DE1617319A1

DE1617319A1 - Verfahren zur Herstellung von stabilem,hepatitisfreiem Serum

Info

Publication number: DE1617319A1
Application number: DE19511617319
Authority: DE
Inventors: Dr-Chem Wolfgang Stephan
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Priority date: 1951-01-28
Filing date: 1951-01-28
Publication date: 1971-02-11
Also published as: DE1617319C3; DE1617319B2

Description

Verfahren zur Herstellung von stabilem, hepatitisfreiem Serum Es ist bekannt, da# sich blutplasma bzw. Blutserum infolge Denaturierung der instabilen Eiwei#komponenten nach einiger Zeit eintrübt und dann nicht mehr zur Infusion verwendet werden kann.
Es ist bisher nicht möglich, im Tierexperiment oder durch in vitro-Analyse-n Ffestzustellen, ob Serum bzw. Plasma Hepatitisviren enthalten. Die Gefahr einer Verunreinigung mit Hepatitisvirus ist aber insbesondere bei Verwendung größerer Blutpools vorhanden. Man hat bis heute noch keine lösungsstabilen, hepatitisfreien Plasma- oder Serumkonserven ohne Verwendung von chemischen Zusätz. und ohne Denaturierung an den Serfumfproteinen herstellen können.
Die immunelektrolytis. chen Untersuchungen von 1 bis 2 Jahre gelagerten Seren und Plasmen zeigten, daß für die Instabilität neben dem Fibrinogen insbesondere die tipoproteine, besonders das alpha2-Lipoprotein, verantwortlich sind. Bekannt ist die Adsorption von Fibrinogen und anderen Gerinnungsfaktoren aus Plasma durch Bentonit (Io P. Soulier, Extrait de la Revue Francaise d'Etudes cliniques et biol., 1959, 2, Band IV, 9. 153 @ 156) sowie die Adsorption von Lipoproteinen und Lipiden aus Serum bei der Herstellung von Coerolo-Plasmin unter Verwendung von Kieselsäure (J. Clausen, A. Pansen und R. Jensen, Prot;Lde;s of the Biol.
Fluids, 9e Kolloquium, Brügge 1961, Elsevier Amsterdam, 1962, S.. 269).
Über die Lagerstabilität der so beha. ndelten Plasmen bzw Seren ist ni-chts bekannt.
Stabilisierte Plasmaproteinlösungen werden im allgemeinen durch Fraktionierung hergestellt. Bekannt ist auch die Adsorption an Bentonit und die Behandlung mi-t Monochloracetat (Donald Dawson et al., ISR- Band II, Nr. 1, Jan. 1-962, 311 Bei der Fraktionierung erhält man hier jedoch nur Plasmaproteinlösungen, in denen therapeutisch wichtige Fraktionen fehlern. Mit den anderen Verfahren kann keine Stabilität erreicht werden.
Es wurde nun gefunden, daß kolloidale Kieselsäure unter geeigne-ten Reaktionsbedingungen imstande ist, neben alpha1-, alpha2- und ß-Lipoproteinen auch Fibrinogen quantitativ zu adsorbieren. Bei der Behandlung von Serum und Plasma erhält man dabei Proteinlösungen, die noch alle therapeutisch wesentlichen Bestandteile enthalten und infolge vollständiger -Entfernung des lösungsinstabilen Fitrinogens sowie der Lipoproteine weitgehen lagerstabil sind, so daß bei gleichmäßiger Kühlraumtemp:eratur (+ 4 bis + 6 ° C) eine Lagerung bis zu 2 Jahren ohne. Eintrübung. und ohne Verlust. der therapeutischen Wirk samkeit möglich ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von lipoproteinfreiem, stabilem -und sterilem Serum, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Blutserum oder Blutplasma mit 250 bis 500 mg kolloidaler Kieselsäure je g Gesamtprotein innig vermischt. und nach Abtrennung der Kieselsäure UV-bestrahlt und sterilfiltriert.
Die erfindungsgemäße Behandlung wird vorzugsweise bei Temperaturen bis zu 50 ° C, insbesondere zwischen 20 und 50 0 C durchgeführt. Dabei liegt der bevorzugte PH-Bereich zwischen 6,5 und 8. Die Dauer des Mischungsvorganges hangt von der Art der zum Mischen verwendeten Vorrichtung ab. Praktische Mischungszeiten sind z. B. 1 bis 8 Stunden Behandlung in mit geeigneter Geschwindigkeit umlaufenden Mischern.
Die UV-Bestrahlung wird vorzugsweise mit einer Intensität bis 1 mW/cm Minute durchgeführt.
Es wurde festgestellt, daß durch die erfindungsgemäße Behandlung von Plasma oder-Serum dem Hepatitisvirus analoge Viren weitgehend daraus entfernt werden. Vorstehend wurde bereits darauf hingewiesen, daß beim heutigen Stand der Technik weder am Tier noch in vitro Versuche mit dem Hepatitisvirfus durchgeführt werden können. Man ist daher auf analoge nachweisbare Viren angewiesen. Als besonders geeignetes Modell für das Hepatitisvirus wurde von LoGrippo (Investigations of the Use of #-Profpiolactone in virus inactivation; G. A. LoGrippo, Annals of the New York Acad. of Sciences, Band 83, Art. 4, Seiten 578 - 594, 130 Januar 1960) der coli-Phage angegeben. Mit Hilfe von colilT2-Phagen-infizierten Testplasmen und -seren konnte nachgewiesen werden, da# bei einer Ausgangskonzentration von 106Phagen ml die erfindungsgemäße Behandlung mit Kieselsäure maximal 102 ml übrig läßt. Eine sichere Entfernung aller Phagen erreicht man, wenn man anschlie#end an die Behandlung mit der kolloidalen-tleselsaure mit UV-Licht bestrahlt, bevorzugt in einer Durchflu#apparatur, wie sie von der Firma DILL im Handel vertrieben wird.
Zur Beseitigung von Viren hat man bisher 2 Verfahren angewendet: 1.) Pasteurisieren durch 10 Stunden Erhitzen auf 60 : C0 Dieses Verfahren ist auf Serum ni-cht anwendbar, da unter diesen -Bedingungen zahlreiche Serumproteine denaturieren.
2.) Kombination von #-Propiolacton-Behandlung + UV-Bestrahlung -(G. A-. LoGrippo et al. Fed. Proceedings, 15:518, 1956).
Diese Methode erlaubt eine Stabilisierung von Seren und Plasmen unter schonenden Bedingungen, wobei Jedoch die Lagerstabilität nicht erhöht wird.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man demgegenüber eine lagerstabile und hepatitisfreie Plasma- bzw. Serumkonserve. i-ie Erffindung wird in den -nachs-tehenden Beispielen erläutert Beispiel 1 Eine 1 1-Flasche wird mit 20 g kolloidaler Kieselsäure, z. B. dem von der Degassa unter der handelsmä#igen Bezeichung "Aerosil" vertriebenen Produkts und 2çO0 g Glasperlen (0,4 cm #) gefüllt, mit Mull verschlossen und 2 Stunden bei 180 ° C hei#luftsterilisiert. Das zu behandelnde Serum (PH 7,5) wird unter sterilen Bedingungen eingefüllt. Nach Verschluß der Flasche lä#t man 4 Stunden, mit 40 bis 50 UpM "über Kopf" rotieren. Der Adsorptionseffekt hängt wesentlich von;der Drehgeschwindig;keit ab. Danach erhitzt man 4 Stunden bei 45 Q C im Wasserbad ohne Rühren oder Schütteln und zentrifufgiert nach dem Abkühlen 30, Minuten bei 5 OOP UpM. Nach W-Bestrahlung in einer DILL-Apparatur wird sterilfiltriert. Nach 4 Wochen Lagerung bei + 5 ° kann von einem sich gelegentlich bildenden geringen Niedersohlag abfiltriert werden.
Zur Aufarbeitung des Kieselsäureniederschlages kann man wie folgt arbeiten: Man friert den voluminösen Niederschlag bei - 20 ° C ein, taut bei Zimmertemperatur auf und zentrifugiert 15 Minuten bei 5 000 UpM.
Der Überstand, der papie-r- und immunelektrophoretisch praktisch die gleiche -Zusammensetzung hat wie die Hauptmenge des adsorbierten Serums bzw. Plasmas, wird nach der UV-Bestrahlung sterilfiltriert und nach 4 Wochen Lagerung bei 5 ° C, wenn erforderlich, nachfiltriert.
Auf diese Weise hergestellte Seren sind sowohl akut als auch chronisch toxisch verträglich und pyrogenfrei.
Beispiel 2 1 1 Humanserum wird bei einem pH 7,5 (physiologischer pE-Wert) zusammen mt 20 g hei#luftsterilisierter kolloidaler Kieselsäure 4 Stunden bei 45 ° C gut gerührt und nach dem Abkühlen 30 Minuten bei 5 000 UpM zentrifugiert, anschlie#end UV-bestrahlt und sterilfiltriert. Nach 4 Wochen Lagerung bei 5 ° C wird von einem sich gelegentlich bildenden geringen Niederschlag abfiltriert.
Beispiel 3 1 1 Human-ACD-Plasma wird auf 5,5 % Protein-eingestellt und bei einem PH-Wert von 6,5 zusammen mit 30 g hei#luftsterilisierter kolloidaler Kieselsäure 4 Stunden bei 45 ° C gut gerührt, zentrifugiert, UV-bestrahlt und sterilfiltriert. Nach 4 Wochen Lagerung bei 5 ° C wird von dem sich gelegentlich bildenden geringen Niederschlag abfiltriert.
Beispiel 4 1 1 Human-ACD-Plasma wird auf 5, 5 % Protein eingestellt und bei pH-Wert von 6,5 zusammen mit kolloidaler Kieselsäure 4 Stunden bei Zimmertemperatur gut durchmischt und anschließend 4 Stunden bei 45 0 erhitzt. Nach dem Abkühlen wird 30 Minuten bei 5 000 UpM zentrifugiert, dann W-bestrahlt und sterilfiltriert. Nach 4 Stunden Lagerung bei 5 0 wird von einem sich gelegentlich bildenden Niederschlag abfiltriert

Claims

Patentansprüche: 1.) Verfahren zur Herstellung von lipoproteinfreiem, stabilem und sterilem Serum, dadurch gekennzeichnet, daß man Blutserum oder Blutplasma mit 250 bis 500 mg kolloidaler Kieselsäure je g Gesamtprotein innig vermischt und nach Abtrennung der Kieselsäure UV-bestrahlt und sterilfiltriert.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Temperaturen bis zu 50 ° C, insbesondere zwischen 20 und 50 ° C arbeitet.
3.) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem pg-Bereich von 6,5 bis 8 arbeitet.

4e) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer Intensität bis 1 mW/cm2 Minute Uf-bestrahlt.