Analyse:

Berechnet ... C 68,55 %, H 7,91 %;

gefunden ... C 68,41%, H 7,89%.

Das zugesetzte 17«,21-Diacetat von 6«-Fluor-16«-methyl-17«,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion kann gemäß der von R. B. T u r η e r, J. Am. Chem. Soc, 75 (1953), S. 3489, beschriebenen Methode hergestellt werden; der Stoff hat folgende physikalischen Konstanten: Schmelzpunkt 226,5 bis 228,5°C; El*„ bei 236 πιμ in Methanol = 350.

Elementaranalyse:

Berechnet ... C 67,51%, H 7,62%; :".-%
gefunden-... C 67*54%, H 7,53%.

Infrarotspektrum: Banden bei 1735 bis 1728, 1682, 1668, 1625 und 879 cm-¹.

NMR-Spektrum: Maxima bei 0,81, 0,98 (Doublet), »5 1,20, 2„14, 2,17, 4,78 und 6,08 ppm.

Claims

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von Enzymen von Flavobacterium dehydrogenans.

Patentanspruch: Andere bekannte Reaktionen sind die Umwandlung

von loa-Methyl-S/S.na^l-trihydroxy-S-pregnen-

Verfahren zur Herstellung von 17«-Acyloxy- 20-on-21-ac3tat in 16a-Methyl-17«,21-dihydroxy-21-hydroxysteroiden der Pregnan-Reihe, d a- 5 4-pregnen-3,20-dion (USA.-Patentschrift 2 985 563), durch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse der 21-Acetoxy-Gruppe von 17a,21-Di-17«-21-Diacyloxysteroide der Pregnan-Reihe en- hydroxy-l,5-pregnadien-3,ll,2Ö-trion-21-acetat und zymatisch mit Flavobacterium dehydrogenans der entsprechenden 9α-Fluor-Verbindung, die Hydro-(A. T. C. C. 13930 — I. M. R. U. 130) bei einem .lyse aller Acetoxygruppen von ll£17«,21-TriacetoxypH-Wert von kleiner als etwa 6,5 verseift. io l,5-pregnadien-3,20-dion und die entsprechende

9α-Fluor-Verbindung (USA.-Patentschrift 2 908 696

und deutsche Patentschrift. 1 097 440), während in

der britischen Patentschrift 796 769 die Umwandlung eines 3/?,17a,21-Trihydroxy-5-pregnen-20-on

Die Herstellung von 17«-Acyloxy-21-hydroxy-Ver- 15 bzw. entsprechender Ester in 17a,21-Dihydroxybindungen der Pregnan-Reihe durch selektive Ver- 4-pregnen-3,20-dion- mit freien Hydroxylgruppen beesterung der entsprechenden I7«,21-Dihydroxy-Ver- schrieben ist. Gleichzeitige Oxydation und Verseifung bindungen ist nicht möglich, da bei diesem Verfahren tritt auch während der Reaktion ein, wie sie in der zunächst 21-Acyloxy-Verbindungen und dann deutschen Patentschrift 1060 860 beschrieben ist, 17a,21-Diacyloxy-Verbindungen erhalten werden. 20 bei der Sftna^l-Trihydroxy-S-pregnen-^O-onO^l-di-Auch die selektive Verseifung von Ha^l-Diacyloxy- acetat in 17a,21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion Verbindungen der Pregnan-Reihe durch chemische umgewandelt wird. Ein Beispiel der Verseifung der Mittel ist nicht möglich. Durch Verseifung oder 11/9- und 17/f-AcyIoxy-Gruppen mit Hilfe von En-Wiederveresterung in einem alkalischen Medium zymen von Flavobacterium dehydrogenans, in diesem werden über die 21-AcyIate stets die freien Alkohole 25 Fall von 17a-Methyl-ll/5,17/5-diacetoxy-l,4,6-androerhalten, ohne daß eine Spur des 17«-Monoacylats statrien-3-on und der entsprechenden 4,6-Androstagebildet würde, während bei der Verseifung in einem dien-Verbindung ist in der USA.-Patentschrift sauren Medium stets ein Gemisch von 21-Acylat, 2 899 447 beschrieben.

17«-Acylat und freiem Alkohol erhalten wird. Schließlich ist auch aus der britischen Patentschrift

Gemäß R. G a r d i 11. a. (Gazz. Chim. Hai., 93, 30 963 427 bekannt, daß in 21-SteIlung keine Acyloxy-S. 431 bis 450 [1963]) können 17«-Acyloxy-Verbin- gruppe enthaltende 3/?-Hydroxy- oder 3/?-Acyloxydungen von 17a,21-Dihydroxy-20-oxosteroiden der 16-methylen-17a-acetoxy-6-X-5-pregnen-20-one, Pregnan-Reihe über die 17«,21-ortho-Ester erhalten bei denen X Wasserstoff, Chlor, Fluor oder Methyl werden, jedoch weist diese Methode den Nachteil ist, mit Hilfe von Enzymen von Flavobacterium auf, daß die Ausbeuten an Πα-Acyloxy-Verbindung 35 dehydrogenans in die. entsprechenden 4-Pregnennicht besonders gut sind und daß stets ein Gemisch 3-one umgewandelt werden können, wenn die Reakdes gewünschten Produktes mit der 21-Acyloxy- tion abgebrochen. wird, sobald die Bildung des Verbindung erhalten wird. Δ *-3-Oxo-Systems praktisch vollkommen ist, jedoch

Es wurde nun gefunden, daß 17«-Acyloxy-21-hy- die Verseifung der 17«-Acetoxy-Gruppe noch nicht droxysteroide der Pregnan-Reihe auf einfache Weise 40 begonnen hat.

mit ausgezeichneten Ausbeuten erhalten werden . Es wurde nun die überraschende Feststellung gekönnen, wenn man I7«,21-Diacyloxysteroide der macht, daß es auch bei 17a,21-Diacyloxy-Verbinduni Pregnan-Reihe mit Flavobacterium dehydrogenans gen möglich ist, die 17«-Acyloxy-Gruppe unverän-(A. T. C. C. 13 930 — I. M. R. U. 130) bei einem dert zu lassen, — wobei die Reaktion zu gegebener pH-Wert von kleiner als etwa 6,5 verseift. 45 Zeit unterbrochen werden muß—jedoch die 21-Acyl-

Flavobacterium dehydrogenans wurde erstmalig oxy-Gruppe zusammen mit etwa anwesenden anderen durch Arnaüdi in BoIl. Sez. Hai. Soc. Intern. Acyloxygruppen zu verseifen. So kann gemäß der Microbiol., 11 (1939), S. 208, beschrieben. Später Erfindung durch Verseifung von 17«,21-Diacetat beschrieb derselbe Autor den von ihm verwendeten des 17«,21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion oder durch Stamm im einzelnen in Zentralblatt für Bakteriologie, 50 Verseifung und Oxydierung von 3/?,17a,21-Trihydroxy-Parasitenkunde und Infektionskrankheiten, II. Abt., 5-pregnen-3,20-dion-3/?,17«,21-triacetat das 17a-Ace-105 (1942), S. 352. In der American Type Culture tat mit hohen Ausbeuten hergestellt werden. Collection erscheint das. Bakter als Flavobacterium Die gemäß der Erfindung zu verwendenden Aus-

dehydrogenansA. T. C. C. 13930 — I. M. R. U. 130. gangsmaterialien sind I7a,21-Diacyloxysteroide der In der ersten Veröffentlichung von A r η a u di ist 55 Pregnan-Reihe. Sie können die üblichen Substituenten der Stamm als Micrococcus dehydrogenans bezeichnet. und Doppelbindungen von Hydroxyl, Acyloxy- oder Es war bekannt, veresterte Hydroxylgruppen von Oxogruppen in 3-, 11-, 16-und/oder 20-StellungiAIkyl-Steroiden mit Hilfe Von Enzymen von Flavobacterium gruppen in 2-, A-, 6- und/oder 16-SteIlung, Halogendehydrogenans zu hydrolysieren. Auch war bekannt, atome in 4-, 6-, 7-, 9- oder 12-Stellung, Doppelbindungen daß in diesem Verfahren eine/1^s-3/?-Acyloxy-Gruppie- 60 in 1-; 2-; 4,5-; 6,7-; 9(11)-; 15,16-Stellung enthalten, rung in eine /l'O-Oxo-Gruppierung umgewandelt Auch kann ein heterocyclischer Ring an dem Steroid wird. So beschreibt Arnaudi in Zcntralblatt kondensiert sein, insbesondere am Α-Ring; auch für Bakt. usw., a. a. O., die Umwandlung von Pre- 18- und/oder 19-nor-Verbindungen können ate Ausgncnolon (3/?-Hydroxy-5-pregncn-20-on) in Proge- gangsmaterialien verwendet werden, steron (4-Pregncn-3,20-dion) und von Dehydro- 65 Die 17«,21-Diacyloxysteroide, als Ausgangsmateepiandrosleron (3/?-Hydroxy-5-androsten-17-on) in rialien können nach üblichen Methoden erhalten Testosteron (17«-Hydroxy-4-androsten-3-on) und werden, z. B. durch Veresterung der entsprechenden Androsten-dion (4-Androsten-3,17-dion) mit Hilfe Dihydroxysteroide in Gegenwart eines sauren Kataly-