DE1648848C - Diagnostisches Mittel und Verfahren zum Nachweis von Urobilinogen-Körpern - Google Patents

Description

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o.\\-. .\lkii\y-. eine ollenkettige oder cyclische, uesaitlylc oder ungesättigte, sekundäre mler tertiäre Amiimgruppe bedeuten, odor R und R, zusamme chic O\a-. I'hia-. Sulfonyl-. Alkylthinniuin-. lniiiui-. Alkylimmo-. gegebenenfalls suhstiunerte Aryliminoiniv'-eine offenketlige. alieyclisehc oder heterocyclische i )ialkyhminogruppe bilden, oder einer der KcsieR, und R_; ein Wassersloffmoin ist. während >i u.id »ι Zahlen von 0 bis 3 sind, gekennzeichnet ist.

tios einer bevorzugten Ausführangsform des neuen diagnostischen Mittels ist der sa.iufähige 1 rauer mit einer Lösung getränkt.die 0.001 bis 1",, eines Aldehvds der allgemeinen Formel (I) und mindestens 3. vorzugsweise 15 bis 3(1",ι einer starken, festen Säure einhält. Als starke, feste Säuren kommen in l'rasze: is Miü'osalicylsäure. p-'l oluolsulfosäure. Kaliumbisulfat, ι MUtaminsäure-hydrochlorid und insbesondere Oxal-

Ί >as im Ans;nuch 3 angegebene erlinduimsüemäße \ erfahren besteht in der allgemeinen Verwendung :o \>·η Substanzen nach Formel (1) /um Nacluveis \on 1'ivhilinogen-Körpern. Zur Durchlührung des Verl'.i'hrens kann man die neuen diagnostischen Mittel in die zu uiuersuehei.de Losung eintauchen und den i ,π !Hirnschlag nach kurzer Zeit ablesen.

im Gegensatz zu den bisherigen diagnostischen ."■■ii'ieln zum Nachweis von Urobiünogen sind die neuen teststreifen -..esentlieh empfindlicher und gesiatien noch dei- Nachweis von etwa 0.4 mg "<, Urohilinogen im Harn.

Γ berraschender'-.veise w ird dice Farbreaktion durch die Anwesenheit \on Harns'.oiT nidit mehr gestört; selbst eine 3" »ige Harnstofflösui.g bewirkt bei den neuen Testpapieren praktisch keine Farbänderung, während Testpapiere. die p-Dimethylaminobenzaldelud enthalten, sich hierbei intensiv gelb verfärben. Weiterhin war nicht vorauszusehen, daß die neuen diagnostischen Mitte! weder durch Llarnindikan noch durch Indol oder Sulfonamide, die bei üblicher Dosierung im Harn vorhanden sind, gestört werden. Dieser Befund ist besonders überraschend, da man die neuen Substanzen, in 2 bis 20%iger Salzsäure gelöst, sehr gut zum Nachweis von Iik'.oI in Lösungen benutzen kann. Zum Nachweis von Urobilinogen bzw. IJrobilinogen-Körpern in Lösungen kann man selbstverständlich ρ - Dimcthylaminobenzaldehyd durch die Substanzen der Fcrmel I ersetzen und so den Gehalt photoirr! risch sehr exakt und störungsfrei in der Küvette bestimmen.

In den nachfolgenden Beispielen sind das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemüßen diagnostischen Mittel näher erläutert, wobei durch Verglcichsversuche mit bisher bekannten diagnostischen Mitteln die Überlegenheit gegenüber dem Stand der Technik nachgewiesen wird.

Beispiel 1

Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt:

p-Bis-(,;-diäthylamino-äthyl)-

aminobcn/aMchyd 0.2 g

Oxalsäure 20.0 g

Methanol ad 100.0 ml

Nach dem Trocknen erhalt man ein weißes Testnanier. welches mit normalem Harn eine schwache 848 3

Rösafurbung ergibt und mit Urinen. die mehr al-. '1.4 mg"" Urobilinogen-Körper enthalter, je nach Gehalt eine mehr oder weniger intensive rosa bis violette Färbung zeigt. IJrobilinogenkörperfreie 1 'line oder eine 3"..ige wäßrige Harnstofflösung rühren zu keiner farblichen Veränderung des Testp.ipieis. llarnindikan gibt keine Farbreaktion. Die 1 estpapiere können jeweils nach 1 bis 2 Minuten abgelesen werden

Beispiel 2

Filterpapier wird mit einer Lösuny folgender Zusammensetzung getränkt:

p-Bis-(.;-cyanoäihyl)-amino-

benzaldehyd . .'. 0.05 g

Oxalsäure . ." 20.0 g

PolvA inylalkohol 3.0 g

Wasser ' 30.0 ml

Methanol ad 100.0 ml

Nach dem Trocknen erhält man ein weißes Testpapier, welches die gleichen Eigenschaften besitzt wie das gemäß Beispiel 1 hergestellte Testpapier.

Beispiel 3

Filterpapier wird mit verschieden konzentrierten Lösungen von jeweils .V Teilen p-N-(N'-Mcihylpipera/.ino) - benzaldehyd (MPBAl bzw. ρ - Dimethylamine-benzaldehyd (DABA) und 20 Teilen Oxalsäure in 100 Teilen Methanol, wie im Beispiel 1 beschrieben, imprägniert. Die so erhaltenen Testpapiere sind nach dem Trocknen allesamt weiß. Die trockenen Testpapiere werden entweder in eine 3° oige Harnstofflösung oder in einen urobilinogenfreien Urin eingetaucht. Die dabei beobachteten Farbveränderungen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

0.05
0.075

0.1

0.2

M P ΒΛ

Weiß
Weiß
Weiß
schwach uelhlich

DABA

Gelb
Gelb
Gelb
stark Gelb

Wie man hieraus deutlich sehen kann, ist das neue Testpapier gegenüber dem bekannten praktisch unempfindlich gegen Harnstoff und reagiert somit empfindlicher und spezifischer auf IVobilinogen-Körper. da die rosa Farbreaktion mit Urobilinogen durch die mehr oder weniger starke gelbe Farbreaktion mit Harnstoff nicht überdeckt wird. Es ist selbstverständlich, daß die Empfindlichkeit und Ablesbarkeit der Urobilinogenfarbreaktion dadurch wesentlich beeinträchtigt wird.

Beispiel 4

Filterpapier wird mit methanolischen Lösungen getränkt, die in 100 Teilen Lösung Α-Teile der folgenden Substanzen I und B-Teile Oxalsäure enthalten. Man erhält weiße Testpapiere.

Die beim Eintauchen dieser Testpapiere beobachteten Farbreaktionen werden nach 1 bis 2 Minuten abgelesen und sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt:

5	Substanz I	1 648 848	■	0.1	25	urobiiiiiugciifreicni	^ 6	urohilino..L-nh
		lahcile il	Λ Β			I.'mi :- .1%ίμι-		L rin
	ρ-Ν,Ν'-Dimethyl-N'-äthyl-			20	gclblich	l-iirbrciiklii'ii mil	Ronioleu
hydrazino-ben/.aldehvd	0.1 25	0.1 25
p-N-Nitroso-N-moihylamino-			20	gelblich	Noriiialui'in	Orange
henzaldehyd		0.1 25			Gelbrosa
p-N-C\unmethvl-N-ineihylamiiio-	0.1 i 25		25	Weiß		Rosarot
bcnzyldehyd	!	0.1 \ 25			gelblich
p-Bis-(carbüthoxymelhyl)-aniino-		20	Weiß		Rosaroi
benzaldehyd				schwach Rosa
ρ-Ν-,ι'-chloraihyl-N-inethylamiiio-	0.1 25	20	gelblich		Purpur
henzaldehyd				schwach Rosa
p-N-,;-hydroxyäthy\-N-'.Tievhyl-	0.1 25	20	gelblich		Purpur
amino-benzaldehyd				Gelbrosa
ρ-Ν-,ι'-Mcthoxyäthyl-N-methyl-	0.1 I 25	20	gelblich		Purpur
amino-bcnzaldehvd				(jelbrosa
p-Bis-((i'-lluora'thyT)-amino-	0.1	20	schwach		Blaurot
benzaldehvd			gelblich	Gelbrosa
p-Bis-(.;-chlorathyl)-amino-	0.1	20	schwach		Blaurot
benzaldehyd		20	gelblich	schwach Rosa
p-Bis-(/i-bromäihy!)-amino-	0.1	20	schwach		Blaurot
benzaldehyd			gelblich	schwach Rosa
p-Bis-(/(-hydroxy äihyll-amino-	0.15	25	gelblich		Purpur
benzaldehyd				schwach Rosa
p-Bis-(,)'-methoxyälhyl)-amino-	0,2	20	gelblich		Purpur
benzaldehyd				Gelbrosa
p-Bis-(/)'--;yanäthyl)-amino-	0.2	20	Weiß		Rosarot
benzaldehyd		20		Gelbrosa
p-Bis-(/)'-dimethylaminoäthyI)-	0.1		Weiß		Rosarot
amino-benzaldehyd		25		schwach Rosa
p-Bis-(/i'-diätI.ylaminoäthyl)-	0.2		Weiß		Rosarot
amino-benzaldehyd		20		schwach Rosa
p-Bis-(/;-N-piperidino;ithyl)-amino-	0.2		Weiß		Rosarot
benzaldehyd		20		schwach Rosa
[p-Bis-(^-triälhyliimmoniumäthyl)-	0.1		Weiß		Rosarot
amino-bcnzaldehyd]-dibromid	0,1	20		schwach Rosa
[p-Bis-(N-pyridiniumäthyl)-amino-	0.2		Weiß		Rosarot
benzaldehydj-dibromid				schwach Rosa
p-N-Morpholino-benzaldehyd	0.1		gelblich		Rotviolett
p-N-Thiomorpholino-benzaldehyd		gelblich	schwach Rosa	Rotviolett
[p-N-(S-M;thyl-thiomorpholinium)-	0.2	Weiß		Rosarot
benzaldehyd]-jodid			Gelbrosa
p-N-(S-Dioxo-thiomorpholino)-	0.1	Weiß	Gelbrosa	Rosarot
benzaldehyd	0.05		schwach Rosa
[p-Bis-(N-chinoliniuniäthyl)-aniino-		Weiß		Rosarot
benzaldehyd] -dibromid	0.1		schwach Rosa
p-N-Piperazino-benzaldehyd		Weiß		Rosarot
p-N-(N'-Methylpiperazino)-	0.1	Weiß	schwach Rosa	Rosarot
benzaldehyd
p-N-[N'-(p-Formylphenyl)-	0.2	schwach	scliwach Rosa	Rotviolett
piperazino]-benzaldehyd		gelblich	schwach Rosa
[p-N-(N'-Dimethylpiperazinium)-	0.2	Weiß		Rosarot
benzaldehyd]-jouid			schwach Rosa
[p-N-iN'-Cyclopentart; Jthylen-		Weiß		Rosarot
piperazinium)-benzaldehyd]-jodid		schwach Rosa
p-N-[N'-Cyclo-(3-oxapenta-	Weiß		Rosarot
methylen)-piperaziniuiii]-		schwach Rosa
benzaldehyd-jodid
	schwach Rosa

Tabelle II

Substanz 1

p-Bis-(carbäthoxyäthyl)-amino

benzaldehyd
p-Bis-(carbamidoäthyl)-amino-

benzaldehyd
p-Bis-()'-brompropyl)-amino-

benzaldehyd
p-Bis-(y-cyanopropyl)-amino-

benzaldehyd
p-Bis-( 7-dimethylaminopropyl)-

amino-benzaldehyd
[p-Bis-(/-trimethyl-ammonio-

propyl)-amino-benzaldehyd]-

dichlorid
p-N-Diäthylaminoäthyl-N-methyl-

amino-benzaldehyd

p-N-Dimethylaminoäthyl-N-methylamino-benzaldehyd

p-N-Diisopropylaminoäthyl-

N-methylamino-benzaldehyd
p-N-Diäthylaminoüthyl-N-üthyl-

amino-benzaidchyd
p-¹1 -Methyl-l.S-diazacyclooctyl-S)-

!"»cnzaldehyd
p-VCyanoäthyl-N-methylamino-

!-cnzaldehyd
p-^v-■-( yanoathyl-N-üthylamino-

vnzaldehyd

ρ ^v -Dimelhylaminopropylnethylamino-benzaldehyd

Γ- '(^sulfoäthylaminovaldehyd

Γ ' ' 'i.ithyl-aminoäthyl-

,M'propylamino-benzaldeliyd p- •,»•mäthylamino-benzaldehyd P ^N ■ ithylaminoäthyl-amino-' ··■· : dehyd

0.1

0.1

0.05

0.05

0.05

0.05

0,05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.01 0.05

20 20 20 20 20 20

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

20 20 urobilinogcnfreiem
Urin = 3%ige
HarnstofTlösung

gelblich
gelblich

schwach
gelblich

schwach
gelblich

schwach
gelblich

Weiß

schwach
gelblich

schwach
gelbl'ch

schwach
gelblich

schwach
gelblich

schwach
gelblich

gelblich

gelblich

Gelb

gelblich

gelblich

Weiß
schwach
gelblich

Beispiel 5

I-.!. Papier wird mit einer Lösung vor. 0 05g P-N-X . Methylpiperazino) - benzaldehyd (M PBA) L· - ü.rncthyl aminobenzaldehyd (DABA und 20u (» '!saure in 100 ml Methanol ""Pragmert und getroc:..,,t. Die trockenen Papiere werden .ηι waßr ge Lösun,, , besonders häufig appüzierter Su fonam.d, gctauclr und nach 1 bis 2 Minuten abgelesen Dc Farbve. ,nderungen sind in der nachfolgenden Tabelle 111 zusammengestellt:

Sulfonamid

50 __ Farbreaktion mit Normalurin

Gelbrosa Gelbrosa schwach Rosa schwach Rosa schwach Rosa schwach Rosa

schwach Rosa schwach Rosa schwach Rosa schwach Rcsa schwach Rosa schwach Rosa Gelblichrosa Gelbrosa schwach Rosa schwach Rosa

schwach Rosa schwach Rosa

irobilinogenhalligem Urin

Rot

Rot

Rosarot

Rosarot

Rosarot

Rosarot

Purpur

Purpur

Purpur

Purpur

Rosarot

Purpur

Purpur

Purpur

Rosarot

Purpur

Rosarot Rosarot

Sulfafurazol

Sulfaphenazol
Sulfamoxolum

Testpapier mit
DABA

Tabelle III

Sulfonimid

Testpapier mit
MPBA

Sulfametin

10 mg %

Weiß

25 mg %

Weiß

50 mg %

schwach gelblich Sulfametin
Sulfafurazol
Sulfaphenazol
Sulfamoxolum

10mg%

Weiß

Weiß Weiß

gelblich Gelb

Weiß

Gelb

25 mg %

Weiß

Weiß schwach gelblich

Gelb

stark

Gelb schwach

Rosa stark

Gelb

50 mg %

schwach gelblicli Weiß gelblich

stark

Gelb sehr stai

GoIb schwach

Rosa sehr stai

Gelb

309613/:

Sulfametin
Sulfafurazol
Sulfaphcnzazol
Swifamoxolum

N'-(5-Methoxy-2-pyrimidiny!)-sulfanilamid.

zolylj-sulfanilamid.

N'-(l-Phcnyl-5-pyra/.olyl)-

sulfanilamid.

N'-(4.5-Dimethyl-2-oxa-

zolyl)-sulfanilamid.

Wie man obiger Tabelle entnehmen kann, wird die Farbreaktion auf Urobilinogen bei den crh'iidungsgemäßen Teststreifen durch Sullonamidkon/.entrationen bis zu 50 mg % praktisch nicht gestört. Höhere Konzentrationen kommen nur kurzfristig nach einer Stoßtherapie vor und sind deshalb dem Beobachter nieist bekannt.

Beispiel 6

Zur Herstellung eines Reagenzfilmes zum Nachweis von Urobilinogen wird eine Mischung aus folgenden Bestandteilen bereitet:

p-Bis-(/;-cyanoäthyl)-amino-

benzaldehyd 0,75 g

Sirupöse Orthophosphorsäure 5.00 g

Kolloidale Kieselsäure (Aerosil) ... 6,00 g Organische Natrium-Sulfonate

(Rapidnetzer) 2.00 g

Polyvinylbutyracetal (Mowital).... 10,00 g

Polyäthylengiykoi 6000 !0.00 g

Methanol 100.0 ml

Auf eine weiße Polyvinylchlorid-Folie wird eine μ dicke Schicht der obigen Mischung aufgelragcn und anschließend mit Warmluft getrocknet, wobei ein wasserunlöslicher Film entsteht. Wird dieser mit einem Tropfen urobilinogenhaltigem Urin benetzt, so entsteht nach 1 bis 2 Minuten eine rote Färbung, die sich nach dem Abwischen des Urins noch verstärkt. Mit urobilinogenfreieni Urin wird keine Färbung beobachtet.

Beispiel 7

25 ml Harn werden mit 12 ml Eisessig angesäuert ίο und mit 40 ml Äther extrahiert. Her F.xtrakt wird zweimal mit je 20 ml Wasser gewaschen und mit Äther wieder auf 40 ml aufgefüllt. Man nimmt 20 ml hiervon, versetzt mit 0.5 ml einer Lösung von 1 g p-N-Morpholino-benzaldehyd in 5 ml konzentrierter Salzsäure und schüttelt kräftig durch. Danach gibt man 6 ml halbgesättigte Natriumacctatlösung zu und schüttelt erneut, wobei sich der rote Farbstoff in der wäßrigen Phase ansammelt. Nach der Abtrennung wird "der Äther nochmals mit 2 ml Wasser gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Auszüge werden auf 20 ml aufgefüllt, bei 557 nni im Photometer gemessen und mittels einer vorher aufgestellten Eichkurve ausgewertet.

Beispiel 8

Filterpapier wird mit einer Lösung von 0.5 Teilen ρ - B\- - (diäthylaminoäthyl) - aminobenzaldehyd - bisliydrogenoxalat. 30 Teilen Maleinsäure und 0.5 Teilen Polyäthylengiykoi 1000 in 100 Teilen Methanol iniprägniert. Das Papier reagiert mit urobilinogenhaitigcn Ui inen rosa bis rot. Papiere mit gleichen analytischen Eigenschaften, aber günstigcrem Verhalten beim Umrollen und Schneiden erhält man be: Verwendung von 5 Teilen Polyäthylengiykoi 600f bzw. 20 000.

Claims (3)

Palentansprüche:

1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis \on Ürobilinogen-Körpern in Körperflüssigkeiten. vorzugsweise in Urin, bestehend aus einem saugfähiger. Trägei oder einen, Film, einer starken festen Säure und einer Substanz, welche nach Art der Ehrlichschen Probe mit Urobilinogen-Kurpern einen Farbumschlag liefert, g e k e r η ζ e ι c h η e ι durch den Gehalt an einer oder mehreren Substanzen der Formel (I)

R₁ -(CH,)

N — "■

CHO (Ii

R,—(CH,)„,

in welcher R, und R_; ein Halogenaiom. eine Cyano-. Nitroso-. Carbalko.xy-. Carbamide-, Hvdroxy-, Acyioxy-. Alkoxy-, eine offcnkettige oiler cyclische, gesattigt ι; oder ungesättigte, sekundäre oder tertiäre Aminogrupp■■ bedeuten, oder R₁ und ,R. zusammen eine O\a-. Thia-, Sulfonyl-, Alkylthionium-, Imino-, Alkylimino-. gegebenenfalls substituierte Aryiimino- oder eine offenkettige. alicyclische oder heterocyclische Dialkyliminogruppe bilden, oder einer der Reste R₁ und R, ein WasserstofTatom ist. während /1 und »1 Zahlen von 0 bis 3 sind.

2. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 1. dadi'cch gekennzeichnet, daß der saugfähige Träger mit einer Lösung getränkt ist. welche pro HKl ml O.DOl bis 1".. eine* Aldehyds der allgemeiner: !■iirmellll und mindestens 3. vorzugsweise i:^: hiv 30" : einer starken, festen Säure enthält.

3. Verfahren zum Nachweis \on Urobilinogcr-Kiirpern :ii körpci flüssigkeiten aui einem -,au:. fähigen !'rager, einem Reagenzlilm oder in L omü:· π; Anwesenheit einer starken, festen bzw. autl; flüssigen Saure mn Hü!'·.· einer Substanz, die nach Art des P.hrlichschen Reagenz mit L.'robilinogen-K.örpern einen Farbumschlag lieler'.. daduixi· gekennzeicnnet. daß man als F'arbindikaioren Substanzen der Forir.jlH¹

R,

R,- (CH₂!,,,

,-CHO (Il

in welcher R₁ und R₂ ein Halogenatom, eine Cyano-, Nitroso-. Caibalkoxy-. Carbamide-, Hydroxy-. Aeyloxy-, Alkoxy-, eine offenkettige oder cyclische, gesättigte odei ungesättigte, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe bedeuten, oder R₁ und R₂ zusammen eine Oxa-, Thia-. Sulfonyl-, Alkylthionium-, Imino-, Alkytimino-, gegebenenfalls substituierte Aryiimino- oder eine offenkettige. alicyclische oder heterocyclische Dialkyliminogruppe bilden, oder einer der Reste R₁ und R₂ ein Wasserstoffatom ist. während η und m Zahlen von 0 bis 3 sind, verwende:.

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mi'.tel zum Nachweis von Urobiünogen-Körpern in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Urin, bestehend aus einem saugfähigcn Träger oder einem Film, einer starken festen Säure und einer Substanz, welche nach Art der Ehrlichschen Probe mit Urobilinogen-Körpjrn einen Farbumschlag liefert.

Es ist bekannt, daß man Urobilinogen-Körpcr (Bilane), Indol, Sulfonamide, Porphobilinogen. Harnindikan und 5-Hydroxy-indolessigsäure mit einer Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd in Salzsäure nachweisen kann. Dieser Nachweis ist in der Literatur als Ehrlichschc Reaktion bekannt: er hat insbesondere in der medizinischen Diagnostik als Nachweis von »vermehrten Urobilinogenenc im Urin erhebliche Bedeutung gewonnen. Obwohl die Probe nicht sehr spezifisch ist, gilt sie als Standardmethode Tür die Diagnose von Leber- und Gallen^rkrankungen.

Zur Vereinfachung des Tests ist bereits vorgeschlagen worden, Testtabletten herzustellen (britische Patentschrift 779 921), in denen außer p-Dimcthyiaminobenzaldehyd eine feste anorganische oder organische Säure enthalten ist (vgl. auch USA.-Patentschrift 2 320 282 — Testtabletten zum Nachweis von Sulfonamiden). Löst man solche Tabletten in mehr oder weniger verdünntem Harn, so erhält man Farbreaktionen, die ungefähr denen der ursprünglichen Ehrlichschen Probe entsprechen; jedoch wird beispielsweise zur Auswertung der Farbreaktion mit Sulfonamiden der Einsatz einer blauen Hilfsfarbe (/. B. Methylenblau) empfohlen.

Zur weiteren Vereinfachung der Ehrlichschen Probe hai man die Reaktion auch schon auf Testpapiere übertragen; vgl. Fi se hl und P i η t o. Clinica Chim. Äcta 2^(1957). S. 527 bis 533. sowie französischen Patentschrift 1 450 273, in welcher die von Fisch! und P i η t ο benutzte Phosphorsäure durch Oxalsäure ersetzt wird.

überraschenderweise wurde nun auf der Suche nach einer weiteren Verbesserung des Tests gefunden, daß bestimmte Derivate des p-Arrvnobenzaldehyds einen wesentlich empfindlicheren und weniger störanfal'igen Nachweis von Urobüinogen als bisher möglich liefern. Als Derivate des p-Aminobcnzaldehyds kommen Substanzen in Frage, welche an der p-Aminogruppe Substituenten tragen, die stark Elektronen abziehende Eigenschaften besitzen. Die Erfindung besteht somit in einem diagnostischen Mittel der eingangs genannten Art. welches durch einen Gehalt an einer oder mehreren Substanzen der Formel (I)

in welcher R₁ und R₂ ein Halogenatom, eine Cyano-, Nitroso·, Carbalkoxy-, Carbamido-, Hydroxy-, Acyl-