DE112020000602T5

DE112020000602T5 - Neues PNA-Oligomer, dessen Verwendung zum Nachweisen einer DNA-Methylierung und Verfahren zum Nachweisen einer DNA-Methylierung, bei dem dieses verwendet wird

Info

Publication number: DE112020000602T5
Application number: DE112020000602.6T
Authority: DE
Inventors: Bat Ochir Chinbayar; Songhak Kim; Kyung Tak Kim; Mee Hyang Jeon; Han Woo Lee; Hee Kyung Park
Original assignee: Seasunbio Mat; SEASUNBIO MATERIALS
Current assignee: Seasunbio Mat; SEASUNBIO MATERIALS
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2021-12-09
Also published as: WO2021045479A1; KR20210026867A; EP4026843A4; US20220162681A1; EP4026843A1; CN114341163A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes PNA-Oligomer zum Nachweisen einer Genmethylierung. Durch die Verwendung einer PNA-Sonde, die durch Einführen eines Methylgruppe-spezifischen Substituenten in die Gamma-Position modifiziert worden ist, kann die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zum Nachweisen unter Verwendung einer Differenz bei den physikalischen Eigenschaften zwischen einem Gen und einem nicht-methylierten Gen, die durch eine Wechselwirkung zwischen der Sonde und Methylgruppen des Gens verursacht wird, verwendet werden.

Description

[Technisches Gebiet]
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptidnukleinsäure (PNA)-Oligomer und insbesondere die Technologie zum Nachweisen einer DNA-Methylierung unter Verwendung einer neuen PNA-Sonde.
[Stand der Technik]
Eine DNA-Methylierung findet vorwiegend an Cytosinen einer CpG-Insel in einer Promotorregion eines bestimmten Gens statt und behindert folglich das Binden von Transkriptionsfaktoren, so dass die Expression des bestimmten Gens unterbrochen wird (Gen-Stilllegung), was als Hauptmechanismus wirkt, durch den die Funktion des Gens in vivo ohne irgendwelche Mutationen in der Basensequenz des Gens verlorengeht. Ferner wurde die Gen-Stilllegung als Ursache des Verlusts von Funktionen von vielen Tumor-Supressorgenen in menschlichen Krebszellen interpretiert.
Es wurde bestätigt, dass eine anomale Methylierung/Demethylierung in den Promotor-CpG-Inseln die Expression von Tumor-Supressorgenen, DNA-Reparaturgenen, Genen, die den Zellzyklus regulieren, und dergleichen unterbricht, da diese Gene in verschiedenen Krebsarten hypermethyliert werden. Insbesondere ist es bekannt, dass die Hypermethylierung in einer Promotorregion eines bestimmten Gens in der frühen Stufe der Karzinogenese stattfindet. Daher ist die Promotor-Methylierung von mit einem Tumor zusammenhängenden Genen ein wichtiger Indikator für Krebs, der in verschiedenen Gebieten verwendet werden kann, wie z.B. bei Frühdiagnosen von Krebs, der Vorhersage eines karzinogenen Risikos, der Vorhersage einer Krebsprognose, einer Nachsorgestudie nach einer Behandlung, der Vorhersage des Ansprechens auf eine Chemotherapie und dergleichen. In den letzten Jahren wurden intensive Versuche unternommen, Untersuchungen unter Verwendung von Verfahren, wie z.B. eines Hydrogensulfit-Sequenzierens, einer kombinierten Hydrogensulfit-Restriktionsanalyse (COBRA), eines Pyrosequenzierens, einer methylierungsspezifischen Polymerasekettenreaktion (methylierungsspezifische PCR: MSP) und dergleichen durchzuführen, um diese in der Krebsdiagnose und im Krebsscreening und dergleichen zu verwenden. Insbesondere wurde ein intensiver Versuch unternommen, die Promotor-Methylierung von mit einem Tumor zusammenhängenden Genen in Blut, Sputum, Speichel, Stuhl, Urin oder dergleichen zu untersuchen, um sie in verschiedenen Krebsbehandlungen zu verwenden.
Ein Verfahren des Behandelns eines Gens mit Hydrogensulfit und einem methylierungsspezifischen Enzym, das durch Forscher am gebräuchlichsten verwendet wird, um eine DNA-Methylierung zu prüfen und eine MSP durchzuführen, ist ein Verfahren, bei dem ein Methylierungszustand von einzelnen Cytosinen in DNA mittels der Tatsache bestätigt wird, dass das Gen mit Hydrogensulfit behandelt wird, so dass nicht-methylierte Cytosine in Uracile umgewandelt werden und bereits methylierte 5-Methylcytosine so, wie sie sind, beibehalten werden, jedoch weist es Beschränkungen bezüglich der Anzahl von Genen und der Anzahl von Proben auf, die auf einmal untersucht werden können, und es weist einen Nachteil dahingehend auf, dass es eine große Menge von DNA während des Nachweises erfordert, da 90 % oder mehr der genomischen DNA abgebaut werden, wenn sie mit Hydrogensulfit behandelt wird. Ferner weist es Probleme dahingehend auf, dass es schwierig ist, Primer für den Nachweis gemäß dem Umwandlungsverhältnis oder der Umwandlungseffizienz von Cytosin zu Uracil zu gestalten, und die Nachweisergebnisse aufgrund eines nicht-spezifischen Bindens der Primer schlecht reproduzierbar sind.
Darüber hinaus können Fehler bei der Umwandlung in Thymin und dergleichen auftreten, da nicht-methyliertes Cytosin nicht in Uracil umgewandelt wird oder 5-Methylcytosin so, wie es ist, beibehalten wird, selbst wenn DNA mit Hydrogensulfit behandelt wird. Ein Verfahren zum Nachweisen einer DNA-Methylierung, das eine Hydrogensulfitbehandlung erfordert, weist aufgrund solcher Fehler ein Problem dahingehend auf, dass es falsch-positive Ergebnisse zeigt, was zu einer schlechten Genauigkeit, Spezifität, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit führt.
Ferner ist eine Peptidnukleinsäure (PNA) eine Pseudo-DNA, an der eine Nukleobase mittels einer Peptidbindung und nicht mittels Zucker- und Phosphatbindungen gebunden ist, und 1991 wurde zuerst darüber berichtet. Eine PNA ist eine künstliche Nukleinsäure, die durch ein chemisches Verfahren synthetisiert wird und in der Natur nicht vorkommt. Die PNA weist eine bekannte gemeinsame Struktur auf, in der N-(2-Aminoethyl)glycin(N-(2-aminoethyl)glycin)-Einheiten wiederholt über eine Amidbindung verbunden sind, so dass ein N-(2-Aminoethyl)glycin-Grundgerüst gebildet wird, und das Grundgerüst wird mit natürlichen Nukleinsäuren mit einer komplementären Basensequenz hybridisiert, so dass ein Doppelstrang gebildet wird, da das Grundgerüst Nukleinsäurebasen, wie z.B. Purinbasen (A und G) und Pyrimidinbasen (C und T) aufweist.
Wenn ein PNA/DNA-Doppelstrang die gleiche Länge wie ein DNA/DNA-Doppelstrang aufweist, ist der PNA/DNA-Doppelstrang stabiler als der DNA/DNA-Doppelstrang und weist ein überlegenes Vermögen zum Nachweisen von SNP verglichen mit den natürlichen Nukleinsäuren auf, da der DNA/DNA-Doppelstrang aufgrund des Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) einen hohen Grad an Instabilität aufweist. Eine PNA ist nicht nur chemisch stabil, sondern auch biologisch stabil, da sie durch Nukleasen oder Proteasen nicht abgebaut wird.
Forschungen unter Verwendung der Eigenschaften von PNA, die gegen biologische Enzyme auf diese Weise stabil ist, wurden durchgeführt. Ein Beispiel ist deren Verwendung als Sonde. Beispielsweise kann eine PNA-Sonde in verschiedenen Nachweisverfahren durch Einstellen der Hybridisierungseffizienz zwischen der PNA-Sonde und Ziel-Nukleinsäuren verwendet werden.
Daher haben die vorliegenden Erfinder zum Lösen der vorstehend genannten Probleme der herkömmlichen Verfahren eine PNA-Sonde, die eine DNA-Methylierung ohne irgendeine Behandlung mit Hydrogensulfit in dem Verfahren zum Nachweisen einer DNA-Methylierung einfach nachweisen kann, und ein Verfahren zum Nachweisen einer DNA-Methylierung unter Verwendung der PNA-Sonde gestaltet.
[Offenbarung]
[Technisches Problem]
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen PNA-Oligomers, das eine Genmethylierung ohne Vorbehandlung mit Hydrogensulfit nachweisen kann, und einer PNA-Sonde zum Nachweisen eines methylierten Gens.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweisen des Vorliegens einer Genmethylierung ohne Amplifizierung eines Gens unter Verwendung einer PNA-Sonde ohne Vorbehandlung mit Hydrogensulfit oder durch selektives Amplifizieren einer nicht-methylierten DNA, während eine Amplifizierung einer methylierten DNA unterdrückt wird, um eine Differenz einer Zyklusschwelle (Ct) zwischen jeweiligen PCR-Produkten zu nutzen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Kits zum Nachweisen des Vorliegens einer Genmethylierung ohne Amplifizierung eines Gens unter Verwendung einer neuen PNA-Sonde oder durch selektives Amplifizieren einer nicht-methylierten DNA, während eine Amplifizierung einer methylierten DNA unterdrückt wird, um eine Differenz von Ct zwischen jeweiligen PCR-Produkten zu nutzen.
[Technische Lösung]
In einem allgemeinen Aspekt ist ein Peptidnukleinsäure (PNA)-Oligomer durch die folgende Formel 1:
dargestellt, wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in das PNA-Oligomer einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der hydrophobe Substituent der Formel 1 jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₃₀-Arylgruppe, einer C₃-C₃₀-Heteroarylgruppe, einer Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, und einer Kombination davon ausgewählt, ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) des hydrophoben Substituenten kann oder können durch ein Halogenelement ersetzt sein, ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) der Alkylgruppe, der Alkenylgruppe oder der Alkinylgruppe kann oder können durch O oder S ersetzt sein und die Heteroarylgruppe kann eines oder mehrere, ausgewählt aus B, N, O, S, P(=O), Si und P, umfassen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 ein oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe und einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, umfassen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine C₈-C₁₈-Alkylgruppe sein.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (lle), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe), Cystein (Cys), Methionin (Met), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Threonin (Thr) und Tryptophan (Trp), umfassen.
In einem weiteren allgemeinen Aspekt ist eine PNA-Sonde zum Nachweisen eines methylierten Gens durch die folgende Formel 1:
dargestellt, wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in das PNA-Oligomer einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in der PNA-Sonde zum Erfassen einer Genmethylierung der hydrophobe Substituent der Formel 1 jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₃₀-Arylgruppe, einer C₃-C₃₀-Heteroarylgruppe, einer Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, und einer Kombination davon ausgewählt, ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) des hydrophoben Substituenten kann oder können durch ein Halogenelement ersetzt sein, ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) der Alkylgruppe, der Alkenylgruppe oder der Alkinylgruppe kann oder können durch O oder S ersetzt sein und die Heteroarylgruppe kann eines oder mehrere, ausgewählt aus B, N, O, S, P(=O), Si und P, umfassen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 ein oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe und einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, umfassen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine C₈-C₁₈-Alkylgruppe sein.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (lle), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe), Cystein (Cys), Methionin (Met), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Threonin (Thr) und Tryptophan (Trp), umfassen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die PNA-Sonde ferner eines, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Reporter und einem Quencher oder einer Kombination von zwei davon, umfassen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die PNA-Sonde einen Reporter, der an das C-Ende davon gebunden ist, und einen Quencher, der an das N-Ende davon gebunden ist, umfassen, oder kann einen Reporter, der an das N-Ende davon gebunden ist, und einen Quencher, der an das C-Ende davon gebunden ist, umfassen.
In einem weiteren allgemeinen Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens unter Verwendung der PNA-Sonde bereitgestellt.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform kann das Verfahren zum Nachweisen eines methylierte Gens umfassen: Herstellen eines ersten Gemischs, das ein nicht-methyliertes Gen und eine PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und die spezifisch an eine Basensequenz des nicht-methylierten Gens binden kann, umfasst; Herstellen eines zweiten Gemischs, das ein Zielgen für die Methylierungsanalyse, das die gleiche Basensequenz wie die Basensequenz des nicht-methylierten Gens umfasst, und die PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist, umfasst; Ändern der Temperaturen des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs; und Analysieren einer Schmelzkurve durch Messen der Schmelztemperaturen (Tm) des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs gemäß der Temperaturänderung:
wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in die PNA-Sonde einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Analysieren der Schmelzkurve das Beurteilen eines zu methylierenden Gens umfassen, wenn angenommen wird, dass ΔTm größer als oder gleich 3 °C ist, wenn ΔTm gemessen wird, und ΔTm die folgende Gleichung erfüllt: ΔTm = Tm (Zielgen für die Methylierungsanalyse) - Tm (nicht-methyliertes Gen, das die gleiche Basensequenz wie das Zielgen für die Methylierungsanalyse umfasst).
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens das Herstellen eines ersten Gemischs, das ein nicht-methyliertes Gen und eine PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und die spezifisch an eine Basensequenz des nicht-methylierten Gens binden kann, umfasst; Herstellen eines zweiten Gemischs, das ein Zielgen für die Methylierungsanalyse, das die gleiche Basensequenz wie die Basensequenz des nicht-methylierten Gens umfasst, und die PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist, umfasst; Unterziehen des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs einer Polymerasekettenreaktion (PCR); und Messen eines Zyklusschwelle (ΔCt)-Werts der PCR umfassen. In diesem Fall erfüllt der Zyklusschwelle (ΔCt)-Wert die folgende Gleichung: ΔCt = Ct (Zielgen für die Methylierungsanalyse) - Ct (nicht-methyliertes Gen, das die gleiche Basensequenz wie das Zielgen für die Methylierungsanalyse umfasst).
In einem weiteren allgemeinen Aspekt umfasst ein Kit zur Verwendung in dem Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens eine PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und die spezifisch an eine Basensequenz eines Gens binden kann, dessen Methylierung stattfinden kann:
wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in die PNA-Sonde einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können.
In einem weiteren allgemeinen Aspekt umfasst ein Verfahren zum Nachweisen einer Genmethylierung das Mischen der PNA-Sonde zum Nachweisen einer Genmethylierung mit einer biologischen Probe zum Hybridisieren der PNA-Sonde mit einem Zielgen, das in der biologischen Probe enthalten ist; Anwenden von Wärme auf das resultierende Gemisch bei einer Temperatur, die höher ist als eine Schmelztemperatur (Tm) eines Hybrids eines nicht-methylierten Gens und der PNA-Sonde und niedriger als diejenige eines Hybrids eines methylierten Gens und der PNA-Sonde ist; und Entfernen des Hybrids des nicht-methylierten Gens und der PNA-Sonde, das bei der Temperatur geschmolzen ist, wobei die Genmethylierung durch ein durch eine Bildgebung erfasstes Fluoreszenzsignal des Hybrids des methylierten Gens und der PNA-Sonde nachgewiesen wird.
[Vorteilhafte Effekte]
Das Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Vorliegen einer Genmethylierung in einer kurzen Zeit selbst ohne irgendein Verfahren zum Amplifizieren eines Gens unter Verwendung eines Schmelzkurvenanalyseverfahrens nachweisen. Ferner kann eine Spur eines methylierten Gens, das in einer Probe enthalten ist, mit einer hervorragenden Empfindlichkeit und Spezifität unter Verwendung von ΔTm selbst ohne eine Amplifizierung des Gens nachgewiesen werden.
Als weiterer Effekt gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Vorliegen einer Methylierung eines Zielgens unter Verwendung einer Differenz zwischen einem Ct-Wert für die Amplifizierungseffizienz des entsprechenden Gens und dem entsprechenden Ct-Wert des nicht-methylierten Gens durch Binden der PNA an eine methylierte Sequenz eines Zielgens zum selektiven Unterdrücken einer Amplifizierung der methylierten DNA nachgewiesen werden. Andererseits kann das Vorliegen einer Methylierung eines Zielgens durch eine ΔΔCt (ΔΔCt = nicht-Methyl-ΔCt - Methyl-ΔCt)-Analyse unter Verwendung eines Ct-Werts des methylierten Gens und eines Ct-Werts (Methyl-ΔCt) eines internen Kontrollgens (beta-Actin, GAPDH oder dergleichen) und einer Differenz des Ct-Werts (nicht-Methyl-ΔCt) zwischen dem nicht-methylierten Gen und dem internen Kontrollgen nachgewiesen werden.
Ferner kann das Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens gemäß der vorliegenden Erfindung ein methyliertes Gen unter Verwendung lediglich eines einstufigen Verfahrens ohne Vorbehandlung mit Hydrogensulfit einfach nachweisen und kann das Vorliegen einer Methylierung mit einer hohen Genauigkeit nachweisen, da es unwahrscheinlich ist, dass während des Methylierungsnachweises aufgrund der Behandlung mit Hydrogensulfit ein Fehler auftritt.
Ferner kann das Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens gemäß der vorliegenden Erfindung das Vorliegen einer Methylierung durch eine Bildgebungstechnik unter Verwendung eines fluoreszierenden Materials ohne ein Verfahren zum Amplifizieren eines Gens mittels PCR nachweisen. Die Methylierung kann durch die Intensität und Verteilung des durch eine Bildgebung erfassten Fluoreszenzsignals quantitativ nachgewiesen werden.
Figurenliste

1 ist ein Graph, der Schmelzkurven für das Vergleichsbeispiel 1 (A) und das Beispiel 1 (B) der vorliegenden Erfindung zeigt.
2 ist ein Graph, der die Ergebnisse von PCR-Amplifizierungskurven für einen Methylierungsnachweis für das Beispiel 2 (A) und das Vergleichsbeispiel 2 (B) der vorliegenden Erfindung zeigt.
3 ist ein schematisches Diagramm, das eine Technik zum Unterscheiden des Vorliegens einer Methylierung für Beispiele und Vergleichsbeispiele der vorliegenden Erfindung zeigt.

[Bester Modus]
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung detailliert beschrieben. Falls nichts Anderes festgelegt ist, weisen die in dieser Beschreibung verwendeten Begriffe bzw. Ausdrücke die gleiche Bedeutung auf, wie sie üblicherweise von einem Fachmann in dem Fachgebiet, zu dem die vorliegende Erfindung gehört, verstanden wird. Die Zeichnungen und Ausführungsformen dieser Beschreibung werden für einen Fachmann für ein leichtes Verständnis und eine einfache Ausführung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt und folglich kann gegebenenfalls ein Inhalt, der in unnötiger Weise den Gegenstand der vorliegenden Erfindung unklar machen könnte, von den Zeichnungen und Ausführungsformen weggelassen sein. Dabei ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Zeichnungen und Ausführungsformen beschränkt.
Der hier verwendete Begriff „Methylierung“ bezieht sich auf einen Vorgang des Bindens einer Methylgruppe an Basen, die ein Gen bilden. Vorzugsweise bezieht sich das Vorliegen einer Methylierung, wie hier verwendet, auf das Vorliegen einer Methylierung, die an Cytosin an einer bestimmten CpG-Stelle eines bestimmten Gens stattfindet.
Der hier verwendete Begriff „Epi-sPNA“ (Epigenom-spezifische PNA) kann sich auf eine PNA beziehen, die mit einer Methylgruppe von methyliertem Cytosin eines Zielgens eine Wechselwirkung eingehen kann, d.h., eine PNA, die durch Binden eines hydrophoben Substituenten an einer vorgegebenen Position modifiziert ist.
Ein PNA-Oligomer, wie hier verwendet, kann sich auf ein Polymer beziehen, das durch Polymerisieren von zwei oder mehr PNA-Monomeren mittels einer Peptidbindung erhalten wird.
Der hier verwendete Ausdruck „spezifisches Binden“ kann sich auf ein komplementäres Binden von 70 % oder mehr einer Basensequenz von PNA an ein methyliertes und nicht-methyliertes Gen beziehen und kann sich vorzugsweise auf ein komplementäres Binden von 80 % oder mehr, mehr bevorzugt 90 % oder mehr und insbesondere 95 % oder mehr einer Basensequenz von PNA an ein methyliertes und nicht-methyliertes Gen beziehen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Peptidnukleinsäure (PNA)-Oligomer bereit, das durch die folgende Formel 1:
dargestellt ist, wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in die PNA-Sonde einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können. Vorzugsweise kann n eine ganze Zahl im Bereich von 8 bis 24 sein, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Insbesondere können die nicht-natürlichen Nukleobasen Purin, 2,6-Diaminopurin, 7-Desazaadenin, 7-Desazaguanin, N⁴N⁴-Ethanocytosin, N⁶N⁶-Ethano-2,6-diaminopurin, 5-Methylcytosin, 5-(C₃-C₆)-Alkanyluracil, 5-(C₃-C₆)-Alkinylcytosin, 5-Fluoruracil und Pseudoisocytosin umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Das PNA-Oligomer gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einer Form vorliegen, in der ein hydrophober Substituent an eine bestimmte Position des Grundgerüsts von PNA gebunden ist, d.h., es kann in einer Form vorliegen, in der ein hydrophober Substituent an die Gamma-Position, das N-Ende, das C-Ende oder beide Enden des basischen Grundgerüsts der PNA gebunden ist, vorzugsweise in einer Form, in der ein hydrophober Substituent an die Gamma-Position des basischen Grundgerüsts der PNA gebunden ist. Mindestens ein hydrophober Substituent kann kontinuierlich oder diskontinuierlich an die PNA-Sonde gebunden sein.
Der hydrophobe Substituent der Formel 1 gemäß der vorliegenden Erfindung ist jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₃₀-Arylgruppe, einer C₃-C₃₀-Heteroarylgruppe, einer Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, und einer Kombination davon, ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) des hydrophoben Substituenten kann oder können durch ein Halogenelement ersetzt sein, ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) der Alkylgruppe, der Alkenylgruppe oder der Alkinylgruppe kann oder können durch O oder S ersetzt sein und die Heteroarylgruppe kann eines oder mehrere, ausgewählt aus B, N, O, S, P(=O), Si und P, umfassen.
Insbesondere kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₁₈-Arylgruppe und einer C₄-C₁₅-Heteroarylgruppe, umfassen, und die Heteroarylgruppe kann vorzugsweise N umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Insbesondere kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₆-C₂₀-Alkylgruppe, einer C₆-C₂₀-Alkenylgruppe und einer C₆-C₂₀-Alkinylgruppe umfassen. Der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 kann vorzugsweise aus einer C₈-C₁₈-Alkylgruppe, einer C₈-C₁₈-Alkenylgruppe oder einer C₈-C₁₈-Alkinylgruppe ausgewählt werden. Die hydrophoben Substituenten sind jedoch nicht speziell beschränkt, solange sie an das Grundgerüst von PNA binden können, so dass eine hydrophobe Wechselwirkung mit Methylgruppen induziert wird.
Der hydrophobe Substituent, der an der Gamma-Position, einem Ende oder beiden Enden des PNA-Oligomers gebunden ist, kann eine Bindungskraft zu einem Zielgen ohne irgendeine sterische Hinderung durch eine hydrophobe Wechselwirkung mit Methylgruppen des Zielgens erhöhen.
Ferner kann die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (IIe), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe), Cystein (Cys), Methionin (Met), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Threonin (Thr) und Tryptophan (Trp), umfassen. Vorzugsweise kann die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (lle), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe) und Cystein (Cys), umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen einer hydrophoben Gruppe, die an eine Seitenkette der Aminosäure gebunden ist, und einer Methylgruppe, die an das methylierte Gen gebunden ist, kann verglichen mit dem nicht-methylierten Gen eine stärkere intermolekulare Bindungskraft aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Peptidnukleinsäure (PNA)-Sonde zum Nachweisen eines methylierten Gens bereit, die durch die folgende Formel 1:
dargestellt ist, wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in die PNA-Sonde einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können. Vorzugsweise kann n eine ganze Zahl im Bereich von 8 bis 24 sein, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Der hydrophobe Substituent der Formel 1 ist jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₃₀-Arylgruppe, einer C₃-C₃₀-Heteroarylgruppe, einer Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, und einer Kombination davon, ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) des hydrophoben Substituenten kann oder können durch ein Halogenelement ersetzt sein, ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) der Alkylgruppe, der Alkenylgruppe oder der Alkinylgruppe kann oder können durch O oder S ersetzt sein und die Heteroarylgruppe kann eines oder mehrere, ausgewählt aus B, N, O, S, P(=O), Si und P, umfassen.
Insbesondere kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₁₈-Arylgruppe und einer C₄-C₁₅-Heteroarylgruppe, umfassen, und die Heteroarylgruppe kann vorzugsweise N umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Insbesondere kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₆-C₂₀-Alkylgruppe, einer C₆-C₂₀-Alkenylgruppe und einer C₆-C₂₀-Alkinylgruppe umfassen. Der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 kann vorzugsweise aus einer C₈-C₁₈-Alkylgruppe, einer C₈-C₁₈-Alkenylgruppe oder einer C₈-C₁₈-Alkinylgruppe ausgewählt werden. Die hydrophoben Substituenten sind jedoch nicht speziell beschränkt, solange sie an das Grundgerüst von PNA binden können, so dass eine hydrophobe Wechselwirkung mit Methylgruppen induziert wird.
Die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, kann jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (IIe), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe), Cystein (Cys), Methionin (Met), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Threonin (Thr) und Tryptophan (Trp), umfassen. Vorzugsweise kann die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (IIe), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe) und Cystein (Cys), umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen einer hydrophoben Gruppe, die an eine Seitenkette der Aminosäure gebunden ist, und einer Methylgruppe, die an das methylierte Gen gebunden ist, kann verglichen mit dem nicht-methylierten Gen eine stärkere intermolekulare Bindungskraft zeigen.
Der hydrophobe Substituent, der an der Gamma-Position, einem Ende oder beiden Enden der PNA-Sonde gebunden ist, kann eine Bindungskraft zu einem Zielgen ohne irgendeine sterische Hinderung durch eine hydrophobe Wechselwirkung mit Methylgruppen des Zielgens erhöhen.
Der Ausdruck „zum Nachweisen eines methylierten Gens“ bedeutet, dass ein Grad der Methylierung eines Gens zum Diagnostizieren von Krebs in einem frühen Stadium gemessen werden kann oder als Teil eines Gentests zum Vorhersagen eines Musters des Fortschreitens von Krebs und zum Vorhersagen des Ansprechens auf Arzneistoffe verwendet werden kann.
Daher kann das methylierte Gen eine krebsspezifische methylierte DNA sein, wie z.B. p14, p16 oder Cyclin D, die an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist, Twist oder E-Cadherin, die an der Zelladhäsion beteiligt ist, MGMT oder h-MLH, die an der DNA-Reparatur beteiligt ist, oder RASSF1α, DAPK, HIN-1 oder RARβ, die an einem Zellsignalgebungsweg beteiligt ist, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Der Krebs kann einer sein, der aus der Gruppe, bestehend aus Brustkrebs, Prostatakrebs, Blasenkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Pankreaskrebs, akuter promyelocytischer Leukämie, Eierstockkrebs, Gehirntumor, Kopf- und Halskarzinom, Melanom, Myelom, Lymphom, Magenkrebs, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Leberkrebs, Speiseröhrenkrebs, Dünndarmkrebs, Endometriumkarzinom, Nierenkrebs, Hautkrebs, Knochenkrebs, Schilddrüsenkrebs und Rückenmarktumor, ausgewählt ist, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Die PNA-Sonde zum Nachweisen eines methylierten Gens gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit einem Gen mit einer komplementären Basensequenz zur Bildung eines Doppelstrangs hybridisieren. Ein PNA/DNA-Doppelstrang ist stabiler als ein DNA/DNA-Doppelstrang. Dies ist darauf zurückzuführen, dass ein DNA/DNA-Doppelstrang eine Abstoßungskraft von negativen Ladungen aufgrund der basischen Grundgerüststruktur von negativ geladener DNA aufweist, wohingegen eine Bindungskraft durch die Abstoßungskraft nicht aufgehoben wird, da die PNA elektrisch neutral ist.
Die PNA-Sonde zum Nachweisen eines methylierten Gens gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf dem Prinzip beruhen, dass sie die Bindungsstabilität an einem methylierten Zielgen weiter erhöht, so dass eine Amplifizierung des Zielgens gehemmt wird, und eine relativ schwache Bindungskraft an einem nicht-methylierten Gen aufweist, so dass das nicht-methylierte Gen amplifiziert wird.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt und ein methyliertes Gen kann ohne Amplifizierung des Gens unter Verwendung eines ΔTm-Werts nachgewiesen werden, der die Differenz zwischen einer Bindungskraft der PNA-Sonde an dem methylierten Zielgen und einer Bindungskraft der PNA-Sonde an dem nicht-methylierten Gen wiederspiegelt.
Insbesondere Guaninbasen der PNA binden an Cytosinbasen entsprechend ihrer komplementären Basen und das komplementäre Binden bildet eine starke intermolekulare Anziehung, wenn eine Guanin- oder Cytosinbase an drei Wasserstoffatome bindet. In diesem Fall ist das methylierte Cytosin ein Cytosinrest, dessen Methylgruppe an das fünfte Kohlenstoffatom eines Pyrimidinrings gebunden ist, wobei die Methylgruppe als Elektronendonorgruppe (EDG) dient, so dass das methylierte Cytosin eine stärkere Wasserstoffbindung mit einer Guaninbase bilden kann, die komplementär zu dem methylierten Cytosin ist.
Die PNA-Sonde zum Nachweisen eines methylierten Gens gemäß der vorliegenden Erfindung kann verglichen mit dem nicht-methylierten Cytosin nicht nur eine stärkere Wasserstoffbindung mit dem methylierten Cytosin bilden, sondern kann verglichen mit der normalen Form einer PNA auch eine stärkere intermolekulare Wechselwirkung mit dem methylierten Cytosin als eine modifizierte PNA bilden, an der ein hydrophober Substituent gebunden ist. Beispielsweise kann, da die Methylgruppe hydrophobe Eigenschaften aufweist, Cytosin, an das die Methylgruppe gebunden ist, eine hydrophobe Wechselwirkung mit der PNA-Sonde induzieren, an die der hydrophobe Substituent gebunden ist, so dass eine stärkere intermolekulare Anziehung mit einer Wasserstoffbindung zwischen Cytosin und Guanin ausgebildet wird.
Die PNA-Sonde kann ferner eines, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Reporter und einem Quencher oder einer Kombination von zwei davon, umfassen. Als bevorzugtes Beispiel kann die PNA-Sonde eine PNA-Sonde, die einen Reporter, der an das C-Ende davon gebunden ist, und einen Quencher, der an das N-Ende davon gebunden ist, umfasst, oder eine PNA-Sonde sein, die einen Reporter, der an das N-Ende davon gebunden ist, und einen Quencher, der an das C-Ende davon gebunden ist, umfasst.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Reporter ein Fluoreszenzdonor, der Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 400 nm bis 800 nm emittiert, und kann einen oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fluorescein, Fluoresceinchlortriazinyl, Rhodamingrün, Rhodaminrot, Tetramethylrhodamin, FITC, Oregongrün, Alexa-Fluor, FAM (6-Carboxyfluorescein), Texasrot, HEX (2,4,5,7-Tetrachlor-6-carboxy-4,7-dichlorfluorescein), JOE, ROX, TET, TRITC, TEMRA, CY3 und CY5, umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Quencher ein Fluoreszenzakzeptor, der Lichtenergie von dem Reporter absorbiert, und kann einen oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin), Eclipse, DDQ, QSY, BlackBerry^®-Quencher, BHQ1, BHQ2, Dabcyl (4,4-Dimethylaminoazobenzol-4-carbonsäure), lowaschwarz, FQ und IRDye^® QC-1, umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Da die PNA-Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung eines, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Reporter und einem Quencher oder einer Kombination von zwei davon, umfasst, wird ein Fluoreszenzsignal erzeugt, wenn die PNA-Sonde mit einem nicht-methylierten Gen oder einem Zielgen für eine Methylierungsanalyse unter Bildung eines Hybrids hybridisiert wird. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die PNA-Sonde eines, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Reporter und einem Quencher oder einer Kombination von zwei davon, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt. Der Reporter oder Quencher kann an das nicht-methylierte Gen oder das Zielgen für eine Methylierungsanalyse gebunden sein.
Wenn eine Temperatur des Hybrids allmählich verändert wird, werden die PNA-Sonde und das Gen, die beide einen Doppelstrang aufweisen, bei einer geeigneten Schmelztemperatur rasch geschmolzen, so dass ein Fluoreszenzsignal gelöscht wird. In diesem Fall kann eine Temperatur in einem Moment, wenn das Fluoreszenzsignal gelöscht wird, als Tm bezeichnet werden. Das Vorliegen einer Genmethylierung kann durch Messen von ΔTm zwischen dem nicht-methylierten Gen und der PNA-Sonde oder ΔTm zwischen dem Zielgen für eine Methylierungsanalyse und der PNA-Sonde geprüft werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens einer Genmethylierung unter Verwendung der PNA-Sonde zum Nachweisen eines methylierten Gens bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens bereit, welches umfasst: Herstellen eines ersten Gemischs, das ein nicht-methyliertes Gen und eine PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und die spezifisch an eine Basensequenz des nicht-methylierten Gens binden kann, umfasst; Herstellen eines zweiten Gemischs, das ein Zielgen für die Methylierungsanalyse, das die gleiche Basensequenz wie die Basensequenz des nicht-methylierten Gens umfasst, und die PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist, umfasst; Ändern der Temperaturen des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs; und Analysieren einer Schmelzkurve durch Messen der Schmelztemperaturen (Tm) des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs gemäß der Temperaturänderung:
wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in die PNA-Sonde einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können. Vorzugsweise kann n eine ganze Zahl im Bereich von 8 bis 24 sein, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Der hydrophobe Substituent der Formel 1 ist jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₃₀-Arylgruppe, einer C₃-C₃₀-Heteroarylgruppe, einer Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, und einer Kombination davon, ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) des hydrophoben Substituenten kann oder können durch ein Halogenelement ersetzt sein, ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) der Alkylgruppe, der Alkenylgruppe oder der Alkinylgruppe kann oder können durch O oder S ersetzt sein und die Heteroarylgruppe kann eines oder mehrere, ausgewählt aus B, N, O, S, P(=O), Si und P, umfassen.
Insbesondere kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₁₈-Arylgruppe und einer C₄-C₁₅-Heteroarylgruppe, umfassen, und die Heteroarylgruppe kann vorzugsweise N umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Insbesondere kann der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₆-C₂₀-Alkylgruppe, einer C₆-C₂₀-Alkenylgruppe und einer C₆-C₂₀-Alkinylgruppe umfassen. Der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 kann vorzugsweise aus einer C₈-C₁₈-Alkylgruppe, einer C₈-C₁₈-Alkenylgruppe oder einer C₈-C₁₈-Alkinylgruppe ausgewählt werden. Die hydrophoben Substituenten sind jedoch nicht speziell beschränkt, solange sie an das Grundgerüst einer PNA binden können, so dass eine hydrophobe Wechselwirkung mit Methylgruppen induziert wird.
Die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, kann jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (lle), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe), Cystein (Cys), Methionin (Met), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Threonin (Thr) und Tryptophan (Trp), umfassen. Vorzugsweise kann die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (IIe), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe) und Cystein (Cys), umfassen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen einer hydrophoben Gruppe, die an eine Seitenkette der Aminosäure gebunden ist, und einer Methylgruppe, die an das methylierte Gen gebunden ist, kann verglichen mit dem nicht-methylierten Gen eine stärkere intermolekulare Bindungskraft zeigen.
Die Temperaturänderung kann in einem Bereich von 30 °C bis 95 °C, vorzugsweise in einem Bereich von 40 °C bis 90 °C liegen.
Das Schmelzen des Doppelstrangs kann aufgrund der Bildung der starken intermolekularen Anziehung zwischen dem methylierten Cytosin des Zielgens und der PNA-Sonde bei einer relativ hohen Temperatur erreicht werden. Insbesondere wird das Binden von Epi-sPNA an ein Gen mit nicht-methylierten Cytosinen lediglich über eine basische Wasserstoffbindung ausgeführt. Andererseits werden Epi-sPNA und ein Gen, das methylierte Cytosine umfasst, zusätzlich zu der basischen Wasserstoffbindung über eine hydrophobe Wechselwirkung gebunden. Als Ergebnis ist eine Differenz bei den Denaturierungstemperaturen zwischen der Wasserstoffbindung und der hydrophoben Wechselwirkung größer als oder gleich 3 °C. Daher kann, wenn gezeigt wird, dass ΔTm größer als oder gleich 3 °C ist, das Gen so beurteilt werden, dass es methyliert ist. Vorzugsweise kann die Differenz bei der Denaturierungstemperatur größer als oder gleich 5 °C, mehr bevorzugt größer als oder gleich 10 °C sein. Wenn das Gen methylierte Cytosine umfasst, wird die Denaturierungstemperatur aufgrund der stärkeren Bindungskraft höher. Diese Temperaturdifferenz kann abhängig von der Anzahl von methylierten Cytosinen variieren, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Schmelzkurvenanalyse unter Verwendung eines Fluoreszenz-Schmelzkurvenanalyse (FMCA)-Verfahrens durchgeführt werden, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Die Fluoreszenz-Schmelzkurvenanalyse kann durch Analysieren einer Schmelzkurve unter Verwendung eines fluoreszierenden Materials durchgeführt werden. In diesem Fall kann jedes der Gemische ferner ein Fluoreszenz-markiertes Material umfassen. Das Zielgen, das nicht-methylierte Gen oder die Epi-sPNA kann ein Fluoreszenz-markiertes Material umfassen. Vorzugsweise kann die Epi-sPNA ein Fluoreszenz-markiertes Material umfassen. Das Fluoreszenz-markierte Material kann eines, ausgewählt aus einem Reporter und einem Quencher oder einer Kombination von zwei davon, sein. Darüber hinaus kann das Fluoreszenz-markierte Material ein interkalierendes fluoreszierendes Material sein.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Reporter auf ein Material, das Licht mit einer bestimmten Wellenlänge zum Emittieren einer Fluoreszenz absorbiert und emittiert, d.h., ein Material, mit dem eine Sonde markiert wird, um zu prüfen, dass eine Ziel-Nukleinsäure mit der Sonde hybridisiert ist, und der Quencher bezieht sich auf ein Material, das Licht absorbiert, das von dem Reportermaterial emittiert wird, so dass die Fluoreszenzintensität vermindert wird.
Das interkalierende fluoreszierende Material kann aus der Gruppe, bestehend aus einem Acridin-Homodimer und Derivaten davon, Acridinorange und Derivaten davon, 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) und Derivaten davon, Actinomycin D und Derivaten davon, 9-Amino-6-chlor-2-methoxyacridin (ACMA) und Derivaten davon, DAPI und Derivaten davon, Dihydroethidium und Derivaten davon, Ethidiumbromid und Derivaten davon, einem Ethidium-Homodimer-1 (EthD-1) und Derivaten davon, einem Ethidium-Homodimer-2 (EthD-2) und Derivaten davon, Ethidiummonoazid und Derivaten davon, Hexidiumiodid und Derivaten davon, Bisbenzimid (Hoechst 33258) und Derivaten davon, Hoechst 33342 und Derivaten davon, Hoechst 34580 und Derivaten davon, Hydroxystilbamidin und Derivaten davon, LDS 751 und Derivaten davon, Propidiumiodid (PI) und Derivaten davon und Cy-Farbstoffderivaten, ausgewählt sein.
Insbesondere kann das Epi-sPNA einen Reporter und einen Quencher umfassen. Da die Epi-sPNA den Reporter und den Quencher umfasst, kann ein Fluoreszenzsignal nach dem Hybridisieren der Epi-sPNA mit einem Gen durch komplementäres Binden an das Gen erzeugt werden und das Fluoreszenzsignal wird gelöscht, wenn das komplementäre Binden der Epi-sPNA an das Gen bei einer Denaturierungstemperatur dissoziiert wird, wenn die Temperatur des hybridisierten Gemischs zunimmt. Das Vorliegen einer Genmethylierung kann durch die Schmelzkurveanalyse bestimmt werden, die aus dem Fluoreszenzsignal und dem gelöschten Signal gemäß dieser Temperaturänderung erhalten wird.
Die Temperatur jedes der Gemische kann von 30 °C bis 95 °C, vorzugsweise von 40 °C bis 90 °C bei einer Geschwindigkeit von 0,1 °C/s bis 20 °C/s, vorzugsweise bei einer Geschwindigkeit von 0,2 °C/s bis 15 °C/s und mehr bevorzugt bei einer Geschwindigkeit von 0,5 °C/s bis 10 °C/s geändert werden. Wenn die Temperatur von jedem der Gemische eine bestimmte Temperatur erreicht, werden die PNA/DNA-Doppelstränge durch eine Dissoziation des komplementären Bindens getrennt. In diesem Fall ist die Temperatur eine Schmelztemperatur (Tm) und die Schmelztemperatur kann durch das Verschwinden des Fluoreszenzsignals geprüft werden.
Das Analysieren der Schmelzkurve kann das Beurteilen eines zu methylierenden Gens umfassen, wenn angenommen wird, dass ΔTm größer als oder gleich 3 °C ist, wenn ΔTm gemessen wird. Vorzugsweise kann ΔTm größer als oder gleich 5 °C sein. Mehr bevorzugt kann ΔTm größer als oder gleich 10 °C sein. In diesem Fall erfüllt ΔTm die folgende Gleichung: ΔTm = Tm (Zielgen für eine Methylierungsanalyse) - Tm (nicht-methyliertes Gen, das die gleiche Basensequenz wie das Zielgen für eine Methylierungsanalyse umfasst). Da die Bindungskraft zwischen dem methylierten Cytosin und der Epi-sPNA stärker ist als die Bindungskraft zwischen dem nicht-methylierten Cytosin und der Epi-sPNA, wird die Schmelztemperatur höher, wenn die Epi-sPNA an das methylierte Cytosin gebunden wird.
Das Verfahren zum Nachweisen einer Genmethylierung gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht ein einfaches Nachweisen einer Genmethylierung lediglich durch Messen der Tm gemäß der Temperaturänderung von jedem der Gemische ohne Amplifizierung des Gens in dem Schritt des Messens der Tm gemäß der Temperaturänderung zum Analysieren einer Schmelzkurve.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens das Herstellen eines ersten Gemischs, das ein nicht-methyliertes Gen und eine PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und die spezifisch an eine Basensequenz des nicht-methylierten Gens binden kann, umfasst; Herstellen eines zweiten Gemischs, das ein Zielgen für die Methylierungsanalyse, das die gleiche Basensequenz wie die Basensequenz des nicht-methylierten Gens umfasst, und die PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist, umfasst; Unterziehen des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs einer Polymerasekettenreaktion (PCR); und Messen eines Zyklusschwelle (ΔCt)-Werts der PCR umfassen. In diesem Fall erfüllt der Zyklusschwelle (ΔCt)-Wert die folgende Gleichung: ΔCt = Ct (Zielgen für die Methylierungsanalyse) - Ct (nicht-methyliertes Gen, das die gleiche Basensequenz wie das Zielgen für die Methylierungsanalyse umfasst).
Das Gen-amplifizierte Produkt, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten wird, kann durch das interkalierende fluoreszierende Material bestimmt werden. Insbesondere nutzt eine Echtzeit-PCR (RT-PCR) einen Fluoreszenzfarbstoff zum Untersuchen der gesamten Reaktion. In diesem Fall nimmt der Fluoreszenzfarbstoff proportional zu, wenn sich das amplifizierte Produkt in jedem Amplifizierungszyklus ansammelt. Zu Beginn der Amplifizierung wird keine Zunahme der Fluoreszenz nachgewiesen, jedoch wird die akkumulierte Fluoreszenzintensität durch das Gerät nachgewiesen, wenn die Amplifizierungen für eine vorgegebene Anzahl oder mehr durchgeführt werden. Dann nimmt die Fluoreszenz signifikant zu, so dass eine Zunahme der Fluoreszenz über dem Hintergrundniveau nachgewiesen werden kann. Dabei wird die Anzahl der Amplifizierungszyklen als Zyklusschwelle (Ct) bezeichnet.
Insbesondere kann das Gen in der vorliegenden Erfindung mittels PCR amplifiziert werden. Die mit dem methylierten Gen hybridisierte Epi-sPNA-Sonde bindet aufgrund der starken Wirkung der intermolekularen Anziehung, die durch die Wasserstoffbindung und die hydrophobe Wechselwirkung verursacht wird, verglichen mit dem Fall, wenn die Epi-sPNA-Sonde mit dem nicht-methylierten Gen hybridisiert wird, stärker an das methylierte Gen. Als Ergebnis wird aufgrund der Hemmung der Genamplifizierung gefunden, dass der Ct-Wert hoch ist. D.h., das Vorliegen einer Methylierung kann durch Bestimmen eines ΔCt-Werts geprüft werden, der durch Subtrahieren eines Ct-Werts des gleichen Gens in einer Kontrollprobe von dem Ct-Wert eines Zielgens erhalten wird.
Gemäß dem Verfahren zum Nachweisen einer Genmethylierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann ΔCt größer als 0,5 sein. Vorzugsweise kann ΔCt größer als 1 sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit zur Verwendung in dem Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, das eine PNA-Sonde umfasst, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und die spezifisch an eine Basensequenz eines Gens binden kann, dessen Methylierung stattfinden kann:
wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in die PNA-Sonde einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können. Vorzugsweise kann n eine ganze Zahl im Bereich von 8 bis 24 sein, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht speziell darauf beschränkt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen einer Genmethylierung bereit, welches das Mischen der PNA-Sonde mit einer biologischen Probe zum Hybridisieren der PNA-Sonde mit einem Zielgen, das in der biologischen Probe enhalten ist; Anwenden von Wärme auf das resultierende Gemisch bei einer Temperatur, die höher ist als eine Schmelztemperatur (Tm) eines Hybrids eines nicht-methylierten Gens und der PNA-Sonde und niedriger ist als diejenige eines Hybrids eines methylierten Gens und der PNA-Sonde; und Entfernen des Hybrids des nicht-methylierten Gens und der PNA-Sonde, das bei der Temperatur geschmolzen ist, umfasst, wobei die Genmethylierung durch ein durch eine Bildgebung erfasstes Fluoreszenzsignal des Hybrids des methylierten Gens und der PNA-Sonde nachgewiesen wird.
Durch Nutzen einer Differenz bei der Bindungstemperatur zwischen der PNA-Sonde und dem methylierten Gen oder dem nicht-methylierten Gen kann eine biologische Probe, die Geweben und Zellen entspricht und die ein nachzuweisendes Gen umfasst, in vitro an die PNA-Sonde binden gelassen werden, die ein fluoreszierendes Material umfasst. Das Vorliegen einer Methylierung des Zielgens in der entsprechenden biologischen Probe kann durch Nachweisen eines Fluoreszenzsignals bei einer bestimmten Temperatur, bei der das Binden der PNA-Sonde an das methylierte Gen, das eine hohe Bindungstemperatur aufweist, beibehalten wird, und das Binden der PNA-Sonde an das nicht-methylierte Gen, das eine niedrige Bindungstemperatur aufweist, dissoziiert werden kann, nachgewiesen werden.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele davon beschrieben. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die folgenden Beispiele lediglich zur detaillierteren Beschreibung der vorliegenden Erfindung dienen, den Umfang der vorliegenden Erfindung jedoch nicht beschränken sollen.
[Modus für die Erfindung]
<Beispiel 1> Analyse der Bindungstemperatur einer Epi-sPNA-Sonde an eine nicht-methylierte oder methylierte Ziel-DNA
Eine Epi-sPNA-Sonde (0,1 µM; Seasun Biomaterials, Korea) mit SEQ ID NO: 2, ein nicht-methyliertes DNA-Oligomer (0,1 µM; Integrated DNA Technologies, USA) mit SEQ ID NO: 3, ein methyliertes DNA-Oligomer (0,1 µM; Integrated DNA Technologies, USA) mit SEQ ID NO: 4 und 10 µL einer 2X PCR-Amplifizierungslösung (Seasun Biomaterials, Korea) wurden 7 µL destilliertem Wasser zugesetzt und gemischt. Danach wurde das Gemisch bei 95 °C für 5 Minuten umgesetzt, auf 40 °C gekühlt und mit einer Geschwindigkeit von 2 °C/s um 1 °C von 40 °C bis 90 °C unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Geräts (CFX96™ Real-time PCR System, Bio-Rad, USA) erwärmt. Dann wurde eine Schmelzkurvenanalyse durch Messen des PCR-Produkts bei einer Fluoreszenzwellenlänge von 510 nm ohne einen Genamplifizierungsvorgang durchgeführt. Die in diesem Experiment verwendeten Sequenzen sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.
<Vergleichsbeispiel 1> Analyse der Bindungstemperatur von nicht-methylierter oder methylierter Ziel-DNA, die an eine normale PNA-Sonde gebunden ist

Dieses Experiment wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde die normale PNA-Sonde mit SEQ ID NO: 1 anstelle der Epi-sPNA-Sonde verwendet. [Tabelle 1]

SEQ ID NO	Sequenzbezeichnung	Sequenz (N' → C')	Anmerkung
1	PNA_1	Dabcyl-ACCCCGCGATCA-O-K(FAM)	Normale PNA
2	Epi-sPNA	Dabcyl-ACCCCG''CG''ATCA-O-K(FAM)	MS-PNA
3	DNA_UC	CCAGCTGCGCGTTGACCGCGGGGTCCGACATG ATGGCTGG	Nicht-methylierte Ziel-DNA
4	DNA_MC	CCAGCTGCGCGTTGACCGCGGGGTCCGACATG ATGGCTGG	Methylierte Ziel-DNA
G'': Guaninbase, die durch einen hydrophoben Substituenten modifiziert ist
C: Methylierte Cytosinbase
O: Linker
G: Base, die zu einer methylierten Cytosinbase komplementär ist
K: Lysin

Die 1A ist ein Graph, der die Ergebnisse für das Vergleichsbeispiel 1 zeigt, und die 1B ist ein Graph, der die Ergebnisse für das Beispiel 1 zeigt. Es zeigte sich, dass ΔTm in dem Fall des Vergleichsbeispiels 1 1 °C betrug und ΔTm in dem Fall des Beispiels 1, bei dem die Epi-sPNA-Sonde verwendet wurde, 13 °C betrug. Auf der Basis dieser Ergebnisse ist ersichtlich, dass die Empfindlichkeit und die Spezifität während des Nachweises der Methylierung beträchtlich verbessert werden konnten, da verglichen mit der nicht-modifizierten PNA eine stärkere Bindungskraft an der methylierten DNA auf die modifizierte Epi-sPNA angewandt wurde, an welcher der hydrophobe Substituent gebunden war.
<Beispiel 2> Analyse von ΔCt einer nicht-methylierten oder methylierten Ziel-DNA, die an eine Epi-sPNA-Sonde gebunden ist
Eine PCR-Amplifizierung wurde unter Verwendung von 45 ng genomischer DNA, DNA-Primern mit SEQ ID NO: 5 und 6 (0,1 µM), einer Epi-sPNA-Sonde mit SEQ ID NO: 2 (0,1 µM) und 10 µL einer 1X PCR-Amplifizierungslösung (Seasun Biomaterials, Korea) durchgeführt. Die PCR-Amplifizierungsbedingungen waren wie folgt. Das resultierende Gemisch wurde bei 95 °C für 5 Minuten umgesetzt, worauf insgesamt 25 Zyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, bei 58 °C für 30 Sekunden und bei 72 °C für 30 Sekunden durchgeführt wurden, und dann wurde bei 72 °C für 5 Minuten umgesetzt, wobei ein Echtzeit-PCR-Gerät (CFX96™ Real-time PCR System, Bio-Rad, USA) verwendet wurde. Dann wurde das Gemisch bei 72 °C für 5 Minuten umgesetzt.
Menschliche HCT116 DKO nicht-methylierte DNA (Cat# D5014-01, Zymo Research, USA) wurde als die nicht-methylierte Ziel-DNA verwendet, und menschliche HCT116 DKO methylierte DNA (Cat# D5014-02, Zymo Research, USA) wurde als die methylierte DNA verwendet.
<Vergleichsbeispiel 2> Analyse von ΔCt von nicht-methylierter oder methylierter Ziel-DNA unter Verwendung von grünem interkalierenden SYBR-Farbstoff
DNA und Primer wurden bei den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 2 verwendet und eine PCR wurde unter Verwendung eines grünen SYBR-Farbstoffs (1X) als interkalierenden Farbstoff anstelle der Epi-sPNA verwendet. Eine PCR wurde ebenfalls bei den gleichen PCR-Bedingungen wie im Beispiel 2 durchgeführt. [Tabelle 2]

SEQ ID NO Sequenzbezeichnung Sequenz (N' → C') Anmerkung

5 Sep_F GCCGCAGCAGCCAGCCA Vorwärtsprimer

6 SepR_C2 ACCAGCCATCATGTCGGACC Rückwärtsprimer
2A ist ein Graph, der die Ergebnisse von PCR-Amplifizierungskurven für den Nachweis einer DNA-Methylierung unter Verwendung der Epi-sPNA-Sonde zeigt. Dabei wurde gezeigt, dass der ΔCt-Wert 3 beträgt. Die 2B ist ein Graph, der die Ergebnisse von PCR-Amplifizierungskurven unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs zeigt. Dabei ist der ΔCt-Wert gemäß der Konzentration der Ziel-DNA normalisiert. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass der ΔCt-Wert 0 beträgt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass verglichen mit dem nicht-methylierten Gen die Amplifizierung des Zielgens aufgrund der starken Wechselwirkung mit methylierten Cytosinen gehemmt wurde, wenn die Epi-sPNA-Sonde verwendet wurde. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass das Vorliegen einer Genmethylierung durch Messen der ΔCt-Werte nachgewiesen werden konnte.

Claims

Peptidnukleinsäure (PNA)-Oligomer, das durch die folgende Formel 1:
dargestellt ist (wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in das PNA-Oligomer einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können).
PNA-Oligomer nach Anspruch 1, wobei der hydrophobe Substituent der Formel 1 jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₃₀-Arylgruppe, einer C₃-C₃₀-Heteroarylgruppe, einer Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, und einer Kombination davon ausgewählt ist, und ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) des hydrophoben Substituenten durch ein Halogenelement ersetzt sein kann oder können, ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) der Alkylgruppe, der Alkenylgruppe oder der Alkinylgruppe durch O oder S ersetzt sein kann oder können und die Heteroarylgruppe eines oder mehrere, ausgewählt aus B, N, O, S, P(=O), Si und P, umfasst.
PNA-Oligomer nach Anspruch 1, wobei der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe und einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, umfasst.
PNA-Oligomer nach Anspruch 1, wobei der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine C₈-C₁₈-Alkylgruppe ist.
PNA-Oligomer nach Anspruch 2, wobei die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (IIe), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe), Cystein (Cys), Methionin (Met), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Threonin (Thr) und Tryptophan (Trp), umfasst.
PNA-Sonde zum Nachweisen eines methylierten Gens, wobei die PNA-Sonde durch die folgende Formel 1:
dargestellt ist (wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in das PNA-Oligomer einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können).
PNA-Sonde nach Anspruch 6, wobei der hydrophobe Substituent der Formel 1 jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, einer C₆-C₃₀-Arylgruppe, einer C₃-C₃₀-Heteroarylgruppe, einer Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, und einer Kombination davon ausgewählt ist, und ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) des hydrophoben Substituenten durch ein Halogenelement ersetzt sein kann oder können, ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) der Alkylgruppe, der Alkenylgruppe oder der Alkinylgruppe durch O oder S ersetzt sein kann oder können und die Heteroarylgruppe eines oder mehrere, ausgewählt aus B, N, O, S, P(=O), Si und P, umfasst.
PNA-Sonde nach Anspruch 6, wobei der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer C₃-C₃₀-Alkylgruppe, einer C₃-C₃₀-Alkenylgruppe und einer C₃-C₃₀-Alkinylgruppe, umfasst.
PNA-Sonde nach Anspruch 6, wobei der hydrophobe Substituent von R₁ in der Formel 1 eine C₈-C₁₈-Alkylgruppe ist.
PNA-Sonde nach Anspruch 6, wobei die Aminosäure, die eine hydrophobe Gruppe umfasst, jeweils unabhängig eine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isoleucin (IIe), Valin (Val), Leucin (Leu), Phenylalanin (Phe), Cystein (Cys), Methionin (Met), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Threonin (Thr) und Tryptophan (Trp), umfasst.
PNA-Sonde nach Anspruch 6, die ferner eines, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Reporter und einem Quencher oder einer Kombination von zwei davon, umfasst.
PNA-Sonde nach Anspruch 6, die eine PNA-Sonde, die einen Reporter, der an das C-Ende davon gebunden ist, und einen Quencher, der an das N-Ende davon gebunden ist, umfasst, oder eine PNA-Sonde ist, die einen Reporter, der an das N-Ende davon gebunden ist, und einen Quencher, der an das C-Ende davon gebunden ist, umfasst.
Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens unter Verwendung der PNA-Sonde gemäß Anspruch 6.
Verfahren nach Anspruch 13, welches umfasst: Herstellen eines ersten Gemischs, das ein nicht-methyliertes Gen und eine PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und die spezifisch an eine Basensequenz des nicht-methylierten Gens binden kann, umfasst; Herstellen eines zweiten Gemischs, das ein Zielgen für die Methylierungsanalyse, das die gleiche Basensequenz wie die Basensequenz des nicht-methylierten Gens umfasst, und die PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist, umfasst; Ändern der Temperaturen des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs; und Analysieren einer Schmelzkurve durch Messen der Schmelztemperaturen (Tm) des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs gemäß der Temperaturänderung:
(wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in die PNA-Sonde einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können).
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Analysieren der Schmelzkurve das Beurteilen eines zu methylierenden Gens umfasst, wenn angenommen wird, dass ΔTm größer als oder gleich 3 °C ist, wenn ΔTm gemessen wird: $\begin{array}{l} [Δ Tm = {Tm}_{(Zielgen f \ddot{u} r die Methylierungsanalyse)} - {Tm}_{(nicht - methyliertes Gen, das die gleiche} \\ _{Basensequenz wie das Zielgen f \ddot{u} r die Methylierungsanalyse umfasst)}] . \end{array}$
Verfahren nach Anspruch 13, welches umfasst: Herstellen eines ersten Gemischs, das ein nicht-methyliertes Gen und eine PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und die spezifisch an eine Basensequenz des nicht-methylierten Gens binden kann, umfasst; Herstellen eines zweiten Gemischs, das ein Zielgen für die Methylierungsanalyse, das die gleiche Basensequenz wie die Basensequenz des nicht-methylierten Gens umfasst, und die PNA-Sonde, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist, umfasst; Unterziehen des ersten Gemischs und des zweiten Gemischs einer Polymerasekettenreaktion (PCR); und Messen eines Zyklusschwelle (ΔCt)-Werts der PCR: $\begin{array}{l} [Δ Ct = {Ct}_{(Zielgen f \ddot{u} r die Methylierungsanalyse)} - {Ct}_{(nicht - methyliertes Gen, das die gleiche} \\ _{Basensequenz wie das Zielgen f \ddot{u} r die Methylierungsanalyse umfasst)}] \end{array}$

(wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in die PNA-Sonde einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können).
Kit zur Verwendung in dem Verfahren zum Nachweisen eines methylierten Gens gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, das eine PNA-Sonde umfasst, die durch die folgende Formel 1 dargestellt ist und spezifisch an eine Basensequenz eines Gens binden kann, dessen Methylierung stattfinden kann:
(wobei R₁ ein hydrophober Substituent ist, R₂ Wasserstoff oder ein hydrophober Substituent ist, R₃ eine Hydroxylgruppe oder ein hydrophober Substituent ist, die Base jedwede Base, ausgewählt aus natürlichen oder nicht-natürlichen Nukleobasen, umfassend Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil, ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 30 ist und jeweilige Struktureinheiten, die in das PNA-Oligomer einbezogen sind, identisch oder voneinander verschieden sein können).
Verfahren zum Nachweisen einer Genmethylierung, umfassend: Mischen der PNA-Sonde gemäß Anspruch 11 mit einer biologischen Probe zum Hybridisieren der PNA-Sonde mit einem Zielgen, das in der biologischen Probe enthalten ist; Anwenden von Wärme auf das resultierende Gemisch bei einer Temperatur, die höher ist als eine Schmelztemperatur (Tm) eines Hybrids eines nicht-methylierten Gens und der PNA-Sonde und niedriger als diejenige eines Hybrids eines methylierten Gens und der PNA-Sonde ist; und Entfernen des Hybrids des nicht-methylierten Gens und der PNA-Sonde, das bei der Temperatur geschmolzen ist, wobei die Genmethylierung durch ein durch eine Bildgebung erfasstes Fluoreszenzsignal des Hybrids des methylierten Gens und der PNA-Sonde nachgewiesen wird.