DE1617949A1

DE1617949A1 - Verfahren zum Abtrennen einer neuen Antioedemsubstanz

Info

Publication number: DE1617949A1
Application number: DE19671617949
Authority: DE
Inventors: Motoko Adachi; Masuo Murakami; Takuro Sado; Akio Tachibana
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1966-06-07
Filing date: 1967-06-05
Publication date: 1971-04-08
Also published as: GB1192773A; NL6707876A; FR8485M; BE699526A

Description

Akte: 1258

DR. WALTER NIELSCH Patentanwalt ₍

2 Hamburg 70 ^!

SchloBstrafle 11? Pöstfqcfi 10914 Fernruf; 652 97 07

Anmelder: Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd* Tokyo (Japan)

Verfahren zum Abtrennen einer neuen Anti-* Ödemsubstanz

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Abtrennen einer neuen Antiödemsubstanz.

Ein Protein "Bromelain" ist bereits aus dem gepreßten Saft von Ananas sativus isoliert worden.( vergleiche J^Physiology, 1_5, 2^-9 - 310 (1894); Science, 188, (1953); Economical Botany, 1, 225 - 234 (1957)).

Bromelain besitzt Antiödem — Aktivität und Antikoagulations - Aktivität. Diese Aktivitäten des Bromelains nimmt man an, stammen von seiner proteolytischen Aktivität (enzymatisehe Aktivität).

Es wurde jetzt gefunden, daß eine neue Substanz, die als vorzügliches Arzneimittel verwendet werden kann, aus

1 Of ; i\/ 188 7

gepreßtem Saft der Ananas und/oder Bromeliapflanzen, besonders von solcher Fraktion des Saftes, die entweder von sauren oder basischen Jonenaustauschharzen nicht absorbiert wurden, erhalten werden kann.

Diese Substanz hat eine ausgezeichnete Antiödem - Aktivität, ihre proteolytische Aktivität (enzymatische Aktivität) ist schwach im Vergleich zu Bromelain.

Diese Substanz unterscheidet sich von Bromelain dadurch, daß sie eine hohe Antiödem - Aktivität nicht nur zeigt, wenn sie gleichzeitig bei der Bildung von Ödemen verabreicht wird, sondern auch, wenn sie vor oder nach der Bildung von Ödemen verabreicht wird.

Die pharmakologischen-Eigenschaften, wie vorstehend erläutert, der neuen Substanz dieser Erfindung sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 wiedergegeben, in denen die entsprechenden Daten, die mit reinem Bromelain erhalten worden sind, zum Vergleich angegeben sind. (Die verwendeten Prüfverfahren bei der pharmakologischen Erprobung sind in den Abschnitten pharmakologische Versuche 1-3 später beschrieben.)

Tabelle 1

Inhibitionsprozentsatz

Enzymatis ehe AktivitSjt (Binheiten)

)ie neue Jubstanz

75.4-

35.9

meines 3romelain

10

25.8

/!887

689.0

Tabelle 2

	Inhibitionsprozentsatz bei verschiedenen Verabreichungszeiten
•	Vor der Bildung von Nach der Bildung von Ödemen (Minuten) Ödemen (Minuten)
Die neue Substanz	120 60 30 0 30 60 120
reines Bromelain	75.7 78.3 71.1 74.3 - 48.6 33.3
0 23.3 46.8 22.3 4.6 0

Die physikochemischen Eigenschaften der neuen Substanz die- zer Erfindung sind in der folgenden Tabelle 3 wiedergegeben, Wie aus der Tabelle 3 ersichtlich ist j sind diese von denen des reinen Bromelains verschieden.

Tabelle 3

	Ultraviolett absorptions spektrum	Ultraviolett Extinktion 280 Ta]X	Wert (?M) der Cu-Folin Methode	Molekular gewicht
Die neue Substanz	.· Fig. 1	0.930	358 ,	y100,000
reines Bromelain	Fig. 1	0.990	610	33,000

Die in der vorstehenden Tabelle 3 angegebenen Werte wurden durch die folgenden Methoden bestimmt:

Ultraviolett Absorptionsspektrum:

Die Messung des Ultraviolett - Absorptionsspektrums wurde in 0,03 molarer Phosphorsäurepufferlösung (ph = 7>5) mit einem Gehalt an 0,3010 mg/ml der neuen Substanz dieser Erfindung und mit der gleichen Pufferlösung und einem- - --."■■"

Gehalt von 0,3085 mg/ml Bromelain durchgeführt.

Ultraviolett Extinktionen:'

Die Messungen der Ultraviolett Extinktionen wurden mit 0,OJ molarer Phosphorsäurepufferlösung (ph = 7,5) mit einem Gehalt an 0,522 mg/ml der neuen Verbindung dieser Erfindung und mit der gleichen Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,518 mg/ml Bromelain durchgeführt.

Werte nach der Cu - Polin Methode:

Messungen der Werte nach der Cu - Folin Methode wurden nach dem Verfahren ausgeführt, welches O.H. Lowrey und Mitarbeiter im J. Biol. Chem., 193, 265 (1951) beschrieben hat.

Unterschiede im Verhalten bei der Durchführung der Gelfiltrationsmethode:

Eine Chromatographiersäule, deren Innendurchmesser etwa 2 cm beträgt, wurde mit etwa 50 ml Sephadex G - 100 gefüllt. (Sephadex ist ein dreidimensionales vemetztes Polysaccharid, das durch Queivemetzung der linearen Makromoleküle von Dextran erhalten wird . Vergleiche Chemie Lexikon HÖmpp,6. Auflage, Franck'sche Verlagsbuchhandlung Stuttgart, Seite 5852). Die Säule wurde mit 1000 ml Wasser ausgewaschen und dann wurde die Testlösung (a), (b) oder (c) wie nachfolgend beschrieben, in die Säule gegeben.

Die Säule wurde mit Wasser eluiert (Elutionsgeschwindigkeit etwa 1 ml/Min.) und die Extinktion bei 250 mu des Eluates wurde kontinuierlich gemessen. „

1 f- /-!387

Das Molekulargewicht wurde aus den Ergebnissen dieser Messungen bestimmt:

Testlösung Ergebnisse

(a) Die neue Substanz dieser Figur 2 Erfindung

(b) reines Broraelain Figur 3

(c) Mischung aus (a) und (b) Figur 4-

Wie vorstehend beschrieben, wird die angestrebte Substanz dieser Erfindung aus dem Eluat, welches bei Behandlung mit sauren und basischen Jonenaustauseherharzen des gepreßten Saftes der.Ananas und/oder Bromeliapflanzen anfällt, er- . halten. Bei dieser Behandlung können andere Absorbentien, wie Gelfiltermittel;anstelle der Ionenaustauscherharze, benutzt werden«

Die angestrebte Substanz dieser Erfindung - kann.auch durch fraktionierte Fällungsmethoden unter Benutzung, organischer Lösungsmittel oder Proteinfällungsmitteln erhalten,werden. ■

Mitunter ist es. schwierig oder mühsam, die reine Substanz durch Dine dieser Methoden zu isolieren· und_ so ist- es vorteilhaft, diese Verfahren in geeigneter Kombination zu verwenden.. Das ■.Herstellungsverfahren- dieser Erfindung wird gewöhnlich wie folgt ausgeführt: Die ganze Pflanze, besonders Rhizom, Früchte und Blätter einer Ananaspflanze_:wie Ananas sativus SCHULT (A. comosus MERR) oder Ananas macrodontos,. E. MORR, oder Bromeliapflanzen wie:Brqmelia fastuoaa, LINDL (B, antiaeantha BERT, .B-. screptum, B. commeliniana) wird ausgepreßt. Zu dem erhaltenen Saft wird etwa

1Ü". '/1887

die gleiche Menge eines organischen Lösungsmittels wie Methanol, Äthanol oder.Aceton oder ein Proteinfällungsmittel wie Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat zugefügt; das rohe, ausgefällte Protein wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Das rohe Protein wird in Wasser oder Pufferlösung aufgelöst und die erhaltene .Lösung wird durch eine mit Jonenaus tauscherharzen, Gelfiltrationsmitteln, Absorbentien oder dergleichen gefüllte Säule gegeben.

Als (Ionenaustauscherharze können basische Jonenaustauscherharze wie Dowex 1, Dowex 3, Duolite A - 2, Duolite A - 40 (diese sind Dow Chemicals Produkte), Amberlite IRA - 400, Amberlite IR - 4-1-3., Amberlite CG - 40 (diese sind Rohm & Haas Produkte), und dergleichen und saure Jonenaustausche.rharze wie Dowex 50, Dowex, Duolite CS - 101, (diese sind Dow Chemicals Produkte), Amberlite IR - 20, Amberlite. IRG-50, Aaberlite CG.-- 50' (Rohm & Haas Produkte) benutzt werden. (Diese Jonenaustauscherharze sind zum Beispiel in dem Buch Römpp, Chemielexikon, 6. Auflage, Seite 236, Seite 1595 1596 und Seite 1627 erläutert).

Als Beispiele der Gelfiltrationsmittel (vergleiche Römpp Chemielexikon 6. Auflage, Franck'sche Verlagsbuchhandlung Stuttgart, Seite 2324) können Sephadex G - 100, Sjephadex G - 200 und dergleichen benutzt werden. . . , -..

Als geeignete Absorbentien können Talkum, Aktivkohle und dergleichen verwendet werden; . ■:

10! i Π / 1 3 8 7

Das Eluat, welches aus der Säule tritt, wird ohne jede Behandlung unter vermindertem Druck oder durch Gefriertrocknung konzentriert, um die neue Verbindung dieser Erfindung zu erhalten. Die angestrebte, so erhaltene Substanz kann noch physiologisch unvorteilhafte Verunreinigungen, die aus den Harzen oder Absorbentien der Säulenfüllung stammen, enthalten*

Diese Verunreinigungen können gewöhnlich durch Dialyse , entfernt werden. Im Falle, daß kleine Mengen der angestrebten Substanz zu behandeln sind, können die Verunreinigungen leicht durch Elektrophorese, Papierchromatographie, DünnschichtChromatographie und dergleichen entfernt werden.

Für weitere Reinigung der angestrebten Substanz werden die iCrennungen mittels Sephadex G - 100, Sephadex G und dergleichen wiederholt.

Figur 1 zeigt das ültraviolettabsorptionsspektrum der neuen Substanz dieser Erfindung (A) und reines Bromelain (B) als Vergleich.

Figur 2 zeigt die Elutionskurve der neuen Substanz dieser Erfindung, die durch Elution einer Sephadex G - 100 Säule erhalten worden ist.

Die Figur 3 zeigt die gleiche Elutionskurve für reines Bromelain zum Vergleich.

Iß -/1887

Figur 4--zeigt die Elutionskurve , die durch Elution der Sephadex G - 100 Säule für eine Mischung der neuen Substanz dieser Erfindung und reinem Broraelain erhalten worden ist.

Im folgenden werden die pharmakologisehen Effekte beschrieben, die die neue Substanz dieser li'rf indung und der vorzugsweisen Ausbildungen des Verfahrens dieser Erfindung bewirkt,

Pharmakologische Prüfung 1

Diese Prüfung wurde durchgeführt, um den Ödeminhibitionswert der neuen Substanz dieser Erfindung im Vergleich mit dem des Bromelains zu ermitteln.

Prüfdurchführung:

Einer männlichen Bart - Ratte mit 200 bis 250 g Gewicht wurden 0,2 ml isotonische Natriumchloridlösung und 0,2 ml isotonische Natriumchloridlösung mit einem Gehalt an 2% Daxtran in das Fußsohlengebiet der rechten beziehungsweise linken Hinterpfote injiziert. Direkt danach wurde die Testlösung in die Vena caudalis der gleichen Ratte im Verhältnis 9 mg/kg injiziert. (Bei der Ratte für den Blindversuch wurde die gleiche Menge isotonischer Natriumchloridlösung in die Vena caudalis injiziert).

Nach zwei Stunden wurde die Ratte mit Hilfe von Chloroform getötet und ihre beiden Unterschenkel wurden am Kniegelenk amputiert und ausgewogen.

^{1 f}- 3 8 7

Die pharmakologische Prüfung wurde,, wie vorstehend beschrieben,, nit dreizehn Ratten für jede Testlösung durchgeführt, Der Blindvorsuch wurde ebenfalls mit dreizehn Ratten durchgeführt. Die numerischen Werte in der Tabelle 1 sind aus
den Mittelwerten aus dreizehn Versuchen errechnet.

Pharmakologische Prüfung 2

Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die enzymatisch^ Aktivität der neuen Substanz dieser Erfindung im Vergleich zum reinen Bromelain festzustellen«

Versuchsdurchführung:

Casein in einer Phosphorsäurepufferlösung (ph = 7,5) wurde zur Herstellung der Testlösung verwendet, wobei Casein zersetzt wurde, um seine enthaltenen Polypeptide freizusetzen. Die letzteren werden in der Losung gelöst aufgenommen.

Nach Entfernung solcher Proteine aus dem Reaktionsgemisch, die durch Trichloressigsäurc gefällt werden können (welches überwiegend unzersetztes Casein ist), wurde die Produktmenge durch -^xtinktionsmessung bei 275 mu bestimmt.
Die numerischen Worte in der Tabelle 1 wurden aus den so
urhaltonen Daten errechnet (Vergl. J. General Physiology,
30, 291,(1947) und folgende).

Pharmakologischo Prüfung 3

Diofjo Versuchsreihe wurde durchgeführt, um die Unterschiede flor üdom - Inhibibionsworbe bei verschiedenen Vorabreichurif';nzrjil;cjri in Bezug auf diu neue Substanz dieser Erfindung und reinem Bromolain zu ermitteln.

1 U ι _i887 BAD ORIGINAL

Ί617949

- ίο -

Versuchsdurchführung:

Das Untersuchungsverfahren war das gleiche, wie das bei der pharmakologischen Prüfung 1 benutzte, jedoch mit der Ausnahme der Zeit für die Verabreichung der" Testlösung und der Zeit, um die amputierten Unterschenkel zu wiegen. Bei der vorliegenden Prüfung wurde jedoch jedes Reagenz in der nachfolgend angegebenen Menge verwendet. Isotonische NatriumChloridlösung 0,1 ml

Isotonische WatriumChloridlösung 0,1 ml

mit 2% Dextran

Die neue Substanz dieser Erfindung 5 mg/kg reines Bromelain 9 mg/kg

Die Verabreichung der Testlösung wurde zu .sieben verschiedenen Zeiten durchgeführt und zwar direkt nach der Injektion der isotonischen Natriumchloridlösung mit Dextran und 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten vor oder nach der besagten Injektion.

Wenn die Testlösung vor der Injektion des Dextrans verabreicht wurde, wurde das Wiegen der Unterschenkel zwei Stunden nach der besagten Injektion durchgeführt. Wenn die Testlösung nach der Injektion des Dextrans verabreicht wurde, wurde das Auswiegen zwei Stunden nach der Verabreichung der Testlösung durchgeführt.

Die Resultate dieser pharmakologischen Prüfung sind in der Tabelle 2 wiedergegeben.

10 / I 8 8 7

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Beispiel 1

10 β rohes Protein, welches aus gepreßtem Saft einer Ananaspflanze erhalten worden ist, wurde in 100 ml 0,05 molarer Phosphorsäure-Pufferlösung (ph = 6,1) aufgelöst und das Ganze wurde bei Zimmertemperatur etwa 50 Minuten gerührt. Die Mischung wurde dann durch Zentrifugieren bei 3000 Umdrehungen/Minute während 20 Minuten getrennt. Nach dieser Trennung wurden alle weiteren Bearbeitungsvorgänge bei Temperaturen unter 4° C durchgeführt.

Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde in eine Säule (innendurchmesser etwa 3 cm und Höhe etwa 45 cm) ₃ die mit Duolite A - 2 gefüllt ist, gegeben. Die Elution aus der Säule wurde mit 0,05 molarer PhosphorSäurepufferlösung (ph-= 6,1) als Eluiermittel durchgeführt. Die Ausfließgeschwindigkeit betrug 5 ml/Minute.

Die ersten 500 ml des Eluates werden zusammengegeben und in die Säule gegeben (mit einem Innendurchmesser von etwa 3 cm und einer Höhe von etwa 70 cm), gefüllt mit Amberlite CG - 50. Die Elution aus dieser Säule wurde unter Benutzung 0,05 molarer Phosphorsäurepufferlösung (ph =6,1) als . Eluiermittel durchgeführt. Die Austrittsgeschwindigkeit betrug 5 ml/Minute.

Die ersten 1000 ml des Eluates wurden zusammengegeben und 400 g Ammoniumsulfat zugefügt und darin aufgelöst. Dann wurden die in der Mischung gebildeten Niederschläge durch Zentrifugieren bei 3000 Umdrehungen/Minute während 20 Minuten getrennt.

^{1 c :}-.' 1 8 8 7

Die so getrennten Niederschläge wurden in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und die so erhaltene Lösung der Dialyse unterworfen. Die Dialyse wurde in 12 Stunden unter Benutzung von Cellophan und 5000 ml Wasser durchgeführt. Eine derartige Dialyse wurde fünfmal wiederholt. Dann wurde das Verfahrensprodukt wieder 20 Minuten bei 3000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde der Gefriertrocknung unterzogen.
Ausbeute: 40 mg.

Beispiel 2

100 g rohes Protein, aus dem gepreßten Saft einer Ananaspflanze erhalten, wurde in 1000 ml 0,2 molarer Phosphorsäurepufferlösung (ph = 6,1) aufgelöst und das Ganze wurde während einer Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde dann einer Trennung durch Zentrifugieren, bei 5000 Umdrehungen/Minute während 30 Minuten unterzogen.

Alle nach dieser Trennung erfolgenden Arbeitsgänge wurden bei Temperaturen unter 4- C durchgeführt.

Die erhaltene, überstehende Flüssigkeit wurde in die Säule (Innendurchmesser etwa 10 cm und die Höhe etwa 110 cm) geleert, die eine Füllung mit Amberlite GG - 50 enthielt. Die Elution aus dieser Säule wurde durch Verwendung von 0,2 molarer Phosphorsäurepufferlösung (ph = 6,1) als Eluiermittel durchgeführt. Die AusfUöJgeschwindigkeit betrug 8 ml/Minute.

/13 8 7

Nachdem die ersten 3000 ml des Eluates beiseite gestellt wurden, wurden die nachfolgenden 5000 ml gesammelt und in eine Säule (Innendurchmesser etwa 10 cm und Hohe etwa 70 cm), die mit Duolite A - 2 gefüllt ist, gegeben. Die Elution aus der Säule wurde unter Benutzung 0,1 molarer Phosphorsäure-Pufferlösung als Eiuiermittel durchgeführt. Die Ausfließgeschwindigkeit betrug 7 ml/Minute»

Nachdem die ersten 1000 ml des Eluates seitwärts gestellt wurden, wurden die folgenden 6000 ml gesammelt. 24-00 g Ammoniumsulfat wurde zugefügt und in dem gesammelten Eluat gelöst. Dann wurden die in._der Mischung gebildeten Niederschläge durch Zentrifugieren bei 5000 Umdrehungen/Minute während 30 Minuten getrennt. '

Die so erhaltenen Niederschläge wurden in einer kleinen Men« ge Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wurde in die mit Sephadex G - 200 gefüllte Säule (Innendurchmesser etwa 3 cm und Höhe etwa 70 cm) gegeben. Die Elution aus der Säule wurde mit destilliertem Wasser als Eluiermittel durchgeführt. Die Ausfließgeschwindigkeit betrug 4- - 5 ml/Minute. '

Nachdem die ersten 50 ml des Eluates beiseite gestellt wurden, wurden die folgenden 150 ml gesammelt und der Gefriertrocknung unterzogen. Die Ausbeute betrug 350 mg«

¹⁰' W1887

Claims

7617949

DR. WALTER NIELSCH 3. Juni 1957

Patentanwalt
2 Hamburg 70 i

Schloßstraße 112 Postfach 10914 Fernruf: 652 97 07

Patentanspruch:

Verfahren zum Abtrennen einer neuen Antiödemsubstanz, die im wesentlichen frei von reinem Bromelain ist, aus gepreßtem Saft der Ananas und/oder Bromeliapflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß der gepreßte Saft einer oder einer Kombinations - Behandlung zum Abtrennen des Proteins, wie Absorption - Desorption mittels Jonenaustausche rhar ζ en, Chromatographie, Gel - Filtration, Proteinfällung und dergleichen unterzogen wird.

10 W 188 7

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