DE1598083C

DE1598083C - Diagnostisches Mittel zum Nachweis kupplungsfähiger Inhaltsstoffe von Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE1598083C
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Dr.rer.nat 6800 Mannheim-Waldhof; Lange Hans-Rudolf 6840 Lampertheim; Rieckmann Peter Dr. rer.nat 6800 Mannheim-Waldhof Rey
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Publication date: 1972-06-22

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein diagnostisches Mittel zum Nachweis kupplungsfähiger Inhaltsstoffe in Körperflüssigkeiten auf einem saugfähigen Träger.

Der qualitative Nachweis und die quantitative s Bestimmung von Inhaltsstoflen des Urins, des Blutes und anderer Körperflüssigkeiten hai für die medizinische Diagnostik in den letzten Jahren zunehmende Bedeutung gewonnen. Zu den analytisch brauchbaren Nachweisreaktionen gehört unter anderem die Kupplungsreaktion mit Diazoniumsalzen, die unter Einhaltung entsprechender Versuchsbedingungen genau reproduzierbar und spezifisch verläuft. Der Nachteil aller kolorimetrischen Bestimmungen, die auf der Kupplung mit Diazoniumsalzen beruhen, besteht jedoch in der mangelnden Haltbarkeit von Diazolösungen, die deshalb stets vor Gebrauch frisch hergestellt werden müssen. Aus der deutschen Patentschrift 1 102 444 ist ein diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Bilirubin im Harn bekanntgeworden, *o welches die Kupplungsreaktion des Bilirubins mit p-Nitrobenzol-diazonium-p-toluolsulfonat in saurer Lösung ausnutzt; hierbei wird eine gewisse Vereinfachung des Bilirubmnachweises dadurch erreicht, daß man das relativ beständige p-Nitrobenzol-diazonium-p-toluolsulfonat in Tablettenform bringt. Zur Durchrührung des Nachweises benötigt man eine saugfähige SpezialUnterlage, wie Asbestpapier oder ein mit Calcium- oder Bariumsalzen imprägniertes Papier, sowie zwei Pipetten zum Auftragen des Harns und des Wassers. Für die Praxis würde es eine wesentliche Erleichterung bedeuten, wenn der Nachweis von Bilirubin mit Hilfe eines einfachen Testpapierstreifens durchführbar wäre; das scheitert jedoch an der mangelnden Haltbarkeit von Diazoniumsalzen, insbesondere, wenn saugfähige Träger mit ihnen imprägniert werden.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man stabile diagnostische Mittel zum Nachweis kupplungsfähiger Inhaltsstoffe von Körperflüssigkciten auf einem saugfähigen Träger erhält, wenn man an Stelle von Diazoniumsalzen Triazen-Derivate bzw. die Salze solcher Verbindungen verwendet. Es ist zwar aus der Färberei bekannt, Naphtholat-Triazen-Gemische zu verwenden, die nach der Auftragung auf das Gewebe bei erhöhter Temperatur im sauren Medium in die gewünschten Azofarbstoffe übergeführt werden; jedoch war es nicht ohne weiteres vorauszusehen, daß sich Triazen-Derivate auch für analytisch auswertbare Kupplungsreaktionen eignen würden. Insbesondere war es für den Fachmann völlig überraschend, daß sich mit Hilfe von Triazen-Derivatefi bzw. deren Salzen ausreichend stabile Testpapiere herstellen lassen, da aus der Literatur bekannt war, daß Triazen-Papier (zur pH-Bestimmung) nicht unbegrenzt haltbar ist; vgl. hierzu Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. Hl/2 (19SS), S. 119.

Nach unseren Befunden weisen die erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel erhebliche Vorteile gegenüber den bekannten auf: 1. Diapostwehe Mittel auf einem saugfähig«! Träger, die unter Verwendung von Triazen-Derivaten bzw. deren Salzen an Stelle von Diazolösungen und festen Diazoniumsalzen hergestellt *5 werden, sind wesentlich stabiler gegen Zersetzung, bei der üblicherweise stark gefafbte und damit störende Produkte entstehen.

2. Feste Diazoniumsalze sind im allgemeinen explosiv und deshalb außerordentlich gefährlich in der Handhabung, während die meisten Triazen-Derivavc und insbesondere ihre Salze nicht explosiv sind.

3. Diazoniumsalze — selbst die relativ stabilen — sind im allgemeinen sehr lichtempfindlich, während die erfindungsgemäß verwendeten Triazen-Derivate keine besonderen Lichtschutzmaßnahmen erfordern.

4. Triazen-Derivate bzw. ihre Salze lassen sich sowohl für Testpapiere wie auch Tabletten und Testlösungen verwenden und sind deshalb universeller einsetzbar.

Für die erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel kommen prinzipiell alle Triazen-Derivate bzw. deren Salze in Frage, bei denen Kupplungsprodukte mit Inhaltsstoffen von Körperflüssigkeiten analytisch auswertbare Farbstoffe liefern. Insbesondere handelt es sich um Triazen-Derivate der allgemeinen Formeln I und II:

(H)

Hierbei bedeuten A und B Wasserstoff, ein Halogenatom, eine Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Alkoxy-, Nitro- oder Sulfonylgruppe, R₁ Wasserstoff, eine Alkyl- oder Arylgruppe. R₂ ein Carboxyalkyl-, Carboxyaryl-, Sulfoalkyl- oder Sulfoarylgruppe, wobei R₁ und R₂ auch gemeinsam mit dem N-Atom einen Ring bilden können, X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder die Gruppe N — R|, wobei R₁ die obige Bedeutung hat.

Vorzugsweise setzt man die Salze der Triazen-Derivate ein. Hierfür kommen grundsätzlich alle ausreichend wasserlöslichen Salze in Frage, insbesondere Alkali-, Ammonium-, Erdalkali- und Schwermetallsalze. Besonders bewährt haben vieh die Calcium-, Barium- und Zinksalze,

Medizinisch besonders interessante Substanzen, die sich mit Hilfe einer Kupplungsreaktion nachweisen lassen, sind beispielsweise Oxalessigsäure (im Glutamat-Oxalat-Transaminase-Test), Kreatinin, Phenylbrenztraubensäure, Acetessigsäure, /?»Naphthylamin (im Leucin-Aminopeptidase-Test) und das bereits wetter oben erwähnte Bilirubin (bzw. dessen GIucuronid).

Die erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel, beispielsweise zum Nachweis von Bilirubin, sind mindestens genauso empfindlich wie die aus der deutschen Austegescbrift 1102 444 bekannten TesttaWetten; vor allem! sind sie aber wesentlich haltbarer und erheblich leichter handzuhaben. Die Empfindlichkeit eines er* fmdungsgemäDen diagnostischen Mittels nun Nach· weis von Bilirubin betrügt wie bei den besten bisher bekannten diagnostischen Mimin 0,OS mgVt und ist somit völlig ausreichend, pathologische Mengen Bilirubin im Urin oder Blutserum nachzuweisen.

Zur Durchführung einer derartigen Nachweisreaktion auf Bilirubin fet es nur noch erforderlich, bei·

Claims

3 4

spielsweise mit einem Kunststoffröhrchen oder mit Beispiel 2
einem Trinkröhrchen einen größeren Tropfen Urin _{Ge|be Test}p_ap_{iere rür} Bilirubin
oder Serum auf das Testpapier aufzubringen und anschließend mit. einigen Tropfen wäßriger, Vorzugs- Ein Filterpapier wird mit folgender Lösung impräweise jedoch alkoholischer Säure zu betropfen. Die 5 gniert:
weißen bzw. gelben Papiere zeigen beim Vorhandensein von Bilirubin einen deutlich blauen Fleck, der
sich von dem übrigen Papier gut abhebt. Enthält die Ä™Ä ^{Y H} η S _B

Probe kein Bilirubin, so bleibt das Testpapier weiß; DestilSes Wasser ad 100 mf

für den Fall, daß ein gefärbtes Triazensalz benutzt io destilliertes Wasser aa iuu ml

wurde, entsteht an dieser Stelle ein weißer Fleck. Das Das erhaltene gelbe Testpapier wird mit einem

Ergebnis kann nach ungefähr einer halben Minute Tropfen bilinibinhaltiger Körperflüssigkeit (Harn,

abgelesen werden, wobei keine anderen störenden Fär- Serum) aus einem Trinkröhrchen versetzt.Betropft

bungen auftreten, welche sonst zu Fehldiagnosen man es anschließend mit etwa 10%iger wäßriger Säure

führen wurden. '5 (Schwefelsäure, Perchlorsäure, Toluolsulfosäure, SuI-

In den folgenden Beispielen sind einige typische und fosalicylsäure, vorzugsweise Salzsäure), so entsteht

bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsge- ein rötlichblauer oder blauer Fleck, wenn mehr als

mäßen diagnostischen Mittel beschrieben. 0,05 mg% »direktes« (konjugiertes) Bilirubin in der

Körperflüssigkeit vorhanden war. Bei Verwendung

B e i s ρ i e 1 1 20 einer Mischung von 3 Teilen Äthanol und 1 Teil

_ . _VT , . _.... , . konzentrierter Salzsäure können »direktes« und »in-

Testpapier zum Nachweis von Bilirubin direktes« (freies) Bilirubin in der angegebenen Kon-

Ein Filterpapier wird mit folgender Lösung im- zentration nachgewiesen werden,

prägniert: Ähnliche Testpapiere erhält man beim Imprägnieren

τ χα .u 1 -, u ., , 25 mit folgenden Lösungen:

S-MethylO-carboxymethyl- ^{6 6}

1 -(2\4'-dichlorphenyl)- 3,3-(2'-Carhoxy-tetramethylen>-

triazen-Calciumsalz 0,5 g l-(p-nitrophenyl)-triazen-

Aceton ad 100,0 ml Natrium- bzw. -Calciumsalz... Ig

„, , . ·„ -. · .... Destilliertes Wasser ad 100 ml

Das erhaltene weiue iestpapier wird mit einem 3° ,

Tropfen Urin aus einem Trinkröhrchen versetzt und , Methvl 2 sulfoäthvl

anschließend mit einer Mischung von 3 Teilen Me- " !.(p^rophenylHriazen-

thanol und 1 Teil konzentnerter Salzsaure betropft. i-nirintn«a1r Ib

Enthält die Probe mehr als 0,05mg% Bilirubin, so MeCnoWoig'·'.".'.'.'.'.'.'.'·". '·'.".'. ad 100ml

entsteht ein blauvioletter Fleck. 35 °

Ähnli ;he Testpapiere erhält man, wenn man Filter- Nach dem Auftropfep von bilirubinhaltigem Urin

papier mit Lösungen folgender Zusammensetzung werden diese Papiere mit einer Mischung aus 3 Teilen

imprägniert: Isopropanol und 1 Teil konzentrierter Salzsäure oder

,..,,,- . .. . einer 20%igen äthanolischen Sulfosalicylsäurelösung

a-MethyW-carboxymethyl- betropft, wobei wiederum im gelben Feld blaue Flecke

Hp-acetylphenyD-tnazen- entstehen.

Zinksalz Ig

Methanol, 60% 100 ml Patentanspruch:

Wird auf dieses Testpapier aus einem Trinkröhrchen Verwendung eines saugfähigen Trägers, ent-

bilirubinhaltiges Serum oder Urin aufgetragen, so 45 haltend ein Triazen-Derivat oder das Salz einer

entsteht bei anschließendem Betropfen mit einer solchen Verbindung als diagnostisches Mittel zum

Mischung aus 3 Teilen Äthanol und 1 Teil konzen- Nachweis kupplungsfähiger Inhaltsstoffe in

trierter Salzsäure ein blauer Fleck. Körperflüssigkeiten.