DE1126068B - Verfahren zur Gewinnung von Antigenen und Haptenen - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Antigenen und Haptenen

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DE1126068B
DE1126068B DET14882A DET0014882A DE1126068B DE 1126068 B DE1126068 B DE 1126068B DE T14882 A DET14882 A DE T14882A DE T0014882 A DET0014882 A DE T0014882A DE 1126068 B DE1126068 B DE 1126068B
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Germany
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antigens
antibody
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haptens
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Dr Med Karl Theurer
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DR MED KARL THEURER
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DR MED KARL THEURER
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies

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  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

  • Verfahren zur Gewinnung von Antigenen und Haptenen Zusatz zum Patent 1 040 748 Vorliegendes Verfahren bringt eine weitere Ausbildung des Verfahrens nach Patent 1 040 748, bei dem man schonend homogenisiertes Organgewebe im wäßrigen Milieu mit in bekannter Weise gewonnenem antimesenchymalem und bzw. oder antineuralem Antikörperserum versetzt, das entstehende Agglutinat bzw. Präzipitat durch Zentrifugieren entfernt, die überstehende Flüssigkeit - im Hauptpatent nicht ganz treffend als Emulsion bezeichnet gegebenenfalls nach Zusatz der entsprechenden Abwehrfermente bei 370 C bebrütet, anschließend durch Dialyse von niedermolekularen Beimengungen befreit und gefriertrocknet.
  • Das Verfahren nach dem Hauptpatent zielt darauf ab, aus dem Gemisch von organspezifischen und unspezifischen Antigenen und Haptenen, welches in einem Organgewebe vorliegt, die organspezifischen Fraktionen zu isolieren. Dabei werden die unspezifischen Antigene mit Hilfe entsprechender Antikörper agglutiniert bzw. präzipitiert und abzentrifungiert, während die organspezifischen Fraktionen in Lösung bleiben.
  • Es wurde nun gefunden, daß das Prinzip des Hauptpatents ganz allgemein angewendet werden kann, um aus biologischen Substraten aller Art die darin enthaltenen spezifischen Antigene bzw. Haptene von unspezifischen Antigenen zu trennen.
  • Unter biologischen Substraten werden dabei neben allgemein vom Normalen abweichenden Zellstrukturen insbesondere auch Mikroorganismen, Viren sowie Stoffe aus dem Pflanzenreich oder Homogenisate oder Extrakte verstanden. Stets handelt es sich um Substrate, die neben anderwärts vorkommenden Antigenen für das betreffende Substrat spezifische Antigene bzw. Haptene enthalten, und stets werden die Substrate mit Antikörperseren versetzt, welche gegen die unspezifischen, anderwärts auch vorkommenden Antigene des in Rede stehenden Substrates gerichtet sind.
  • Diese Antikörperseren agglutinieren bzw. präzipitieren die unspezifischen Antigene des behandelten Substrates, und in der nach dem Zentrifugieren überstehenden Flüssigkeit verbleiben die spezifischen Antigene. Diese sind noch vergesellschaftet mit Serumbestandteilen, welche bei aktiver Immunisierung der für die Gewinnung der anfänglich eingesetzten Antlkörperseren benutzen Tierart keine Antikörper bilden. In weiterer Ausbildung des Verfahrens nach der Erfindung werden nun durch Immunisierung der gleichen Tierart gegen die spezifischen Antigene gerichteteAntikörperseren gewonnen und diese dem in Rede stehenden biologischen Substrat zugemischt. Aus dem jetzt entstehenden Agglutinat bzw. Präzipitat werden dann die spezifischen Antigene in üblicher Weise in reiner Form isoliert.
  • Wie schließlich weiter gefunden wurde, kann man zur Isolierung solcher spezifischer Antigene auch zunächst das abzentnfugierte Agglutinat bzw. Präzipitat der unspezifischen Antigene, wie es in der ersten Gewinnungsphase anfällt, in an sich bekannter Weise spalten, mit dem freien Gemisch unspezifischer Antigene über die gleiche Tierart erneut ein Antikörperserum gewinnen und dieses reinere, nur unspezifische Antikörper enthaltende Serum mit neuen Anteilen des biologischen Ausgangssubstrats versetzen.
  • Die Antikörper können auch zunächst an geeignete Absorbenzien angelagert und dann mit dem Stoffgemisch, aus dem unspezifische Substanzen eliminiert werden sollen, in Kontakt gebracht werden.
  • Nach Anlagerung der Antikörper können dann zunächst die im Serum enthaltenen Begleitstoffe, wie z. B. Albumin u. a.. ausgewaschen und beseitigt und erst dann das aufzuarbeitende Stoffgemisch zugesetzt werden. Für diese Art der Isolierung eignen sich insbesondere auch Verfahren, wie sie in der Chromatographie und bei der Elektrophorese bekannt sind. Als Adsorbenzien können alle dafür geeigneten Stoffe, wie z. B. Aluminiumhydroxyd, Kaolin, Silicagel, Kohle, Zellstoff u. dgl., benutzt werden. Die Aufspaltung des Stoffgemisches kann auch in der Art eines Durchlaufverfahrens erfolgen, wobei Teile der Extrakte von den jeweiligen Antikörpern abgefangen und zurückgehalten werden. Eine Elution der an die Absorbenzien gebundenen Antigen-Hapten-Antikörper-Komplexe ist nach bekannten Verfahren möglich, ebenso die weitere Aufspaltung und Isolierung sowohl der Antikörper als auch der antigenen und haptenen Bestandteile.
  • Die optimalen Verhältnisse sind bekanntlich für verschiedene Antigen-Antikörper-Reaktionen unterschiedlich, so daß diese für jedes System durch Vorversuche speziell bestimmt werden müssen. Insbesondere sind Temperatur, pH, Jonenmilieu und Bebrütungszeit durch Vorversuche zu bestimmen.
  • Unter Umständen vergrößert Alkoholzusatz nach eingetretenerAntigen-Antikörper-Reaktion die Menge des als Sediment zu erfassenden Antigen-Antikörper-Komplexes. Trotzdem sollte eine mengenmäßige Abstimmung der Antikörperkonzentration und des Antigengemisches erfolgen. Bei einer im Verhältnis zur Menge der Antikörper zu großen Menge von Antigen besteht die Gefahr, daß sich kein oder zu wenig Sediment bildet.
  • Unspezifische Agglutinations- und Präzipitationsreaktionen sind ebenso wie auch die Konglutination durch Berücksichtigung der diesbezüglichen wissenschaftlichen Erkenntnisse zu vermeiden. Es eignet sich dazu z. B. der Zusatz von SOi0iger Glukosaminlösung, von 2°/oiger Bernsteinsäure, von Lecithin oder von oberflächenaktiven Substanzen. Diesbezüglich ist auch die Konzentration von Salzen und das Ionenmilieu von Bedeutung. Bei verschiedenen Systemen ist die Flockungsgeschwindigkeit um 45 bis 50° C bei einem NaCl-Gehalt von O,ln optimal. Andere Reaktionen sind dann wiederum bei Temperaturen wenig über 0 oder bei 30 C durchzuführen.
  • Auch bei vorliegendem Verfahren können Abwehrfermente zur weiteren Reinigung der Antigene verwendet werden. Zum Herauslösen der so gewonnenen Fraktion aus dem aufzuarbeitenden Substrat lassen sich dann alle bekannten Verfahren zusätzlich anwenden. wie z. B. Dialyse, Fällungsmethoden, Elektrophorese, Chromatographie. Adsorptionsmethoden mit Ionenaustauschern.
  • Die erfindungsgemäß gewonnenen Antigene bzw.
  • Haptene werden zur serologischen Bestimmung von Antikörpern bei Krankheiten für diagnostische Zwecke verwendet. Sie können auch therapeutisch angewendet werden.
  • Beispiel 1 Zur Isolierung von ubiquitären Bestandteilen aus Organzellen, die in allen Zellarten des Menschen vorkommen und zur Isolierung der für mesenchymale Gewebe spezifischen Antigene und Haptene wird nach bekannten Methoden zunächst durch aktive Immunisierung von Kaninchen ein hochtitriges Antikörperserum gegen Leberparenchymzellen sowie Abwehrfermente gegen diese Zellen gewonnen. Mit diesem Antikörperserum wird ein verdünntes Homogenat oder ein Extrakt aus mesenchymalen Geweben der Milz des Menschen zusammengebracht und das entstehende Präzipitat bzw. Agglutinat durch Zentrifugieren abgetrennt. In dem Antigen-Antikörper-Komplex sind die ubiquitären, in allen Körperzellen enthaltenen Antigene enthalten. Diese können dann nach bekannten Verfahren gewonnen und weiterverarbeitet werden, ebenso lassen sich durch Dissoziation des Antigen-Antikörper-Komplexes die Antikörper zurückgewinnen und erneut verwenden. Die aus der Zentrifuge kommende überstehende Flüssigkeit wird fermentativ durch Zusatz von entsprechenden Abwehrfermenten gereinigt und danach durch Dialyse und Elektrophorese von unerwünschten Bestandteilen getrennt. In ihm sind die spezifisch mesenchymalen Gewebsbestandteile enthalten sowie die Antikörperfraktionen, die gegen die spezifischen parenchymatösen Gewebebestandteile gerichtet waren.
  • Letztere können durch spezifische Antigene von Leberzellen entfernt werden. ebenfalls auf Grund einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Mit den spezifischen Mesenchymbestandteilen werden nun durch aktive Immunisierung von Kaninchen spezifische Antikörper und Abwehrfermente gewonnen. Diese können dann bei erneuten Herstellungsgängen Verwendung finden. Die für mesenchymales Gewebe spezifische Fraktion läßt sich aus dem Antigen-Antikörper-Komplex in gleicher Weise eluieren. Im Rückstand ist hier dann keine fremde Antikörperfraktion enthalten. Die isolierten Zellbestandteile werden nach bekannten Verfahren konserviert bzw. gefriergetrocknet, ebenso die zurückgewonnenen Antikörperfraktionen.
  • Beispiel 2 Aus pathologischen Geweben eines Leberkrebses sollen die Bestandteile isoliert werden, die spezifisch für diese Krebsart sind. Hierzu wird ein hochkonzentriertes Serum sowie Abwehrfermente gegen gesunde Leberzellen gewonnen und das Antikörnerserum mit einem verdünnten Homogenat oder einem Extrakt der Geschwulstzellen zusammengebracht. Das sich bildende Sediment enthält die Gewebebestandteile, die auch beim gesunden Gewebe vorkommen. Im Rückstand sind hingegen die für die Krebsgeschwulst spezifischen Bestandteile enthalten. Sowohl das Sediment als auch die überstehende Flüssigkeit werden von Begleitstoffen gereinigt und die antigenen Bestandteile daraus isoliert. Mit den aus der Flüssigkeit gewonnenen Antigenen lassen sich dann spezifische Antikörperseren und Abwehrfermente herstellen, die es wiederum erlauben, in umgekehrter Richtung die krebsspezifischen Fraktionen mittels der Antigen-Antikörper-Reaktion zu gewinnen. Andrerscits können diese krebsspezifischen Seren und Abwehrfermente auch therapeutisch Verwendung finden.
  • Durch Absättigungsversuche mit verschiedenen Krebsarten bzw. mit jeweils auf andere Krebsarten gerichteten Seren und Abwehrfermenten kann ein ubiquitär bei allen Krebsarten einer bestimmten Spezies vorhandenes krebsspezifisches Agens isoliert werden. Zum Beispiel wird ein Homogenat bzw.
  • Extrakt aus den für den Leberkrebs spezifischen Zellbestandteilen mit einem Antikörperserum sowie mit Abwehrfermenten behandelt, die gegen Magenkrebs spezifisch gerichtet sind. Sofern eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfindet, sind in dem Antigen-Antikörper-Komplex dann die Gewebselemente enthalten, die sowohl im Leberkrebs wie im Magenkrebs vorkommen.
  • Beispiel 3 In ähnlicher Weise können allgemein die vom Normalen abweichenden Zellstrukturen isoliert und mit ihrer Hilfe spezifische Antikörperseren und Abwehrfermente hergestellt werden, so z. B. die nach überstandener Virusinfektion in den Zellen serbliebenen Virusteilchen oder in den Zellen abgelagerten Stoffwechselschlacken. Auch hier hat man von Homogenaten oder Extrakten der anomalen Zellen und spezifischen Antikörperseren und Abwehrfermenten auszugehen. die gegen gleichartige, jedoch gesunde bzw. normale Zellen gerichtet sind.
  • Beispiel 4 Durch ein analoges Vorgehen können auch gruppenspezifische und für einzelne Stämme kennzeichnende Bestandteile von Mikroorganismen getrennt werden. Zum Beispiel werden die für Salmonellen spezifischen Antigene und Haptene aus einem Homogenat oder Extrakt von Salmonellen durch spezifische Antikörperseren und Abwehrfermente, die gegen Colibazillen, Pneumococcenstämme undi oder Pseudotuberkulosebazillen gerichtet sind, gewonnen. Späterhin wird ein spezifisch gegen Salmonellen-Antigene gerichtetes Serum bzw. entsprechende Abwehrfermente hergestellt, die es erlauben, die für Salmonellen spezifischen Partialantigene aus dem Produkt der Antigen-Antikörper-Reaktion zu isolieren.
  • In analoger Weise können unter Verwendung von isolierten Antigenen spezielle Seren hergestellt werden, die elne Differenzierung von Bakterienstämmen erlauben. Ebenso lassen sich nach diesem Verfahren auch Virusstämme und Virusarten unterscheiden.
  • Bei der Herstellung der Seren und der spezifischen Abwehrfermen te werden zweckmäßigerweise Adjuvantien bzw. Stoffe zum Antigen zugesetzt, die es erlauben, hapene Bestandteile zum Vollantigen zu komplettieren. wie z. B. eine kolloidale Komplexverbindung aus Aluminiumhydroxyd und Kleselsäure oder das Freundsche Adjuvans u. a. Auch ist es mög- lich, dazu chemische Verfahren anzuwenden, wie z. B. die vorherige Diazotierung durch die Diazoniumverbindungen hergestellt werden, die Behandlung mit Isozyanaten, die Umsetzung mit Karbobenzoxyverbindungen, das Curtiussche Azidverfahren, das Oxazolonverfahren von Lettre u. dgl. Auf diese Weise lassen sich dann bezüglich der Gewebeart homologe als auch heterologe Seren nach bekannten Methoden gewinnen.

Claims (3)

  1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Gewinnung von Antigenen oder Haptenen nach Patent 1 040 748, dadurch gekennzeichnet, daß man von anderen biologischen Substraten, auch von Mikroorganismen oder Viren oder von Extrakten ausgeht und diese mit Antikörperseren versetzt, welche gegen die zu eliminierenden Bestandteile des biologischen Substrates gerichtet sind.
  2. 2. Verfahren zur Gewinnung von Antigenen oder Haptenen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit den gewonnenen Antigenen wiederum Antikörper gewinnt unter Verwendung von Lebewesen, die mit denen artgleich sind, aus welchen die ersten Antikörperseren gewonnen waren, und mit diesen Antikörperseren in an sich bekannter Weise die Antigene von ihren Beimischungen abtrennt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Agglutinat bzw.
    Präzipitat enthaltenen Antigene in an sich bekannter Weise isoliert und damit gewonnene Antikörper zur Gewinnung von Antigenen mlttels des Verfahrens nach dem Hauptanspruch einsetzt.
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