DE1545799C

DE1545799C - Markierung von Eiweißstoffen mit radio aktivem Jod

Info

Publication number: DE1545799C
Authority: DE
Inventors: Elfnede Dr 6000 Frank fürt Schwanheim Niemann
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG, vormals Meister Lucius & Bruning, 6000 Frankfurt
Publication date: 1971-07-01

Description

In Biochemie und Medizin werden radioaktiv markierte Eiweißstoffe verwendet. Eine schonende und verhältnismäßig leicht durchführbare Methode zu ihrer Herstellung ist die Markierung mit radioaktivem Jod. Dabei werden radioaktive Jodatome durch Substitution von Wasserstoffatcmen in den Benzolring von Tyrosinresten und in geringerem Maße in den Imidazolring von Histidinresten eingeführt. Die Jodmarkierung muß so ausgeführt werden, daß keine Denaturierung des Eiweißes eintritt.
. Es sind verschiedene Methoden zur Jödierung von Eiweißstoffen bekannt, z. B. die Herstellung des für die Markierung erforderlichen radioaktiven Jods durch Oxydation von radioaktivem Jodid unter Zusatz von Trägerjodid mit einem Oxydationsmittel wie Nitrit, Jodat, Persulfat, Wasserstoffperoxyd oder Chloramin T direkt in der Eiweißlösung, die anschließend mit dem radioaktiven Jod reagiert. Dabei kann jedoch das Eiweiß leicht durch Oxydation von SH-Gruppen und Disulfidbrücken · sowie durch Zerstörung von Methionin oder Tryptophan denaturiert werden. Lösungen von radioaktivem Jodid enthalten nämlich auf Grund ihrer Herstellungsprozesse Verunreinigungen und außerdem die bei Aktivitätskonzentrationen von mehreren Hundert Millicurie pro Milliliter erforderlichen Stabilisatoren wie Natriumthiosulfat oder Natriumbisulfit, welche Stoffe durch strahlenchemische Reaktionen verändert werden. Man muß also bei Verwendung dieser radioaktiven Jodidlösungen in Eiweißlösungen größere Mengen von Oxydationsmitteln zusetzen als nach slöchiometrischer Berechnung für die radioaktiven Jodidionen gebraucht würden. Der Überschuß von Oxydationsmitteln ist hierbei grundsätzlich nicht vorausberechenbar. Deshalb kann bei dieser Methode eine Schädigung des Eiweißstoffes durch überschüssiges Oxydationsmittel nicht vermieden werden.

Weiter ist bekannt, die Jodierung in ^heterogener Phase durchzuführen, wobei das radioaktive Jodid unter Zugabe von Trägerjodid in saurem Medium, oxydiert, das gebildete radioaktive Jod mit Tetrachlorkohlenstoff oder Chloroform extrahiert und diese Lösung anschließend in der Eiweißlösung suspendiert wird; Nachteile der Methode sind Aktivitätsverluste, geringe Reaktionsausbeuten und die Gefahr der Eiweißdenaturierung durch Tetrachlorkohlenstoff oder Chloroform; Auch die elektrolytische Oxydation von radioaktivem Jodid in der Eiweißlösung ist bekannt, jedoch sind hier elektrolytisch^ Nebenreaktionen möglich, die das Eiweiß in unerwünschter Weise verändern; außerdem ist der apparative Aufwand beträchtlich. Schließlich ist der Austausch von trägerfreiem radioaktivem Jodid in alkalischer Lösung gegen inaktives Jodchiorid und Reaktion des Eiweißes mit dem so entstandenen akliven Jodchlorid bekannt, wobei jedoch die Herstellung der Jodierungslösungen außerordentlich schwierig und zeitraubend ist, weil sie reinste Ausgangsstoffe erfordern, und wobei die Jodierungsreaktion schlecht reproduzierbar ist, weil die ablaufenden Reaktionen nicht aufgeklärt sind.

Es wurde nun ein Verfahren zur Markierung von Eiweißstoffen mit radioaktivem Jod durch Oxydation von radioaktivem Jodid unter Zusatz von Trägerjodid in saurem. Medium, Abtrennung des freigesetzten radioaktiven Jods zusammen mit dem Trägerjodid und anschließender Einbringung in eine Fiwcißlösung gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das freigesetzte radioaktive Jod zusammen mit dem Trägerjod durch einen Inertgasstrom aus dem Reaktionsgefäß treibt, in einer geringen Menge eines niedrigmolekularen, mit Wasser mischbaren Alkohols absorbiert und die so erhaltene alkoholische Lösung entweder direkt oder aber nach Überführung mit einer stöchiometrischen Menge Chlor in eine radioaktive Jodchloridlösung mit der verdünnten Eiweißlösung in einem Phosphatpuffer vom pH-Bereich 7 bis 10 bei einer Temperatur zwischen 0 bis 25⁰C zur Reaktion bringt.

ίο Bevorzugt werden als radioaktive Jodisotope Jod-131 und Jod-125 verwendet und die Umsetzung mit der Eiweißlösung in einem Phosphatpuffer vom pH-Bereich 7 bis 8 vorgenommen.
In der alkalischen, durch Phosphat gepufferten Lösung von Jod stellen sich folgende Gleichgewichte ein:

J₂ + 2OH- '*=* J- -h OJ- + H₂O

J₂+

OH- +J-

Überraschenderweise stellt sich gerade unter den Bedingungen des beanspruchten Verfahrens, d. h. bei Zugabe einer alkoholischen Lösung von Jod-(¹²⁵J) oder Jod-(¹³¹J) zu einer phosphatgepufferten Eiweißlösung vom pH 7-8 das oben an zweiter Stelle aufgeführte Gleichgewicht bevorzugt ein, so daß die Ausbeuten an jodierten Eiweißstoffen nach dem beanspruchten Verfahren bis zu 100% tier Theorie erreichen.

Dies ist um so überraschender, als bei Verwendung anderer Puffersysteme mit gleichen ρϊ!-Bereichen, die aller Erfahrung nach gleichfalls für biologische Systeme geeignet sind, z. B. Veronal-Natrium/Salzsäure, Trisoxymethylaminomethan/Salzsäure oder Triäthanolamin/Salzsäure, die Ausbeuten bei der Jodierung von Eiweißstoffen wesentlich tiefer liegen.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäß zu verwendenden Puffersystems ist die Tatsache.daß Nebenprodukte wie das Jodat-Ion, welches durch Disproportionierung nach

3 JO- -» 2 J- + JO₃

• entstehen könnte, in diesem Fall nicht auftreten. Demzufolge sind Oxydationsreaktionen der nach dem beanspruchten Verfahren jodierten Eiweißstoffe, welche zu biologischen Veränderungen führen, nicht festgestellt worden. ;

Es ist auch überraschend, daß die verwendete alkoho-. lische Jodidlösung weniger denaturierend auf Eiweißstoffe wirkt als Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff. Bekannt ist, daß Alkohole denaturierend auf Proteine wirken können. Nach dem genannten Verfahren aber treten nachweislich keine biologischen und immunologischen Veränderungen der Eiweißstoffe auf. Dafür sind die gewählten Reaktionsbedingungen, nämlich ein mit Wasser mischbarer Alkohol, pH-Bereich, Art der Pufferionen und Temperaturbereich maßgebend.

Dies zeigen folgende Erläuterungen:
Jodiert man Humanalbumin mit ¹²⁵J- oder ¹³¹J" in Gegenwart von Oxidationsmitteln, z. B. Peroxydisulfat, so hat das jodmarkierte Humanalbuinin eine biologische Halbwertszeit von 8'bis 12 Tagen, d. h. es wird innerhalb dieser Zeit in vivo zur Hälfte biologisch abgebaut. Markiert man dagegen Humanalbumin nach dem in der vorliegenden Anmeldung beanspruchten Verfahren, so hat das entstandene, jodierte Humanalbumin eine biologische Halbwertszeit von 13 bis 18 Tagen.

Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung kann grundsätzlich jedes readioaktive Jodid verwendet werden, jedoch wird Natriumjodid bevorzugt, weil es keine Fremdaktivitäten enthält. Als inaktives Trägerjodid wird ebenfalls vorzugsweise Natriumjodid verwendet. Das saure Reaktionsmedium soll vorzugsweise mineralsauer sein, verdünnte Schwefelsäure hat sich besonders bewährt. Als Oxydationsmittel können die zum Freisetzen von Jod bekannten gebraucht werden, wie Wasserstoffperoxyd, Jodat, Persulfat oder Nitrit. Das Oxydationsmittel wird zweckmäßig in einem geringen stöchiometrischen Überschuß verwendet. Als Inertgas kann z. B. Stickstoff verwendet werden. .

Der zum Auffangen des übergetriebenen radioaktiven Jods dienende Alkohol wird in einer möglichst geringen Menge vorgelegt; vorzugsweise wird Äthanol verwendet. Die Konzentration der alkoholischen Jodlösung (aktives und inaktives Jod) soll zweckmäßig zwischen 0,005 und 0,3 %, vorzugsweise zwischen 0,05 und 0,1 %> liegen.

. Die Eiweißlösung, die mit der alkoholischen Lösung aktiven Jods behandelt wird, soll zweckmäßig in einer Konzentration zwischen,0,1 und 2% bei einem pH-Wert von 7 bis 10, vorzugsweise von 7 bis 8, vorliegen. Die Reaktion findet bei Temperaturen zwischen 0 und 25° C, vorzugsweise zwischen 4 und 21° C statt.

Die Reinigung des jodmarkierten Eiweißes von nicht umgesetztem aktiven oder inaktiven Jod wird durch Dialyse, Fällung, über Ionenaustauscher oder über Molekülsiebe wie Sephadex ausgeführt; dabei ist es vorteilhaft, daß die Lösung keine Oxydationsmittel mehr enthält.

Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung können Eiweißstoffe mit spezifischen Aktivitäten zwischen 10~⁸ und 200 mCi/mg Eiweiß hergestellt werden. Zu diesem Zweck werden bis zu 1 Ci radioaktives Jodid mit inaktivem Jodid in Mengen zwischen 0,01 und 1 mg oxydiert. Dadurch erreicht man spezifische Aktivitäten bis zu 10 Ci/mg Jod, z. B. bei Verwendung von 1 Ci radioaktivem Jodid mit 0,1 mg Trägerjodid.

Für die Radiojodmarkierung nach dem Verfahren gemäß der Erfindung kann grundsätzlich jedes radioaktive Jodisotop verwendet werden. Wegen der Strahlungseigenschaften und günstigen Halbwertszeiten werden jedoch die Isotope Jod-131 und Jod-125 bevorzugt verwendet. Mit ihnen lassen sich spezifische Aktivitäten bis zu 200 mCi/mg Eiweiß erreichen. Die Anzahl einführbarer Jodatome ist von den im Eiweißmolekül vorhandenen Tyrosin- und Histidinresten und von deren sterischer Anordnung abhängig. Man führt vorzugsweise mit steigender Molekülgröße durchschnittlich 1 bis 4 Jodatome pro Molekül ein.

Grundsätzlich können alle Eiweißstoffe mit biologischer Aktivität nach dem Verfahren gemäß der Erfindung markiert werden, insbesondere Eiweißstoffe mit hormonellcr Wirkung, z. B. Peptide, wie Hypertensin, Insulin und Wachstumshormon (STH), weitere Enzyme wie Streptokinase, Transporteiweiße wie Transferrin, Globuline wie Fibrinogen oder y-Globulin.

Die Jodierung erfolgt unter den angegebenen Bedingungen schonend und innerhalb kurzer Zeit, so daß Nebenreaktionen vermieden werden. Die Aktivitätsausbeute nach der Jodmethode liegt zwischen 35 und 49%, also zwischen 70 und 98°/o des theoretisch möglichen Wertes, da 50% <-Ies radioaktiven Jods als Jodwasserstoff freigesetzt werden. Die Aktivitätsausbeuten nach der Jodchloridmethode betragen dagegen bis zu 70% der Theorie.

Durch die schonenden Reaktionsbedingungeh gemäß der Erfindung kann die Denaturierung auch empfindlicher Eiweißstoffe vermieden werden. Die biologische Aktivität der so markierten Verbindungen bleibt innerhalb der Meßfehler erhalten. Zusammen mit den hier anwendbaren einfachen und schonenden Reinigungsmethoden des jodmarkierten Eiweißes von nicht

ίο umgesetzter Radioaktivität ist das Verfahren gemäß der Erfindung den bisher bekannten Markierungsverfahren weit überlegen.

. Jodmarkierte Eiweiße werden in der Medizin diagnostisch verwendet, z.B.-für Blutvolumenbestimmungen, Myelographien, Gehirntumorszintigraphien,. gastrointestinale Studien und radioimmunologische Bestimmungen von Proteohormonen in Sera, Organ-

. und Gewebeextrakten, sowie in der biochemischen und medizinischen Forschung für Stoffwechseluntersuchungen bestimmter Eiweiße.

Beispiel 1

Jod-131-Markierung von Insulin ■

a) 130 Mikrogramm Natriumjodid (8,7 · ΙΟ-⁷ MoI) . mit 100 mCi Jodid-131 sind in 3 ml 0,1 η Natronlauge enthalten. Diese Lösung wird mit 0,2 ml konzentrierter Schwefelsäure angesäuert und mit 0,2 ml 30%igem Wasserstoffperoxyd versetzt. Man leitet 30 Minuten Stickstoff durch die Reaktionslösung und erwärmt sie dabei auf 80° C. Das gebildete Jod-¹³¹J destilliert in eine eisgekühlte Vorlage mit 0,3 ml Äthanol. Die Ausbeute an Jod-¹³¹J beträgt 85% in bezug auf eingesetztes Natriumjodid und Jodid-131. .

b) 2 mg Insulin (3,5 · 10~⁷ Mol) werden in 2 ml Phosphatpuffer pH 7,4 gelöst und bei 21⁰C langsam unter Rühren mit der nach a) gewonnenen alkoholischen Jod-¹³¹J-Lösung [94 μg J₂ (3,69 · ΙΟ-⁷ Mol) mit 85 mCi ¹³²J] versetzt. Man läßt die 'Reaktionslösung 20 Minuten stehen und prüft dann die Aktivitätsausbeute papierelektrophoretisch in Pyridin/Eisessig pH 6,5. Diese beträgt 47,5%, d.h. 95% der Theorie in bezug auf eingesetztes Jod-^l31J. Die Lösung wird mit 0,1 η Salzsäure auf pH 6,0 eingestellt und dabei das Jodinsulin-¹³¹J gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Man prüft anschließend mit Hilfe der Papierelektrophorese in Pyridin/ Eisessig bei pH 6,5 auf nicht gebundene Jodaktivität. Diese beträgt weniger als 2%. Das Jodinsulin-^l31J ist durchschnittlich mit 1 J/Molekül und einer spezifischen Aktivität von 20 mCi/mg markiert. »

Beispiel 2

Jod-125-Markierung von y-lilobulin

a) 775 (Jig Natriumjodid (5,17 · 10 " Mol) mit 39 mCi Jodid-125 sind in 3 ml 0,1 η Natronlauge enthalten. Die Lösung wird mit 0,2 ml konzentrierter Schwefelsäure angesäuert und unter Zusatz von

0,2 ml 30°/_oigcm Wasserst off peroxyd das Jodid-¹³¹J zu Jod-¹³¹J oxydiert. Man leitet 25 Minuten Stickstoff durch die Lösung und erwärmt sie dabei auf 80⁰C. Das gebildete Jod-¹³JJ destilliert in eine eisgekühlte Vorlage mit 1 ml Äthanol. Die Ausbeute an Jod-¹³¹J beträgt 85,5% ·^η bezug auf eingesetztes Natriumjodid und Jodid-131.

b) In die alkoholische Jod-¹³¹J-Lösung werden mit Hilfe einer Mikrospritze 50 μΐ Chlorgas dosiert. 232 mg ^-Globulin (1,55 · ΙΟ"⁶ Mol) werden in

.. 20 ml Phosphatpuffer pH 7,6 gelöst und bei 21°C unter Rühren mit der nach a) gewonnenen alkoholischen Jodchlorid-¹³¹J-Lösung versetzt [720 (ig JCI (4,43 ■ J0^c MoI) mit 33,4 mCi ¹²⁶J]. Die Reaktionslösung wird nach 20 Minuten wie in Beispiel 1 unter b) angegeben, geprüft, die Aktivitätsausb;ute beträgt 70% ^c'^cr Theorie in bezug auf eingesetztes Jodchlorid-¹³¹J. Zur Reinigung des Präparates von nicht umgesetzter Jodaktivität wird die Lösung 18 Stunden lang viermal gegen 1.5 1 0.9% Kochsalzlösung dialysiert. Die in der Jod-j'-Glolnilin-¹³¹J-LoSUiIg verbleibende nicht gcbifndenc Jodaktivitäl wird yvie in Beispiel! unter b) angegeben, bestimmt. Sie ist geringer als 2%. Das Jod-j'-Globulin-¹³¹J ist durchschnittlich mit 2 J/Molckü! markiert und hat eine spezifische Aktivität von 0,1 mCi/mg.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Markierung von Eiweißstoffen mit radioaktivem Jod durch Oxydation von radioaktivem Jodid unter Zusatz von Trägerjodid in saurem Medium, Abtrennung des freigesetzten radioaktiven Jods zusammen mit dem Trägerjodid und anschließender Einbringung in eine Eiweißlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man das freigesetzte radioaktive Jod zusammen mit dem Trägerjod durch einen Inertgasstrom aus dem Reaktionsgefäß treibt, in einer geringen' Menge eines niedrigmolekularen, mit Wasser mischbaren Alkohols absorbiert und die so crhaltenealkoholische Lösung entweder direkt oder aber nach Überführung mit einer stöchiometrischen Menge Chlor in eine radioaktive Jodchloridlösung mit der verdünnten Eiweißlösung in einem Phosphatpuffer vom .pH-Bereich 7 bis 10, bei einer Temperatur zwischen 0 und 25°C zur Reaktion bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als radioaktive Jodisotope Jod-131 und Jod-125 verwendet.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit der Eiweißlösung im pH-Bereich von 7 bis 8 vorgenommen wird.