DE1142613B - Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-thiocolchicinderivaten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-thiocolchicinderivaten der allgemeinen Formel

CH₃O

CH_aO

— NH-C —NH-R

worin X für ein Sauerstoff- oder Schwefelatom steht und R eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Phenyl- oder Naphthylgruppe bedeutet.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I weiden hergestellt, indem man in an sich bekannter Weise entweder

a) Desacetyl-thiocolchicin der Formel

CH₃O.

CH₃O

NH,

CH₃O

II

CH₃

mit einer Verbindung der allgemeinen Formel

R-N = C = X III

oder indem man

Verfahren zur Herstellung
von Desacetyl-thiocolchicinderivaten

Anmelder:
Sandoz A. G., Basel (Schweiz)

Vertreter: Dr. W. Schalk, Dipl.-Ing. P. Wirth,

Dipl.-Ing. G. E. M. Dannenberg

und Dr. V. Schmied-Kowarzik, Patentanwälte,

Frankfurt/M., Große Eschenheimer Str. 39

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 3. August 1959 und 23. Mai 1960
(Nr. 76 502 und Nr. 5902)

Dr. Hans-Peter Sigg, Binningen (Schweiz),
ist als Erfinder genannt worden

salz in eine Verbindung der allgemeinen Formel CH₃O.. ^\/-v

V- N = C = X

CH₃O ' "^VO^8-C
CH₃O I j

η^^ο iv

CH₃

überführt und diese mit einem primären Amin der allgemeinen Formel

R-NH₂

b) Desacetyl-thiocolchicin der allgemeinen Formel II durch Umsetzung mit Phosgen oder Thiophosgen oder durch Umsetzung mit Schwefelkohlenstoff in Gegenwart von Ammoniak und Behandlung des entstandenen Dithiocarbamats mit Phosgen, Chlorameisensäureester oder einem Schwermetallumsetzt.

Das Verfahren wird vorzugsweise folgendermaßen ausgeführt:

Desacetyl-thiocolchicin wird in wenig absolutem Benzol gelöst und mit einer Lösung eines Isocyanats bzw. Isothiocyanats der allgemeinen Formel III in absolutem Benzol versetzt. Nach 4- bis 24stündigem Stehen des Reaktionsgemisches bei 20⁰C erfolgt im allgemeinen Kristallisation, eventuell erst nach Ätherzugabe. Andernfalls werden die Produkte durch

209 759/210

Ausfällen mit Petroläther gewonnen und durch Umfallen gereinigt.

Man kann auch so verfahren, daß man Desacetylthiocolchicin in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Benzol, mit Ammoniak und Schwefelkohlenstoff versetzt und das intermediär entstandene Dithiocarbamat unter Kühlung mit Phosgen in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Toluol, behandelt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird an Silicagel chromatographiert. Das auf diese Weise dargestellte Isothiocyanat wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, mit einem primären Amin der allgemeinen Formel V umgesetzt, die Reaktionsmischung 24 Stunden stehengelassen und, wie weiter oben beschrieben, aufgearbeitet.

Man erhält so gelbe Kristalle bzw. amorphe Pulver, deren Schmelzpunkte nicht sehr charakteristisch sind, da sie meist Zersetzungspunkte sind. Sie lösen sich in den meisten organischen Lösungsmitteln leicht, z. B. in Chloroform, Methylenchlorid und niederen Alkanolen, sind aber in Äther und Petroläther schwer löslich und unlöslich in Wasser. Die Charakterisierung der Substanzen erfolgt durch Messung der molekularen Drehung und des Infrarotspektrums. Die Prüfung der Reinheit ist mittels der Papierchromatographie möglich.

Die angeführten Thiocolchicinderivate haben eine ausgesprochene selektive Hemmwirkung auf die Teilungsvorgänge des Zellkerns. Sie wurde in vitro an der Fibroblastenkultur geprüft. In einer Konzentration von 10~⁸·⁵ bis 10~⁷ vermögen sie alle die Mitose in früher Metaphase total zu arretieren. In fünf- bis zehnmal geringerer Konzentration bewirken sie eine 50°/_oige Hemmung des Wachstums solcher Zellkulturen. Als In-vivo-Test wurden experimentelle Mäuse-Tumore, und zwar in erster Linie der Ehrlichsche Mäuse-Ascitestumor verwendet. Einzeldosen, die ohne Nebenerscheinungen gut toleriert wurden, vermochten die Zellteilung während 20 bis 40 Stunden total zu unterbinden. Die chronische Applikation gut verträglicher Dosen bewirkte eine deutliche Hemmung des Wachstums des Ehrlichschen Mäuse-Ascitestumors und auch von Sarkom 37 der Maus. Die Überlebenszeit von Mäusen, welche mit Leukämie 1210 beimpft waren, konnte zum Teil um 100% heraufgesetzt werden.

In therapeutisch wirksamen Dosen von 0,5 bis 2 mg/kg parenteral einmal täglich verabreicht während 10 Tagen erwiesen sich die Thiocolchicinderivate als nicht cytotoxisch. Nebenerscheinungen, wie Nausea, Erbrechen und Durchfall, wurden nicht beobachtet. Die neuen Verbindungen sind bei neoplastischen Affektionen vorteilhaft verwendbar.

Die antimitotische Wirksamkeit und die Toxizität von Verfahrensprodukten wurden mit der antimitotischen Wirksamkeit bzw. der Toxizität des bekannten N-Desacetyl-thiocolchinins verglichen.

Die antimitotische Wirkung in der Zellkultur, die antimitotische Wirkung am Ehrlichschen Mäuse-Ascitestumor, die akute Toxizität sowie die Wirkung bei der Mäuseleukämie der folgenden Verbindungen wurde bestimmt:

I. N-(N'-Allyl-thiocarbamido)-desacetyl-thiocoI-

chicin,

II. N-(N'-n-Nonyl-carbamido)-desacetyl-thiocolchicin,

III. N-(N'-a-Naphthyl-thiocarbamido)-desacetylthiocolchicin,

IV. Desacetyl-thiocolchicin.

Antimitotische Wirkung in der Zellkultur (Fibroblasten)

Die Substanzen wurden an Fibroblastenkulturen an embryonalen Gefäßwandzellen des Hühnchens auf ihre mitosehemmende Wirkung untersucht. Die Kulturen wurden während 8 Stunden mit den Testpräparaten überschichtet, dann fixiert und gefärbt. Die Substanzen gelangten in einer Konzentration von 10"'* bis 10~⁸ zur Anwendung. Zur Beurteilung der Mitosewirkung wurden

1. die Verteilung der Mitosestadien und

2. die Ruhezellschäden, Granulation des Plasmas. Vakuolen und Zelltrümmer

berücksichtigt. Als Kriterium der antimitotischen Wirkung diente der Stop in früher Metaphase.

Präparat

Minimale Konzentration für Hemmung in früher Metaphase teilweise total

Cytotoxizität

II
III
IV

10-⁸ bis 10-⁸'^s IO-⁷ bis 10-⁸

10-'»*
10-⁸ bis 10-»

io-⁸ 10-⁷

10-'

io-⁸

io-8	bis ΙΟ-8·5
	10-'
	10-'
10-7	bis ΙΟ"8

schwach — keine deutlich keine schwach

Antimitotische Wirkung am Ehrlichschen Ascitestumor

der Maus

Mäuse aus einheitlichem Stamm mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden intraperitoneal mit Zellen des Ehrlichschen Mäuse-Ascitestumors geimpft. 8 Tage nach der Überimpfung fand sich bei allen Tieren ein Ascites von durchschnittlich 5 ecm mit etwa 000 Zellen pro Kubikzentimeter. In diesem Stadium wurden die zu untersuchenden Stoffe i. p. dem Ascites zugegeben. In gewissen Zeitabständen wurden den Tieren 1 bis 2 Tropfen Ascites entnommen. Die Substanzwirkung wurde bewertet, indem die Beeinflussung der mitotischen Tätigkeit der Tumorzellen untersucht wurde. Totale Hemmung lag dann vor, wenn nur Prophasen und frühe Metaphasen gefunden

55

60

65 wurden. Festgehalten wurde die Anzahl Stunden nach der Injektion, während welcher dieser totale Mitosestop in früher Metaphase nachzuweisen war. Die cytotoxische Wirkung der zu untersuchenden Stoffe wurde vorwiegend an den Ruhezellen beurteilt.

Präparat	Dosis mg/kg i.p. Maus	Mittlere totale Hemmung in früher Metaphase während	Cytotoxizität
I II III IV	12,5 12,5 12,5 12,5	30 bis 35 Stunden 35 bis 40 Stunden 12 bis 15 Stunden 20 bis 30 Stunden	leicht leicht keine deutlich

Akute Toxizität

Die akute Toxizität wurde an weißen Mäusen untersucht. Dabei ergaben sich folgende LD₅₀-Werte:

Substanz I i. ρ > 150 mg/kg

Substanz II i. ρ 20 mg/kg

Substanz III i. ρ > 150 mg/kg

Substanz IV i. ρ 97 mg/kg

Mäuse-Leukämie 1210

Den Mäusen wurden 1 000 000 Tumorzellen subcutan injiziert. Nach 8 Stunden erhielten die Mäuse täglich 1 bzw. 2 mg/kg der Versuchssubstanz subcutan verabreicht. Nach zwölf Injektionen wurde die Überlebenszeit der Versuchstiere mit den unbehandelten Kontrolltieren verglichen.

Präparat

III
IV

Dosis s.c.
mg/kg

Anzahl

der
Injektionen

12
12

12
12

Uberlebenszeit

sechs Tiere 148%

zwei Tiere total überlebt

fünf Tiere 174%

drei Tiere total überlebt setzungspunkt 239 bis 246°; [α]?' = -115° (c = 0,780 in Chloroform); Ausbeute: 85%·

Beispiel 5
N-(N'-Ä-Naphthyl-carbarnido)-desacetyl-thiocolchicin

Analog wie im Beispiel 1 wird mit a-Naphthylisocyanat die genannte Verbindung dargestellt; F. 200 bis 202° (Zersetzung); [oc]f = +20° (c = 0,935 in Chloroform); Ausbeute: 80%.

Beispiel 6
N - (N' - Phenyl - carbamido) - desacetyl - thiocolchicin

Analog wie im Beispiel 1 wird mit Phenyl-isocyanat die genannte Verbindung dargestellt. Da das Produkt nicht zur Kristallisation gebracht werden kann, wird es durch Eintropfen der Benzollösung in Petroläther ausgefällt. Beim Umfallen aus Methylenchlorid—Petroläther erhält man ein reines Produkt vom Schmelzpunkt 175 bis 185° (Zersetzung); [*]?' = —119° (c = 0,43 in Chloroform); Ausbeute: 85%.

Beispiel 7
N - (N' - η - Nonyl - carbamido) - desacetyl - thiocolchicin

130%
184%

Analog wie im Beispiel 1 wird mit n-Nonyl-isocyanat die genannte Verbindung dargestellt. Die Reindarstellung erfolgt wiederum wie im Beispiel 6 durch In den nachfolgenden Beispielen, welche die Aus- 30 Ausfällen mit Petroläther; F. 120 bis 140° (Zersetzung); führung des Verfahrens erläutern, ist die Temperatur [«]?' = —67° (c = 0,075 in Chloroform); Ausbeute: in Celsiusgraden angegeben. Die Schmelzpunkte sind 95%·
im evakuierten Röhrchen bestimmt und unkorrigiert. Beispiel 8

Beispiel 1

N-(N'-Phenyl-thiocarbamido)-desacetyl-thiocolchicin

5 g kristallines Desacetyl-thiocolchicin werden in Chloroform gelöst und die Lösung im Vakuum zur Trockne gebracht. Der amorphe Rückstand wird in 50 ecm absolutem Benzol gelöst und mit 1,80 g Phenyl-isothiocyanat in 5 ecm Benzol versetzt. Nach 18stündigem Stehen der Reaktionsmischung bei einer Temperatur von 2O⁰C werden die gelben Kristalle abgenutscht und mit Benzol—Äther (1 : 1) gewaschen; F. 235 bis 236° (Zersetzung); [<x]V = -77° (c = 0,935 in Chloroform); Ausbeute: 100%.

N - (N' - Cyclohexyl - thiocarbamido) - desacetyl - thio -

colchicin

300 mg kristallines Desacetyl-thiocolchicin werden in 2 ecm Chloroform gelöst und die Lösung im Vakuum zur Trockne gebracht. Der amorphe Rückstand wird in 6 ecm absolutem Benzol gelöst und mit 112 mg Cyclohexyl-isothiocyanat in 2 ecm Benzol versetzt. Nach 70stündigem Stehen der Reaktionsmischung bei einer Temperatur von 20°, anschließender Konzentration und Zugabe von Äther werden die gelben Kristalle abgenutscht und mit Benzol—Äther (1:1) gewaschen; F. 190 bis 194° (Zersetzung); [λ]V = —56° (c = 1,07 in Chloroform); Ausbeute: 70%.

Beispiel 2
N-(N'-Methyl-thiocarbarnido)-desacetyl-thiocolchicin

Analog wie im Beispiel 1 wird mit Methyl-isothiocyanat die genannte Verbindung hergestellt; Zersetzungspunkt 190 bis 201°; [xl'] = -128° (c = 0,600 in Chloroform); Ausbeute: 90%.

Beispiel 3
N - (N' - Äthyl - thiocarbamido) - desacetyl - thiocolchicin

Analog wie im Beispiel 1 wird mit Äthyl-isocyanat die genannte Verbindung dargestellt; Zersetzungspunkt 170 bis 187 °; [a] I¹ = -109 ° (c = 0,830 in Chloroform); Ausbeute: 100%.

Beispiel 4
N - (N' - Allyl - thiocarbamido) - desacetyl - thiocolchicin

Analog wie im Beispiel 1 wird mit Allyl-isothiocyanat die genannte Verbindung dargestellt; ZerBeispiel 9
N-(N'-n-Hexyl-thiocarbamido)-desacetyl-thiocolchicin

Analog wie im Beispiel 8 wird mit n-Hexyl-isothiocyanat die genannte Verbindung hergestellt; F. 135 bis 138° (Zersetzung), [a]f = —94° (c = 1,085 in Chloroform) ; Ausbeute: 75 %■

Beispiel 10

N - (N' - λ - Naphthyl - thiocarbamido) - desacetyl -thiocolchicin

Analog wie im Beispiel 8 wird mit «-Naphthyl-isothiocyanat die genannte Verbindung hergestellt; F. 190 bis 191° (Zersetzung); [a]S' = +6° (c = 1,04 in Chloroform); Ausbeute: 100%.

Beispiel 11

N - (N' -ß - Naphthyl - thiocarbamido) - desacetyl - thio -

colchicin

Analog wie im Beispiel 8 wird mit /3-Naphthyl-isothiocyanat die genannte Verbindung hergestellt; F. 180

bis 185° (Zersetzung), [α]?¹=—15^C Chloroform); Ausbeute: 70°/₀.

(c = 1,27 in

Beispiel 12 N-(N'-Phenyl-thiocarbamido)-desacetyl-thiocolchicin

373 mg Desacetyl-thiocolchicin werden in 15 ecm absolutem Benzol gelöst. Unter Eiskühlung wird während 10 Minuten trockenes Ammoniakgas eingeleitet. Dann wird in zwei Portionen eine Mischung aus 76 mg ίο Schwefelkohlenstoff in 2 ecm Benzol zugegeben und noch für weitere 10 Minuten Ammoniak eingeleitet. Nach kurzem Ansetzen von Vakuum wird der überschüssige Ammoniak mit Stickstoff ausgetrieben. Unter Kühlung werden zweimal 0,5 ecm einer 20%igen Lösung von Phosgen in Toluol zugegeben. Die gut geschüttelte tomatenrote Lösung wird nach 15 Minuten im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand, ein braunes öl, wird an Silicagel Chromatographien. Zuerst wird rohes Isothiocyanat (Ausbeute: 20%) ao eluiert (Chloroform mit 1 % Methanol), in den folgenden Fraktionen zuerst rohes Urethan und dann Desacetyl-thiocolchicin. 95 mg rohes Isothiocyanat werden in 2 ecm Benzol gelöst und mit 30 mg Anilin versetzt. Nach 20stündigem Stehen der Reaktionsmischung bei einer Temperatur von 24° werden die gelben Kristalle abgenutscht und mit Benzol—Äther 1: 1 gewaschen; F. 234 bis 238° (Zersetzung); Ausbeute: 100%.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-thiocolchicinderivaten der allgemeinen Formel

   CH₃O

   CH₃O

   35

   NH-C —NH-R

   45

   worin X für ein Sauerstoff- oder Schwefelatom steht und R eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-,

   Phenyl- oder Naphthylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise entweder

   a) Desacetyl-thiocolchicin der Formel

   CH₃O ^. ..._

   CH₃O

   CH_aO

   )— NH₂

   CH₃

   mit einer Verbindung der allgemeinen Formel

   R-N = C = X

   umsetzt oder

   b) Desacetyl-thiocolchicin der Formel II durch Umsetzung mit Phosgen oder Thiophosgen oder durch Umsetzung mit Schwefelkohlenstoff in Gegenwart von Ammoniak und Behandlung des entstandenen Dithiocarbamats mit Phosgen, einem Chlorameisensäureester oder einem Schwermetallsalz in eine Verbindung der allgemeinen Formel

   CH₃O. ^\ ._,

   V-N = C = X

   CH₃O

   CH₃O

   IV

   CH₃

   überführt und diese mit einem primären Amin der allgemeinen Formel

   R — NH₂ V

   umsetzt.

   In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Patentschrift Nr. 960 202.

   ® 209 759/210 1.63