DE1249797B

DE1249797B - Verfahren zur Herstellung von Streptokinase-Präparaten verminderter Antigenität

Info

Publication number: DE1249797B
Application number: DENDAT1249797D
Authority: DE
Inventors: Marbach bei Marburg/Lahn Dr. Hans Gerhard Schwick Marburg/Lahn Dr. Norbert Heimburger Marbach bei Marburg/Lahn Dr. Hermann Eduard Schultze
Original assignee: Behringwerke Aktiengesellschaft, Marburg/Lahn
Priority date: 1963-06-29
Publication date: 1967-09-14
Also published as: US3326776A; CH443190A; SE316734B; FR1508055A; NL6407231A; GB1070746A; AT251761B; FR3757M; BE649875A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND C12d

DEUTSCHES

PATENTAMT

& 1 £N 'ά /«rtJ

AUSLEGESCHRiFT '

Int. Cl.:

Deutsche KL: 6a-22/04

Nummer: 1 249 797

Aktenzeichen: B 72486IV a/6 a

Anmeldetag: 29. Juni 1963

Auslegetag: 14. September 1967

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Streptokinase-Präparaten verminderter Antigenität, welches praktisch die volle funktioneile Wirksamkeit des Ausgangsstoffes besitzt. Die Streptokinase ist ein Biokatalysator, der für die Therapie venöser und arterieller Thrombosen, Thrombophlebitiden und Lungenembolien Bedeutung besitzt. Er wird bekanntlich durch Züchtung von Streptokokken gebildet; man verwendet zu seiner Herstellung einen menschen-apathogenen Streptokokkenstamm (vgl. Chris te η sen, L. R., J. Gen. Physiol., 28, S. 363, 1945).

Die Streptokinase besitzt eine geringe antigene Wirkung, so daß es im Hinblick auf die therapeutische Verwendung wünschenswert ist, die Antigenität zu beseitigen oder wenigstens zu vermindern. Bisher ist noch kein Verfahren bekanntgeworden, das es erlauben würde, die Antigenität der Streptokinase zu reduzieren.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Streptokinase-Präparaten verminderter Antigenität gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptokinase mit proteolytischen Fermenten behandelt und aus der erhaltenen Lösung das gebildete Streptokinase-Präparat in an sich bekannter Weise abtrennt.

Als Ausgangsstoff für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man zweckmäßig eine Streptokinase, die einer Reinigung z. B. nach den Angaben der deutschen Patentschriften 1 115 888 und 1 133 505 unterworfen wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf Streptokinase enthaltende Rohfraktionen, z.B. solche, die durch Alkoholfällung gewonnen wurden, angewandt werden. Zweckmäßig geht man von einer gereinigten Streptokinase aus, damit man in der fermentbehandelten Lösung nur das Verfahrensprodukt und unspezifische Abbauprodukte der Streptokinase erhält, die in an sich bekannter Weise voneinander getrennt werden.

Als proteolytische Fermente verwendet man z. B. Pepsin, Thrombin, Papain oder Plasmin, vorzugsweise Pepsin oder Thrombin. Der Fermentierungsprozeß kann auf verschiedene Weise zum Stillstand gebracht werden. Das Pepsin inaktiviert man, indem man auf neutralen pH-Wert einstellt. Das Thrombin ist ein sehr empfindliches Ferment und wird schon durch Oberflächenkontakt inaktiviert (J. Green, Biochem. J., 79, S. 13 p., 1961). Es verliert während der Inkubation mit Streptokinase weitgehend seine Aktivität. Der verbleibende Rest geht bei der anschließenden Chromatographie verloren, das inaktivierte Thrombin wird zusammen mit den unspezifischen Spaltprodukten vom Verfahrensprodukt abgetrennt. Die Fermentation

Verfahren zur Herstellung von
Streptokinase-Präparaten verminderter
Antigenität

Anmelder:

Behringwerke Aktiengesellschaft, Marburg/Lahn

ίο Als Erfinder benannt:

Dr. Hermann Eduard Schultze,

Marbach bei Marburg/Lahn;

Dr. Hans Gerhard Schwick, Marburg/Lahn;
Dr. Norbert Heimburger,

Marbach bei Marburg/Lahn

kann auch durch Unterkühlung auf — 20⁰C oder durch chromatographische Trennung unterbrochen werden.

Die Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung erfolgt zweckmäßig in der Weise, daß man eine gereinigte wäßrige Streptokinaselösung mit einer gegebenenfalls gepufferten Lösung eines der vorgenannten Fermente versetzt und einige Zeit bei Temperaturen zwischen 10 und 4O⁰C, vorzugsweise zwischen 15 und 37°C, inkubiert. Die Einwirkungsdauer hängt naturgemäß von der Aktivität des jeweils verwendeten Fermentpräparates und diese wieder von dem pH-Wert des Reaktionsgemisches ab. Bei einem gegebenen Ferment läßt sich die Reaktionsdauer durch Variation des pH-Wertes verkürzen oder verlängern. Im allgemeinen ist es zweckmäßig, nicht den für Aktivität des eingesetzten Fermentes optimalen pH-Wert zu wählen. Bei Verwendung der obengenannten Fermente wählt man vorzugsweise folgende pH-Werte:

Pepsin 5,0 bis 6,6, vorzugsweise 6,0

Thrombin .... 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,6

Papain 5,5 bis 6,5, vorzugsweise 6,0

Plasmin 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,0

Die Einwirkungszeit beträgt dann etwa V₂ bis 5 Stunden. Zur Einstellung des jeweils gewünschten pH-Wertes ist es zweckmäßig, die Fermente in einer Pufferlösung, z.B. in Citrat- oder Phosphatpuffer zu lösen und diese Lösung der Streptokinaselösung zuzufügen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird das entstandene Streptokinase-Präparat in an sich bekannter Weise, z.B. durch Dialyse, Alkoholfällung, Ammonsulfatfällung, chromatographische Trennung an DEAE-

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Cellulose oder mit Diäthylaminoäthyl- (DEAE-) Gruppen veräthertem, vernetztem Dextran im Säulenoder Batch-Verfahren, gereinigt und gegebenenfalls anschließend durch Lyophilisation getrocknet.

Die Wirksamkeit der Verfahrensprodukte wird, wie die Streptokinase, in Christenseneinheiten angegeben (J. Clin. Invest., 28 [1949], S. 163). Es besitzt in der Stärkegelelektrophorese und in der Immunoelektrophorese eine höhere Wanderungsgeschwindigkeit als das Ausgangsmaterial. Die Antigenität wird mittels des Immunpräzipitationsvermögens und des passiven cutanen Anaphylaxieversuches geprüft. Das Tmmunm^jpitationsvermögen der ernndungsgemäß behan-..,iaelten*-Streptokinase gegenüber einem spezifischen Jf Antistreptokinaseserum vom Pferd hat sich um etwa *· 5(f°/o gegenüber dem Ausgangsmaterial verringert (quantitative Immunpräzipitation nach Heidelberger und Ken dall, J. exp. Med., 1935, 61, S. 563).

Das ernndungsgemäß erhältliche Präparat stellt ein physikalisch-chemisch neuartiges Produkt, das noch die funktioneile Wirkung der Streptokinase besitzt, aber eine gegenüber dem Ausgangsmaterial deutlich verminderte Antigenität aufweist, dar. Auf Grund dieser Eigenschaften ist es der Streptokinase überlegen. und daher besonders für die eingangs erwähnten therapeutischen Zwecke geeignet.

Beispiel 1
Pepsinbehandlung

15 ml einer hochgereinigte Streptokinase enthaltenden Lösung mit insgesamt 10 650 000 Christenseneinheiten werden mit 20 ml eines 0,lmolaren Citratpuffers, pH 6,0 und mit 750y Pepsin (zweimal kristallisiert), die in 0,75 ml des Citratpuffers, pH 6,0, gelöst sind, versetzt und 3 Stunden bei 20⁰C inkubiert. Danach wird der Fermentierungsprozeß durch Einstellen auf pH 7,2 mit 0,lnormaler Natronlauge abgestoppt, anschließend gegen Aqua dest., pH 7,2, dialysiert und lyophil getrocknet. Die Ausbeute beträgt 6 400 000 Einheiten = 60°/₀ der eingesetzten Streptokinasemenge.

Das nach diesem Beispiel gewonnene Streptokinase-Präparat besitzt nach der Analyse in der Stärkegel- und in der Immunoelektrophorese eine größere Beweglichkeit als das Ausgangsmaterial. Das Präzipitationsvermögen mit dem homologen Antikörper ist um etwa die Hälfte vermindert. Im passiven Anaphylaxieversuch in der Kaninchen- und in der Meerschweinchenhaut ruft die ernndungsgemäß behandelte Streptokinase eine deutlich gegenüber dem Ausgangsmaterial verringerte Hautreaktion hervor.

Beispiel 2
Thrombinbehandlung

16 ml einer Streptokinaselösung mit insgesamt 11 360 000 Christenseneinheiten werden bei pH 7,6 mit 1500 Einheiten Thrombin — in 0,4 ml O,85°/_Oiger Kochsalzlösung, pH 7,6, gelöst —, das durch autokatalytische Umwandlung in Natriumeitrat gewonnen wurde, bei 37° C inkubiert. Nach 4 Stunden kommt die fermentative Spaltung zum Stillstand. Von der ursprünglichen Gerinnungsaktivität des Thrombins sind zu diesem Zeitpunkt nur noch etwa 20°/₀ nachweisbar. Die Ausbeute beträgt 7 724 800 Einheiten Streptokinase = 68 °/₀ der eingesetzten Menge.

In der Stärkegel- und Immunoelektrophorese wandert das mit Thrombin gewonnene Streptokinase-Präparat deutlich schneller als das Ausgangsmaterial. Zwei inaktive Spaltprodukte, die durch ihre geringere Wanderungsgeschwindigkeit identifiziert worden sind, werden chromatographisch an mit Diäthylaminoäthyl-(DEAE-) Gruppen veräthertem, vernetztem Dextran vom aktiven Produkt abgetrennt. Dabei wird auch das Thrombin entfernt.

ίο Der Austauscher wird dazu mit ü,06molarem Phosphatpuffer, pH 6,6, äquilibriert und mit dem Fermentansatz überschichtet. Anschließend wird mit dem gleichen Puffer, dem noch 0,2 Mol Natriumchlorid zugesetzt wurden, eluiert. Dadurch werden alle unerwünschten Begleitstoffe entfernt. Werden dem Puffer 0,4 Mol Natriumchlorid zugefügt, so wird anschließend das aktive Streptokinase-Präparat eluiert.

Das fermentativ gewonnene Streptokinase-Präparat wird aus dem Eluat bei pH 5,5, einer spezifischen elek-

ao trischen Leitfähigkeit von weniger als 5 mS/cm und einer Temperatur von 0 bis — 5°C mit 40°/₀ Alkohol gefällt.

Das mit Thrombin behandelte Streptokinase-Präparat zeigt im passiven Anaphylaxieversuch in der Kaninchen- und Meerschweinchenhaut nur noch eine ganz schwache positive Reaktion.

Beispiel 3
Papainbehandlung

10 ml Streptokinaselösung mit insgesamt 5 000 000 Christenseneinheiten werden mit 10 ml 0,lmolarem Phosphatpuffer, pH 6,0, und 0,1 ml einer Papainlösung, die 100 γ kristallisiertes Papain in Phosphatpuffer, pH 6,0, gelöst enthält, versetzt und 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Spaltung werden 1950 000 Einheiten Streptokinase gefunden, entsprechend einer Ausbeute von 39°/₀ der eingesetzten Menge.

Zur Entfernung des Papains wird das Fermentierungsprodukt der chromatographischen Auftrennung an DEAE-Cellulose unterzogen.

Die DEAE-Cellulose wird mit 0,06molarem Phosphatpuffer, pH 5,5, äquilibriert und mit dem Fermentansatz überschichtet. Dabei wird das aktive Streptokinase-Spaltprodukt adsorbiert. Die unspezifischen Proteine und die inaktiven Abbauprodukte laufen durch die Säule hindurch (im Batch-Verfahren verbleiben sie im Überstand). Eluiert man nun mit 0,15molarem Phosphatpuffer, pH 5,5, so wird das Streptokinase-Präparat mit verminderter Antigenität im Eluat gefunden.

Auch das durch Papainbehandlung gewonnene Produkt ergibt bei der physikalisch-chemischen Prüfung und bei der Prüfung auf Antigenität praktisch die gleichen Befunde wie nach Pepsin- und Thrombinbehandlung.

Beispiel 4

Piasminbehandlung

Diese Fermenteinwirkung wird mit Plasminogen

ausgeführt, das eine Vorstufe des Plasmins darstellt und durch Streptokinase in Plasmin übergeführt wird.

Das dabei entstandene Plasmin spaltet darauf wiederum die Streptokinase.

10 ml Streptokinaselösung mit insgesamt 1,5 ■ 10^b Christenseneinheiten werden mit 1 ml einer Plasminogenlösung, die insgesamt 20 000 Einheiten gereinigtes

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Plasminogen enthält, versetzt und 30 Minuten bei pH 7,0 und 20⁰C inkubiert. Die Ausbeute nach der Piasmineinwirkung beträgt 629 000 Einheiten Streptokinase = 42 °/o der eingesetzten Menge.

Das mit Plasmin gewonnene Streptokinase-Präparat wird daraufhin gemäß Beispiel 3 zur Abtrennung des Plasmins an DEAE-Cellulose gereinigt. Auch dieses Präparat besitzt, wie sich aus der physikalisch-chemischen Prüfung und der Bestimmung der Antigenität ergibt, ähnliche Eigenschaften wie die durch Pepsin-, Thrombin- und Papainbehandlung erhaltenen Spaltprodukte.

Beispiel 5

Vernasebehandlung _t

10 ml Streptokinaselösung mit insgesamt 5 000 000 Christenseneinheiten werden mit 10 ml 0,lmolarem Phosphatpuffer, pH 6,5, und 0,5 ml einer Vernaselösung, die 500 γ Vernase in Phosphatpuffer, pH 6,5, gelöst enthält, versetzt und 4 Stunden bei 20°C inku- ao biert. Nach der Spaltung werden 1 700 000 Einheiten Streptokinase gefunden, die einer Ausbeute von 34% entsprechen.

Zur Entfernung der Vernase wird der Fermentierungsansatz in der DEAE-Cellulosesäule chromatographiert. Mit dem aus dem Eluat erhaltenen Streptokinase-Präparat werden physikalisch-chemische Analysen und Teste auf Antigenität ausgeführt, die praktisch die gleichen Ergebnisse wie nach Pepsin- und Thrombinbehandlung erbringen. Sie zeigen, daß auch Vernase ein Streptokinase-Präparat verminderter Antigenität herzustellen erlaubt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Streptokinase-Präparaten verminderter Antigenität, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptokinase mit proteolytischen Fermenten behandelt und aus der erhaltenen Lösung das gebildete Streptokinase-Präparat in an sich bekannter Weise abtrennt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Britische Patentschrift Nr. 911 103;
Hoffmann — Ostenhof, »Enzymologie«, 1954, S. 328.