DE1617486A1 - Verfahren zum Herstellen von Antigenen fuer die Impfstofferzeugung - Google Patents

Description

4432-66/Dr.v.B/Ro.

(M. Allen)

U.S.-Ser.No. 429,817

Piling Date; February 2, 1965 ι—■— ^- ι

Dr. Expl.

General Electric Company, Schenectady, N.Y., V.St.A.

Verfahren zum Herstellen von Antigenen für die Impfstofferzeugung

Die Erfindung betrifft ein'Verfahren zum Herstellen von Antigenen für die Erzeugung von Impfstoffen, insbesondere ein elektrohydraulisch.es Sterilisationsverfahren, mittels dessen sich die Lebensfähigkeit von Mikroorganismen zerstören läßt ohne gleichzeitig ihre Antigeneigenschaften zu beeinträchtigen.

Die Fähigkeit von Mensch und Tier, Antikörper zu erzeugen, ermöglicht eine Immunisierung gegen bestimmte Infektionskrankheiten, wie Diphtherie, Blattern, Tetanus, Masern und Poliomyelitis. Die Erzeugung von Antikörpern kann durch eine Injektion oder andere Einführung einer Suspension lebender oder getöteter Mikroorganismen in den Körper angeregt werden, welche die spezielle Krankheit oder Infektion verursachen. Solche zur Iramuni-

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sierung verwendeten Suspensionen lebender oder abgetöteter Mikroorganismen werden als Impfstoffe oder Vaccine bezeichnet. Man bevorzugt zum Zwecke einer Immunisierung im allgemeinen eine Injektion abgetöteter Mikroorganismen, da die Verwendung von Impfstoffen, die geschwächte, aber immer noch lebende Mikroorganismen enthält, mit gewissen Gefahren verbunden ist, die in der Humanmedizin möglichst vermieden werden sollen.

Zur Sterilisierung oder Abtötung der Mikroorganismen des jeweiligen Impfstoffes bedient man sich gewöhnlich eines von zwei Verfahren. Beim ersten Verfahren wird eine Suspension der speziellen Mikroorganismen auf eine Temperatur erhitzt, die ausreicht, um die Mikroorganismen abzutöten, jedoch nicht hoch genug ist, um die Antigene, die die wirksame Substanz des Impfstoffes darstellen, übermäßig zu verändern. Die Antigene regen dann im menschlichen oder tierischen Körper eine Erzeugung von Antikörpern an, die mit dem speziellen Antigen zu reagieren vermögen, wenn dieses später im Verlaufe einer diesbezüglichen Erkrankung auftritt. Bei nichtsporenbildenden Organismen wendet man im allgemeinen eine einstündige Erhitzung auf 60°C an. Beim zweiten und manchmal bevorzugten Verfahren wird der die Mikroorganismen enthaltenden Suspension eine Chemikalie, z*B. eine Formalinlösung zugesetzt und man läßt die Suspension

dann 12 Stunden bei JJ⁰C ruhen. Nach dem Abtöten der Mikroorganismen wird die mit der Chemikalie versetzte Suspension durch Zentrifugieren und mehrmaliges Waschen mit einer 0,9#igen

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Natriurachloridlösung chemisch gereihigt. Bei beiden bekannten Verfahren wird der Impfstoff dann in einer Salzlösung suspendiert und durch Verdünnen standardisiert,, so daß die zur Krankheitoder Infektionsbekämpfung erforderliche Dosis in 1 oder 2 Milliliter Flüssigkeit enthalten ist. Nach der Standardisierung wird der Impfstoff auf Sterilität überprüft und es wird ein Konservierungsmittel, z.B. 0,5 % Phenol oder 0,01 fo Merthiolat (beides bezogen auf die Endkonzentration) zugesetzt. Bei löslichen Impfstoffen, wie Toxinen, Toxoiden oder verschiedenen Eiweißlösungen, sterilisiert man gewöhnlich durch Filtrieren mittels eines Seitz- oder Berkefeld-Filters. Bei manchen löslichen Impfstoffen verwendet man auch gelegentlich Äthylenoxid zum Sterilisieren,

Das Abtöten von Mikroorganismen durch Erhitzung stellt ein sehr empfindliches Verfahren dar und läßt sich außerdem bei einer ganzen Reihe von Mikroorganismen, insbesondere Sporenbildnern, nicht anwenden. Außerdem besteht die Gefahr, daß durch die Erhitzung auch die Immunisierungsfähigkeit der auf diese Weise erzeugten Antigene verringert wird. Das zweite, chemische Verfahren zum Abtöten der Mikroorganismen ist ebenfalls ziemlich problematisch, da manche chemischen Desinfektionsmittel mit dem Bakterieneiweiß Komplexe bilden. Formalin wirkt außerdem bei bestimmten Organismen nicht zufriedenstellend und das Verfahren ist zeitraubend und umständlich, da der gebildete Impfstoff zur chemischen Reinigung gründlich ausgewaschen werden muß,

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um ihn für eine Injektion geeignet zu machen. Die konventionellen Verfahren zum Abtöten von Mikroorganismen zur Herstellung von Impfstoffen sind also verbesserungsbedürftig.

In jüngerer Zeit sind sogenannte elektrohydraulisch^ Verfahren bekannt geworden,;von denen man weiß, daß damit viele Stämme von Mikroorganismen abgetötet werden können. Bei einem elektrohydraulischen Verfahren wird elektrisch gespeicherte Energie in einer verhältnismäßig inkompressiblen, isolierenden Flüssigkeit, die das zu verarbeitende Material enthält, gesteuert freigesetzt. Die gesteuerte Freisetzung der gespeicherten Energie in der Flüssigkeit läßt einen gesteuerten Druckanstieg in Form einer Schockwelle ausreichender Intensität und eine Vielzahl chemisch aktiver Stoffe entstehen, durch die die Mikroorganismen zerstört und abgetötet werden und die erwünschte Sterilisation bewirkt wird. Die Intensität und Steilheit des Druckanstieges der Schockwelle, durch die der hauptsächliche Teil der Nutzarbeit in dem flüssigen Medium geleistet wird, können mittels des Betrages und anderer Parameter der gespeicherten Energie oder die Art ihrer Übertragung in die Flüssigkeit beeinflußt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt also in erster Linie die Aufgabe zugrunde, ein neues Sterilisationsverfahren zum Abtöten von Mikroorganismen für die Herstellung von Impfstoffen anzugeben, bei dem elektrohydraulisch^ Prozesse nutzbar gemacht werden.

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Bei einem Verfahren zum Herstellen von Antigenen für die Impfstofferzeugung werden also die speziellen Mikroorganismen in einem strömungsfähigen, insbesondere flüssigen Medium durch einen elektrohydraulischen Prozeß abgetötet und sterilisiert. Die jeweiligen Mikroorganismen werden in einer bestimmten Menge lebend einer bestimmten Menge einer gewählten sterilen Flüssigkeit zugesetzt, so daß sich' eine gewünschte Konzentration der Suspension lebender Mikroorganismen ergibt, die normalerweise

in der Größenordnung von 10 Mikroorganismen pro Milliliter liegt. Die die lebenden Mikroorganismen enthaltende Suspension wird dann in eine sterilisierte Elektrohydraulikkammer gebracht und in dieser für die Dauer der Sterilisation eingeschlossen. Während sich die Suspension der Mikroorganismen in der Kammer befindet, werden ein oder mehrere elektrohydraulische Stoßwellen ausgelöst, indem man pro Stoßwelle eine Entladung einer bestimmten" elektrischen Energiemenge an einer in die Flüssigkeit eintauchenden Funkenstrecke bewirkt. Durch die elektrohydraulischen Effekte wird die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zerstört ohne daß ihre Antigeneigenschaften beeinträchtigt werden, so daß also eine Sterilisierung der Suspension der Mikroorganismen eintritt und aus ihr eine Antigen-Suspension gebildet wird. Die Antigen-Suspension wird dann aus der elektrohydraulischen Kammer entnommen und in üblicher Weise weiterverarbeitet, also auf Sterilität geprüft und mit einem Konservierungsmittel versetzt, um sie für den Endverbrauch als in der Human- oder

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Veterinär-Medizin injizierbaren Impfstoff zur Immunisierung gegen eine bestimmte Krankheit oder Infektion geeignet zu machen.

Für die Funkenstrecke der elektrohydraulischen Einrichtung kann eine Funkenentladungselektrode verwendet werden, die eine vorgefertigte Röhre enthält, die aus einem Laminat besteht, das aus einer spirallartig aufgewickelten porösen Bahn besteht, welche mit einem geeigneten Polymerisat getränkt ist, so daß sich die Röhre durch hohe mechanische Festigkeit, sehr gutes elektrisches Isolationsvermögen und geringe Wasserabsorptionsfähigkeit auszeichnet. Die vorgefertigte Röhre bildet einen Teil einer koaxialen Elektrodenanordnung und isoliert eine im Betrieb auf hoher Spannung liegende Mittelelektrode von einer mit Masse verbundenen, koaxialen hohlen Außenelektrode gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel einer Elektrodenanordnung gemäß der Erfindung. Bei einem zweiten Ausführungsbeispiel der Elektrodenanordnung werden zwei stabartige Elektroden verwendet, die Gewinde aufweisen und in eine obere und untere Wand einer elektrohydraulischen Kammer eingeschraubt sind, deren Seitenwände aus einem elektrisch isolierenden Material bestehen. Die Funkenstrecke wird dabei durch den Zwischenraum zwischen den einander gegenüberstehenden Enden der kollinear angeordneten Elektroden gebildet.

Die Erfindung wird an Hand der Zeichnung näher erläutert, es zeigen:

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Fig. 1 eine geschnittene Seitenansicht einer elektrohydraulischen Kammer, in die eine gemäß der Erfindung aufgebaute Funkenentladungselektrode dicht eingesetzt ist, und

Fig. 2 eine teilweise geschnittene Seitenansicht einer elektrohydraulischen Kammer mit einer Elektrodenanordnung gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung.

-Bei elektrohydraulischen Verfahren wird eine verhältnismäßig große Menge elektrisch gespeicherter Energie innerhalb sehr kurzer Zeit in einem verhältnismäßig inkompressiblen flüssigen, dielektrischen, jedoch nicht notwendigerweise vollständig isolierenden Medium freigesetzt. Die elektrische Energie wird im allgemeinen von einer Spannungsquelle geliefert, die eine Gleichspannung in der Größenordnung von Kilovolt zu liefern vermag. Die elektrische Energie wird anfänglich in einem Kondensator gespeichert der durch die Spannungsquelle aufgeladen wird. Die in dem Kondensator gespeicherte elektrische Energie wird dann über eine Funkenstrecke entladen, die mindestens eine in die Flüssigkeit eintauchende Elektrode enthält; die Flüssigkeit ist dabei in einem Behälter eingeschlossen, der als elektrohydraulische Kammer bezeichnet werden soll. Die Entladung erfolgt in einem elektrischen Reihenkreis, der den Kondensator, eine Schalteranordnung, die Funkenstrecke und verbindende Leitungen enthält, die zur Übertragung der gespeicherten Energie an die Funkenstrecke dienen und den Verlauf der durch die Entladung in der Flüssigkeit erzeugten steilen Druck:- oder

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Schockwelle zu beeinflussen. Die Intensität der Druckwelle und die entstehenden chemisch aktiven Stoffe reichen bei geeigneter Wahl der Verfahrensparameter aus, um Mikroorganismen einer Vielzahl von Stämmen zu zerstören und abzutöten und damit die Flüssigkeit zu sterilisieren. Der Begriff "Mikroorganismen" soll hier Bakterien, Viren, Rickettsien, Pilze und Protozoen. Da Viren keine lebenden Mikroorganismen sind, sollen die Begriffe "Abtöten" oder "Zerstören" von Mikroorganismen auch eine Inaktivierung von Viren umfassen.

Die Vorgänge bei der elektrohydraulischen Energieumsetzung und Zerstörung von Mikroorganismen sind ziemlich verwickelt und noch nicht in allen Einzelheiten geklärt. Die folgenden Erläuterungen können jedoch zum Verständnis beitragen. Die hochgespannte elektrische Energie wird der Funkenstrecke schneller zugeführt, als die entstehende Wärme von der Flüssigkeit aufgenommen werden kann. Die Flüssigkeit wird daher im Bereich der Funkenstrecke verdampft und mindestens teilweise ionisiert. Die Plasmablase dehnt sich dann während der kurzen Zeitspanne der Energiefreisetzung aus und läßt im Rest der inkompressiblen flüssigen Umgebung einen Druckstoß entstehen.

Wenn Wasser als Flüssigkeit verwendet wird, beruht die Zerstörung der Mikroorganismen und die Sterilisation in erster Linie auf der auftretenden chemischen Aktivität, der hohen örtlichen Temperatur, der intensiven Druck- und Stoßwelle, die im Wasser auftritt, und der diese begleitenden extremen Turbulenz

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und Phasenänderungen. Die infolge der Funkenentladung entstehenden chemisch aktiven Substanzen spielen offensichtlich bei der. Zerstörung der Mikroorganismen eine ebenso wesentliche Rolle wie der Druckstoß. Die aktiven Stoffe können als Zersetzungsprodukte der Flüssigkeit beschrieben werden und umfassen im Falle \Λοη Wasser Wasserstoff, HydroxyIradikale, naszierenden Wasserstoff und Sauerstoff, Wasserstoffperoxid und Ozon. Durch den Druckstoß treten Übergänge von der flüssigen Phase in die Gas- oder Dampfphase und bei den hohen Drücken momentan sogar in die feste Eis-Phase ein. Die die einwirkende Energie beeinflussenden Parameter, z.B. Spannung, Kapazität, Widerstand und Induktivität und gewisse konstruktive Parameter, wie Elektrodenabstand, Flüssigkeitsvolumen und physikalische und chemische Eigenschaften der Flüssigkeit können entsprechend dem jeweils zu behandelnden Mikroorganismus verändert werden. Die Zusammenhänge zwischen den verschiedenen Parametern sind zwar sehr verwickelt und noch nicht vollständig erforscht, es scheinen jedoch für die verschiedenen Mikroorganismen und Flüssigkeiten optimale Bedingungen hinsichtlich des Abtötungs- und Sterilisationswirkungsgrades zu existieren. Die für die Sterilisierung erforderliche Energie kann in weiten Grenzen schwanken, beispielsweise von niedrigen Werten wie einem Bruchteil einer Wattstunde bis hinauf zu mehreren hundert Wattstunden pro Gallone (5*78 1) Suspension der zu behandelnden Mikroorganismen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden spezielle Antigene zur Verwendung in einem injizierbaren Impfstoff für die Human- ^BADOR®_lNAL

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oder Veterinär-Medizin dadurch erzeugt, daß die das spezielle Antigen erzeugenden Mikroorganismen auf elektrohydraulische Weise abgetötet werden. Die jeweiligen Mikroorganismen können auf irgendeine bekannte Weise gezüchtet worden sein und bei Verwendung einer auf der Oberfläche eines festen Nährbodens gezüchteten Kultur wird diese von der Oberfläche des Nährbodens abgespült, um eine Suspension lebender Mikroorganismen herzustellen. Bei vielen Impfstoffherstellungsverfahren wird zum Abwaschen der Kultur vom' Nährboden eine Pufferflüssigkeit verwendet, die als Suspensionsmedium und zur Stabilisierung des pH der Suspension dient. Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von Antigenen verläuft wie' folgt: Eine bestimmte Menge einer Suspension lebender Mikroorganismen wird zu einer bestimmten Menge einer ausgewählten sterilen Flüssigkeit zugesetzt, so daß man eine Suspension lebender Mikroorganismen mit einer gewünschten Konzentration erhält, die im allgemeinen

in der Größenordnung von 10 Mikroorganismen pro Milliliter liegt. Die Flüssigkeit wird nicht erhitzt und kann irgendeine geeignete Flüssigkeit sein, wie sie für Impfstoffe Verwendung findet, z.B. eine Salzlösung, Serum,, steriles destilliertes Wasser oder andere serologische Flüssigkeiten. Bei Verwendung von sterilem destilliertem Wasser oder anderer dielektrischer Flüssigkeiten wird außerdem eine bestimmte Menge eines geeigneten Puffers zugesetzt, um· die Leitfähigkeit der Flüssigkeit auf einen Wert einzustellen, der eine Erzeugung von elektrohydraulischen Druck-

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stoßen in der Flüssigkeit mit gutem Wirkungsgrad ermöglicht. Die auf eine gewünschte Konzentration eingestellte Suspension lebender Mikroorganismen wird dann In eine sterilisierte elektrohydraulische Kammer eingebracht und in dieser für die Dauer der Sterilisation eingeschlossen» Der Kondensator oder die Kondensatorbatterie der elektrohydraulischen Anlage wird dann in üblicher Weise mittels einer Gleichspannungsquelle auf eine gev/ünschte Spannung im Kilovoltbereich aufgeladen. In der die Mikroorganismen enthaltenden Suspension, die sich in der elektrohydraulischen Kammer befindet, werden dann durch eine entsprechende Anzahl von Kondensatorentladungen eine oder mehrere elektrohydraüllsche Stoßwellen erzeugt, indem jeweils die in der Kondensatoranordnung gespeicherte elektrische Energie über eine Funkenstrecke entladen wird, die in die die Mikroorganismen enthaltende Suspension eintaucht. Die elektrohydraulischen Stoßwellen und die sie begleitende chemische Aktivität töten effektiv alle Mikroorganismen in der Suspension ab und sterilisieren diese also in der oben beschriebenen Weise, dabei wird zwar die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zerstört, überraschenderweise jedoch nicht deren Antigeneigenschaften. Die für eine vollständige Abtätung der speziellen Mikroorganismen erforderliehen Verfahrensparameter werden durch elektrohydraulische Sterilisations-Vorversuche mit den zur Herstellung der gewünschten Impfstoffe verwendeten Mikroorganismen ermittelt. Durch diese Vorversuche wird also die optimale Kombination von

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Speisespannung, elektrischer Energiebetrag pro Entladung, Anzahl der elektrohydraulischen Druckstöße, Punkenstreckenabmessung, Kondensatorgröße usw. für die speziellen Volumina und Konzentrationen der jeweils interessierenden Mikroorganismen-Suspensionen festgestellt. Nach Erzeugung der gewünschten Anzahl elektrohydraulischer Druckstöße wird die sterilisierte Mikroorganismen-Suspension, also die Antigen-Suspension, von der elektrohydraulischen Kammer in einen sterilisierten Aufbewahrungsbehälter für den Impfstoff übergeführt. Der Impfstoff wird dann auf Sterilität überprüft und kann dann in üblicher Weise, z.B. durch Zusetzen eines geeigneten Konservierungsmittels oder Lagern bei geeigneter Temperatur weiterbehandelt und aufbewahrt werden, bis er als Impfstoff zur Immunisierung gegen eine gewünschte Krankheit oder Infektion Menschen oder Tieren injiziert wird.

Als Ausführungsbeispiel der Erfindung soll die Herstellung eines E. Coli-Impfstoffes mittels des elektrohydraulischen Verfahrens gemäß der Erfindung beschrieben werden. Eine Kultur von E. Coil-Bakterien (Escherichia coli ATCC 11229) wurde bei 37°C auf einem geneigten Agar-Agar-Nährboden hergestellt. Nach einer Inkubationszeit von 20 Stunden wurde die Kultur mit einem 0,01 molaren Phosphatpuffer, pH 7>2> von der Nährbodenoberfläche abgewaschen. Die Bakteriensuspension wurde dann in etwa 4 Liter sterilen destillierten Wassers eingebracht, das 200 ml 0,01 ' molaren Phosphatpuffers enthielt. 200 ml der resultierenden

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4 Liter Bakteriensuspension wurde für Abstriche entnommen, um die Anzahl der Mikroorganismen pro Milliliter vor der elektrohydraulischen Behandlung zu ermitteln. Die Auszählung ergab

1,53 x 10 Mikroorganismen pro Milliliter. Nach der Herstellung der Abstriche wurden den entnommenen 200 ml Suspension 1,5 ml Formaldehydlösung zugesetzt, um einen Kontrollimpfstoff zu erhalten. 1,2 Liter des Restes der ursprünglichen 4 Liter Suspension wurden dann mit 200 Entladungen elektrohydraulisch behandelt. Die elektrische Energie stammte von einer Kondensatorbatterie mit 1-8 /UP und die Speisespannung betrug 4,5 kV entsprechend einer elektrischen Eingangsenergie von insgesamt 35,2 Wattstunden pro Gallone (3,78 Liter) bei 182 Joule |pro Entladung. Die Größe der Funkenstrecke betrug 1,6 mm und der elektrische Entladungskreis hatte eine Induktivität von nur 2,5 /UH um die gewünschte Steilheit der in der Mikroorganismen-Suspension erzeugten Druckwellen zu erreichen. Die elektro-' hydraulisch behandelte Probe wurde dann erneut durch Abstriche getestet und erwies sich als bakteriologisch steril,, d.h. es waren keine lebenden E. CoIi-Bakterien mehr vorhanden. Der Rest der Ausgangssuspension wurde dann bei anderen elektrischen Bedingungen in zwei Chargen von jeweils 1,2 Liter ebenfalls elektrohydraulisch sterilisiert,,. für die Impfstofftests wurde jedoch nur die unter den angegebenen Bedingungen behandelte Charge verwendet.

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Die Antigenwirkung der elektrohydraulisch sterilisierten E.Coli-Bakterien wurden in der folgenden Weise geprüft: Zwei Gruppen von je drei Kaninchen erhielten Injektionen des elektrohydraulisch behandelten bzw. äes mit Formaldehyd behandelten Impfstoffes. Es wurden während zweier Wochen dreimal wöchentlich 1,0 ml Impfstoff injiziert, die Gesamtzahl der Injektion betrug also sechs. Eine Woche nach der letzten Injektion wurde

von jedem Kaninchen Blut durch eine ICardialpunktation abgenommen, das Blut zur Gerinnung gebracht und das Serum gewonnen. Das Serum wurde zur Inaktivierung 30 Minuten auf 56°C erwärmt. Zur Durchführung eines Agglutinatipnstestes wurde eine Reihe von zweifacher Verdünnungen jeder Serumprobe hergestellt. Den verdünnten Serumproben wurde jeweils ein gleiches Volumen einer E.CoIi-Suspension zugesetzt und die Mischung eine Stunde bei 37°C inkubiert. Bei Serumverdünnungen bis zu einschließlich einer Verdünnung von 1 zu 640 ergab sich eine vollständige

P Agglutination. Beide Impfstoffe regten also die Produktion von Antikörpern gegen E.Coli-Bakterien an und es konnten keine nennenswerten Unterschiede in der Antigenwirkung der beiden Impfstoffe festgestellt werden. Das elektrohydraulische Verfahren liefert offensichtlich einen reinen und geläuterten Impfstoff, der keine schädlichen Toxine enthält, die unerwünschte Nebenwirkungen haben, wie die unveränderte Gesundheit der Kaninchen zeigte, die die intravenösen Injektionen erhalten hatten. Bei dem E.Coli-Impfstoff konnten auch keine durch die

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e lekt rohydraulisciie Wirkung verursachten Zellmutationen festgestellt werden* Obwohl das Bakterium E.CoIi ein nichtpathogener Mikroorganismus ist, wird es bei Impfstoff-Forschungen viel verwendet, da es mit den speziellen pathogenen Mikroorganismen, die in den bekannten Impfstoffen verwendet werden, die Eigenschaft gemeinsam haben, Antigene zu erzeugen. Die mit dem Bakterium E. CoIi erhaltenen Versuchsergebnisse lassen sich also auf pathogene Mikroorganismen anwenden, die für die bekannten Impfstoffe verwendet werden, was auch gemäß der Erfin- dung geschehen soll.

Es ist im allgemeinen vorzuziehen, die jeweiligen Mikroorganismen unter Anwendung eines möglichst niedrigen Energiepegels pro Entladung abzutöten, so daß zwar die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zerstört wird, aber andererseits möglichst wenig physikalische und chemische Änderungen in der Struktur der Mikroorganismen auftreten, da dann Schwierigkeiten wie Entstehen von Toxinen, Auftreten unerwünschter Nebenreaktionen, Unspezifität, Proteinänderungen und dgl. weitgehend vermieden und die Immunisierungskwirksamkeit des Impfstoffes erhöht wird. Die elektrohydraulischen Druckstöße können mit elektrischen Energien von nur 50 Joule pro Entladung erzeugt werden und trotzdem zur Herstellung, von Antigenen ausreichen. Die elektrohyäraulischen Stöße können in rascher Aufeinanderfolge erzeugt werden, die im wesentlichen durch die Spannung und die Fähigkeit der Spannungsquelle, die Kondensatoren aufzuladen, begrenzt

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ist. Eine Entladungsfrequenz von j50 Hz läßt sich leicht erreichen, so daß sich bei dem Verfahren gemäß der Erfindung im Vergleich zu den bekannten Sterilisationsverfahren, die mit Erhitzung oder chemischer Behandlung arbeiten, eine erhebliche Zeitersparnis ergibt.

Fig. 1 zeigt eine elektrohydraulische Kammer und ein erstes Ausführungsbeispiel einer Funkenentladungselektrode, die sich für die Erzeugung elektrohydraulischer Druckstöße für das vorliegende Sterilisierungsverfahren eignet. Die elektrohydraulische Kammer enthält eine obere und eine untere Deckplatte 1 bzw. 2, zwischen denen sich ein zylindrisches Teil 3 befindet, so daß eine abgedichtete elektrohydraulische Kammer gebildet wird. Die Bauteile 1, 2, J können aus korrosionsfestem Stahl, Messing oder irgendeinem anderen geeigneten, mechanisch festen Material bestehen, das elektrisch leitet und nicht mit den in der.Kammer zu erzeugenden Impfstoffen reagiert. Die Anordnung, wird durch Schraubenbolzen 4 zusammengehalten und durch Ringdichtungen 5, 6 abgedichtet. Die lebende Mikroorganismen enthaltende Suspension kann in die elektrohydraulische Kammer durch ein erstes Gewindeloch in der oberen Deckplatte 1 eingeführt werden, das durch einen Gewindestojwpfen 7 verschließbar ist. Zum Ablassen der behandelten Antigen-Suspension aus der Kammer dient ein Gewindeloch in der unteren Deckplatte 2, das durch einen zweiten Gewindestoeipfen 8 verschlossen ist. Die als Ganzes mit· 9 bezeichnete Funkenentladungselektrode ist durch ein Gewinde an ihrer äußeren

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zylindrischen Oberfläche gekennzeichnet.; Die EleÄr:©dfe· 9' wird von der oberen Deckplätte I? im $ie sie eihges^eh-ra-uÄ %&$■# getragen und ist mittels- eines ©Ringes 12 und einet: M&t-ter^ W abgedichtet,, die durch eine Gegenffiufcter Ii gesichert ist* Der O-Ring 12 dächtet das GeWü.nd^fe der Elektrode 9* gegem daw.Gewinde der Mutter 10' ßh_f so¹ daß¹ aus" der Kämmer: keine Flüssigkeit entweichen kann-» .

Der Aufbau der in Fig* 1 dargeötellten Funfeenelektrö'de 9 bildet einen Teil der vo^lieg^nxleir E^flnaüng. Die Slekfcrodie ^ hat eine zylihdrisehey koäxisie St'ru-ktjur und eignet sieh feesonders^ ftir eiektröhydräulische ZWecke, Wie das hdler' beschriebene Antigen-Herstellungsve^rfäiireh-y bei denen die elektrische Energie pro Entladung kleiner als 500© jOule ist. Die eiäi?ge-*. steilte Elektrode wurde mit Ehtiadungsfreqtiehzeni Mg zu ^O Έζ verwendet, dies stellt Jedoch keineswegs die obere Grenze darv Im Gegensatz zu den Funkenentladungselektroden,, die "bet den bekannten elektrohydraulisehen Einrichtungen verwende* Werden, wird für die Elektrode· 9 keine gegossene und .gebundene Keramik (z.B. Keramikkörper,, die durch- Mischen einer Kerämlkteilehehsuspension mit Flüssigkeit an; Ort ^n^ Stelle durch Gießen hergestellt wurden) für den koaxialen und ringförmigen Isolator ■ benötigte der eine mittlere Roehspannürigselektrode I^ in Form · eines sich in Längsrichtung erstreckeriden massivehi Stabes : einer höhlzylinderförmigeri äußeren- Mässeelektröde·IM Bei den in Fig. 1 dargestellten Aiii

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Isolator 15 aus einer Balbzeugröhre, die aus einer verbundenen; in vielen Lagen spiralig aufgewickelten porösen Bahn durch Imprägnierung mit einem geeigneten Polymerisat hergestellt; wurde und sich durch- hohe mechanische Festigkeit* ausgezeichnetes elektrisches.Isolationsvermögen und geringes Wasserabsorptionsvermögen auszeichnen. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird für doie Isalatorröhre 15 ein viellaglges Laminat aus spdlralig auf gewickeltem Fiberglasgewebe verwendet, das⁵ mit einem Epoxyharz (Glas-Epoxyharz NEMA Grade G-IO) verbunden ist. Andere Glasgewebe, Fasern, Papier oder polymere Gewebe, die mit einem polymere** Wirkstoff verbunden sind, und; andere Harze, ζ".,B-". Phenolharze^ können ebenfalls verwendet werden., Me is©ljierende Halbzeugröhre 15 hat einen Innendurchmesser,, der etwa 10Θ bis 250 /um größer ist als der Durchmesser der mittleren Spannungselektrode 13 und einen Außendurehmesser^ der &bwm WO Ms 250 am kleiner ist als der Innendurchmesser der hohlen koaxialen Masse elektrode 14. Die Wanddicke der Halbzeugröhre 15 entspricht daher ungefähr der Funkenstrecke, in der die Ent- ^; ladung auftritt, wenn die elektrische Energie entladen wird,, '-'-die in dem nicht dargestellten Kondensator der elektrohydrattlischen Einrichtung gespeichert worden war.

Die in der Mtte verlaufende Hochspannungselektrode 13 besteht aus einem- elektrisch gut leitenden Metall, sie 1st zylinsenförmig ttnd hat glatte oberflächen« Für Sterilisierungszwecke kanti die massive, stabförmige Elektrode i% z«B* atis

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einer Kupfer-Siliclurn-Legierüng, wie Everdur 1010, bestehen, die eine hohe Zugfestigkeit und Lichtbogenbeständigkeit- aufweist, so daß-die Erosion an der Spitze gering ist. Die äußere hohle Masseelektrode l4 besteht ebenfalls aus einem gut leitenden Metall, sie ist hohlzylinderförmig und kann auf der Außenfläche ganz oder teilweise mit einem Gewinde versehen sein> wie es in •Fig. 1 dargestellt ist. Für Sterilisationszwecke hat sich als Material für die Masseelektrode eine Aluminiumlegierung des Typs 6o61-T6 als geeignet erwiesen. Die Außenseite der rohrförmigen Masseelektrode 14 kann selbstverständlich auch glatt sein und keinen Gewindegang aufweisen, die Elektrode wird dann auf andere Weise dicht in die obere Deckplatte 1 eingesetzt, falls dies erwünscht ist. Die jeweils 100 bis 250 /um messenden Zwischenräume zwischen den benachbarten Bauteilen 1>, 15 und l4, 15 dient zur Aufnahme eines Kittes oder Klebstoffes, durch, die .die drei koaxialen Teile zu einer massiven einheitlichen Struktur verbunden werden. Für den Klebstoff l6, 17,.der die isolierende Röhre 15 mit der stabförmigen Hochspannungselektrode 13 bzw. mit der Masseelektrode 14 verbindet, kann irgendein handelsübliches Produkt geringer Wasserabsorptionsfähigkeit sein. Als Kleber haben sich beispielsweise handelsübliche Zweikomponenten-Epoxyharzkleber bewährt (z.B. Barco-bond MB-lOOX der Barco Chemical Corporation, Scheneetady, New York).

Bei der Herstellung der Funkenentladungselektrode 9 werden die zusammenzufügenden Teile IJ, 14, 15 durch Scheuern und

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Waschen rait geeigneten Lösungsmitteln gereinigt und entfettet und dann in Luft getrocknet. .Die isolierende Röhre 15 wird an ihrer Außenseite mit Klebstoff überzogen und dann vorsichtig in die rohrförmige Masseelektrode 14 eingesetzt. Wenn der Kleber zwischen den Teilen 14, 15 genügend angezogen hat, wird die Hochspannungselektrode IJ mit Kleber überzogen und in das Mittelloch der Röhre 15 eingesetzt. Die Mittelelektrode IJ soll genügend weit über das obere Ende der Röhre 15 hinausragen, um einen einwandfreien Anschluß der Hochspannungszuführung zu ermöglichen. Die isolierende Röhre 15 soll über das obere Ende der außenliegenden Masseelektrode 14 soweit überstehen, daß keine Überschläge und Gleitentladungen auftreten können. Nach der Montage und dem Aushärten des Klebers wird, das untere Ende der Elektrode 9 soweit abgearbeitet, daß die Arbeitsspitze der Hochspannungselektrode IJ etwa 1,5 bis 6,4 mm vorsteht und die Isolierröhre 15 mit der äußeren Masseelektrode 14 eine ebene Fläahe bilden, die senkrecht zur Elektrodenachse verläuft. Die Funken- oder Bogenentladungen treten zwischen der vorstehenden inneren Hochspannungselektrode IJ und der äußeren Masseelektrode 14 längs der Unterseite der Isolierröhre I5 auf. Die Funkenentladungselektrode 9 kann in beliebiger Länge hergestellt werden und der Elektrodenabstand, also die radiale Abmessung der Röhre'I5 und der beiden Kleberschichten l6, 17*"kann entsprechend den Eigenschaften des Isoliermaterials der Röhre und der verwendeten Spannung und Flüssigkeit gewählt werden. Es

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wurden Funkenstrecken mit Elektrodenabständen zwischen 0,79 und· 19 mm gebaut und erprobt, diese Werte stellen jedoch keineswegs die untere bzw« obere Grenze für den Elektrodenabstand dar» Die Wanddicke der äußeren Masseelektrode ist beliebig^ solange die Elektrode eine genügende mechanische Festigkeit hat und unter der Einwirkung der elektrohydraulischen Drückstöße nicht reißt. Die Form der Spitze der elektrohydraulischen Elektrode wird durch regelmäßiges Nacharbeiten aufrechterhalten, Dieⁱ Elektrode kann oft nachgearbeitet werden und die Eindringtiefe der Elektrode 9 to ale Kammer wird dann entsprechend nachgestellt , so daß die Spitze, also das untere Ende der Hochspannungselektrode 13* immer die gewünschte Lage innerhalb der Kammer einnimmt« " . . -^: "." ^; · -

Fig. 2 zeigt ein zweites Äu&führungsbeispiel einer elektrohydraullschen. Kammer und Funkenentladungselektrodenanordnung gemäß der.Erfindung. Die Kammer enthält eine obere und untere Deckplatte 1 bzw. 2_t die aus einem elektrisch leitenden Metall ausreichender mechanischer Festigkeit, das mit der Füllflüssigkeit nicht reagiert* hergestelltwerden, z.B. Edelstahl oder Messing.. Die Platten 1, 2 werden durch Halterung splat ten 20, 21 und diese durchsetzende .Halterungsbolzen 22, 23 dicht gegen ein zylindrisches Bauteil 5 gepreßt, das die Seitenwand der Kammer bildet. In Fig. 2. sind nur zwei Spannbolzen 22* 23 dargestellt, selbstverständlich kann in der Praxis eine beliebige Anzahl solcher Bolzen verwendet werden« Die Halterungsplattefi 20* 21

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und das zylindrische Bauteil > bestehen aus einem elektrisch gut isolierenden Material. Das Bauteil 3 kann vorteilhafterweise aus einem Laminat bestehen, das einen mittels eines Polymerisats verbundenen spiraligen Wickel einer porösen, folienartigen Bahn enthält, wobei im wesentlichen die gleichen Werkstoffe wie für die isolierende Röhre 15 (Pig. 1) Verwendung finden können. Die Halterungsplatten 20, 21 bestehen zweckmäßigerweise aus

P einem harzgebundenen Laminat (z.B. einem unter dem; Handelsnamen Textolite von der General Electric Company vertriebenen Produkt). Die Hochspannungs- und Masseelektrode sind bei der in Pig. 2 dargestellten Ausführungsform im Gegensatz zu der koaxialen und ringförniigen Anordnung der Pig» I kollinear angeordnet« Die Elektroden 24* 25 bestehen dabei aus zwei mit Gewinden versehenen zylindrischen Stäben mit teilweise glatter Oberfläche und sind in gegenüberliegende Wände der elektrohydrau-Iisehen Kammer eingeschraubt»Sie stehen sich dabei !collinear

* gegenüber, wobei der Abstand ihrer Enden der gewünschten Große der Funkenstrecke entspricht. Die Elektroden 24, 25 können aus einer Kupfer-Silicium-Legierung (Everdur 1010) bestehen und jeweils mit einer Gegenmutter 26 bzw. 27 gesichert sein. Die Neuartigkeit dieser Konstruktion liegt darin, daß das isolierende zylindrische Bauteil jj sowohl als Behälteraußenwand ' als auch als elektrischer Isolator zwischen den Elektroden arbeitet und die Hochspannungselektrode 24 von der Masseelektrode 25 isoliert. Die Elektroden 24, 25 sind an der Seite mit Leitungen 28 bzw. 29 verbunden. Die in Fig. 2 dargestellte

Anordnung kann ebenfalls mit Entladungsfrequenzen bis zu JO Hz betrieben werden* :

Das InFIg. 1 dargestellte Ausfülirungsbeispiel hat dem Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 2 gegenüber folgende Vorteile: Die elektrohydraulische Kammer läßt sich bei Fig. 1 größer machen, so daß auch größere Chargen sterilisiert werden können,, da das Fassungsvermögen der in Fig» 2 dargestellten Anordnung durch die fabrikatorisch erreichbaren Höchstmaße des Bauteils "J" begrenzt ist. Das innere der elektrohydraulischen Kammer laßt sich außerdem leichter reinigen, da die Platte 1, selbst wenn sich Flüssigkeit in der Kammer befindet, leicht abgenommen kann, indem man die oberen Schrauben Λ löst; hierdurch ergibt sich im Effekt auch eine längere Lebensdauer des Gerätes.

Das in Fig. 2 dargestellte Ausführungsbeispiel hat dagegen seinerseits gegenüber dem Ausführungsbeispiel der Fig. 1 die Vorteile, daß das Bauteil 3 sowohl einen Teil der die Flüssigkeit aufnehmenden Kammer bildet als auch als Isolator zwischen der Hochspannungselektrode 2Ά und der Masseelektrode 25 arbeitet, so daß sieh eine wesentlich leichtere und■" wirtschaftlichere " Konstruktion ergibt. Für die Befestigung der Deckplatten an dem die Seitenwand bildenden Bauteil 5 sind keine Flanschen erforderlieh, so daß eine billige und einfache Herstellung . möglich ist. Da die Elektrodenanordnung vollständig eingeschlossen ist, kann sie auch nicht zu Undichtigkeiten Anlaß geben, es lassen sich auch höhere elektrohydraulisehe Drücke

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erreichen und pathogene Mikroorganismen mit größerer Sicherheit sterilisieren. Die Elektrodenerosion ist in erster Linie eine Funktion der Größe der Funkenstrecke, der Leitfähigkeit der Flüssigkeit, in der die elektrohydraulischen Druckstoß© erzeugt werden, der Entladungsspannung an der Funkenstrecke und der elektrischen Energie pro Entladung. Ein Vorteil bei der Verwendung der oben beschriebenen speziellen Elektroden- und Isolatormaterialien besteht darin, daß bei der Erosion der Elektroden und anderen Bestandteile der Anordnung keine Materialien in Lösung gehen, sondern daß die bei der Erosion abgetragenen Materialien nur eine Suspension mit der elektrohydraulischen sterilisierten Flüssigkeit bilden und daher durch Absetzen filtrieren oder im Falle magnetischer Werkstoffe, durch eine magnetische Anordnung entfernt werden können. Die kleine Menge an Elektrodenerosionsprodukten, die bei der Behandlung in die Suspension von E. Coli-Bakterlen gelangt war, wurde erst vor der Injektion entfernt und beeinträchtigte weder die Kaninchen, denen die Injektion verabreicht wurde, noch die Antikörperbildung.

Durch die vorliegende Erfindung wird also ein neuartiges elektrohydraulisches Verfahren zur Herstellung von Antigenen für die Impfstofferzeugung angegeben, bei dem eine Suspension lebender Mikroorganismen bestimmter Art und Konzentration derart elektrohydraulisch behandelt wird, daß die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen, nicht jedoch ihre Antigeneigenschaft zerstört

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wird. Durch die Erfindung werden außerdem verbesserte elektrohydraulische Kanunern und Elektrodenanordnungen angegeben," die die Funkenstrecke der elekt ^hydraulischen Einrichtungen bilden. Das durch die Erfindung angegebene elektrohydraulisohe Verfahren zur Herstellung von Antigenen hat gegenüber den bisher für diesen Zweck verwendeten Verfahren eine Heihe erheblicher Vorteile, es verdient insbesondere nochmals erwähnt zu werden, daß die Reinigung, die bei der bekannten chemischen Abtötung von Mikroorganismen erforderlich ist, die genau dosierte Anwendung von Hitze die bei den anderen bekannten Verfahren nötig sind, entfallen können, und daß die Abtötung von Mikroorganismen bei dem Verfahren gemäß_v der Erfindung in einer viel kürzeren Zeit möglich ist, als bei den bekannten Verfahren, nämlich in einigen wenigen Sekunden oder Minuten, je nachdem mit welcher Wleder-

. die
holungsfrequenz/Entladungen erfolgen. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung ist also eine vollständige Sterilisierung der Mikroorganismen-Suspension innerhalb von Sekunden möglich, wenn man mit geeigneten Ehtladüngsparametern arbeitet, während dies bei den konventionellen Verfahren eine oder mehrere Stunden erforderte.

Die beschriebenen Ausführungsbeispieie lassen sich in der verschiedensten Weise abwandeln ohne den Rahmen der Erfindung zu überschreiten. Die Erfindung ist insbesondere nichtauf Soli-Impfstoffe beschränkt, sondern läßt sich auf die Herstellung aller bekannten Impfstoffe aus Mikroorganismen,wie Bakterien, Viren, Rickettsien, Pilzen und Protozoen anwenden.

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Claims (7)

- . 26 Patentansprüche

1.) Verfahren zum Herstellen von Antigenen für die Impfstofferzeugung, d. ad u r c h gekennzeichnet, daß in einer Suspension, die ausgewählte Mikroorganismen in einer festgelegten Konzentration enthält, elektrohydraulisch Druckstöße erzeugt werden, die die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen, nicht jedoch ihre Antigeneigenschaften zerstören.

2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurc' h gekennzeichnet, daß eine nicht-erhitzte Suspension, die die ausgewählten Mikroorganismen in eingestellter Konzentration enthält, verwendet wird.

3.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit elektrohydraulischen Druckstößen relativ kurzdauernd während einer Zeitspanne bis zu einigen Minuten durchgeführt wird, um die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zu zerstören ohne ihre Antigenwirkung zu beeinträchtigen,

4.) Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3* dadurch gekennzeichnet, daß eine unerhitzte Suspension gewünschter lebender Mikroorganismen in gewünschter Konzentration hergestellt wird, indem eine bestimmte Menge gewünschter lebender Mikroorganismen in einer bestimmten Menge nicht-erhitzter steriler Flüssigkeit eingebracht werden.

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5·) Verfahren nach einem; der Ansprüche 1 bis 4, d ad arch g e k e η η ζ e I c h η e t , daß die Suspension dadurch hergestellt wird, daß eine bestimmte Menge einer Suspension ausgewählter lebender Mikroorganismen in eine abgemessene Menge nicht-erhitzten, gepufferten, sterilen destillierten Wassers eingebracht wird, um die gewünschte Konzentration an lebenden Mikroorganismen in der nicht-erhitzten Suspension zu erhalten.

6») Verfahren nach Anspruch 5, d a d u r c h ge kennzeichnet , daß die lebende Mikroorganismen in gewünschter Konzentration enthaltende Suspension in eine sterilisierte elektrohydräulische Kammer eingebracht und in dieser eingeschlossen wird, daß eine Kapazität mittels einer elektrischen Stromquelle bis zu einem gewünschten" Energiebetrag aufgeladen wird, daß eine bestimmte Anzahl elektrohydraulischer Druckstöße ausgelöst werden, indem für jedfen Druckstoß in der in der elektro^hydraulischen Kammer enthaltenen Mikroorganismen-Suspenslon eine elektrische Entladung erzeugt wird, bei der die in dem Kondensator gespeicherte elektrische Energie über eine in die Suspension eintauchende Funkenstrecke entladen wird, um die Vitalität der Mikroorganismen,, nicht jedoch ihre Äntigeneigenschaften zu zerstören und eine Antigen-Suspension herzustellen, und daß die Antigen-Suspension aus der elelctrohydraulischen Kammer für die Verwendung als Impfstoff entnommen wird. - ■ ":.·■"." ^:

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7.) Einrichtung zur Ausübung des Verfahrens nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch eine Funkenentladungselektrode (9)* die einen in Längsrichtung verlaufenden, massiven Stab (lj5) aus einem elektrisch leitenden Material, ein zu diesem Stab koaxial hohles Bauteil (l4) aus einem elektrisch leitenden Material, dessen Innenabmessungen größer sind als der Durchmesser des Stabes, und eine vorgefertigte Röhre (15) aus * elektrisch nichtleitendem Material enthält, das den im Querschnitt ringförmigen Raum zwischen dem Stab (13) und dem hohlen Bauteil (14) einnimmt und mit diesen Teilen zu einer einheitlichen massiven Struktur verbunden ist, wobei die vorgefertigte Röhre (15) aus einem gebundenen, in mehreren Schichten spiralig aufgewickelten, porösen, flächigen Material besteht, das mit einem Polymerisat getränkt ist, so daß sich eine Röhre hoher mechanischer Festigkeit, hoher elektrischer Isolationsfähigkeit und niedriger Wasserabsorptionsfähigkeit ergibt (Fig. l).

^ 8.). Einrichtung zur Ausübung des Verfahrens nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch eine elektrohydraulische Kammer mit einem oberen Abschlußteil (l) aus einem mechanisch festen und elektrisch leitenden Material, einem unteren Abschlußteil (2) aus einem mechanisch festen und elektrisch leitenden Material, einem eine Seitenwand bildenden Bauteil (5), das zwischen dem oberen und unteren Abschlußteil angeordnet ist und mit diesen eine flüssigkeitsdichte Kammer bildet, eine Halterung (20 bis 23) durch die die Abschlußteile (1, 2) flüssig-

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keitsdicht an dem die Seitenwand bildenden Bauteil (5) gehalten werden, das aus einem mechanisch festen und elektrisch isolierenden Material bestellt, einen ersten in Längsrichtung verlaufenden massiven Zylindrischen Stab.(24) aus einem elektrisch leitenden Material,, der mit einem ein Gewinde aufweisenden Ende in das obere Abschlußteil (l) eingeschraubt ist, einem zweiten longitudinal verlaufenden,, massiven zylindrischen Stab aus einem elektrisch leitenden Material, der mit einem Gewinde versehen und in das untere Abschlüßteil (2) eingeschraubt ist, wobei die beiden Stäben (24, 25) kollinear angeordnet, sind und mit ihren gegenüberliegenden Enden eine Funkenstrecke gewünschter Größe bilden, und durch eine Anordnung (7, 8) zum Füllen und Entleeren der elektrohydraulischen. Kammer (Fig. 2), ; / λ,\

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