DE1212553B - Verfahren zur Herstellung von Oxytocin - Google Patents

Description

Crt

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C07c

Deutsche Kl.: 12 q-6/01

Nummer: 1212 553

Aktenzeichen: F 42119IV b/12q

Anmeldetag: 25. Februar 1964

Auslegetag: 17. März 1966

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung des Hypophysenhormons Oxytocin, einem cyclischen Oktapeptidamid der Formel I. dessen Struktur von Du Vigneaud und Mitarbeitern (J. Amer. Chem. Soc, 76 [1954], S. 3115 bis 3121) aufgeklärt wurde.

NH₂ NH₂
H-Cys-Tyr-Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NHa

Es sind verschiedene Verfahren zur Synthese des Oxytocins bekannt. Ihr gemeinsames Aufbauprinzip ist die Synthese eines am Aminoende und beiden SH-Gruppen geschützten Nonapeptidamids der allgemeinen Formel II, anschließend die gleichzeitige Abspaltung der drei Schutzgruppen und schließlich die Herstellung der Disulfidbrücke durch Oxydation.

R² NH₂ NH₂ R₂

R¹- Cys-Tyr-Ile-Glu-Asp -CyS-PrO-LeU-GIy-NH₂

Die bekannten Synthesen verwenden die Schutzgruppen Kombinationen a) bis c) mit folgender Bedeutung:

a) R' = Carbobenzoxy-, R² = Benzylrest;

b) R¹ = p-Toluolsulfonyl-, R² = Benzylrest;

c) R¹ = R² = Triphenylmethylrest.

Die bekannten Synthesen haben jedoch eine Reihe von Nachteilen, die sich insbesondere einer Herstellung im technischen Maßstab entgegenstellen. So kommt der Weg über das Zwischenprodukt II c für eine Gewinnung des Oxytocins im technischen Maßstab nicht in Betracht, da die Säurelabilität der Triphenylmethyl-Schutzgruppe ein äußerst kompliziertes Syntheseschema erforderlich macht, bei dem in einigen Stufen eine partielle Racemisierung in Kauf genommen werden muß. Außerdem kristallisieren triphenylmethylgeschützte Aminosäuren und Peptide sehr schlecht. Weiterhin sind zwar die an beiden Mercaptogruppen durch Benzylreste geschützten Nonapeptidderivate Ha und II b technisch einfach darzustellen (J. Amer. Chem. Soc, 81 [1959], S. 5688 bis 5691; Coil. Czechoslow. Chem. Com., 21 [1956], S. 202 bis 210), jedoch wirkt sich bei der Überführung von Ha oder Hb in Oxytocin die Beständigkeit der S-Benzylreste ungünstig aus.

Verfahren zur Herstellung von Oxytocin

Anmelder:

Farbwerke Hoechst Aktiengesellschaft

vormals Meister Lucius &Brüning, Frankfurt/M.

Als Erfinder benannt:

Dr. Karl Sturm, Frankfurt/M.-Unterliederbach;

Dr. Rolf Geiger, Frankfurt/M.,

Dr. Walter Siedel, Bad Soden (Taunus)

Ihre Abspaltung kann nur durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak erfolgen, wobei zwangläufig auch der Carbobenzoxy- bzw. p-Toluolsulfonylrest eliminiert werden. Dabei kommt es in erheblichem Umfang zu Nebenreaktionen. Die Ausbeute an rohem Oxytocin sinkt mit zunehmender Reaktionsdauer und Konzentration der Reaktionspartner von 66 bis 79°/o d^er Theorie bei Ansätzen im 50-mg-Maßstab auf 40% der Theorie bei einem 1,3-g-Ansatz. Das danach erhaltene Rohmaterial besteht neben aktivem Oxytocin aus inaktiven Peptiden und Salzen, wobei der Gehalt an aktivem Oxytocin höchstens 20% beträgt. Eine technische Oxytocinsynthese sollte aber mindestens im 10-g-Maßstab gute Ausbeuten liefern. Da Oxytocin sehr labil ist und nur unter hohem Aufwand an Zeit und Apparaturen (Gegenstromverteilung über 200 Stufen, Elektrophorese) und auch dann nur unter beträchtlichen AktivitätsverJusten gereinigt werden kann, ist die Ausbeute dieser Stufe entscheidend. Bereits beim Eindampfen einer wäßrigen Oxytocinlösung im Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur sinkt die biologische Aktivität um etwa 10%. Daher läßt sich nicht einmal eine so einfache Reinigungsoperation wie das Abtrennen des bei dem bekannten Reduktionsverfahren anfallenden Natriumchlorid und Ammoniumchlorid vom Oxytocin verlustlos durchführen.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Oxytocin gefunden, das dadurch gekeiaBKäßhnet ist, daß man das Dipeptidderivat der FortpeLJJJ .

Bz tBu

BOC~Cys-Tyr-N₂H₂

(HI)

worin BOC den tert.-Butyloxycarbonyl-, Bz den

609 538/400

Benzyl- und tBu den tert.-Butylrest bedeutet, nach der moniak in das Nonapeptidderivat der Formel VI Azidmethode mit dem Heptapeptidderivat der For- überführt,
mel IV

tBu NH₂ NH₂
NH₂ NH₂ Bz ₅

BOC-Cys-Tyr-Ile-GIu-Asp-Cys-Pro-LeU-GIy-NH₂

H-Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH₂ (IV)

worin Bz ebenfalls den Benzylrest bedeutet, konden- dieses durch Behandeln mit überschüssiger starker siert, das gebildete Nonapeptidderivat der Formel V io Säure in das Nonapeptidamid VII

Bz tBu NH₂NH₂ Bz

NH, NH,

BOC-Cys-Tyr-Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH, H-Cys-Tyr-Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH,

(V) ^l5 (VH)

überführt und dieses in bekannter Weise durch durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Am- Oxydation in Oxytocin umwandelt.

Die Durchführung der Synthese erfolgt nach dem Schema 1:

Bz tBu

NH₂ NH₂ Bz

BOC-

Cys Tyr

-N₂H₃ + H-

He GIu Asp Cys Pro Leu GIy

-NH₂

Bz tBu

Azidkupplung

NH₂ NH₂ Bz

BOC-

BOC-

H-

Cys	Tyr	Na	He	GIu	Asp	GIu	Asp	Cys	Pro	Leu	GIy
	tBu I		in flüssigem NH NH2 NH2 I	NH2	NH2 ι	3
Cys	Tyr	H©	He	GIu	Asp	Cys	Pro	Leu	GIy
Cys	Tyr	He	Cys	Pro	Leu	GIy

-NH.

1°.

Oxytocin

Danach wird zunächst das Hydrazid III in wäßrigem Tetrahydrofuran oder Dioxan bei Temperaturen zwischen —10 und 20⁰C, vorzugsweise zwischen O und 5°C, in Gegenwart von vorteilhaft 1,5 bis 2,0 Äquivalenten Mineralsäure, vorzugsweise Salzsäure, mit der äquivalenten Menge salpetriger Säure in das entsprechende Azid übergeführt. Dieses wird durch Fällen mit Eiswasser und Aufnehmen in ein mit Wasser nicht mischbares, indifferentes, leicht flüchtiges organisches Lösungsmittel wie Diäthyläther, Diisopropyläther, Methylenchlorid, Chloroform oder Essigsäureäthylester abgetrennt und durch Eindampfen der bei O⁰C getrockneten Lösung bei Temperaturen unterhalb +5⁰C isoliert.

Zur Kondensation wird das Azid in 10- bis 50%igem molaren Überschuß mit der Aminkomponente IV, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 0 und +5⁰C, in einem indifferenten organischem Lösungsmittel wie Dimethylformamid umgesetzt. Nach 2tägigem Stehen bei Zimmertemperatur wird das Nonapeptidderivat V aus der Reaktionslösung durch Zugabe eines orga-

nischen Lösungsmittels wie Äther, Essigester oder Methanol ausgefällt und durch Umkristallisieren aus Methanol, Methanol—Wasser, Dimethylformamid— Essigester oder Extraktion mit heißem Äthanol gereinigt.

Zur Abspaltung der Benzyl-Schutzgruppen wird das Zwischenprodukt V in der 50- bis 250fachen Menge trocknen Ammoniaks gelöst und bei der Siedetemperatur des Ammoniaks unter Rühren soviel Natrium, vorteilhaft als 2- bis 5%tige Lösung in trocknem Ammoniak, innerhalb einiger Minuten zugegeben, daß die ursprünglich farblose Reaktionslösung tiefblau gefärbt ist und diese Färbung mindestens 30 Sekunden beständig bleibt. Damit ist die Reduktion beendet. Man neutralisiert das gebildete

Natriumamid durch Zugabe eines großen Überschusses des Ammoniumsalzes einer starken Säure, vorzugsweise Ammoniumchlorid, und läßt das Ammoniak bei Raumtemperatur abdampfen. Man erhält

so das in Wasser schwer lösliche Zwischenprodukt Vl, das durch Digerieren mit verdünnter Essigsäure und Wasser von Salzen befreit wird und nach einmaligem Umkristallisieren aus Methanol oder Methanol— Wasser analysenrein ist. Dieses Peptidderivat ist sehr stabil und deshalb für längere Lagerung besonders geeignet.

Die Abspaltung der BOC- und tBu-Schutzgruppen von dem Nonapeptidderivat VI wird vorteilhaft mit starken, leicht flüchtigen Säuren bei Raumtemperatur ausgeführt. Als Carbonsäure hat sich dabei Trifluoressigsäure bewährt. Man löst das Peptid bei Raumtemperatur in der 5- bis lOfachen Gewichtsmenge 90- bis 100°/_oiger Trifluoressigsäure und läßt die Mischung etwa '/₂ Stunde bei Raumtemperatur stehen. Das gebildete Trifluoracetat wird durch Abziehen der Trifluoressigsäure im Vakuum isoliert.

Besonders vorteilhaft ist die Abspaltung der BOC- und tBu-Schutzgruppen mit einer Mineralsäure, insbesondere Salzsäure. Man kann das Nonapeptid VI in der 3- bis öfachen Menge konzentrierter wäßriger Salzsäure unter Bildung des Hydrochlorids der Dimercaptoverbindung VII lösen und sofort anschließend mit viel Wasser verdünnen, die überschüssige Säure mit einem stark basischen Ionenaustauscher entfernen und Iyophilisieren. Bevorzugt ist jedoch die Chlorwasserstoff-Spaltung in wasserfreien organischen Lösungsmitteln. Dazu löst man das Nonapeptid VI in der 5- bis 15fachen Menge Eisessig, versetzt die Mischung mit dem gleichen Volumen einer 1 bis 2n-Lösurig von Chlorwasserstoff in Eisessig, fällt nach kurzem Stehen bei Raumtemperatur das Hydrochlorid der Dimercaptoverbindung VII mit absolutem Äther und trocknet das pulverige Produkt im Vakuum über Kaliumhydroxyd. Die Ausbeute ist unabhängig von der Größe des Ansatzes fast quantitativ.

Die Oxydation der leicht wasserlöslichen Dimercaptoverbindung VII zu Oxytocin wird nach

ίο bekannten Verfahren, z. B. mit Luftsauerstoff in wäßriger Lösung bei pH 6,5 bis 8,0 ausgeführt. Die Ausbeuten liegen zwischen 75 und 80% der Theorie. Das durch Lyophilisieren der Oxydationslösung gewonnene Oxytocin läßt sich auch durch Trocknen im Hochvakuum über P₂O₅ nicht vollständig von Wasser befreien und hat, je nach Trocknungsgrad, eine Aktivität von 300 bis 350 I.E./mg. Das Produkt ist farblos und klar wasserlöslich und kann in Form einer sterilen wäßrigen Lösung in der anfallenden Reinheit

ao unmittelbar subcutan, parenteral und intravenös appliziert werden.

Die Darstellung des in erster Stufe als Aminkomponente eingesetzten Heptapeptidderivates IV ist bereits in Jour. Am. ehem. Soc, 81 (1959), S. 5688 bis 5691, beschrieben. Das Dipeptidhydrazid III ist neu und wurde gemäß Schema 2 durch Umsetzen von BOC-S-Beneylcystein mit O-tert.-Butyl-tyrosin-methylester mittels Dicyclohexylcarbodiimids und nachfolgender Hydrazinolyse des Dipeptidesters gewonnen.

Schema 2:

Bz

Cys -OH BOC-Azid/
Triäthylamin

Z-Tyr -OCH₃ 1. Isobutylen/H⁺
2. Pd/H₂

BOC-

Bz

Cys

Bz

-OH

H-Tyr

-OCH,

Dicyclohexylcarbodiimid
tBu

BOC-	Cys	BOC-	Cys	Hydrazin	Tyr
Bz			tBu
Tyr

Auch die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten Zwischenprodukte V und VI sind neu.

Die Vorteile des Verfahrens gemäß der Erfindung liegen einerseits darin, daß bei der Reduktion in flüssigem Ammoniak lediglich die beiden S-Benzyl-Schutzgruppen abgespalten werden, während die endständige Aminogruppe und die Hydroxygruppe des Tyrosinrestes durch den BOC bzw. den tert.-Butylrest geschützt bleiben. Dadurch werden die bei der Natriumreduktion der bekannten Verbindungen IIa und Hb auftretenden Nebenreaktionen, die im wesentlichen durch das Auftreten von Benzylradikalen (Benzylierung der endständigen Aminogruppe und des Hydroxyphenyirestes· von Tyrosin) und das stark alkalische Reaktionsmedium (Umamidierung unter dem Einfluß von NaNH₂) bedingt sind, stark zurückgedrängt. Außerdem wird der Natriumverbrauch reduziert und die Reaktionszeit verkürzt. Deshalb fällt das Zwischenprodukt VI in sehr hoher Ausbeute an. Von besonderem Vorteil für die Abtrennung der bei der Natriumreduktion stets anfallenden Salze ist ferner die Schwerlöslichkeit des Nonapeptids VI in Wasser bei neutralem bis schwach saurem pH-Wert. Weiterhin ist das Nonapeptidderivat VI so stabil, daß die nachfolgende Spaltreaktion in beliebig großem Maßstab und in besonders einfacher Weise das aktive

7 8

Oxytocin liefert. Vorteilhaft ist weiterhin, die über- eine Lösung von 22,0 g Dicyclohexylcarbodiimid in

raschend hohe Ausbeute, die von der Größe des 50 ecm Acetonitril zu. Nach ltägigem Stehen bei +4⁰C

Ansatzes unabhängig ist und somit für eine Her- wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abgesaugt

stellung in technischem Maßstab von Bedeutung ist. und das Kupplungsprodukt aus dem Filtrat durch

Entscheidend ist schließlich die hohe Aktivität des 5 Zugabe von 1,01 Wasser abgeschieden. Das Roh-

Endproduktes von 300 bis 360 I.E./mg, während nach produkt wird in 0,5 1 Essigester aufgenommen und mit

dem Stand der Technik ähnliche Produkte eine je 0,11 lmolarer Zitronensäure ln-Natriumbicarbonat-

Aktivität von 80 bis 100 I.E./mg aufweisen. lösung und Wasser gewaschen. Die Essigesterlösung

Durch die nachstehenden Beispiele wird die Er- wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft,

findung näher erläutert. io Der ölige Rückstand kristallisiert bei Raumtemperatur.

Alle eingesetzten Aminosäuren gehören der L-Reihe Ausbeute: 46 g (85% der Theorie),

an. Die Schmelzpunkte wurden im Kupferblock Zur Überführung in das entsprechende Hydrazid

bestimmt und sind unkorrigiert. Lösungsmittelgemisch wird der so erhaltene Dipeptidester in einer Mischung

für die Chromatographie (System A): 375 ecm n-Bu- von 0,21 Methanol und 28 ecm 80%igem Hydrazin-

tanol—75 ecm Eisessig—250 ecm Pyridin—300 ecm 15 hydrat 4 Stunden am Rückfluß gekocht. Nach dem

Wasser. Abkühlen saugt man die Lösung von wenig kristallin

Beispiel abgeschiedenem Dicyclohexylharnstoff ab und dampft

das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Der kristalline

Stufe 1 Rückstand wird mit Äther verrieben, abgesaugt, mit

BOC-Cys(Bz)-Tyr(-tBu)-N₂H₃ (HI) ²⁰ Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpent-

r>r\r- η r\v ?.^x^ getrocknet. Nach dem Umkristallisieren aus

a) BOC-Cys(Bz)-OH Äthanol beträgt die Ausbeute 32,5 g (70% der 210 g S-Benzyl-cystein (1,0 Mol), 166 ecm Triäthyl- Theorie); Schmelzpunkt 123 bis 124°C; [<x]i° = -22,1°

amin (1,2 MoI) und 191 g 90%iges tert.-Butyl-oxy- (c = 2 in Methanol).

carbonylazid (1,2 Mol) werden in 2,51 60%igem 25

Dioxan 24 Stunden bei 50⁰C gerührt, die Mischung Stufe 2

dann im Vakuum auf 1,01 eingeengt, mit 2 01 Wasser _ßOC-Cys(Bz)-Tyr(tB_U)-Ile-Glu(NH₂)-As_P(NH₂)-verdunnt und mit 0,5 1 Essigester ausgeschüttelt. Die ' kJTnj \_rn \ ... r_¥r_{v MH (}ΐλ
nitrierte wäßrige Phase versetzt man bei 0°C mit 1,51 Cys(öz)-Fro-Leu-Oly-NH₂ (V)
20%iger Citronensäure, schüttelt das harzig ab- 30 Die Mischung von 84 g BOC-Cys(Bz)-Tyr-(tBu)-geschiedene BOC-Derivat in 2 1 Essigester, wäscht mit N₂H₃ (135 Mol) in 0,8 1 Tetrahydrofuran und 150 ecm Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft lmolarer Natriumnitritlösung wird bei 0°C unter im Vakuum unterhalb 50° C ein. Das zurückbleibende Rühren tropfenweise mit 50 ecm 5n-Salzsäure versetzt öl kristallisiert und wird nach dem Verreiben mit und dann noch 5 Minuten bei O⁰C gehalten. Nach Petroläther abgesaugt und an der Luft getrocknet. 35 Zugabe von 3 1 Eiswasser schüttelt man das ölig abAusbeute: 205 g (66% der Theorie), Schmelzpunkt geschiedene Azid in 1,5 1 Essigester, wäscht die Lösung 86 bis 87⁰C, [a]^? ₀° = -33,6° {c = 1 in Methanol). bei 0°C mit 0,51 ln-Natriumbicarbonatlösung und

Wasser, trocknet kurz bei 0⁰C über Natriumsulfat

b) Z-Tyr(tBu)-OCH_{3 unc}j _zj_ent dann bei einer Badtemperatur von +5⁰C 333 g Z-Tyr-OCH₃ hergestellt nach Biochem. J., 40 den Essigester im Vakuum ab. Den Rückstand

Bd. 57 (1954), S. 538, (1,0 Mol) werden in einer versetzt man sofort mit der eiskalten Lösung von

Mischung von 2,01 Methylenchlorid, 2,0 kg Iso- 83,5 g H-Ile-Glu(NH₂)-Asp(NH₂)-Cys(Bz)-Pro-Leu-

butylen und 25 ecm konzentrierter Schwefelsäure in GIy-NH₂ (100 mMol) (J. Amer. ehem. Soc, 81 [1959],

einer Drucknasche 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt. S. 5688 bis 5691) in 11 Dimethylformamid. Nach

Zur Aufarbeitung kühlt man auf — 15°C, öffnet die 45 2tägigem Stehen bei+5° C wird die hellgelbe Reaktions-

Druckflasche, spült den Inhalt mit 2,0 1 Äther heraus lösung mit 4 1 5%iger Essigsäure geschüttelt, die

und wäscht die Mischung mit zweimal 0,5 I 2n-Soda- Fällung abgesaugt, mit Wasser gewaschen und bei

lösung. Die organische Phase wird dann im Vakuum 40^cC im Vakuum über Kaliumhydroxyd getrocknet,

unterhalb 40° C eingedampft, der Rückstand mit Äther Das Rohprodukt (138 g, Zersetzungspunkt 225 bis

aufgenommen und die Lösung bei O⁰C mit 0,31 50 228⁰C) wird durch Auskochen mit 21 Äthanol von

In-NaOH und 1 1 Wasser gewaschen. Das nach Nebenprodukten befreit, bei Raumtemperatur abge-

Abdampfen desÄthers zunächst ölige Reaktionsprodukt saugt und bei 50° C im Vakuum über Kaliumhydroxyd

kristallisiert bei Raumtemperatur innerhalb einiger getrocknet. Ausbeute: 94 g (70% der Theorie);

Stunden. Ausbeute: 305 g (79% der Theorie); Zersetzungspunkt 233 bis 235°C; Rf(A) = 0,95;

Schmelzpunkt 52 bis 53°C; [λ]²",= -10,2° (c = 2 in 55 [*]f = -60,1° (c = 1 in Eisessig).
Methanol).

Stufe 3

c) BOC-Cys(Bz)-Tyr(tBu)-OCH₃

38,4 g Z-Tyr₍tBu)-OCH₃ (0,1 Mol) werden in 0,3 1

Methanol bei Raumtemperatur und in Gegenwart 60

von 4 g Palladiummohr hydriert, wobei das frei- 40 g des Nonapeptidderivates V (30 mMol) werden

gesetzte Kohlendioxyd in einem zweiten Gefäß durch in 5,01 trockenem flüssigem Ammoniak gelöst. Bei

40%tige Kahlauge absorbiert wird. Nach beendeter der Siedetemperatur des Ammoniaks läßt man dann

Wasserstoffaufnahme saugt man die Lösung vom unter Rühren eine Lösung von 5 g Natrium in 0,21

Katalysator ab, versetzt das Filtrat mit 31,2 g 65 trockenem flüssigem Ammoniak eintropfen, bis die

BOC-Cys(Bz)-OH (0,1 Mol) und dampft die Mischung Blaufärbung 1 Minute lang bestehen bleibt. Man

unterhalb 30° C im Vakuum ein. Den Rückstand nimmt entfärbt durch Zugabe von 40 g Ammoniumchlorid,

man in 0,11 Dimethylformamid auf und gibt bei 0⁰C läßt das Ammoniak bei Raumtemperatur abdampfen

ίο

und verreibt den Rückstand mit 2 1 5%Jger Essigsäure. Das ungelöste pulverige Produkt wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur im Vakuum über Kaliumhydroxyd getrocknet. Ausbeute: 31,8 g (92% der Theorie); Zersetzungspunkt 22O⁰C; Rf(A) = 0,86.

Stufe 4

H-Cys-Tyr-lle-GIuiNHii-AspiNHäV-Cys-Pro-Leu-GIy-NH₂ · HCl (VII)

30 g des Nonapeptiddenvates VI (26 mMol) werden in 300 ecm Eisessig gelöst. Bei Raumtemperatur gibt man 300 ecm einer 2,0 η-Lösung von Salzsäure in Eisessig zu, und die Hauptmenge des Hydrochlorids von VII scheidet sich als farblose Masse ab. Nach 2 Minuten fällt man den Rest durch Zugabe von 2,5 1 trockenem Äther, dekantiert, verreibt das amorphe Produkt mit frischem Äther, saugt ab, wäscht mit trockenem Äther und trocknet im Vakuum über Kaliumhydroxyd. Ausbeute: 26 g farbloses, klar wasserlösliches Pulver (fast quantitativ), Rf(A) = 0,89; [«]*> = -61,4° (c = 1 in Wasser).

Oxytocin (I)

20 g des Nonapeptid-hydrochlorids VII (19 mMol) löst man in 201 Wasser, gibt 10 g Ammoniumacetat zu, stellt den pH-Wert mit 2n-Ammoniak auf 7,0 ein und leitet 7 Stunden lang einen lebhaften Strom kohlendioxydfreier Luft durch die Lösung. Anschließend wird filtriert, das Filtrat mit Eisessig auf pH 5 eingestellt und lyophilisiert. Das farblose Lyophilisat wird bei Raumtemperatur 10 Stunden bei 0,001 Torr über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute: 19,5 g 5 Oxytocinhydrochlorid mit einer Aktivität von 350 ±301. E. pro Milligramm (79% der Theorie); R_F(A) = 0,69; [«f = -21,6° (c = 1 in l%iger Essigsäure).

Claims (1)

1. Patentanspruch:
   10

   Verfahren zur Herstellung von Oxytocin, dadurch gekennzeichnet, daß man das Dipeptidderivat der Formel IN

   Bz tBu

   BOC-Cys-Tyr-N₂H₃ (III)

   worin BOC den tert.-Butyloxycarbonyl-, Bz den Benzyl- und tBu den tert.-Butylrest bedeutet, nach der Azidmethode mit dem Heptapeptidderivat der Formel IV

   NH₂ NH₂ Bz

   H-Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NHss

   (IV)

   worin Bz ebenfalls den Benzylrest bedeutet, kondensiert, das gebildete Nonapeptidderivat der Formel V

   Bz tBu NH₂ NH₂ Bz

   BOC-Cys-Tyr-Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NHj (V)

   durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak in das Nonapeptidderivat der Formel VI überführt,

   tBu NH„ NH₂

   1 : Ί

   BOC-Cys-Tyr- Ile-Glu-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly-NH., (VI)

   dieses durch Behandeln mit überschüssiger starker Säure in das Nonapeptidamid VII

   NH₂ NH₂
   H-Cys-Tyr-Ue-Glu-Asp-CyS-PrO-LeU-GIy-NH₂ (VII)

   überführt und dieses in bekannter Weise durch Oxydation in Oxytocin umwandelt.