DE112019003498T5

DE112019003498T5 - Mikrodurchflusselektroporationsgeräte und verfahren zur zelltransfektion

Info

Publication number: DE112019003498T5
Application number: DE112019003498.7T
Authority: DE
Inventors: Chih-Wei Chang
Original assignee: Nanocav LLC
Current assignee: Nanocav LLC
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2021-04-08
Also published as: AU2020311908A1; US20200017847A1; JP7185009B2; US11377652B2; CN112639112A; KR20210028687A; WO2020014264A1; KR102546174B1; WO2021007315A1; JP2021535738A; US20210348155A1; AU2020311908B2; AU2019301062A1; EP3818143A1; EP3818143B1; JP2023018085A

Abstract

Es werden Systeme und Verfahren zum Transfizieren von Zellen wie Säugetierzellen und Nichtsäugetierzellen unter Einsatz einer Elektroporationsvorrichtung mit Elektroporationskammer umfassend eine obere Mikromesh-Elektrode, eine untere Mikromesh-Elektrode und einen in der Elektroporationskammer definierten Pfad bereitgestellt. Die Elektroporationsvorrichtung umfasst einen ersten Einlass, der die Passage von Zellen in die Elektroporationskammer gestattet, und einen ersten Auslass, der die Passage von elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet. Der erste Einlass und der erste Auslass sind durch eine Offset-Distanz beabstandet.

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldungen
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität unter 35 U.S.C. §119(e) der U.S. Provisional Patent Application Serial No. 62/695,436 , eingereicht am 9. Juli 2018, deren gesamter Inhalt hiermit durch Verweis Bestand der vorliegenden Anmeldung ist.
Gebiet der Erfindung
Das Gebiet der Erfindung betrifft Transfektionsssysteme und -verfahren sowie insbesondere Elektroporationssysteme und -verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Die Hintergrundbeschreibung umfasst Informationen, die zum Verständnis der hier dargestellten Verfahren und Techniken von Nutzen sein können. Es ist kein Eingeständnis, dass es sich bei den hier angeführten Informationen um den Stand der Technik handelt oder sie für den hier dargestellten Gegenstand relevant sind oder dass es sich bei einer speziell oder implizit erwähnten Publikation um den Stand der Technik handelt.
Mittels Transfektion lassen sich Nukleinsäuren unter Bildung genetisch modifizierter Zellen in Zellen einschleusen. Zum Transfizieren von Zellen gibt es verschiedene physikalische, chemische und virale Methoden, einschließlich der Optoperforation, Methoden auf Polymerbasis unter Verwendung von Calciumphosphat, der Mikroinjektion, der Elektroporation, der viralen Transduktion und lipidvermittelten Methoden (z. B. unter Verwendung von Liposom-DNA-Komplexen).
Bei der Elektroporation setzt man eine Zelle einem kontrollierten elektrischen Gleichstrom(Direct Current, DC)-Impuls von relativ kurzer Dauer aus. Man nimmt an, dass der elektrische Impuls ein Transmembranpotential induziert, dass einen reversiblen Zusammenbruch der geordneten Struktur einer Zellmembran zur Folge hat, was zur Bildung von Poren in der Membran führt. Moleküle von Interesse können dann durch die Poren in die Zelle eindringen, bis sich die Poren schließen, typischerweise innerhalb von Millisekunden bis Sekunden. Die Porenbildung lässt sich durch Einstellen verschiedener Parameter, insbesondere der Spaltbreite (z. B. der Distanz zwischen parallelen Elektrodenplatten), der Wellenform des elektrischen Impulses, der elektrischen Feldstärke, der Temperatur und der Länge des elektrischen Impulses, steuern.
Die Elektroporation wird gewöhnlich im Labormaßstab eingesetzt (z. B. unter Verwendung von kleinen Küvetten mit einem Fassungsvermögen von etwa 0,5 ml), jedoch eignen sich solche Laborverfahren aufgrund mangelnder Effizienz und hoher Kosten nicht für eine Produktion von klinischer Qualität in großem Maßstab. Andere Transfektionsmethoden wie Verfahren auf Lipidbasis mit Lipofectamine 2000™ kommen ebenfalls häufig zur Anwendung, haben jedoch aufgrund hoher Kosten ähnliche Nachteile. Darüber hinaus sind Verfahren auf Lipidbasis für einige Zelltypen von klinischem Interesse, z. B. NK-Zellen wie haNK-Zellen, nicht gut geeignet. NK-Zellen wurden beispielsweise mit mRNA und Elektroporation transfiziert, um primäre NK-Zellen genetisch so zu manipulieren, dass sie chimäre Antigenrezeptoren (CARs - siehe Leuk Res. (2009) 33:1255-9) exprimieren oder Zytokine für die autokrine Wachstumsstimulation exprimieren (Cytotherapy (2008) 10:265-74). Es gibt kommerzielle Produkte wie Maxcyte für die Transfektion im Großmaßstab, z. B. Reaktionsgrößen von mehr als 1 ml, jedoch sind diese Produkte ebenfalls teuer und/oder sich haben keine Hochdurchsatzfähigkeit. In ähnlicher Weise sind diese kommerziellen Produkte nicht für die Transfektion von NK-Zellen optimiert, was häufig zu schlechten Ausbeuten und/oder Problemen mit geringer Zelllebensfähigkeit führt. Typische Elektroporationraten können 2-5% DNA-Transfektionseffizienz mit etwa 10-20% Zellviabilität liefern.
Bei herkömmlichen Techniken wird, wie in 1A gezeigt, die Elektroporation mit zwei parallelen Plattenelektroden durchgeführt. In dieser Konfiguration strömen die Zellen typischerweise zwischen den beiden parallelen Platten. Das elektrische Feld ist jedoch nicht einheitlich, wobei auf Zellen in der Mitte der Kammer, als (a) gezeigt, ein einheitlicheres elektrisches Feld einwirkt, während als Zellen in der Nähe einer Elektrode, als (b) gezeigt, ein nicht einheitliches elektrisches Feld einwirkt und insbesondere eine an der Grenze der Elektrode vorhandene Spitze des elektrischen Felds einwirkt. Bei anderen Techniken setzt man parallele Platten von Mikromesh-Elektroden ein, wie in 1B gezeigt (Selmeczi, D. et al., „Efficient large volume electroporation of dendritic cells through micrometer scale manipulation of flow in a disposable polymer chip", Biomed Microdevices, 13: 383-392 (2011)), wobei die Zellen zwischen einer oberen Mikromesh-Elektrode und einer unteren Mikromesh-Elektrode durchströmen. Diese Technik liefert ein einheitlicheres elektrisches Feld als der Durchgang zwischen zwei parallelen Elektrodenplatten, wie durch die ähnlichen Bahnlinien von Zellen in der Mitte der Kammer (a) und in der Nähe des Randes der Kammer (b) gezeigt, jedoch ist die Kammerbreite bzw. die Distanz zwischen der oberen Mikromesh-Elektrode und der unteren Mikromesh-Elektrode eingeschränkt, was eine geringe Transfektionseffizienz zur Folge hat. Bei den in 1A und 1B gezeigten Konfigurationen werden elektrische Feldstärken von etwa 1-1,3 kV/cm (z. B. 200 V/2 mm bei parallelen Platten, 40 V/400 um bei parallelen Mikromesh-Elektroden) verwendet.
Gemäß anderen Aspekten wurden zur Transfektion Einzelzellelektroporationschips verwendet. Bei dieser Technik kann ein Siliconchip mehrere lineare Kanäle umfassen, wobei sich in jedem Kanal auf gegenüberliegenden Seiten des Kanals plazierte entgegengesetzte Elektroden befinden. Die Zellen strömen durch den Kanal und werden einem elektrischen Feld ausgesetzt. Bei dieser Technik wurden DNA-Transfektionseffizienzen von etwa 68% mit Zellviabilitäten von etwa 79% erzielt.
Auch wenn es verschiedene Transfektionssysteme und -verfahren für Säugetierzellen gibt, so weisen solche Techniken jedoch ein oder mehrere Nachteile auf. Dementsprechend besteht immer noch ein Bedarf zur Verbesserung von Elektroporationssystemen und -verfahren, insbesondere für Hochdurchsatz-Herstellungsverfahren im Großmaßstab.
Kurze Darstellung der Erfindung
Die hier dargestellten Verfahren beziehen sich auf verschiedene Geräte, Systeme und Verfahren zur Elektroporation von Zellen wie zum Beispiel Säugetierzellen und Nichtsäugetierzellen für kontinuierliche Herstellungsverfahren im Großmaßstab. Insbesondere Systeme und Verfahren zur Elektroporation von Zellen mittels einer Elektroporationsvorrichtung mit einem durch eine Offset-Distanz von einem ersten Auslass beabstandeten ersten Einlass können hohe Effizienz und Viabilität liefern.
Gemäß einigen Aspekten wird ein Verfahren zur Elektroporation von Zellen mit einer Ladung bereitgestellt. Bei dem Verfahren strömen die Zellen mit der Ladung in eine Elektroporationskammer. Die Elektroporationskammer umfasst eine obere Mikromesh-Elektrode, eine untere Mikromesh-Elektrode und einen zwischen der oberen Mikromesh-Elektrode und der unteren Mikromesh-Elektrode definierten Pfad, auf dem die Zellen und die Ladung strömen können. Die obere Mikromesh-Elektrode und die untere Mikromesh-Elektrode sind jeweils porös. Darüber hinaus ist die obere Mikromesh-Elektrode von einem ersten Material gebunden und die untere Mikromesh-Elektrode von einem zweiten Material gebunden. Das erste Material umfasst einen ersten Einlass, der die Passage von Zellen in die Elektroporationskammer gestattet, und das zweite Material umfasst einen ersten Auslass, der die Passage von elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet. Der erste Einlass und der erste Auslass sind durch eine Offset-Distanz beabstandet. Weiterhin sind die Zellen in einem Elektroporationsmedium suspendiert.
Gemäß einem anderen Aspekt wird eine Vorrichtung zum Elektroporieren von Zellen mit einer Ladung bereitgestellt. Die Vorrichtung umfasst eine oder mehrere Elektroporationskammern. Die Elektroporationskammern umfassen jeweils eine obere Mikromesh-Elektrode, eine untere Mikromesh-Elektrode und einen zwischen der oberen Mikromesh-Elektrode und der unteren Mikromesh-Elektrode definierten Pfad, auf dem die Zellen und die Ladung strömen können. Die obere Mikromesh-Elektrode und die untere Mikromesh-Elektrode sind jeweils porös. Darüber hinaus ist die obere Mikromesh-Elektrode von einem ersten Material gebunden und die untere Mikromesh-Elektrode von einem zweiten Material gebunden. Das erste Material umfasst einen ersten Einlass, der die Passage von Zellen in die Elektroporationskammer gestattet, und das zweite Material umfasst einen ersten Auslass, der die Passage von elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet. Der erste Einlass und der erste Auslass sind durch eine Offset-Distanz beabstandet.
Gemäß einem anderen Aspekt wird ein Kit zur Zelltransfektion bereitgestellt. Das Kit umfasst die wie hier beschriebene Vorrichtung zur Elektroporation und gegebenenfalls Reagenzien ausgewählt aus der aus zu transfizierenden Zellen, einem Elektroporationsmedium oder einer Kombination davon bestehenden Gruppe.
Gemäß einigen Aspekten setzt man bei einem Elektroporationsprotokoll Zellen mehreren elektrischen Impulsen, einer gestuften Fluidströmung, einem Elektroporationspuffer mit geringer Leitfähigkeit und geringer Osmolarität, relativ mäßiger Kapazität und/oder einer relativ mäßigen Zeitkonstante aus.
Verschiedene Objekte, Merkmale, Aspekte und Vorteile des hier beschriebenen Gegenstands werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen zusammen mit den angehängten Zeichnungen, in denen gleiche Nummern gleiche Komponenten bezeichnen, offensichtlicher.
Figurenliste
Das Patent bzw. die Anmeldungsakte enthält mindestens eine farbig ausgeführte Zeichnung. Kopien dieses Patents bzw. dieser Patentanmeldungspublikation mit farbiger Zeichnung/farbigen Zeichnungen werden nach Anforderung und Zahlung der anfallenden Gebühr vom Amt bereitgestellt.

In 1A und 1B sind herkömmliche Elektroporationsgeräte mit parallelen Plattenelektroden (wie in 1A gezeigt) und Mikromesh-Elektroden ohne Offset zwischen dem Einlass und dem Auslass (wie in 1B gezeigt) gezeigt.
In 2A-2D sind Aspekte einer Vorrichtung zur Elektroporation gezeigt, die ein Elektroporationsgerät gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen umfasst. In 2A ist eine Illustration der Struktur des Einlass-Auslass-Kammer-Offset-Elektroporationsgeräts gezeigt. In 2B ist eine Illustration des elektrischen Felds des Einlass-Auslass-Kammer-Offset-Elektroporationsgeräts gezeigt. In 2C ist die elektrische Feldstärke als Funktion der Wegstrecke der Zellen durch das Einlass-Auslass-Kammer-Offset-Elektroporationsgerät gezeigt. In 2D ist eine alternative Konfiguration einer Elektroporationsvorrichtung gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen.
In 2E-2G sind Aspekte eines Pfades in einer Elektroporationskammer gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen gezeigt.
In 2H-2J sind alternative Konfigurationen einer Elektroporationsvorrichtung gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen gezeigt.
In 2K-2L sind beispielhafte Mikrofluidik-Kammern zum Sortieren von Zellen gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen gezeigt.
2M-2S sind Illustrationen, die verschiedene Aspekte der Geometrie und Positionierung von Pfosten innerhalb der Kammer gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen zeigen.
In 2T ist eine beispielhafte Mikrofluidik-Kammer zum Pufferaustausch gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen gezeigt.
In 2U ist ein beispielhaftes Mikrofluidik-Gerät mit zwei separaten Kammern
- - einer Kammer zum Zellsortieren und einer anderen Kammer zum Pufferaustausch
- - gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen gezeigt.
In 2V und 2W sind alternative Konfigurationen einer Elektroporationsvorrichtung gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen gezeigt.
In 3 ist eine Tabelle mit mit dem Kammer-Offset-Elektroporationsgerät gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen assoziierten Parametern gezeigt.
In 4 sind Beispiele für Fluidströmungs-Wellenformen (Pumpe) und elektrische Wellenformen (stim), denen durch das Kammer-Offset-Elektroporationsgerät strömende Zellen ausgesetzt werden können, gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen gezeigt.
In 5 sind verschiedene Beispiele für aus verschiedenen für eine Verwendung mit dem Kammer-Offset-Elektroporationsgerät geeigneten Materialien gebildete Mikromeshe gemäß einiger der hier bereitgestellten Ausführungsformen gezeigt.
In 6A-6E sind Ergebnisse von Elektroporationsexperimenten mit haNK-Zellen und entsprechende Parameter unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte gezeigt.
In 7A-7D sind weitere Ergebnisse von Elektroporationsexperimenten mit haNK-Zellen und entsprechende Parameter unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte gezeigt.
In 8A-8E sind Ergebnisse von Elektroporationsexperimenten mit EC7-Zellen und entsprechende Parameter unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte gezeigt.
In 9A-9D sind weitere Ergebnisse von Elektroporationsexperimenten mit EC7-Zellen und entsprechende Parameter unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte gezeigt.
In 10A-10C sind Mikroskopiebilder elektroporierter EC7-Zellen gezeigt.
In 11A-11B sind weitere Ergebnisse der Transfektion von EC7-Zellen unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte gezeigt.
In 12A-12D sind verschiedene Transfektionseffizienzen für verschiedene Zelllinien unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte gezeigt.
In 13A-13E sind Ergebnisse von Transfektionsexperimenten zum Einschleusen von mRNA in T-Zellen mittels PbAE wie hier beschrieben gezeigt.
In 14A und 14B sind Ergebnisse von Transfektionsexperimenten zum Einschleusen von mRNA in T-Zellen mit oder ohne Elektroporation, wie hier beschrieben, gezeigt.
In 15A-15D sind Ergebnisse von Transfektionsexperimenten mit mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe (Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells, AD-MSC) und entsprechende Parameter unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte gezeigt.

Ausführliche Beschreibung
Bereitgestellt werden Systeme und Verfahren zur Elektroporation von Zellen, zum Beispiel Säugetierzellen (z. B. NK-Zellen, EC-7-Zellen, T-Zellen usw.) und Nichtsäugetierzellen, mittels einer Elektroporationsvorrichtung mit einem durch eine Offset-Distanz von einem ersten Auslass beabstandeten ersten Einlass. Insbesondere werden Systeme und Verfahren zur Elektroporation von Säugetierzellen (z. B. NK-Zellen, EC-7-Zellen, T-Zellen, etc.) und Nichtsäugetierzellen zusammen mit entsprechenden Elektroporationsprotokollen, die für eine hohe Effezienz und Viabilität sorgen, bereitgestellt. Gemäß einigen Aspekten setzt man bei dem Elektroporationsprotokoll die Zellen mehreren elektrischen Impulsen, einer gestuften Fluidströmung, einem Elektroporationspuffer mit geringer Leitfähigkeit und geringer Osmolarität, relativ mäßiger Kapazität und/oder einer relativ mäßigen Zeitkonstante aus.
Gemäß verschiedenen Aspekten wird eine Vorrichtung zum Elektroporieren von Säugetierzellen mit einer Ladung bereitgestellt. Die Vorrichtung kann eine oder mehrere Elektroporationskammern umfassen, wobei die Elektroporationskammern jeweils eine obere Mikromesh-Elektrode, eine untere Mikromesh-Elektrode und einen zwischen der oberen Mikromesh-Elektrode und der unteren Mikromesh-Elektrode definierten Pfad, auf dem die Zellen und die Ladung strömen können, umfassen. Die obere Mikromesh-Elektrode und die untere Mikromesh-Elektrode sind jeweils porös, zum Beispiel um eine Passage von Zellen durch die Mikromesh-Elektroden entweder in die oder aus der Elektroporationskammer zu gestatten. Beispielsweise können eine obere Mikromesh-Elektrode und eine untere Mikromesh-Elektrode jeweils eine Porosität einer offenen Fläche von etwa 30% bis etwa 50% aufweisen. Eine Weite einer Porenöffnung einer oberen Mikromesh-Elektrode und einer unteren Mikromesh-Elektrode kann jeweils etwa 70 µm bis etwa 140 µm betragen. Die obere Mikromesh-Elektrode kann von einem ersten Material gebunden sein und die untere Mikromesh-Elektrode kann von einem zweiten Material gebunden sein. Das erste Material umfasst einen ersten Einlass, der die Passage von Zellen in die Elektroporationskammer gestattet, und das zweite Material umfasst einen ersten Auslass, der die Passage von elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung schließen „elektroporierte Zellen“ transfizierte Zellen, tote Zellen und nicht transfizierte Zellen ein. Der erste Einlass und der erste Auslass sind durch eine Offset-Distanz beabstandet. Darüber hinaus oder alternativ dazu kann, statt dass die Zellen und/oder die Ladung durch die Poren der oberen Mikromesh-Elektrode strömen, um in die Elektroporationskammer zu gelangen, die obere Mikromesh-Elektrode gegebenenfalls einen zweiten Einlass umfassen, der die Passage von Zellen und/oder Ladung in die Elektroporationskammer gestattet. Der zweite Einlass kann im Wesentlichen mit dem ersten Einlass im ersten Material ausgerichtet sein. Darüber hinaus oder alternativ dazu kann, statt dass die elektroporierten Zellen durch die Poren der unteren Mikromesh-Elektrode strömen, um aus der Elektroporationskammer auszutreten, die untere Mikromesh-Elektrode einen zweiten Auslass umfassen, der die Passage von Elektroporation aus der Elektroporationskammer gestattet. Der zweite Auslass kann im Wesentlichen mit dem ersten Auslass im zweiten Material ausgerichtet sein.
2A beispielsweise veranschaulicht eine beispielhafte Vorrichtung zum Elektroporieren von Zellen mit Ladung, die ein IOCO-Elektroporationsgerät 200 umfasst. Das IOCO-Elektroporationsgerät 200 umfasst zwei Mikromesh-Elektroden, eine obere Mikromesh-Elektrode 240(1) und eine untere Mikromesh-Elektrode 240(2), die hier zueinander ausgerichtet gezeigt sind. Die obere Oberfläche der oberen Mikromesh-Elektrode 240(1) kann von einem ersten Material gebunden sein und die untere Oberfläche der unteren Mikromesh-Elektrode 240(2) kann von einem zweiten Material gebunden sein. Bei dem ersten Material und dem zweiten Material kann es sich zum Beispiel um ein nichtporäses Material wie z. B. Polydimethylsiloxan (PDMS), Acryl, Polyethylen, Polypropylen handeln, wodurch die Zellen in der inneren Kammer des Elektroporationsgeräts und insbesondere in der Kammer 220 zwischen den beiden parallelen Mikromesh-Elektroden gehalten werden. Ein erster Einlass 210 (eine Region ohne PDMS) ist auf der oberen Mikromesh-Elektrode 240(1) gebildet und ein erster Auslass 230 (eine Region ohne PDMS) ist auf der unteren Mikromesh-Elektrode 240(2) gebildet. Somit überspannen die obere und die untere Mikromesh-Elektrode 240(1) und 240(2) die Länge der Elektroporationskammer 220, gebunden von einem ersten Material (einer oberen PDMS-Schicht) und einem zweiten Material (einer unteren PDMS-Schicht), wodurch die Strömung der Zellen entlang einer lateralen Strecke der Kammer geleitet wird. Eine Öffnung (erster Einlass 210) in dem ersten Material (obere PDMS-Schicht) und eine Öffnung (erster Auslass 230) in dem zweiten Material (untere PDMS-Schicht) sind durch eine Offset-Distanz (d) beabstandet, was eine laterale Strömung von Zellen durch die Elektroporationskammer 220 ermöglicht.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform kann eine Elektroporationskammer eine beliebige gewünschte Form aufweisen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, kreisförmig, oval, quadratisch, rechteckig oder vieleckig.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform kann die Breite (w) einer Elektroporationskammer im Bereich von etwa 0,01 mm bis etwa 5 mm, etwa 0,05 mm bis etwa 5 mm, etwa 0,1 mm bis etwa 5 mm, etwa 1 mm bis etwa 5 mm, etwa 2 mm bis etwa 5 mm, etwa 0,01 mm bis etwa 4 mm, etwa 0,1 mm bis etwa 4 mm, etwa 1 mm bis etwa 4 mm, etwa 0,01 mm bis etwa 2 mm, etwa 0,05 mm bis etwa 1 mm, etwa 0,1 mm bis etwa 0,5 mm oder etwa 0,2 mm bis etwa 0,4 mm liegen. Gemäß einigen Aspekten beträgt die Breite (w) der Kammer etwa 0,3 mm.
Gemäß einigen Aspekten kann eine Offset-Distanz (d) im Bereich von etwa 0,1 cm bis etwa 10 cm, von etwa 0,1 cm bis etwa 5 cm, von etwa 0,1 cm bis etwa 4 cm, von etwa 1 cm bis etwa 3 cm liegen. Gemäß einigen Aspekten beträgt die Offset-Distanz (d) etwa 2 cm. Gemäß einigen Aspekten gibt es zwischen dem Einlass und dem Auslass keine Überlappung.
Der erste Einlass und/oder der zweite Einlass stehen in Fluidkommunikation mit der Elektroporationskammer und die Elektroporationskammer steht in Fluidkommunikation mit dem ersten Auslass und/oder dem zweiten Auslass. Einlass(e), Auslass(e) und Elektroporationskammer können darüber hinaus ein oder mehrere Ventile, Regulatoren, Pumpen oder beliebige andere Mikrofluidik-Komponenten zur Steuerung der Strömung von Zellen durch die Elektroporationskammer umfassen.
Gemäß einigen Aspekten können sowohl der erste Einlass als auch der erste Auslass im ersten Material an der oberen Mikromesh-Elektrode positioniert sein, mit der Maßgabe, dass zwischen dem ersten Einlass und dem ersten Auslass eine geeignete Offset-Distanz aufrechterhalten bleibt. Darüber hinaus oder alternativ dazu können sowohl der zweite Einlass als auch der zweite Auslass in der oberen Mikromesh-Elektrode vorliegen. Gemäß anderen Aspekten können sowohl der erste Einlass als auch der erste Auslass im zweiten Material auf der unteren Mikromesh-Elektrode positioniert sein, mit der Maßgabe, dass zwischen dem ersten Einlass und dem ersten Auslass eine geeignete Offset-Distanz aufrechterhalten bleibt. Darüber hinaus oder alternativ dazu können sowohl der zweite Einlass als auch der zweite Auslass in der unteren Mikromesh-Elektrode vorliegen.
Gemäß einigen Ausführungsformen können die Zellen durch den ersten Einlass eintreten, wobei die in eine erste Richtung strömen. Nachdem sie die obere Mikromesh-Elektrode passiert haben, kann die Strömung der Zellen die Richtung ändern und lateral in einem Pfad entlang der Länge der Elektroporationskammer in einer Richtung senkrecht oder im Wesentlichen senkrecht zur ersten Richtung strömen. Beim Erreichen des ersten Auslasses kann die Strömung der Zellen abermals die Richtung ändern und in einer zweiten Richtung parallel zur ersten Richtung aus der Elektroporationskammer austreten.
Gemäß einigen Aspekten wird eine Spannung über die parallelen Mikromesh-Elektroden angelegt, die dazu geeignet ist, ein elektrisches Feld im Bereich von etwa 0,3 kV/cm bis etwa 3 kV/cm zu produzieren. Typische elektrische Felder liegen im Bereich von etwa 1-1,3 kV/cm (z. B. 40 V/300 um) bei haNK-Zellen und etwa 0,3-1 kV/cm bei EC-7-Zellen. Gemäß einigen Aspekten kann die Spannung etwa 10 V, etwa 20 V, etwa 30 V, etwa 40 V, etwa 50 V, etwa 75 V, etwa 100 V oder etwa 200 V betragen, oder ein beliebigen Bereich darin, oder darüber liegen.
Gemäß einigen Aspekten können die Durchmesser des ersten Einlasses, des zweiten Einlasses, des ersten Auslasses und des zweiten Auslasses etwa gleich sein. Gemäß anderen Aspekten kann der Durchmesser des ersten Einlasses größer oder kleiner als der Durchmesser des ersten Auslasses sein und/oder der Durchmesser des zweiten Einlasses kann größer oder kleiner als der Durchmesser des zweiten Auslasses sein. Beispielsweise kann der Durchmesser des ersten Einlasses und/oder des zweiten Einlasses im Bereich von etwa 0,1 mm bis etwa 10 mm, von etwa 1 mm bis etwa 7 mm, von etwa 3 mm bis etwa 5 mm liegen oder kann etwa 4 mm betragen. Der Durchmesser des ersten Auslasses und/oder des zweiten Auslasses kann im Bereich von etwa 0,1 mm bis etwa 10 mm, von etwa 1 mm bis etwa 7 mm, von etwa 3 mm bis etwa 5 mm liegen oder kann etwa 4 mm betragen.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform kann eine Länge (1) der Elektroporationskammer im Bereich von etwa 2 mm bis etwa 100 mm, etwa 2 mm bis etwa 80 mm, etwa 2 mm bis etwa 60 mm, etwa 2 mm bis etwa 40 mm, etwa 2 mm bis etwa 20 mm, von etwa 5 mm bis etwa 15 mm, von etwa 8 mm bis etwa 12 mm liegen oder kann etwa 10 mm betragen.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform kann ein Verhältnis von Länge (1) zu Breite (w) (1/w) etwa 1 bis etwa 50, etwa 1 bis etwa 40, etwa 1 bis etwa 20 oder etwa 1 bis etwa 10 betragen.
2B ist eine Illustration des elektrischen Felds im IOCO-Elektroporationsgerät 200. Nach dem Eintritt der Zelle in die Elektroporationskammer ist die Zelle bis zum Austritt aus der Elektroporationskammer einem einheitlichen elektrischen Feld ausgesetzt. Position (1) bezieht sich auf eine Zelle im Einlass (erster Einlass 210), Position (2) bezieht sich auf eine Zelle in der Elektroporationskammer und Position (3) bezieht sich auf eine Zelle im Auslass (erster Auslass 230).
2C ist eine Auftragung der elektrischen Feldstärke gegen die Wegstrecke, die eine Zelle durch das IOCO-Elektroporationsgerät 200 zurückgelegt hat. Zellen im Einlass (erster Einlass 210), gezeigt bei Position (1), sind, bis sie durch die Mikromesh-Elektrode in die Elektroporationskammer eingetreten sind, keinem elektrischen Feld ausgesetzt. Innerhalb der Elektroporationskammer, gezeigt als Position (2), sind die Zellen einem einheitlichen (maximale Stärke) elektrischen Feld ausgesetzt, während sie entlang der Länge der Kammer strömen. Sind sie im Auslass (erster Auslass 230), gezeigt als Position (3), sind die Zellen keinem elektrischen Feld ausgesetzt.
2D zeigt eine alternative Konfiguration einer hier dargestellten Elektroporationsvorrichtung, die ein Elektroporationsgerät 310-330 umfasst. Bei dieser Ausführungsform können die Zellen, anstatt dass sie einen linearen (horizontalen) Strömungspfad zwischen dem oberen und den unteren Mesh folgen, einem gekrümmten oder kreisförmigen (horizontalen) Strömungspfad zwischen dem oberen und den unteren Mesh folgen. Der lineare Strömungspfad und der gekrümmte Strömungspfad können jeweils mindestens ein Segment einschließen, das sich parallel zu einer durch die Oberfläche des oberen und/oder unteren Mesh definierten Ebene erstreckt.
In diesem Beispiel sind die verschiedenen Schichten eines Elektroporationsgerät 310-330 in 2D gezeigt. Feste äußere Platten 310(1) und 310(2) (z. B. Kunststoff, Metall oder ein anderes geeignetes Material) kapseln des Gerät ein. Eine Klebeschicht oder ein anderes geeignetes Material (z. B. doppelseitiges Band, Haftklebematerial usw.) 320(1) (erstes Material) ist zwischen der oberen äußeren Platte 310(1) und dem unteren Mesh 330(1) platziert und eine Klebeschicht oder ein anderes geeignetes Material (z. B. doppelseitiges Band, Haftklebematerial usw.) 330(2) (zweites Material) ist zwischen der unteren äußeren Platte 310(2) und dem unteren Mesh 330(2) platziert. Eine andere Klebeschicht (z. B. Haftklebematerial oder doppelseitiges Band usw.) (340), umfassend einen gekrümmten Kanal bzw. gekrümmten Pfad 335, über den die Zellen und die Ladung strömen können, kann zwischen dem oberen und dem unteren Mesh 330(1) bzw. 330(2) positioniert sein. Fluid kann mittels einer Spritze 350 durch das Elektroporationsgerät 310-330 gedrückt werden. Das Elektroporationsgerät 310-330 kann außerdem mit einem Elektroporator-Impulsgeber 360 verbunden sein. Gemäß einer beliebigen Ausführungsform kann es sich bei dem Elektroporationsgerät 310-330 um ein kontinuierliches Elektroporationsgerät handeln, wobei Zellen kontinuierlich durch das Gerät strömen.
In der Elektroporationskammer ist ein Pfad definiert, auf dem Zellen und Ladung durch die Elektroporationskammer strömen können, zum Beispiel zwischen der oberen Mikromesh-Elektrode und der unteren Mikromesh-Elektrode. Es versteht sich, dass jeder geeignete Pfad von den hier bereitgestellten Ausführungsformen in Betracht gezogen wird, mit der Maßgabe, dass der Pfad mindestens ein horizontales Fließsegment umfasst, dass parallel zu dem oberen Mesh und/oder dem unteren Mesh ist. Das horizontale Fließsegment kann mehr oder weniger als 1/10, 1/4, 1/2, 3/4, 7/8 oder 9/10 der Länge des sich zwischen der oberen und der unteren Mikromesh-Elektrode erstreckenden Pfades bilden. In einigen Fällen kann der Pfad linear, gekrümmt, verzweigt, umführend, gewunden oder eine beliebige Kombination davon sein. Beispiele für krümmte Pfade schließen, wobei dies nicht einschränkend ist, einen kreisförmigen Pfad, einen spiralförmigen Pfad, einen konischen Pfad oder beliebige Kombinationen davon ein. Beispielsweise ist, wie in 2B veranschaulicht, ein Pfad linear, wobei Pfeile die Strömung von Zellen veranschaulichen. Wie in 2D und 2E veranschaulicht, ist ein Pfad gekrümmt, wobei Pfeile die Strömung von Zellen veranschaulichen. Wie in 2F veranschaulicht, kann ein Pfad linear mit einer oder mehreren Richtungsveränderungen oder Serpentinen sein, wobei Pfeile die Strömung von Zellen veranschaulichen. Wie in 2G veranschaulicht kann ein Pfad kreisförmig sein oder eine oder mehrere Verzweigungen aufweisen. Wie in 2E-2G veranschaulicht können die Pfade einen Einlass 380 (aus der Ebene herausragend), der dem ersten Einlass entsprechen kann oder im Wesentlichen mit dem ersten Einlass ausgerichtet ist, und einen oder mehrere Auslässe 390 (in die Ebene hineinragend), die dem ersten Auslass entsprechen oder im Wesentlichen mit dem ersten Auslass ausgerichtet sind, umfassen. Die Länge des Pfades kann in Abhängigkeit von den jeweiligen Charakteristika des Elektroporationsverfahrens angepasst, z. B. verkürzt oder verlängert, werden.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform können die hier beschriebenen Elektroporationsvorrichtungen Mittel zum Erzeugen einer Strömung von Zellen aus einem Probenröhrchen in eine Elektroporationskammer eines Elektroporationsgeräts und einer Strömung durch das Gerät in ein Sammelröhrchen umfassen. Beispielsweise befindet sich, wie in 2H veranschaulicht, ein Mittel zum Erzeugen einer Strömung 520 in Fluidkommunikation mit einem Zellen und/oder Ladung zur Transfektion enthaltenden Probenröhrchen 510 und einem Elektroporationsgerät 530. Das Mittel zum Erzeugen einer Strömung 520 kann eine Strömung der Zellen und/oder Ladung aus dem Probenröhrchen 510 durch das Elektroporationsgerät 530 und in das Sammelröhrchen 550 erzeugen. Das Mittel zum Erzeugen einer Strömung kann eine beliebige geeignete Pumpe sein, zum Beispiel eine peristaltischen Pumpe oder eine Spritzenpumpe. Es wird in Betracht gezogen, dass mehr als ein Mittel zum Erzeugen einer Strömung 520 in einer Elektroporationsvorrichtung vorhanden sein kann. Beispielsweise können ein oder mehrere Mittel zum Erzeugen einer Strömung 520 zwischen und in Fluidkommunikation mit dem Probenröhrchen 510 und dem Elektroporationsgerät 530 vorhanden sein und ein oder mehrere Mittel zum Erzeugen einer Strömung 520 können zwischen und in Fluidkommunikation mit dem Sammelröhrchen 550 und dem Elektroporationsgerät 530 vorhanden sein. Darüber hinaus oder alternativ dazu können das Elektroporationsgerät 530 und/oder das Mittel zum Erzeugen einer Strömung 520 auch mit einem Steuergerät 540 verbunden sein, dass zum Beispiel einen Elektroporator-Impulsgeber umfasst.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform können die hier beschriebenen Elektroporationsvorrichtungen auch ein Röhrchen mit Priming-Puffer in Fluidkommunikation mit dem Elektroporationsgerät zur Bereitstellung von Priming-Puffer je nach Bedarf umfassen. Beispiele für geeignete Priming-Puffer schließen, wobei dies nicht einschränkend ist, definiertes Wasser, vollentsalztes Wasser, isotonischen Puffer und Kombination davon ein. Beispielsweise befindet sich, wie in 21 veranschaulicht, ein Röhrchen mit Priming-Puffer 560 in Fluidkommunikation mit dem Elektroporationsgerät 530. Zur Zuführung von Priming-Puffer zum Elektroporationsgerät 530 über ein Mittel zur Erzeugung einer Strömung 520 kann ein Ventil 570 geöffnet werden, oder das Ventil 570 kann zur Beendigung der Zuführung geschlossen werden. Zur Zuführung von Zellen und/oder Ladung zum Elektroporationsgerät 530 über ein Mittel zur Erzeugung einer Strömung 520 kann ein Ventil 575 geöffnet werden, oder das Ventil 575 kann zur Beendigung der Zuführung geschlossen werden. Gemäß einigen Ausführungsformen können zur Zuführung von Zellen und Priming-Puffer die Ventile 570 und 757 beide geöffnet sein. Gemäß einigen Ausführungsformen kann zunächst Priming-Puffer zugeführt werden, gefolgt von der Zuführung von Zellen und/oder Ladung.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform können die hier beschriebenen Elektroporationsvorrichtungen außerdem ein erstes Mikrofluidik-Gerät zum Sortieren der Zellen vor dem Eintritt in eine Elektroporationskammer eines Elektroporationsgerätes umfassen. Beispielsweise kann sich, wie in 2J veranschaulicht, ein erstes Mikrofluidik-Gerät 580 in Fluidkommunikation mit einem Elektroporationsgerät 530, einem Zellen zur Transfektion enthaltenden Probenröhrchen 510 und gegebenenfalls einem Puffersortierröhrchen 577 befinden. Mittel zum Erzeugen einer Strömung 520 können eine Strömung der Zellen vom Probenröhrchen 510 und/oder Puffer vom Sortierröhrchen 577 durch das Elektroporationsgerät 530 und in ein Sammelröhrchen 550 erzeugen. Das erste Mikrofluidik-Gerät 580 ist dazu fähig, Zellen vorzusortieren, zum Beispiel basierend auf der Größe von Zellen, vom Probenröhrchen 510 zum Elektroporationsgerät 530. Darüber hinaus oder alternativ dazu ist das erste Mikrofluidik-Gerät 580 dazu fähig, eine Pufferveränderung von den Zellen zum Probenröhrchen 510 vorzunehmen. Strom 590 enthält aussortierte und nicht dem Elektroporationsgerät 530 zugeführte Zellen, bei denen es sich entweder um einen Abwasserstrom handeln kann oder die einem anderen Elektroporationsgerät mit anderen Parametern zugeführt werden können. Darüber hinaus oder alternativ dazu kann sich ein zweites Mikrofluidik-Gerät 585 in Fluidkommunikation mit dem Elektroporationsgerät 530 und dem Sammelröhrchen 550 befinden. Das zweite Mikrofluidik-Gerät 585 ist dazu fähig, elektroporierte Zellen zu sortieren, zum Beispiel basierend auf der Größe der elektroporierten Zellen, vor dem Sammeln im Sammelröhrchen 550. Strom 595 enthält die aussortierten elektroporierten Zellen, die nicht dem Sammelröhrchen 550 zugeführt wurden.
Wenngleich in 2J zwei Mikrofluidik-Geräte gezeigt sind, wird hier in Betracht gezogen, dass in einer Elektroporationsvorrichtung nur ein Mikrofluidik-Gerät vorhanden sein kann, zum Beispiel zum Sortieren von Zellen vor dem Eintritt in eine Elektroporationskammer oder zum Sortieren elektroporierter Zellen vor dem Austritt aus einer Elektroporationskammer.
2K ist eine Veranschaulichung eines beispielhaften Mikrofluidik-Geräts (z. B. Mikrofluidik-Gerät 580, Mikrofluidik-Gerät 585). In diesem Beispiel tritt eine Zellen umfassende Lösung 100 (z. B. Zellen zur Transfektion, elektroporierte Zellen, transfizierte Zellen) beim Einlass-Mechanismus 110 in eine Kammer 105 ein. Zellen sind als Kreise veranschaulicht. Die Zellen passieren die Kammer 105, die eine Matrix von Pfosten 115 umfasst, die hier als rechteckige Strukturen gezeigt sind, die entlang mehrerer Linien mit einem Gefälle verteilt sind. Während die Zellen die diagonal angeordneten Reihen von Pfosten in der Kammer passieren, werden die Zellen lateral zu einem zweiten Auslass-Mechanismus 122 abgelenkt. Eine Seitenansicht eines Teils der Kammer ist in 1B gezeigt, wobei die Kammer einen Boden 160 und gegebenenfalls eine Decke 150 aufweist, die aus dem gleichen Material wie die Pfosten 115 oder aus einem anderen Material sein können. Es sind durch die Matrix von Pfosten strömende Zellen (schwarze Kreise) gezeigt. Es versteht sich, dass die Reihen von Pfosten auch kurvenförmig angeordnet sein können, was zur Folge hätte, dass die Zellen zu einer Seite der Kammer gelenkt werden würden.
In diesem Beispiel sind zwei Auslass-Mechanismen für die Kammer gezeigt. Die Lösung, die die Kammer über einen ersten Auslass-Mechanismus 120 (der auch als dritter Auslass-Mechanismus bezeichnet werden kann, wenn mehr als ein Mikrofluidik-Gerät vorhanden ist) verlässt, ist an Zellen abgereichert, während die Lösung, die die Kammer über einen zweiten Auslass-Mechanismus 122 (der auch als vierter Auslass-Mechanismus bezeichnet werden kann, wenn mehr als ein Mikrofluidik-Gerät vorhanden ist) verlässt, an Zellen angereichert ist. Gemäß einer beliebigen Ausführungsform kann der zweite Auslass-Mechanismus in Fluidkommunikation mit einer Elektroporationskammer stehen, zum Beispiel mit einem ersten Einlass. Abreicherung bezieht sich auf einen Zustand, bei dem die Konzentration an Zellen in der über den Auslass-Mechanismus 120 aus der Kammer austretenden Lösung im Vergleich zur Konzentration an Zellen in der am Einlass-Mechanismus 110 in die Kammer eintretenden Lösung um 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% reduziert wurde. Anreicherung oder Konzentration bezieht sich auf einem Zustand, bei dem die Konzentration an Zellen in der über den Auslass-Mechanismus 122 aus der Kammer austretenden Lösung im Vergleich zur Konzentration an Zellen in der am Einlass-Mechanismus 110 in die Kammer eintretenden Lösung um 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% oder mehr erhöht wurde. Damit die Zellen zum Auslass-Mechanismus 122 gelenkt werden, sollte der Ablenkungspunkt 130 der Kammer so positioniert sein, dass die austretenden Zellen zum Auslass-Mechanismus 122 (und nicht zum Auslass-Mechanismus 120) gelenkt werden. Im allgemeinen ist der Auslass-Mechanismus 122 so konfiguriert, dass er eine größere Querschnittsfläche aufweist als der Auslass-Mechanismus 120. Im Allgemeinen werden die Auslass-Mechanismen eine Querschnittsfläche aufweisen, die groß genug ist, damit Fluid mit den hier beschriebenen Strömungsgeschwindigkeiten strömen kann, ohne dass hohe Drücke auftreten, die die Zellen oder das Gerät schädigen würden.
Gemäß einigen Ausführungsformen ist die Breite des Auslass-Mechanismus 120 größer als die Breite des Auslass-Mechanismus 122. Die Breite des Auslass-Mechanismus 120 ist beispielsweise das 1,5-fache, 2-fache, 2,5-fache, 3-fache, 3,5-fache, 4-fache, 4,5-fache, 5-fache, 5,5-fache, 6-fache, 6,5-fache, 7-fache, 7,5-fache, 8-fache, 8,5-fache, 9-fache, 9,5-fache der Breite des Auslass-Mechanismus 122. Gemäß anderen Ausführungsformen kann die Summe der Querschnittsflächen der Auslass-Mechanismen gleich oder größer sein als die Summe der Querschnittsflächen der Einlass-Mechanismen.
Gemäß einigen Ausführungsformen ist das Mikrofluidik-Gerät so konfiguriert, dass man eine Standardpumpe oder eine Spritze oder dergleichen mit dem Mikrofluidik-Gerät verbinden kann, so dass eine Zellen umfassende Lösung durch das Gerät geströmt wird. Parameter, die die Strömung einer Lösung durch das Gerät beeinflussen können, schließen die Dimensionen der Kammer 105, die Dimensionen der Pfosten 115 in der Ebene und aus der Ebene heraus, den Abstand der Pfosten in einer Reihe (dx), die Drehung der Pfosten (ϕ), den Abstand zwischen Reihen von Pfosten (dy), den Durchmesser der Einlass-Mechanismus und die Durchmesser der Auslass-Mechanismen ein (siehe 2M-2Q unten). Gemäß einigen Ausführungsformen werden die Dimensionen dieser Parameter so gewählt, dass sie mit dem angewandten Druck des manuellen Betriebs von Spritzen oder Standardpumpen (z. B. peristaltischen Pumpen, Membranpumpen, Spritzenpumpen, Nockenpumpen usw.), die die Strömung der Lösung durch das Gerät treiben, kompatibel sind. Ein Bereich von Drücken ist zulässig, mit der Maßgabe, dass der Druck das Mikrofluidik-Gerät bzw. die Zellen nicht schädigt.
Im Allgemeinen können Zellen in Reihe (eine zur Zeit und auf einem festgelegten Pfad) oder parallel (mehrere Zellen, die auf mehreren Pfaden strömen) in das Mikrofluidik-Gerät strömen.
2L ist eine Veranschaulichung einer Aufsicht eines Teils der Kammer 105, wobei der Teil zwei Reihen von jeweils sieben Pfosten umfasst. Die Strömung der Zellen ist entlang Pfad (p) gezeigt. Diese Veranschaulichung zeigt die Positionierung der Pfosten 115 in einem Teil der Kammer des Mikrofluidik-Geräts. Im Allgemeinen sind die Pfosten entlang Linien mit einem durch Winkel (θ) definierten Gefälle in einem Abstandsintervall (dx), das fix oder variabel sein kann, mit der Maßgabe, dass die Variation nicht dazu führt, dass Zellen zwischen den Pfosten vom Pfad (p) abweichen können, angeordnet.
Gemäß einigen Ausführungsformen beträgt die Breite der Kammer 1 mm, 2,5mm, 5 mm, 7,5 mm, 10 mm, 12,5 mm, 15 mm, 17,5 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm, 50 mm oder mehr oder eine beliebige Größe dazwischen. Durch die Breite der individuellen Pfade (p) werden die Charakteristika der Stromlinien gesteuert. Je nach Breite der Kammer kann eine beliebige Anzahl von Pfaden, z. B. 1, 2, 4, 8, 12, 16, 32 usw. oder ein beliebiger Bereich dazwischen eingesetzt werden. Gemäß anderen Ausführungsformen kann die Strömungsgeschwindigkeit durch die Kammer 1 ml/h, 2 ml/h, 3 ml/h, 4 ml/h, 5 ml/h, 6 ml/h, 7 ml/h, 8 ml/h, 9 ml/h, 10 ml/h, 15 ml/h, 20 ml/h, 25 ml/h, 30 ml/h, 40 ml/h, 50 ml/h und so weiter betragen. Die Kammer ist wünschenswerter Weise rechteckig, kann jedoch auch kreisförmig, halbkreisförmig oder V-förmig sein oder eine andere geeignete Form aufweisen.
Bei dem Winkel (θ) handelt es sich um den Winkel zwischen der horizontalen Achse mit einem Gefälle von null und einer Linie mit einem Gefälle, entlang der die Pfosten verteilt sind (in diesem Beispiel liefert der Winkel ein Maß für das negative Gefälle (tan (θ) = Δy/Δx) einer Reihe von Pfosten). Es versteht sich, dass die Pfosten in diesem Beispiel ein positives oder negatives Gefälle haben können, da die Reihen von Pfosten jeweils diagonal angeordnet sind. Hier versteht es sich, dass diagonal eine beliebige Orientierung umfassen kann, die nicht parallel oder senkrecht zur Kammer ist, z. B. einen Winkel zwischen 1 und 89 Grad, zwischen 91 und 179 Grad, zwischen 181 und 269 Grad oder zwischen 271 und 359 Grad, im Uhrzeigersinn oder entgegen des Uhrzeigersinn. Andere beispielhafte Winkelbereiche können 1 bis 10 Grad, 11 bis 20 Grad, 21 bis 30 Grad, 31 bis 40 Grad, 41 bis 50 Grad, 51 bis 60 Grad, 61 bis 70 Grad, 71 bis 80 Grad, 81 bis 90 Grad, 91 bis 100 Grad, 101 bis 110 Grad, 111 bis 120 Grad, 121 bis 130 Grad, 131 bis 140 Grad, 141 bis 150 Grad, 151 bis 160 Grad, 161 bis 170 Grad oder 171 bis 180 Grad sein.
Im Allgemeinen sind in einer Kammer mehrere Reihen von Pfosten vorhanden, und jede Reihe hat das gleiche Gefälle oder im Wesentlichen das gleiche vom Winkel (θ) definierte Gefälle. Treten Zellen 100 in die Kammer 105 des Mikrofluidik-Geräts ein, so strömen die Zellen lateral durch mehrere Pfade (p) zwischen den Pfosten 115 zu einer Seite der Kammer 105, bis sie eine Seite der Kammer erreichen. Zum Konzentrieren der Zellen kreuzen die Zellen im Allgemeinen nicht eine Reihe von Pfosten, sondern die Zellen strömen vielmehr entlang eines bestimmten Pfades (p). Die Zellen treten dann über den Auslass-Mechanismus 122 aus der Mikrofluidik-Kammer aus. Gemäß anderen Ausführungsformen können die Pfosten einer kurvenförmige Komponente entlang der Länge der Kammer 105 aufweisen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Pfosten“ auf eine Struktur in der Kammer mit einer damit assoziierten Dimensionen innerhalb der Ebene, einer Dimension aus der Ebene heraus, einem Drehwinkel und einer Form. Eine Dimension innerhalb der Ebene kann sich auf die Länge (1) und Breite (w) des Pfosten beziehen, während sich eine Dimension aus der Ebene heraus auf die Höhe (h) des Pfosten beziehen kann. Kippwinkel oder Drehwinkel (ϕ) bezieht sich auf die Drehung des Pfosten im Bezug auf die Kammer.
Form bezieht sich auf die 3-D-Charakterisierung des Pfostens, z. B. zylindrisch, konisch, pyramidal, kubisch oder quaderförmig usw. Im Allgemeinen wird ein Pfosten so positioniert sein, dass seine Achse (Dimension aus der Ebene heraus) senkrecht zur Oberfläche, an der er befestigt ist, ist. Gemäß einigen Ausführungsformen haben alle Pfosten in der Kammer die gleichen Dimensionen. Gemäß anderen Ausführungsformen variieren die Dimensionen der Pfosten als Funktion des Raumes, wie in Abhängigkeit von der entlang der Höhe (h) des Pfostens gemessenen Position. Im Allgemeinen kann der Pfosten eine beliebige Form aufweisen und ist nicht auf einer bestimmte hier dargestellte geometrische Form beschränkt. Die Form des Pfostens kann willkürlich gewählt sein, wie in 2R gezeigt, wiedergegeben durch eine Achsenlänge (1) und Breite (w) und mehrere Radien (r4-r12), die mit einer Krümmung assoziiert sind, positioniert entlang der Achsenlänge, z. B. in wiederholten konstanten Abständen oder wiederholten variablen Abständen. Durch die mehreren Radien lässt sich eine beliebige Anzahl verschiedener Geometrien beschreiben. Darüber hinaus, im Bezug auf 2R und 2S, können eine oder mehrere Seiten des Pfostens die Form einer geraden Linie haben. Dementsprechend können die Pfosten eine beliebige aus Kurven und/oder geraden Linien gebildete geeignete Form aufweisen.
Gemäß einigen Ausführungsformen sind die Pfosten in einem Abstand (dx) entlang einer Linie mit einem Gefälle angeordnet, wobei der Abstand regelmäßig bzw. fix ist. Beispielsweise kann alle 5 µm, 10 µm, 15 µm, 20 µm, 25 µm, 30 µm, 35 µm, 40 µm, 45 µm, 50 µm, 55 µm, 60 µm, 65 µm, 70 µm, 75 µm, 85 µm, 90 µm, 95 µm, 100 µm und so weiter ein Pfosten platziert sein, einschließlich beliebiger Werte zwischen diesen Bereichen, in Abhängigkeit von der Größe der zu konzentrierenden Zelle.
Gemäß anderen Ausführungsformen sind die Pfosten entlang einer Linie mit einem Gefälle angeordnet, so dass der Abstand nicht fix ist, sondern vielmehr zwischen zwei beliebigen aufeinanderfolgenden Pfosten variiert. Ein Abstand (dx) ist zulässig, mit der Maßgabe, dass der Abstand klein genug ist, um die Zelle daran zu hindern, vom Pfad (p) abzuweichen. Bei einem variablen Abstand kann beispielsweise ein erster Pfosten an einem bestimmten Ort platziert sein, der zweite Pfosten kann 5 µm vom ersten Pfosten platziert sein, ein dritter Pfosten kann 4 µm vom zweiten Pfosten platziert sein, und so weiter. Der Abstand kann nach der Größe der Zelle gewählt werden.
Gemäß einigen Ausführungsformen kann der Abstand so gewählt werden, dass er ausreichend groß ist, um eine Konzentration eines bestimmten Zelltyps zu erlauben, während kleinere Zellen über den Auslass-Mechanismus 120 austreten können. Eine Blutprobe beispielsweise kann mehrere verschiedene Zelltypen einer relativ kleinen Größe einschließlich roter Blutkörperchen, neutrophiler Zellen (Durchmesser z. B. 12-14 µm), eosinophiler Zellen (Durchmesser z. B. 12-17 µm), basophiler Zellen (Durchmesser z. B. 14-16 µm), Lymphozyten (Durchmesser z. B. 10-14 µm) und Monozyten (Durchmesser z. B. 20 µm) umfassen. Andere Typen von Zellen im menschlichen Körper sind sehr viel größer, z. B. im Bereich von einem Durchmesser von 40 bis 100 µm oder mehr. In solchen Fällen können die Pfosten so angeordnet sein, das rote und weiße Blutkörperchen hindurch treten können, während größere Zellen (z. B. normale Zellen, Tumorzellen usw.) konzentriert werden. Die Konfiguration der Pfosten (Abstand) wird nach dem Typ der zu isolierenden Zelle festgelegt. Unterschiedliche Mantel-zu-Probe-Strömungsverhältnisse können die auf Größe basierende Sortierleistung beeinträchtigen.
Jeder Pfosten hat eine damit assoziierten Länge (1) und eine Breite (w), auch als Dimensionen in der Ebene bezeichnet, sowie eine Höhe (h), auch als Dimensionen aus der Ebene heraus bezeichnet (siehe auch 2B). Gemäß einigen Ausführungsformen kann die Breite des Pfostens 5 µm, 10 µm, 15 µm, 20 µm, 25 µm, 30 µm, 35 µm, 40 µm, 45 µm, 50 µm, 55 µm, 60 µm, 65 µm, 70 µm, 75 µm, 85 µm, 90 µm, 95 µm, 100 µm und so weiter, oder ein beliebiger Wert dazwischen, betragen. Die Länge des Pfostens kann 5 µm, 10 µm, 15 µm, 20 µm, 25 µm, 30 µm, 35 µm, 40 µm, 45 µm, 50 µm, 55 µm, 60 µm, 65 µm, 70 µm, 75 µm, 85 µm, 90 µm, 95 µm, 100 µm und so weiter, oder ein beliebiger Wert dazwischen, betragen. Im Allgemeinen können die Pfosten eine beliebige Form haben (bei der Betrachtung von oben und in Bezug auf die Dimensionen w und 1), einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, kreisförmig, oval, quadratisch, rechteckig usw.
Bei den hier angeführten Beispielen haben die Pfosten eine ovale oder rechteckige Form. Gemäß einigen Ausführungsformen ist die Länge des Pfostens 1,1- bis 10-fach größer als die Breite des Pfostens; 1,1- bis 5-fach größer als die Breite des Pfostens; 2 bis 4-fach größer als die Breite des Pfostens; 3 bis 4-fach größer als die Breite des Pfostens oder 2-3-fach größer als die Breite des Pfostens. Gemäß einigen Ausführungsformen können die Länge und die Breite ein Verhältnis von größer als oder kleiner als 20 bis 1, 18 bis 1, 16 bis 1, 14 bis 1, 12 bis 1, 10 bis 1, 9 bis 1, 8 bis 1, 7 bis 1, 6 bis 1, 5 bis 1, 4 bis 1, 3 bis 1, 2 bis 1, 1,1 bis 1 oder kleinere oder größere Verhältnisse aufweisen.
Gemäß einigen Ausführungsformen kann der Querschnitt des Postens durch die Schnittfläche des Postens mit einer zur der Wand, von der sich der Pfosten mit der Höhe (h) erstreckt, parallelen Ebene definiert werden. Der Querschnitt kann entlang der Richtungen der Länge (1) und/oder der Breite (w) symmetrisch sein.
Gemäß noch anderen Ausführungsformen sind die Länge und die Breite jedes Pfostens in der Matrix gleich. Gemäß noch anderen Ausführungsformen ist, wenn die Pfosten kreisförmig sind, der Radius jedes Pfostens in der Matrix gleich.
Zusätzliche Merkmale schließen den Drehwinkel (ϕ) des Pfostens, die Höhe bzw. die Dimension des Postens aus der Ebene heraus, den Abstand zwischen den Reihen (dy) und den Offset der Reihen (xo) ein, die detaillierter in 2N-2Q und in der Anmeldung beschrieben sind. Im Rahmen der vorliegenden Findung bezieht sich der Begriff „Drehwinkel“ auf den Grad der Drehung eines Pfostens im Hinblick auf dessen Position in der Kammer. Gemäß einigen Ausführungsformen hat der Pfosten eine Länge, die größer ist als seine Breite. Gemäß dieser Ausführungsformen bedeutet ein Drehwinkel von null, dass die Länge des Postens mit einer zu einer Seite der Kammer senkrechten Achse ausgerichtet ist. Zur Beschreibung verschiedener Drehwinkeln kann der Pfosten im Uhrzeigersinn oder entgegen des Uhrzeigersinns gedreht werden. Beispielsweise sind die Pfosten in 2M-Q um etwa 35 Grad entgegen dem Uhrzeigersinns gedreht, so das man zu der in diesen Figuren gezeigten Pfostengeometrie kommt.
Unter Bezug auf 2N hat jeder Pfosten eine damit assoziierten Höhe (h) bzw. Dimension aus der Ebene heraus, so das die Pfosten ausreichend hoch sind, um die Zellen daran zu hindern, den Pfad (p) zu verlassen, in dem sie auf einem aufwärts gerichteten Pfad (z. B. über die Pfosten hinüber in einen anderen Pfad) strömen. Gemäß einigen Ausführungsformen erstrecken sich die Pfosten beispielsweise über die Höhe der Mikrofluidik-Kammer, so dass sich die Pfosten im Kontakt mit dem Boden der Kammer 160 und der Decke der Kammer 150 befinden. Gemäß anderen Ausführungsformen kann sich die Höhe bzw. Dimension aus der Ebene heraus über einen Bruchteil der Gesamthöhe des Mikrofluidik-Gerät erstrecken. Die Pfosten können beispielsweise eine Höhe von 1 µm, 3 µm, 5 µm, 10 µm, 15 µm, 20 µm, 25 µm, 30 µm, 35 µm, 40 µm, 45 µm, 50 µm, 55 µm, 60 µm, 65 µm, 70 µm, 75 µm, 85 µm, 90 µm, 95 µm, 100 µm und so weiter, oder ein beliebiger Wert dazwischen, aufweisen.
Unter Bezug auf 20 hat jeder Pfosten einen damit assoziierten Drehwinkel (ϕ) bzw. eine damit assoziierten Neigung, wie sich in der Aufsicht zeigt. Im vorliegenden Beispiel wird die Drehung des Postens ausgehend von einer Orientierung, bei der die Länge des Postens mit einer ersten zur Seite der Kammer senkrechten Achse ausgerichtet ist und die Breite des Pfostens mit einer zweiten Achse in eine Richtung mit der Seite der Kammer ausgerichtet ist, festgelegt, in dem man dem Pfosten gegen den Uhrzeigersinn dreht, z. B. in diesem Beispiel um etwa 35 Grad gegen den Uhrzeigersinn, bis die gewünschte Drehung erreicht ist. Man kann einen Drehwinkel verwenden, der die Strömung der Zellen über den Pfad (p) erleichtert, und alle solche Drehwinkel werden hier in Betracht gezogen. Gemäß einigen Ausführungsformen beträgt der Drehwinkel zwischen 1 Grad und 179 Grad, zwischen 1 Grad und 89 Grad, zwischen 5 Grad und 85 Grad, zwischen 10 Grad und 80 Grad, zwischen 15 Grad und 75 Grad, zwischen 20 Grad und 70 Grad, zwischen 25 Grad und 65 Grad, zwischen 30 Grad und 60 Grad, zwischen 35 Grad und 55 Grad, zwischen 40 Grad und 50 Grad, zwischen 30 Grad und 40 Grad, zwischen 32 Grad und 38 Grad, zwischen 34 Grad und 36 Grad oder 35 Grad. Gemäß anderen Ausführungsformen kann der Drehwinkel zwischen 91 Grad und 179 Grad, zwischen 95 Grad und 175 Grad, zwischen 100 Grad und 170 Grad, zwischen 105 Grad und 165 Grad, zwischen 110 Grad und 160 Grad, zwischen 115 Grad und 155 Grad, zwischen 120 Grad und 150 Grad, zwischen 125 Grad und 145 Grad, zwischen 130 Grad und 140 Grad oder 135 Grad liegen.
Wie zuvor angegeben sind die Pfosten entlang einer Linie mit einem negativen Gefälle angeordnet. In dem die Zellen entlang dieser Linie orientiert werden, werden die über Pfad (p) strömenden Zellen lateral zu einer Seite der Kammer gelenkt, während die Lösung, in der die Zellen ursprünglich suspendiert waren, so (z. B. nahezu horizontal oder horizontal) strömen kann, dass sie über den Auslass-Mechanismus 120 aus der Mikrofluidik-Kammer austritt.
Unter Bezug auf 2P sind die Reihen von Pfosten gemäß noch anderen Ausführungsformen in einem Abstand (dy) angeordnet. Gemäß einigen Ausführungsformen sind die Pfosten in einem Abstand (dy) entlang einer vertikalen Linie angeordnet, wobei die Abstände regelmäßig bzw. fix sind. Ein Pfosten kann beispielsweise alle 5 µm, 10 µm, 15 µm, 20 µm, 25 µm, 30 µm, 35 µm, 40 µm, 45 µm, 50 µm, 55 µm, 60 µm, 65 µm, 70 µm, 75 µm, 85 µm, 90 µm, 95 µm, 100 µm und so weiter, einschließlich beliebiger Werte dazwischen, platziert sein, in Abhängigkeit von der Größe der zu konzentrierenden Zelle.
Gemäß anderen Ausführungsformen sind die Pfosten entlang einer vertikalen Linie angeordnet, so dass der Abstand (dy) nicht fix ist, sondern stattdessen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Reihen von Pfosten variiert. Beispielsweise kann eine erste Reihe von Pfosten an einem bestimmten Ort platziert sein, die zweite Reihe von Pfosten kann 5 µm von der ersten Reihe von Pfosten platziert sein, eine dritte Reihe von Pfosten kann 4 µm von der zweiten Reihe von Pfosten platziert sein, und so weiter, ausgerichtet im Bezug auf eine vertikalen Linie. Der Abstand (dy) kann basierend auf der Größe der zu konzentrierenden Zelle gewählt werden. Alle Abstände (dy) sind zulässig, mit der Maßgabe, dass der Abstand ausreichend weit ist, um eine Strömung der Lösung durch die Kammer zu gestatten, ohne dass hohe Drücke erforderlich sind, die das Mikrofluidik-Gerät schädigen könnten. Gemäß einigen Ausführungsformen haben aufeinanderfolgende Reihen von Pfosten einen Offset (xo) von null.
Unter Bezug auf 2Q können aufeinanderfolgende Reihen von Pfosten einen Offset (xo), bezogen auf den Abstand (dx), haben. Beispielsweise kann sich eine Reihe (r) an einem bestimmten Ort (z. B. unter Verwendung des kartesischen Koordinatensystems x, y) befinden. Die (r+1)te Reihe kann um einen Betrag (xo) nach rechts versetzt sein. Die (r+2)te Reihe kann um einen Betrag (2xo) nach rechts versetzt sein. Die (r+3)te Reihe kann um einen Betrag (3xo) nach rechts versetzt sein, und so weiter bis zum Abstand (dx). Offsets können auf eine fixe Weise vorliegen, so dass jeder weitere Reihe um einen fixen Betrag in der gleichen Richtung versetzt ist. Alternativ dazu können Offsets auf eine variable Weise vorliegen, so das jede weitere Reihe um einen variablen Betrag (bis zum Betrag von (dx)) in die gleiche Richtung versetzt ist. Gemäß anderen Ausführungsformen können Offsets in einer wechselnden Richtung angewendet werden, so das im Hinblick auf eine Reihe (r) die (r+1)te Reihe einen fixen oder variablen Offset in eine Richtung hat und die (r+2)te Reihe einen fixen oder variablen Offset in der entgegengesetzten Richtung hat (z. B. ist ein Offset nach rechts und der nächste Offset ist nach links).
Die Pfosten können aus einem beliebigen geeigneten Material hergestellt sein, einschließlich Poly(dimethylsiloxan) (PDMS), Glas, Kunststoff, Elastomeren, Silicon usw. PDMS lässt sich allgemein mit einer Submikron-Auflösung (z. B. Merkmale unterhalb 0,1 µm) herstellen. Gemäß einigen Ausführungsformen sind die Kammer 105 und/oder Pfosten 115 aus PDMS hergestellt. Gemäß anderen Ausführungsformen lässt sich die Kammer aus Glas und/oder Silicon und/oder Kunststoff herstellen und die Pfosten können mit PDMS hergestellt werden (z. B. kann der Boden der Kammer aus Glas oder Silicon und die Decke der Kammer aus Glas oder Kunststoff sein). Zur Herstellung der wie hier beschriebenen Kammern und Pfosten kann die im Stand der Technik gut bekannte Lithographie zur Anwendung kommen. Materialien mit ähnlichen Eigenschaften wie PDMS lassen sich ebenfalls zur Konstruktion der hier beschriebenen Mikrofluidik-Geräte einsetzen.
Darüber hinaus können spezielle Ausführungsformen eine Reihe zusätzlicher Merkmale umfassen, einschließlich Ventile (z. B. zwischen einem Einlass-Mechanismus und der Kammer, zwischen der Kammer und einem Auslass-Mechanismus, zwischen einem Auslass-Mechanismus und einem anderen Einlass-Mechanismus oder einer anderen Kammer usw.), Pumpen und Mischer. Gemäß einigen Ausführungsformen können Ventile während der Aushärtung in PDMS eingesetzt werden.
Zur Herstellung eines Mikrofluidik-Geräts kann man sich verschiedener Techniken bedienen. Das Mikrofluidik-Gerät kann aus einem oder mehreren der folgenden Materialien gebildet werden: Poly(methylmethacrylat) (PMMA), Polycarbonat, Polystyrol, Polyethylen, Polyolefine, Silicone (z. B. Poly(dimethylsiloxan) PDMS), Silicon und Kombinationen davon. Andere Materialien sind im Stand der Technik gut bekannt.
Verfahren zur Herstellung einer Kammer mit Pfosten und einem Mikrofluidik-Gerät unter Einsatz der hier angeführten Materialien sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und schließen, wobei dies nicht einschränkend ist, Prägen, Lasermikrobearbeitung, Mahlen, Formen (z. B. thermoplastisches Spritzformen oder Formpressen), Photolithographie (z. B. Stereolithographie oder Röntgenphotolithographie), Siliconmikrobearbeitung, nasses oder trockenes chemisches Ätzen usw. ein.
Bei Glasmaterialien lassen sich Siliconherstellungsverfahren unter Anwendung von Photolithographie gefolgt von nassem (KOH) oder trockenem Ätzen (plasmaunterstütztes Ätzen mit Fluor oder einem anderen reaktiven Gas) anwenden. Beispielsweise kann man durch herkömmliche Photolithographie eine Vorlage aus Glas bilden, die dann als Vorlageschablone für Formtechniken zur Erzeugung von einem Gerät auf Kunststoff- oder PDMS-Basis dient.
Ein Mikrofluidik-Gerät lässt sich in einer oder mehreren z. B. durch Klebstoffe, Klemmen, Hitze, Lösungsmittel usw. miteinander verbundenen Schichten herstellen. Alternativ dazu kann das Mikrofluidik-Gerät in einem einzelnen Stück angefertigt werden, z. B. unter Anwendung von Stereolithographie oder anderen dreidimensionalen Herstellungsverfahren.
Gemäß einigen Ausführungsformen kann aufgrund der Deformierbarkeit von Zellen ein Spaltabstand gewählt werden, der etwa 5 µm oder weniger als die Größe (z. B. einem Durchmesser) der Zelle, die konzentriert wird, beträgt. Gemäß anderen Ausführungsformen kann ein Spaltabstand gewählt werden, der etwa 5 µm oder mehr als die Größe (z. B. a Durchmesser) der Zelle, die sortiert wird, beträgt. Bei steifen Zellen oder Mikrosphären mit dem gleichen oder einem ähnlichen Durchmesser wie eine deformierte Zelle kann der Spaltabstand vom Spaltabstand bei deformierbaren Zellen des gleichen Durchmessers abweichen (z. B. größer bei steifen Zellen) .
2T ist eine Veranschaulichung eines anderen beispielhaften Mikrofluidik-Zellkonzentrators. Bei diesem Beispiel tritt eine erste Zellen umfassende Lösung 100 an einem ersten Einlass-Mechanismus 110 in eine Kammer 105 ein. Die Zellen sind als Kreise dargestellt. Die Zellen treten durch die Kammer 105 hindurch, die eine Matrix von Pfosten 115 umfasst, hier als rechteckige Strukturen verteilt entlang Linien mit einem Gefälle gezeigt. Beim Durchgang der Zellen durch die diagonal ausgerichteten Reihen von Pfosten in der Kammer werden die Zellen lateral zu einer Seite der Kammer abgelenkt. Ähnlich wie 2L hat die Kammer einen Boden 160 (nicht gezeigt) und gegebenenfalls eine Decke 150, die aus dem gleichen Material wie die Pfosten 115 oder einem anderen Material sein können.
Bei dem Beispiel ist in diesem System ein zweiter Einlass-Mechanismus 112 vorhanden. Eine zweite Lösung (z. B. ein Puffer, der sich von der ersten über den ersten Einlass-Mechanismus 110 in die Kammer eintretenden Lösung unterscheidet) tritt über einen zweiten Einlass-Mechanismus 112 in die Kammer ein, zum Beispiel Puffer aus Pufferröhrchen 577. Gemäß einigen Ausführungsformen kommt es zu keiner wesentlichen Mischung der ersten Lösung und der zweiten Lösung und die obere Region der Kammer 155 umfasst somit die erste Lösung und, wenn überhaupt, nur wenig der zweiten Lösung, während die untere Region der Kammer 165 die zweite Lösung und, wenn überhaupt, nur wenig der ersten Lösung umfasst. Somit handelt es sich, da die Zellen lateral abgelenkt werden und die Kammer über den Auslass-Mechanismus 122 verlassen, bei der Lösung, die die Kammer über den Auslass-Mechanismus 122 verlässt, um den zweiten Lösungspuffer.
Gemäß einigen Aspekten können Pufferveränderungen aufeinanderfolgend auftreten, in einem Kaskadendesign, wie in 2U gezeigt. Bei diesem Beispiel tritt eine erste Zellen umfassende Lösung 100 bei einem ersten Einlass-Mechanismus 110 (eins) in eine erste Kammer 105(1) ein. Die Zellen sind als Kreise dargestellt. Die Zellen treten durch die Kammer 105(1) hindurch, die eine Matrix von Pfosten 115(1) umfasst, hier als rechteckige Strukturen verteilt entlang Linien mit einem Gefälle gezeigt. Beim Durchgang der Zellen durch die diagonal ausgerichteten Reihen von Pfosten in der Kammer werden die Zellen lateral abgelenkt. Ähnlich wie 1B hat die Kammer einen Boden 160 (nicht gezeigt) und gegebenenfalls eine Decke (150), die aus dem gleichen Material wie die Pfosten 115 oder einem anderen Material sein können. Die Zellen (angereichert) verlassen die Kammer durch den Auslass 122(1), der in den Einlass-Mechanismus 110(2) strömt, wo ein zweiter Einlass-Mechanismus 112 in das System eintritt.
Eine zweite Lösung (z. B. ein Puffer), die sich von der ersten, über den ersten Einlass-Mechanismus 110(1) in die Kammer eintretenden Lösung unterscheidet, tritt über den zweiten Einlass-Mechanismus (112) in die Kammer ein. Gemäß einigen Ausführungsformen kommt es zu keiner wesentlichen Mischung der ersten Lösungen der zweiten Lösung und die obere Region der Kammer (155) umfasst somit die erste Lösung und, wenn überhaupt, nur wenig der zweiten Lösung, während die untere Region der Kammer (165) die zweite Lösung und, wenn überhaupt, nur wenig der ersten Lösung umfasst. Die Zellen (angereichert und im Puffer von Einlass-Mechanismus 112) treten durch den Auslass-Mechanismus 122(2) aus der Kammer 105(2) aus.
Gemäß anderen Aspekten können Pufferveränderungen parallel auftreten. Der Strömungspfad kann beispielsweise so geteilt werden, dass die Probe in mehreren Kammern strömt, wobei jede Kammer über einen Einlass-Mechanismus für einen Puffer verfügt. Bei dieser Konfiguration kann jeder der parallelen Kammern der gleiche Puffer zugeführt werden, so dass die Zellen im gleichen Puffer konzentriert werden. Alternativ dazu kann jede der parallelen Kammern ein anderer Puffer zugeführt werden, so dass die Zellen in verschiedenen Puffern konzentriert werden, z. B. für verschiedene stromabwärts befindliche Assays.
Im Allgemeinen kann der Einlass-Mechanismus durch eine Spritzenpumpe oder durch manuelles Herunterdrücken einer Spritze betrieben werden. Gemäß einigen Aspekten kann man bei mehreren Einlässen eine oder mehrere Spritzenpumpen verwenden, um jeden Einlass automatisch zu betreiben. Gemäß anderen Aspekten kann man bei mehreren Einlässen durch manuelles Herunterdrücken einer oder mehrerer Spritzen die Einlässe jeweils manuell betreiben.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform wird hier eine zur Bereitstellung verschiedener Elektroporationseffekte fähige Elektroporationsvorrichtung beschrieben. Beispielsweise wird ein wie in 2V veranschaulichtes Elektroporationsgerät 600 mit drei Mikromesh-Elektroden 640(1), 640(2), 640(3) bereitgestellt. Das Elektroporationsgerät 600 umfasst zwei Pfade, über die Zellen und Ladung strömen können, einen ersten Pfad zwischen Mikromesh-Elektrode 640(1) und Mikromesh-Elektrode 640(2) und einen zweiten Pfad zwischen Mikromesh-Elektrode 640(2) und Mikromesh-Elektrode 640(3) wobei die Pfeile die Strömung von Zellen anzeigen. Die Zellen können am Einlass 620 in eine Elektroporationskammer eintreten und diese am Auslass 630 verlassen. Wenngleich nicht gezeigt, wird hier in Betracht gezogen, dass mehr als ein Auslass vorhanden sein kann; beispielsweise können die Auslässe jeweils verschiedene Typen von Zellen sammeln. In dem Elektroporationsgerät 600 sind verschiedene Elektrodenspaltlängen (L1, L2, L3, L4) vorhanden. Die verschiedenen Elektrodenspaltlängen und verschiedene Pfade haben eine unterschiedliche Kapazität zur Folge; es lassen sich daher für die die jeweiligen Pfade entlangströmenden Zellen unterschiedliche elektrische Feldstärken und Elektroporationseffekte erzielen. Beispielsweise kann L2 größer sein als L4, und in einem solchen Fall kann eine Kapazität (C1) im ersten Pfad größer sein als eine Kapazität (C2) im zweiten Pfad (C1>C2). Gemäß einer beliebigen Ausführungsform können Zellen (des gleichen oder verschiedener Typen) unter Einsatz der oben beschriebenen Mikrofluidik-Geräte vorsortiert und/oder ausgewählt werden, so dass sie auf den ersten Pfad oder den zweiten Pfad gelangen.
Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass die hier beschriebenen Elektroportionsgeräte als Kartuschen vorliegen können, die in Fluidkommunikation miteinander stehen können (z. B. verbunden, gestapelt), zur Bereitstellung eines Pfades in einer gewünschten Länge und Geometrie. Beispielsweise können die Kartuschen 410, wie in 2W veranschaulicht, jeweils eine Elektroporationskammer umfassen, die eine obere Mikromesh-Elektrode 440(1) und eine untere Mikromesh-Elektrode 440(2) umfasst, wobei die Kartuschen in Reihe gestapelt sein können, wobei die Pfeile in die Strömung von Zellen durch die Kartuschen zeigen. Beispielsweise befindet sich ein Auslass der obersten Kartusche 410 in Fluidkommunikation mit einem Einlass der mittleren Kartusche 410 und ein Auslass der mittleren Kartusche 410 befindet sich in Fluidkommunikation mit einem Einlass der untersten Kartusche 410.
Die hier beschriebenen Elektroporationsvorrichtungen haben eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu Elektroporationsgeräten auf Mesh-Basis wie der in 1B gezeigten Konfiguration. Zunächst lässt sich die Wegstrecke durch die Elektroporationskammer, gemessen vom ersten Einlass zum ersten Auslass der Elektroporationskammer, erhöhen, ohne dass dies zu einer entsprechenden Zunahme beim elektrischen Feld führt. Die Zellen sind somit über eine längere Zeit einem einheitlichen elektrischen Feld ausgesetzt als bei einem strengen linearen Strömungspfad, was zu einer verbesserten Elektroporationseffizienz ohne eine entsprechende Abnahme bei der Viabilität führt.
Wenngleich die Elektroporationskammerbreite (w) zwischen der oberen Mesh-Elektrode und der unteren Mesh-Elektrode in 1B erhöht werden könnte um eine längere Wegstrecke bereitzustellen, würde eine größere Elektroporationskammerbreite eine größere Impedanz haben, und zur Erzeugung einer geeigneten Feldstärke müsste eine höhere Spannung angelegt werden. Darüber hinaus würde eine höhere Spannung wahrscheinlich eine abträgliche Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen haben. Weiterhin wäre bei Konfigurationen mit parallelen Elektrodenplatten wie in 1A die Verteilung des elektrischen Feldes nicht einheitlich.
Somit können gemäß Ausführungsformen die hier beschriebenen Elektroporationsvorrichtungen aufgrund des Offset-Einlass-Auslass-Designs ein kürzeres Elektrodenpaar haben, wodurch die Länge der Elektroporationskammer vergrößert wird, ohne dass es zu einer Zunahme des Elektrodenpaarabstands kommt.
In 3 ist eine Tabelle gezeigt, die Unterschiede zwischen einem wie hier beschriebenen Elektroportionsgerät und Elektroportionsgeräten aus dem Stand der Technik veranschaulicht. Zu solchen Unterschieden zählen, wobei dies nicht einschränkend ist: (1) das Vorhandensein der Einlass-Auslass-Offset-Distanz, (2) die Verwendung von Elektroporationsmedien mit niedriger Leitfähigkeit und niedriger Osmolarität anstelle von handelsüblichen Elektroporationsmedien wie BTX und RPMI, (3) exponentiell entladende Wellenformen, angewendet in einer Reihe von elektrischen Impulsen, und (4) ein gestuftes Fluidströmungsschema.
Während bei dem Beispiel in 2A-2C Mikromesh-Elektroden aus Edelstahl verwendet werden, sind die Elektroden nicht auf ein bestimmtes Material eingeschränkt und können aus einem beliebigen geeigneten Material gebildet werden. Beispielsweise und wie in 5 gezeigt schließt geeignetes Material Silicon, Polyimid und Mikromesh ein. Silicon und Polyimid können zur Bildung geeigneter Mikromesh-Elektroden verwendet werden, jedoch werden solche Materialien typischerweise unter Anwendung von Stand der Technik bekannten Mikroherstellungsprotokollen in Reinraumanlagen verarbeitet. Im Gegensatz dazu sind Mikromesh-Elektroden aus Edelstahl leicht einzurichten und erfordern keine speziellen Anlagen wie Reinräume.
Es versteht sich, dass man ein beliebiges geeignetes Material verwenden kann, mit der Maßgabe, dass das Mikromesh Poren aufweist, die die Passage von Zellen gestatten (z. B. sind die Mikromesh-Poren größer als die Zellen), und dass die Mikromesh-Poren kompatibel mit der Elektrodenanordnung um die Porenöffnung sind.
Elektroporationsverfahren und -parameter
Hier werden Verfahren zum Elektroporieren von Zellen mit einer Ladung bereitgestellt, zum Beispiel mit den wie oben beschriebenen Elektroporationsvorrichtungen. Die Verfahren können das Einströmen der Zellen mit der Ladung in eine Elektroporationskammer umfassen. Die Elektroporationskammer umfasst eine wie hier beschriebene obere Mikromesh-Elektrode, eine wie hier beschriebene untere Mikromesh-Elektrode und einen wie hier beschriebenen, zwischen der oberen Mikromesh-Elektrode und der unteren Mikromesh-Elektrode definierten Pfad, auf dem die Zellen und die Ladungen strömen können. Die obere Mikromesh-Elektrode und die untere Mikromesh-Elektrode haben jeweils eine wie hier beschriebene Porosität. Darüber hinaus kann die obere Mikromesh-Elektrode von einem wie hier beschriebenen ersten Material gebunden sein. Das erste Material kann einen wie hier beschriebenen ersten Einlass umfassen, der die Passage von Zellen in die Elektroporationskammer gestattet. Die untere Mikromesh-Elektrode kann von einem Zweitmaterial gebunden sein. Das zweite Material kann einen wie hier beschriebenen ersten Auslass umfassen, der die Passage von elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet. Der erste Einlass und der erste Auslass sind durch eine wie hier beschriebene Offset-Distanz beanstandet. Die Zellen können in einem Elektroporationsmedium suspendiert sein. Gegebenenfalls kann die obere Mikromesh-Elektrode weiterhin einen wie hier beschriebenen zweiten Einlass umfassen, und/oder die untere Mikromesh-Elektrode kann weiterhin einen wie hier beschriebenen zweiten Auslass umfassen.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform kann das Strömen der Zellen und Ladung stufenweise erfolgen. Beispielsweise kann ein Fluidvolumen von etwa der Hälfte des Gesamtvolumens der Elektroporationskammer in einem festgelegten Zeitintervall in die Elektroporationskammer gepumpt werden. 4 zeigt ein Beispiel einer Reihe von elektrischen Impulsen (stim) und ein beispielhaftes gestuftes Fluidströmungsschema (Pumpe). Bei dem gestuften Fluidströmungsschema beträgt das Kammervolumen ungefähr 22 µl. Jede Sekunde werden 11 µl in die Elektroporationskammer gepumpt, wobei die Hälfte des Volumens verdrängt wird. Dies kann solange wie zur Verarbeitung der gewünschten Menge an Zellen erforderlich wiederholt werden.
Ein beliebiges Zeitintervall kann zusammen mit einem geeigneten Volumen für das gestufte Fluidströmungsschema verwendet werden. Das Zeitintervall kann beispielsweise im Bereich von etwa 0,1 Sekunden bis etwa 10 Sekunden, von etwa 0,5 Sekunden bis etwa 5 Sekunden, von etwa 1 Sekunde bis etwa 2 Sekunden, oder einer beliebigen Zeitspanne dazwischen liegen oder kann längere Intervalle einschließen. Gemäß einigen Aspekten kann es sich bei der als eine Funktion der Zeit in die Elektroporationskammer gepumpte Menge an Fluid um drei Viertel des Volumens der Einlasskammer, die Hälfte des Volumens der Elektroporationskammer, ein Viertel des Volumens der Elektroporationskammer, ein achtel des Volumens der Elektroporationskammer oder weniger handeln.
Gemäß einer beliebigen Ausführungsform werden die Zellen in der Elektroporationskammer einem einheitlichen oder im Wesentlichen einheitlichen elektrischen Feld ausgesetzt. Die Zellen können in der Elektroporationskammer mehreren elektrischen Impulsen ausgesetzt werden, wobei die einzelnen elektrischen Impulse gleich oder verschieden sind. Gemäß einigen Ausführungsformen wird ein elektrischer Gleichstromimpuls (Direct Current, DC) angewendet. Darüber hinaus oder alternativ dazu wird ein elektrischer Wechselstromimpuls (Alternating Current, AC) elektrischer Impuls angewendet. Gemäß einer beliebigen Ausführungsform können die Impulse jeweils eine Form einer exponentiell entladenden Wellenform oder einer quadratischen Wellenform haben. Gemäß beliebigen Ausführungsformen können die mehrfachen elektrischen Impulse sowohl eine exponentiell entladende Wellenform und eine quadratische Wellenform einschließen.
Bei der Reihe von elektrischen Impulsen kann alle 100 ms bis 5000 ms (z. B. alle 100 ms, alle 250 ms, alle 500 ms, alle 1000 ms, alle 2000 ms, alle 3000 ms usw.) eine Spannung an die Elektroden angelegt werden, um ein elektrisches Feld einer gegebenen Stärke aufzubauen. Dies kann solange wie zum Verarbeiten einer gewünschten Menge an Zellen erforderlich wiederholt werden. Dementsprechend versteht es sich, dass, während Aspekte als eine kontinuierliche Strömung bezeichnet werden können, kontinuierliche Strömung ein gestuftes Fluidströmungsschema einschließt, bei dem Fluid kontinuierlich gemäß einem definierten Zeitintervall in die Elektroporationskammer gepumpt wird.
Man kann beliebige geeignete Zeitintervalle zusammen mit einer beliebigen geeigneten Dauer des elektrischen Impulses für Zellen in der Elektroporationskammer verwenden. Das Zeitintervall zwischen Impulsen kann beispielsweise im Bereich von etwa 0,1 Sekunden bis etwa 5 Sekunden, von etwa 0,2 Sekunden bis etwa 1 Sekunde, von etwa 0,4 Sekunden bis etwa 0,6 Sekunden oder einem beliebigen Zeitraum dazwischen liegen und kann längere Intervalle einschließen. Gemäß einigen Aspekten kann die Dauer des elektrischen Impulses im Bereich von etwa 10ms bis etwa 250 ms, von etwa 50ms bis etwa 150 ms, von etwa 75 ms bis etwa 125 ms oder einem beliebigen Bereich dazwischen liegen.
Es können beliebige geeignete Zellen, zum Beispiel Säugetierzellen, Nichtsäugetierzellen oder beide, mit einer Ladung transferziert werden. Beispiele für geeignete Säugetierzellen schließen, wobei dies nicht einschränkend ist, NK-Zellen, EC-7-Zellen (ein Derivat von HEK-293-Zellen, das so modifiziert wurde, dass es Adenovirus produziert), T-Zellen, Embryozellen, Stammzellen, Epithelzellen, Lymphozyten, Makrophagen, Gametenzellen und Fibroblasten ein. Beispiele für geeignete Nichtsäugetierzellen schließen, wobei dies nicht einschränkend ist, Bakterienzellen und Hefezellen ein. Man kann eine beliebige geeignete Ladung verwenden, zum Beispiel eine Nukleinsäure. Bei der Nukleinsäure kann es sich um eine RNA z. B. synthetische RNA, mRNA, in vitro transkribierte RNA, GFP-mRNA usw.) und/oder eine DNA (z. B. synthetische DNA, GFP-DNA, Plasmid-DNA usw.) handeln. Insbesondere können mit dem hier beschriebenen IOCO-Elektroporationsgerät NK-Zellen, EC-7-Zellen (ein Derivat von HEK-293-Zellen, das so modifiziert wurde, dass es Adenovirus produziert) und T-Zellen mit RNA (z. B. synthetischer RNA, mRNA, in vitro transkribierter RNA, GFP-mRNA usw.) und/oder DNA (z. B. synthetische DNA, GFP-DNA, Plasmid-DNA usw.) transfiziert werden. Es wird hier außerdem in Betracht gezogen, dass die hier beschriebenen Elektroporationsvorrichtungen zum Durchführen einer Invitro-Befruchtung verwendet werden können. Beispielsweise könnten ein Ei und Sperma durch einen wie hier beschriebenes Elektroportionsgerät strömen, um das Ei zu befruchten.
Gemäß weiteren in Betracht gezogenen Aspekten handelt es sich bei dem Medium bzw. Elektroporationspuffer, in dem die Zellen transfiziert werden, um ein Medium mit geringer Leitfähigkeit und geringer Osmolarität, das gegebenenfalls ein oder mehrere Nährstoffe enthält. Geeignete Medien schließen daher, wobei dies nicht einschränkend ist, die folgenden ein: Cw100 (0,11 S/m, 0,12 osm/1) oder Cw240. es ist möglich, handelsübliche Elektroporationsmedien zu verwenden, jedoch hat sich dies als suboptimal erwiesen. Solche handelsüblichen Medien schließen die folgenden ein: RPMI (1,37 S/m, 0,28 osm/l) und BTX (8 mS/m, 0,27 osm/l). Geeignete Leitfähigkeiten können im Bereich von etwa 0,05 mS/m bis etwa 0,2 S/m liegen. Geeignete Osmolaritäten können im Bereich von etwa 0,05 osm/l bis etwa 0,2 osm/l liegen. Bei den Medien handelt es sich im Allgemeinen um elektrisch leitfähige Medien, die außerdem steril sein können. Tabelle 1. Zusammensetzung von Elektroporationsmedien

KH₂PO₄ Na₂HPO₄ MgSO₄-7H₂O Saccharose HEPES

Cw240 2 mM 5 mM 1 mM 200 mM 15 mM

Cw100 2 mM 0 mM 1 mM 99 mM 20 mM
Was geeignete Kapazitäten betrifft, so wird in Betracht gezogen, dass die Kapazität im Bereich von etwa 1 µF bis etwa 150 µF liegen kann. Gemäß einigen Ausführungsformen kann die Kapazität im Bereich von etwa 1-100 µF, von etwa 5 bis etwa 75 µF, von etwa 5 bis etwa 50 µF, von etwa 10 bis etwa 40 µF oder von etwa 10 bis etwa 30 µF oder von etwa 10 bis etwa 25 µF liegen. Gemäß anderen Ausführungsformen beträgt die Kapazität etwa 10 µF.
Gemäß einigen Ausführungsformen kann man mehrere elektrischen Impulse zusammen mit einer entsprechend kurzen Zeitkonstante anwenden. Gemäß einigen Aspekten kann man eine Zeitkonstante von weniger als 30 ms, weniger als 20 ms, weniger als 10 ms oder weniger als 5 ms verwenden. Gemäß anderen Aspekten kann eine Zeitkonstante im Bereich von etwa 0,5 bis 30 ms, von etwa 1 bis 20 ms und von etwa 5 bis 15 ms oder etwa 10 ms liegen.
Gemäß einigen Aspekten liegt die elektrische Feldstärke für die Elektroporation zwischen etwa 0,3-3 kV/cm. Es wurde gefunden, dass sich niedrigere elektrische Feldstärken (z. B. etwa 0,5-1kV/cm) für EC-7-Zellen eignen, während gefunden wurde, dass sich höhere elektrische Feldstärken (z. B. etwa 1-3kV/cm) für haNK-Zellen eignen. Im Allgemeinen werden hier elektrische Feldstärken für die Elektroporation im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5 kV/cm in Betracht gezogen. Die Spannung kann so gewählt werden, dass sie geeignete elektrische Feldstärken erzeugt.
Im Allgemeinen kann die Impedanz (Rp) im Bereich von etwa 200 Ω bis unendlich oder in anderen Fällen von etwa 200 Ω bis zu etwa 1k liegen.
Die Konzentration der der Elektroporationsreaktion zugesetzten Ladung, z. B. des in die Zelle einzubringenden Materials, hat eine Konzentration von etwa 50 µg/ml. Gemäß einigen Aspekten wurde der Elektroporationsreaktion GFP-mRNA oder GFP-DNA in einer Konzentration von etwa 50 µg/ml zugesetzt, während gemäß anderen Ausführungsformen der Elektroporationsreaktion Dextran 500k in einer Konzentration von etwa 50 µg/ml zugesetzt wurde.
Was geeignete Impulszahlen und Impuls-zu-Impuls-Intervalle betrifft, so können mindestens zwei, drei und vier Impulse wünschenswertere Ergebnisse liefern als ein einzelner Impuls oder von fünf oder mehr Impulsen. Es wird daher in Betracht gezogen, dass Impulse im Bereich zwischen 2-4 Impulsen liegen können. Typischerweise sind die Impulse durch ein relativ kurzes Zeitintervall, typischerweise zwischen 0,5 Sekunden und 15 Sekunden, von folgenden Impulsen getrennt, wenngleich in einigen Fällen noch längere Intervalle verwendet werden können.
Gemäß einigen Aspekten lassen sich in einem Einkammergerät bis zu 7,33 ul/s bei 4×10⁷ Zellen/ml (13,2 ml (5,28×10⁸ Zellen) in 30 min erzielen. Zum Erzielen von 20×10⁹ Zellen in 30 min kann die Zelldichte um einen Faktor von vier erhöht und/oder eine Parallelverarbeitung unter Einsatz mehrerer Elektroporationskammern durchgeführt werden.
Gemäß einigen Aspekten und weiter zu den unten angeführten Beispielen wurden Elektroporationselektronik und -parameter speziell entwickelt und für die Elektroporation von haNK- und EC7-Zellen optimiert.
Gemäß einer Ausführungsform können die hier beschriebenen Verfahren weiterhin einen ersten Zellsortierschritt und/oder einen zweiten Zellsortierschritt zum Beispiel unter Einsatz der wie hier beschriebenen Mikrofluidik-Geräte umfassen. Beim ersten Zellsortierschritt können die Zellen vor dem Einbringen in die Elektroporationskammer sortiert werden, in dem man Druck anwendet, durch den eine erste die Zellen umfassende Lösung zum Strömen durch eine wie hier beschriebene Mikrofluidik-Kammer gebracht wird, die mehrere Reihen von wie hier beschriebenen Pfosten umfasst und die Zellen durch die Reihen von Pfosten zu einer Seite der Kammer ablenkt, um Zellen von der aus einem ersten wie hier beschriebenen Auslass-Mechanismus austretenden Lösung abzureichern und Zellen in der aus einem zweiten wie hier beschriebenen Auslass-Mechanismus austretenden Lösung anzureichern. Die aus dem zweiten Auslass-Mechanismus austretenden Zellen können mit der Ladung in die Elektroporationskammer eingebracht werden. Beim zweiten Zellsortierschritt können die elektroporierten Zellen nach dem Austritt aus der Elektroporationskammer sortiert werden, indem man Druck anwendet, der eine vierte, die elektroporierten Zellen umfassende Lösung dazu bringt, durch eine wie hier beschriebene Mikrofluidik-Kammer zu strömen, die mehrere Reihen von wie hier beschriebenen Pfosten umfasst und die elektroporierten Zellen durch die Reihen von Pfosten zu einer Seite der Kammer ablenkt, um elektroporierte Zellen von der aus einem dritten wie hier beschriebenen Auslass-Mechanismus austretenden Lösung abzureichern und elektroporierte Zellen in der aus einem vierten wie hier beschriebenen Auslass-Mechanismus austretenden Lösung anzureichern.
Die hier bereitgestellten Techniken und Verfahren können als Teil eines Arbeitsablaufs in verschiedene Geräte oder Plattformen integriert werden. Beispielsweise kann man eine wie hier beschriebene Elektroporationsvorrichtung in ein automatisches Gerät einbauen, zum Beispiel in katholischen Formen, wobei die Elektroporation zusammen mit einem oder mehreren anderen automatisierten Verfahren an Zellen durchgeführt werden kann. Eine automatisierte Elektroporierung lässt sich beispielsweise zusammen mit automatisierter Zellkultivierung und -ernte durchführen, wie in der US-Patentveröffentlichung Nr. 2017/0037357, die hiermit in ihrer Gesamtheit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung wird, beschrieben.
Gemäß anderen Aspekten werden Verfahren zur Inn-vivo-Transfektion bereitgestellt, wobei die oben beschriebenen Verfahren durchgeführt und die transfizierten Zellen, zum Beispiel mit einem isotonische Puffer gemischt, einem Patienten zur Behandlung einer Krankheit oder Störung verabreicht werden können. Beispiele für Krankheiten schließen, wobei dies nicht einschränkend ist, eine mitochondriale Störung, kardiale Dysfunktion, Herzinsuffizienz, Autismus, Diabetes mellitus und Taubheit ein. Es wird hier außerdem in Betracht gezogen, dass die hier beschriebenen Elektroporationsvorrichtungen auf die Anwendung auf Zielgewebe eines Subjekts angepasst werden können, um die Verabreichung eines Arzneimittels oder einer Formulierung zu unterstützen, zum Beispiel die Verabreichung von Insulin oder eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes zu unterstützen. Man könnte beispielsweise Elektroden für die Elektroporation auf die Haut aufbringen oder ein nadelähnliches Elektrodenpaar subkutan verabreichen.
Es werden hier außerdem Kits bereitgestellt. Die Kits können beispielsweise eine wie hier beschriebene Elektroporationsvorrichtung und gegebenenfalls geeignete Reagenzien umfassen. Geeignete Reagenzien schließen, wobei dies nicht einschränkend ist, wie hier beschriebene Zellen für die Transfektion, ein wie hier beschriebenes Elektroporationsmedium und eine Kombination davon ein. Darüber hinaus oder alternativ dazu kann ein Kit weiterhin Elektroporationschips, Verbindungsschläuche, Vorrichtung, Werkzeuge zur Elektroporation, Elektroporationspuffers, Zusätze, Reagenzien und Kombination davon umfassen.
BEISPIELE
Beispiel 1. Transfektion von haNK-Zellen.

Gemäß einigen Aspekten sind die Bedingungen für die Elektroportionen von haNK-Zellen in Tabelle 2 unten gezeigt. Tabelle 2. Bedingungen für die Elektroporation von haNK-Zellen

EP-Parameter	Wert	EP-Parameter	Wert
Ladung	Dextran 500k (dx500k) bei 50 ug/ml; GFP-mRNA (mRNA) bei 50 ug/ml	Fließgeschwindigkeit	4-6,8 Millionen Zellen/min
Zelldichte	5×10⁶ ~ 1x10⁷/ml	Gesamte Probe	16 Millionen Zellen
Medien	BTX: 8 mS/m, 0,27 osm/l; Cw100: 0,11 S/m, 0,12 osm/l; RPMI: 1,37 S/m, 0,28 osm/l	Frequenz	2 Hz
Widerstand (Rp)	200 Ω - unendlich	Impulszahl	3-4 Impulse (entladend oder monophasische Impulsfolge)
Elektrisches	1-3 kV/cm	Qavg	0,11 - 0,44 ml/min
Feld
Kapazität	10 uF - 150 uF	Probengröße (Küvette)	0,45 ml
Gerät	∅5mm, d=420um, reg;	Zeitkonstante	10 - 30 ms
Parameter	∅5mm, d=560um, reg;
	∅10mm, d=284um, Offset

6A-E zeigen die experimentellen Ergebnisse von Elektroporationsreaktionen. 6A zeigt verschiedene experimentelle Bedingungen mit unterschiedlichen Effizienzen und Viabilitäten. Es ist beachtenswert, dass Bedingungen mit 1,5 kv/cm, Rp 1k, 10 uF unter Einsatz des IOCO-Elektroporationsgerätes bei der GFP-mRNA-Elektroporation in haNK-Zellen eine Effizienz von mehr als 80% mit mehr als 70% Viabilität lieferten. Die Bezeichnung „reg“ bezieht sich auf das ursprüngliche Mikromesh, während „Offset“ sich auf das Offset-Mikromesh bezieht. 6B zeigt ein Mikroskopiebild von GFP-mRNA, die in haNK-Zellen elektroporiert wurde. 6C und 6D zeigen Ergebnisse von Zellsortierung, wobei 6C lebende Zellen zeigt und 6D elektroporierte Zellen zeigt. 6E zeigt ein Histogramm, das den Zellsortierergebnissen entspricht, das die Kontrollzellen und mit GFP elektroporierte Zellen zeigt.
7A-7D zeigen einen anderen Satz experimenteller Ergebnisse mit anderen experimentellen Elektroporationsbedingungen, mit einer Effizienz von mehr als 50% und einer Viabilität von mehr als 70% bei der GFP-mRNA-Elektroporierung in haNK-Zellen. 7B und 7C zeigen Ergebnisse von Zellsortierung, wobei 7B lebende Zellen zeigt und 7C elektroporierte Zellen zeigt. 7D zeigt ein Histogramm, das den Zellsortierergebnissen entspricht, das die Kontrollzellen und mit GFP elektroporierte Zellen zeigt. Es wurde die GFP-Expression in den lebenden Zellen gezählt (Propidiumiodid-negativ, PI-). CTL steht für Kontrollexperimente.
Beispiel 2. Transfektion von EC7-Zellen.

Typische Bedingungen für die Elektroporation von EC7-Zellen sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Tabelle 3. Bedingungen für die Elektroporation von EC7-Zellen

EP-Parameter	Wert	EP-Parameter	Wert
Ladung	Dextran 500k (dx500k) bei 50 ug/ml; GFP-mRNA (mRNA) bei 50 ug/ml; GFP-DNA (DNA) bei 50 ug/ml	Fließgeschwindigkeit	4 -17,6 Millionen Zellen/min
Zelldichte	5×10⁶∼4×10⁷/ml	Gesamte Probe	16 Millionen Zellen
Medien	BTX: 8 mS/m, 0,27 osm/l; Cw100: 0,11 S/m, 0,12 osm/l; Cw240: 0,2 S/m, 0,24 osm/l; Eppendorf: 0,35 S/m, 0,09 osm/l; Wasser	Frequenz	2 Hz
Widerstand (Rp)	200 Ω bis unendlich	Impulszahl	3-4 Impulse (entladend oder monophasische Impulsfolge)
Elektrisches	0,3 - 3 kV/cm	Qavg	0,44 ml/min
Feld
Kapazität	10 - 75 uF	Probengröße (Küvette)	0,44 - 0,45 ml
Geräteparameter	∅5mm, d=420um, Reg; ∅5mm, d=560um, Reg; ∅10mm, d=284um, Offset	Zeitkonstante	5 - 20 ms

8A-E zeigen die experimentellen Ergebnisse von Elektroporationsreaktionen in EC-7-Zellen.
8A zeigt verschiedene experimentelle Bedingungen mit unterschiedlichen Effizienzen und Viabilitäten. Es ist beachtenswert, dass Bedingungen mit 1,5 kv/cm, Rp 200, 10 uF unter Einsatz des IOCO-Elektroporationsgerätes bei der GFP-DNA-Elektroporation in EC-7-Zellen eine Effizienz von mehr als 90% und eine Viabilität von mehr als etwa 50% lieferten. 8B-8C zeigen Ergebnisse von Zellsortierung, wobei 8B lebende Zellen zeigt und 8C elektroporierte Zellen zeigt. 8D ist ein Histogramm, das den Zellsortierergebnissen entspricht, das die Kontrollzellen und mit GFP elektroporierte Zellen zeigt.
9A-9D zeigen zusätzliche Sätze experimenteller Ergebnisse in EC-7-Zellen unter anderen experimentellen Elektroporationsbedingungen. 9B und 9C zeigen Ergebnisse von Zellsortierung, wobei 9B lebende Zellen zeigt und 9C elektroporierte lebende Zellen zeigt. 9D zeigt ein Histogramm, das den Zellsortierergebnissen entspricht, mit Kontrollzellen und mit GFP elektroporierten Zellen. Es wurde die GFP-Expression in den lebenden Zellen gezählt (Propidiumiodid-negativ, PI-). CTL steht für Kontrollexperimente.
10A-10C zeigen Bilder von GFP-DNA, die unter Verwendung des Offset-Kammer-Elektroporationsgeräts von 2A-C erfolgreich in EC-7-Zellen elektroporiert wurden.
10A wurde 20 Stunden nach der Elektroporation aufgenommen und zeigt die Elektroporation von GFP-DNA und GFP-AD5 (DNA, die für die Produktion von AD5-Virus codiert) in EC-7-Zellen. 10B wurde 44 Stunden nach der Elektroporation aufgenommen und zeigt die Elektroporation von GFP-DNA und einem DNA-Shuttle-Vektor in EC-7-Zellen. 10C wurde 6 Tage nach der Elektroportion aufgenommen und zeigt einen Vergleich von Elektroporationsergebnissen mit Mikromesh gegenüber einer Küvette.
10C zeigt außerdem Kometenbildung während der frühen Stufen der AD5-Virusproduktion in EC7-Zellen, gemäß den hier dargestellten Ausführungsformen.
Bei dieser Reihe von Bildern bilden die Zellen einen Cluster bzw. einen „kometen“ förmigen Plaque, wobei die Form einzelner Zellen abgerundeter wird.
Wie durch diese Reihe von Bildern gezeigt, wurden die EC-7-Zellen erfolgreich mit fluoreszent getaggter viraler DNA (zur AD5-Virusproduktion) elektroporiert und waren dazu fähig, die Virusproduktion einzuleiten, was darauf hindeutet, dass sich die hier bereitgestellten Techniken und Systeme zur Adenovirusproduktion eignen (z. B. zur Verwendung in viralen Impfstoffen und zur Produktion viraler Proteine).
11A und 11B zeigen zusätzliche Ergebnisse der Transfektion von EC7-Zellen unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte. 11A zeigt eine Tabelle von Elektroporationsparametern, bei denen die Menge an Ladung zwischen den Elektroporationsläufen variiert wurde. In 11B sind Bilder sechs Tage nach der Elektroporation gezeigt. Vierzehn Tage nach der Elektroproportion wurde eine Effizienz von etwa 70-80% beobachtet. Nach der Transfektion wurden mehrere „kometen“ förmige Cluster beobachtet. Etwa 17-18 Millionen Zellen/min können in EC7-Zellen transfiziert werden, bei einer Zellkonzentration von etwa 40 m/ml in Elektroporationspuffer cw100, der eine Leitfähigkeit von etwa 240 mS/m hat.
Beispiel 3. Electroporation verschiedener Zelltypen.
Gemäß anderen Aspekten können die hier bereitgestellten Verfahren und Systeme zur Transfektion verschiedener unterschiedlicher Zelltypen angewendet werden. Beispielsweise lassen sich durch die hier bereitgestellten Verfahren und Systeme bis zu 10⁸ Zellen oder mehr transfizieren. Mit den hier bereitgestellten Verfahren und Systemen lassen sich EC7-Zellen, haNK-Zellen, CHO-Zellen und T-Zellen transfizieren. Die hier dargestellten Verfahren und Techniken können beispielsweise zum Transfizieren von EC7-Zellen bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/min mit einer Zellkonzentration von 4×10⁷ Zellen/ml angewendet werden. In einem anderen Beispiel können die hier dargestellten Verfahren und Techniken zum Transfizieren von haNK-Zellen bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,36 ml/min mit einer Zellkonzentration von 3×10⁷ Zellen/ml angewendet werden. In noch einem anderen Beispiel können die hier bereitgestellten Verfahren und Techniken zum Transfizieren von CHO Zellen bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,45 ml/min mit einer Zellkonzentration von 2,5×10⁷ Zellen/ml angewendet werden. Bei T-Zellen können die hier dargestellten Verfahren und Techniken zum Transfizieren von T-Zellen bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,44 ml/min mit einer Zellkonzentration von etwa 2×10⁷ Zellen/ml angewendet werden. Diese Bedingungen können zum Erzielen optimaler Bedingungen weiter variiert werden.
12A-12D zeigen verschiedene Transfektion Effizienz für diese verschiedenen Zelllinien, unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren und Geräte. 12A zeigt eine Transfektionseffizienz von mehr als 95% mit einer Zellviabilität von mehr als 90% für haNK-Zellen (transfiziert mit GFP-mRNA). Es wurden bis zu 0,127 Milliarden Zellen/min transfiziert. 12B zeigt eine Transfektionseffizienz von mehr als 90% mit einer Zellviabilität von mehr als 50% für CHO-Zellen (transfiziert mit GFP pmax DNA). Es wurden bis zu 15 Millionen Zellen/min transfiziert. 12C zeigt eine Transfektionseffizienz von mehr als 95% mit einer Zellviabilität von mehr als 50% für EC7-Zellen (transfiziert mit GFP-Adenovirus-DNA). Es wurden bis zu 20 Millionen Zellen/min oder mehr transfiziert. 12D zeigt eine Transfektionseffizienz von mehr als 90% mit einer Zellviabilität von mehr als 80% für T-Zellen (transfiziert mit GFP-mRNA). Es wurden bis zu 8,8 Millionen Zellen/min transfiziert.
Beispiel 4. Transfektion von primären T-Zellen
Gemäß anderen Aspekten wurden die hier dargestellten Verfahren und Systeme zum Elektroporieren von primären T-Zellen mit mRNA gebunden an Poly(β-aminoester) verwendet. Es wurde gezeigt, dass bestimmte Poly(β-aminoester)-Polymere als effektive RNA-Transfektionsmittel wirken.
RNA und Poly(β-aminoester)-Polymere umfassende Nanopartikel wurden zur Verabreichung von mRNA an T-Zellen verwendet (siehe z. B. Moffett, et al., Nature Communications (2017) 8:389). Beispielsweise können gemäß einigen Ausführungsformen Nanopartikel mit einer auf Polyglutaminsäure(PGA) basierenden Hülle erzeugt werden. An das PGA-Molekül kann ein zielführendes Molekül (z. B. eine Bindungsdomäne eines Antikörpers) angeheftet werden, um das Nanopartikel zu einem entsprechenden Ziel zu lenken. Um das Nanopartikel beispielsweise auf T-Zellen zu lenken, könnte man an PGA-Moleküle eine Anti-CD3/Anti-CD28-Bindungsdomäne anheften. Zur Zielführung lässt sich PGA oder ein anderes geeignetes negativ geladenes Molekül verwenden. Die Aufnahme des Nanopartikels kann durch spezifisches Targeting oder durch kationische Membranassoziation erfolgen.
Das Innere des Nanopartikels kann mRNA und ein Trägermolekül wie Poly(β-aminoester) umfassen. Nach der Aufnahme des Nanopartikel Cindy Zelle wird die mRNA durch Abbau des Nanopartikel, durch osmotisches Quellen oder durch einen anderen geeigneten Prozess in der Zelle freigesetzt und die mRNA wird in ihr entsprechendes Protein transkribiert. In einigen Fällen kann man zur Reduktion des mRNA-Abbaus synthetische mRNA verwenden.
Mit den hier bereitgestellten Verfahren lässt sich mRNA in Zellen transfizieren, z. B. unter Einsatz von mRNA und einem Poly(β-aminoester)(PbAE)-Träger oder unter Einsatz eines Nanopartikels, in dem mRNA und ein Poly(β-aminoester) verkapselt sind. 13A-13E zeigen T-Zell-Transfektionen mit PbAE komplexiert mit mRNA (keine freie mRNA, und ohne Elektroporation). 13A zeigt die Struktur eines Poly(β-aminoesters), der sich für die Verwendung mit den hier bereitgestellten Techniken eignet. 13B zeigt Zellsortierergebnisse unter Anwendung von Durchflusszytometrie von T-Zellen transfiziert mit mRNA mittels PbAE. 13C ist eine graphische Darstellung normalisierte Ergebnisse für lebende Zellen basierend auf verschiedenen Verhältnissen von mRNA zu Trägermolekül. 13D und 13E zeigen Zellviabilitätsergebnisse unter verschiedenen Bedingungen für die GFP-mRNA-Transfektion in stimulierten T-Zellen (13D) und nicht stimulierten T-Zellen (13E). Bei diesen Instrumenten führte ein PbAE:RNA-Verhältnis von 60:1 zu einem hohen Grad lebensfähiger Zellen, unter Bereitstellung einer hohen GFP-Verabreichungsrate.
14A und 14B zeigen die T-Zell-Transfektion mit GFP-mRNA mit Kontrollzellen (keine Elektroporation) und elektroporierten Zellen. Insbesondere zeigt 14A Kontrollzellen (keine Elektroporation), wobei hauptsächlich Hintergrundfluoreszenz beobachtet wird. 14B zeigt elektrooperierte Zellen, wobei in den meisten Zellen GFP-mRNA detektiert wird, wie sich im Histogramm zeigt.
Beispiel 5. Transfektion von mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe
(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells, AD-MSC)
Mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe (Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells, AD-MSC) abgelöst und geerntet bei einer Dichte von etwa 1×10^5 Millionen pro Milliliter. Die Zellen wurden mit PBS und Elektroportionspuffer gewaschen und in einer Dichte von 3,3 Millionen Zellen pro Milliliter in Elektroporationspuffer suspendiert. Jede Bedingung wurde mit 0,1 Milliliter Endzelldichte mit 30 ug DNA elektroporiert. Die Elektrooperationsbedingungen waren wie folgt: Impulsbreite = 100 us, Impulsperiode = 340 ms, die elektrische Feldstärke wurde von 0,9 bis 1,6 kV/cm variiert, wie in Tabelle 4 unten gezeigt Tabelle 4. Elektroporations-Feldstärkebedingungen

Nr. kv/cm

1 1,6

2 1,5

3 1,4

4 1,3

5 1,2

6 1,1

7 1,0

8 0,9
Nach der Elektroporation wurden die Zellen in einer Dichte von 30×10^3 Zellen pro Quadratzentimeter gesät. Die Effizienz der GFP-Expression wurde 24 Stunden nach der Elektroporation mittels Durchflusszytometrie verifiziert. Die Ergebnisse sind in 15A-15D gezeigt. Die x-Achsen-Werte von 1-8 in jeder der 15A-15C entsprechend den in Tabelle 4 gezeigten Feldstärken und „CTL“ steht für die Kontrolle ohne Elektroporation. 15A zeigt die Zellviabilität 24 h nach der Elektroporation. Je niedriger die elektrische Feldstärke, desto lebensfähiger sind die Zellen. 15B zeigt die Expression von GFP (grünem fluoreszierendem Protein), abgelesen durch Durchflusszytometrie, bei der Messung der Zelltransfektionseffizienz 24 Stunden nach der Elektroporation. Je stärker das elektrische Feld, desto höher der Prozentsatz an GFP exprimieren den lebenden Zellen. 15C den Medianwert der GFP-Fluoreszenz, der angibt, wie stark das GFP bei der Durchflusszytometriemessung leuchtete. Je stärker das elektrische Feld, umso heller leuchtend das gemessene GFP. Die Ergebnisse legen nahe, dass elektrische Feldstärken zwischen 1,1 bis 1,3 kv/cm die beste Leistung für Viabilität und Effizienz geben. Es sei angemerkt, dass die Viabilität hier sowohl anhaftende Zellen als auch über Stand einschließt, um die wahre Gesamtviabilität wiederzugeben. 15D ist ein Foto des MSC-Transfektion Ergebnisses. Das Foto auf der linken Seite zeigt die Morphologie der MSCs und das Bild auf der rechten Seite ist ein Fluoreszenzbild vom gleichen optischen Feld, das zeigt, dass die meisten der Zellen grünes fluoreszentes Protein (grün) exprimieren.
Gemäß einigen Ausführungsformen sind die Zahlen, die Mengen von Inhaltsstoffen, Eigenschaften wie Konzentration, Reaktionsbedingungen usw. ausdrücken, die zur Beschreibung und Beanspruchung bestimmter Ausführungsformen verwendet werden, so zu verstehen, dass sie in gewissen Fällen durch den Begriff „etwa“ modifiziert sind. Dementsprechend sind gemäß einigen Ausführungsformen die in der Beschreibung und den angefügten Ansprüchen angeführten numerischen Parameter Annäherungen, die in Abhängigkeit von den von einer bestimmten Ausführungsformen angestrebten gewünschten Eigenschaften variieren können. Gemäß einigen Ausführungsformen sollten die numerischen Parameter angesichts der Anzahl angegebener signifikanter Stellen und durch Anwendung herkömmlicher Rundungsverfahren ausgelegt werden. Ungeachtet dessen, dass die im breiten Umfang einige Ausführungsformen angeführten numerischen Bereiche und Parameter Annäherungen sind, sind die in den speziellen Beispielen angegebenen numerischen Werte so genau wie möglich angeführt. Die in einigen Ausführungsformen angeführten numerischen Werte können bestimmte Fehler enthalten, die sich zwangsläufig aus den in ihren jeweiligen Testmessungen gefundenen Standardabweichung ergeben.
Wie in der vorliegenden Beschreibung und den folgenden Ansprüchen verwendet, schließt die Bedeutung von „ein“ bzw. „eine“ und „der“, „die“ bzw. „das“ einen Verweis auf den Plural ein, wenn aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht. Außerdem schließt die Bedeutung von „in“, wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, „in“ und „an“ ein, wenn aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht. Wenn aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht, sollten alle hier angeführten Bereiche einschließlich ihrer Endpunkte interpretiert werden, und Bereiche ohne Endpunkte sollten so interpretiert werden, dass sie kommerziell praktische Werte einschließen. In ähnlicher Weise sollten alle Aufzählungen von Werten so angesehen werden, dass sie Zwischenwerte einschließen, wenn aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht.
Es sollte dem Fachmann außerdem offensichtlich sein, dass neben den bereits hier beschriebenen viele weitere Modifikationen möglich sind, ohne von den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Konzepten abzuweichen. Außerdem sollten bei der Interpretation sowohl der Beschreibung als auch der Ansprüche alle Begriffe in der breitestmöglichen mit dem Zusammenhang vereinbaren Weise interpretiert werden. Insbesondere sollten die Begriffe „umfasst“ und „umfassend“ so interpretiert werden, dass sie sich in einer nicht ausschließenden Weise auf Elemente, Komponenten oder Schritte beziehen, was bedeutet, dass die Elemente, Komponenten bzw. Schritte, auf die Bezug genommen wird, zusammen mit anderen Elementen, Komponenten bzw. Schritten vorhanden sind oder verwendet werden oder kombiniert sind, auf die nicht ausdrücklich hingewiesen wird. Beziehen sich die Ansprüche der Erfindung auf mindestens ein Element ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A, B, C .... und N, so sollte der Text so interpretiert werden, dass nur ein Element aus der Gruppe erforderlich ist, und nicht A plus N, oder B plus N, usw.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 62/695436 [0001]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Selmeczi, D. et al., „Efficient large volume electroporation of dendritic cells through micrometer scale manipulation of flow in a disposable polymer chip“, Biomed Microdevices, 13: 383-392 (2011) [0007]

Claims

Verfahren zum Elektroporieren von Zellen mit einer Ladung, bei dem man: die Zellen mit der Ladung in eine Elektroporationskammer spült, wobei die Elektroporationskammer Folgendes umfasst: eine obere Mikromesh-Elektrode, eine untere Mikromesh-Elektrode und einen zwischen der oberen Mikromesh-Elektrode und der unteren Mikromesh-Elektrode definierten Pfad, auf dem die Zellen und die Ladung strömen können, wobei die obere Mikromesh-Elektrode und die untere Mikromesh-Elektrode jeweils eine Porosität aufweisen, wobei die obere Mikromesh-Elektrode von einem ersten Material gebunden ist, wobei das erste Material einen ersten Einlass umfasst, der die Passage von Zellen in die Elektroporationskammer gestattet, wobei die untere Mikromesh-Elektrode von einem zweiten Material gebunden ist, wobei das zweite Material einen ersten Auslass umfasst, der die Passage von elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet, wobei der erste Einlass und der erste Auslass durch eine Offset-Distanz beabstandet sind und wobei die Zellen in einem Elektroporationsmedium suspendiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fließen schrittweise erfolgt, wobei ein Flüssigkeitsvolumen von etwa der Hälfte des Gesamtvolumens der Elektroporationskammer in einem festgelegten Zeitintervall in die Elektroporationskammer gepumpt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Offset-Distanz 2 mm oder mehr beträgt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei eine Breite der Elektroporationskammer etwa 0,01 mm bis etwa 2 mm beträgt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Porosität der oberen Mikromesh-Elektrode die Passage der Zellen und der Ladung aus dem ersten Einlass durch die obere Mikromesh-Elektrode in die Elektroporationskammer gestattet und/oder die Porosität der unteren Mikromesh-Elektrode die Passage der elektroporierten Zellen durch die untere Mikromesh-Elektrode und den ersten Auslass aus der Elektroporationskammer gestattet.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die obere Mikromesh-Elektrode weiterhin einen zweiten Einlass umfasst, der die Passage der Zellen und der Ladung in die Elektroporationskammer gestattet, und/oder die untere Mikromesh-Elektrode weiterhin einen zweiten Auslass umfasst, der die Passage der elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Pfad linear, gekrümmt, verzweigt oder eine Kombination davon ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Pfad horizontal bezogen auf die obere Mikromesh-Elektrode und die untere Mikromesh-Elektrode ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zellen in der Elektroporationskammer lateral im Pfad entlang der Länge der Elektroporationskammer strömen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zellen in der Elektroporationskammer einem einheitlichen oder im Wesentlichen einheitlichen elektrischen Feld ausgesetzt sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem man auf die Zellen in der Elektroporationskammer weiterhin mehrere elektrische Impulsen anwendet, wobei die einzelnen elektrischen Impulse gleich oder verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die mehreren elektrischen Impulse in einer Feldstärke etwa 0,3 kV/cm bis etwa 3 kV/cm angewendet werden.
Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei eines oder mehrere der Folgenden stattfindet: (a) jeder elektrische Impuls hat die Form einer sich exponentiell entladenden Wellenform oder einer quadratischen Wellenform, (b) ein Zeitintervall zwischen den einzelnen elektrischen Impulsen beträgt etwa 0,5 Sekunden bis etwa 15 Sekunden, (c) eine Dauer jedes einzelnen elektrischen Impulses beträgt etwa 0,1 Sekunden bis etwa 5 Sekunden, (d) eine Zeitkonstante beträgt etwa 10 ms bis etwa 30 ms, (e) die elektrischen Impulse werden von einem Kondensator mit einer Kapazität von etwa 5 µF bis etwa 75 µF geliefert und (f) eine Feldstärke wird mit einer Spannung von etwa 40 V angewendet.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Elektroporationspuffer eine Leitfähigkeit von 0,05 mS/m bis etwa 0,2 S/m und eine Osmolarität von etwa 0,05 osm/l bis etwa 0,2 osm/l aufweist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den Zellen um Säugetierzellen oder Nichtsäugetierzellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Säugetierzellen aus der aus NK-Zellen, EC-7-Zellen, T-Zellen, Embryozellen, Stammzellen, Epithelzellen, Lymphozyten, Makrophagen, Gametenzellen und Fibroblasten bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei den Nichtsäugetierzellen um Bakterienzellen oder Hefezellen handelt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei der Ladung um eine Nukleinsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei es sich bei der Nukleinsäure um eine RNA oder eine DNA handelt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den elektroporierten Zellen um haNK-Zellen mit einer Viabilität von mindestens 70% und einer Effizienz von mindestens 80% handelt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den elektroporierten Zellen um EC-7-Zellen mit einer Viabilität von mindestens 50% und einer Effizienz von mindestens 90% handelt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, weiterhin umfassend einen ersten Zellsortierschritt zum Sortieren der Zellen vor dem Einbringen in die Elektroporationskammer, umfassend: die Anwendung von Druck, mit dem eine die Zellen umfassende erste Lösung zum Fließen durch eine Mikrofluidik-Kammer gebracht wird, wobei die Mikrofluidik-Kammer mehrere Reihen von Pfosten umfasst, wobei jede Reihe mehrere Pfosten umfasst, die entlang einer Linie angeordnet sind, die bezogen auf die Mikrofluidik-Kammer diagonal ausgerichtet ist, und das Ablenken der Zellen zu einer Seite der Kammer durch die Reihen von Pfosten zum Abreichern der Zellen von der über einen ersten Auslass-Mechanismus austretenden Lösung und zum Anreichern der Zellen in der über einen zweiten Auslass-Mechanismus austretenden Lösung, wobei die über den zweiten Auslass-Mechanismus austretenden Zellen mit der Ladung in die Elektroporationskammer eingebracht werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, weiterhin umfassend einen zweiten Zellsortierschritt zum Sortieren der elektroporierten Zellen nach dem Austritt aus der Elektroporationskammer, umfassend: die Anwendung von Druck, mit dem eine die elektroporierten Zellen umfassende vierte Lösung zum Fließen durch eine Mikrofluidik-Kammer gebracht wird, wobei die Mikrofluidik-Kammer mehrere Reihen von Pfosten umfasst, wobei jede Reihe mehrere Pfosten umfasst, die entlang einer Linie angeordnet sind, die bezogen auf die Mikrofluidik-Kammer diagonal ausgerichtet ist, und das Ablenken der elektroporierten Zellen zu einer Seite der Kammer durch die Reihen von Pfosten zum Abreichern der elektroporierten Zellen von der über einen dritten Auslass-Mechanismus austretenden Lösung und zum Anreichern der elektroporierten Zellen in der über einen vierten Auslass-Mechanismus austretenden Lösung.
Vorrichtung zum Elektroporieren von Zellen mit einer Ladung, umfassend: eine oder mehrere Elektroporationskammern, wobei die Elektroporationskammern jeweils Folgendes umfassen: eine obere Mikromesh-Elektrode, eine untere Mikromesh-Elektrode und einen zwischen der oberen Mikromesh-Elektrode und der unteren Mikromesh-Elektrode definierten Pfad, auf dem die Zellen und die Ladung strömen können, wobei die obere Mikromesh-Elektrode und die untere Mikromesh-Elektrode jeweils eine Porosität aufweisen, wobei die obere Mikromesh-Elektrode von einem ersten Material gebunden ist, wobei das erste Material einen ersten Einlass umfasst, der die Passage von Zellen in die Elektroporationskammer gestattet, wobei die untere Mikromesh-Elektrode von einem zweiten Material gebunden ist, wobei das zweite Material einen ersten Auslass umfasst, der die Passage von elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet, und wobei der erste Einlass und der erste Auslass durch eine Offset-Distanz beabstandet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 24, wobei die Offset-Distanz 2 mm oder mehr beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, wobei die Breite der Elektroporationskammer etwa 0,01 mm bis etwa 2 mm beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Mikromesh-Elektrode aus rostfreiem Stahl, Polyimid oder Silicon gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die obere Mikromesh-Elektrode weiterhin einen zweiten Einlass umfasst, der die Passage der Zellen und der Ladung in die Elektroporationskammer gestattet, und/oder die untere Mikromesh-Elektrode weiterhin einen zweiten Auslass umfasst, der die Passage der elektroporierten Zellen aus der Elektroporationskammer gestattet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei der Pfad linear, gekrümmt, verzweigt oder eine Kombination davon ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei der Pfad horizontal bezogen auf die obere Mikromesh-Elektrode und die untere Mikromesh-Elektrode ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei die elektrischen Impulse von einem Kondensator mit einer Kapazität von 5-75 µF geliefert werden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 31, wobei es sich bei dem ersten Material und dem zweiten Material jeweils um ein Klebematerial handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei es sich bei dem Klebematerial um ein Haftklebematerial handelt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei eine Länge der Elektroporationskammer im Bereich von etwa 5 mm bis etwa 100 mm liegen kann.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 34, wobei ein Durchmesser des ersten Einlasses, des zweiten Einlasses oder beider jeweils etwa 2 mm bis etwa 5 mm beträgt und der Durchmesser des ersten Auslasses, des zweiten Auslasses oder beider jeweils etwa 2 bis etwa 5 mm beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 35, weiterhin umfassend ein erstes Mikrofluidik-Gerät zum Sortieren der Zellen vor dem Eintritt in die Elektroporationskammer, wobei das erste Mikrofluidik-Gerät Folgendes umfasst: einen Einlass-Mechanismus zum Einbringen einer die Zellen umfassenden ersten Lösung; eine Mikrofluidik-Kammer in Fluidkommunikation mit dem Einlass-Mechanismus, wobei die Mikrofluidik-Kammer mehrere Reihen von Pfosten umfasst, wobei jede Reihe mehrere Pfosten umfasst, die entlang einer Linie angeordnet sind, die bezogen auf die Mikrofluidik-Kammer diagonal ausgerichtet ist, und mindestens einen ersten Auslass-Mechanismus und einen zweiten Auslass-Mechanismus, wobei sich der erste Auslass-Mechanismus und der zweite Auslass-Mechanismus in Fluidkommunikation mit der Mikrofluidik-Kammer befinden und sich der zweite Auslass-Mechanismus in weiterer Fluidkommunikation mit dem ersten Einlass der Elektroporationskammer befindet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 36, weiterhin umfassend ein zweites Mikrofluidik-Gerät zum Sortieren der aus der Elektroporationskammer austretenden elektroporierten Zellen, wobei das zweite Mikrofluidik-Gerät Folgendes umfasst: einen Einlass-Mechanismus zum Einbringen einer die elektroporierten Zellen umfassenden vierten Lösung, wobei sich der Einlass-Mechanismus in Fluidkommunikation mit dem ersten Auslass befindet, eine Mikrofluidik-Kammer in Fluidkommunikation mit dem Einlass-Mechanismus, wobei die Mikrofluidik-Kammer mehrere Reihen von Pfosten umfasst, wobei jede Reihe mehrere Pfosten umfasst, die entlang einer Linie angeordnet sind, die bezogen auf die Mikrofluidik-Kammer diagonal ausgerichtet ist, und mindestens einen dritten Auslass-Mechanismus und einen vierten Auslass-Mechanismus.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 38, wobei, wenn mehr als eine Elektroporationskammer vorhanden ist, die Elektroporationskammern in Reihe miteinander verbunden sind.
Kit zur Zelltransfektion, umfassend: die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 38 und gegebenenfalls Reagenzien ausgewählt aus der aus Zellen für die Transfektion, einem Elektroporationsmedium und einer Kombination davon bestehenden Gruppe.