KR20240093662A - 전기 천공 디바이스 및 세포 형질 감염 방법 - Google Patents
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Abstract
제1 전극, 제2 전극 및 전기 천공 챔버 내에 정의된 경로를 포함하는 전기 천공 챔버를 갖는 전기 천공 장치를 사용하여, 포유류 세포 및 비포유류 세포와 같은 세포를 형질 감염시키기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 전기 천공 장치는 세포 및 화물(cargo)의 5 전기 천공 챔버 내로의 통과를 가능하게 하는 제1 투입부, 및 전기 천공 챔버로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는 제1 배출부를 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은, 2018 년 7 월 9 일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/695,436의 이익을 주장하는, 2019 년 7 월 9 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 16/506,190의 일부 계속 출원인, 2020 년 7 월 8 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 16/923,606의 일부 계속 출원인, 2021 년 10 월 28 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 17/513,007의 이익 및 우선권을 주장하는 PCT 국제 출원이다. 상기 열거된 출원의 각각의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 형질 감염 시스템 및 방법, 구체적으로, 전기 천공 시스템 및 방법에 관한 것이다.
배경기술의 기재는 본원에 제시된 방법 및 기술을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는, 본원에 제공된 어느 정보가 선행 기술 또는 본원에 제공된 대상에 관련된다거나, 명확히 또는 암시적으로 참조된 어느 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것이 아니다.
형질 감염은 핵산을 세포로 도입하여 유전적으로 변형된 세포를 생산하는 데 사용될 수 있다. 광 천공(optoperforation), 칼슘 포스페이트를 이용한 폴리머 기반 방법, 미세 주입, 전기 천공, 바이러스 형질 도입, 및 지질 매개 방법(예를 들어 리포좀-DNA 복합체 사용)을 포함하는, 세포를 형질 감염시키기 위한 다양한 물리적, 화학적 및 바이러스 방법이 존재한다.
전기 천공은 비교적 짧은 지속 시간 동안 제어된 직류(DC) 전기 펄스를 세포에 인가하는 것을 포함한다. 전기 펄스는 막 내 공극 형성으로 이어지는, 세포막의 질서 정연한 구조의 가역적 붕괴를 유발하는 막 전위를 유도하는 것으로 여겨진다. 관심 분자는 그 후, 공극이 닫힐 때까지, 전형적으로 수 밀리초 내지 수 초 내에 공극을 통해 세포로 들어갈 수 있다. 공극 형성은 다양한 파라미터, 특히 갭(gap) 너비(예를 들어 평행 전극 판 사이의 거리), 전기 펄스 파형, 전기장 강도, 온도, 및 전기 펄스 길이를 조정함으로써 제어될 수 있다.
전기 천공은 통상적으로 실험실 규모에서(예를 들어 약 0.5 mL 용량을 갖는 작은 큐벳(cuvette)을 사용하여) 사용되지만, 이러한 실험실 기반 기술은 효율 부족 및 높은 비용으로 인해, 대규모 임상 등급 생산에 적합하지 않다. 리포펙타민(Lipofectamine) 2000TM을 사용하는 지질-기반 기술과 같은 다른 형질 감염 방법도 빈번하게 사용되지만, 높은 비용으로 인해 유사한 결점을 갖는다. 추가로, 지질 기반 방법은 일부 임상적 관심 세포 유형, 예를 들어 haNK와 같은 NK 세포에서 잘 작동되지 않는다. NK 세포는, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR - 문헌[Leuk Res. (2009) 33:1255-9] 참고)를 발현하거나 자가 분비 성장 자극을 위한 사이토카인(Cytotherapy (2008) 10:265-74)을 발현하도록 일차 NK 세포를 유전적으로 조작하기 위해, mRNA 및 전기 천공을 사용하여 형질 감염되었다. 대규모 형질 감염, 예를 들어 1 mL 초과의 반응 크기를 위한 맥스사이트(Maxcyte)와 같은 상업적 제품이 존재하지만, 이들 제품 또한 고가이고/이거나 고-처리량 능력이 부족하다. 유사하게, 이들 상업적 제품은 NK 세포를 형질 감염시키는 데 최적이 아니며, 종종 열등한 수율 및/또는 낮은 세포 생존력 관련 문제로 이어진다. 전형적인 전기 천공 비율은 약 10 내지 20% 세포 생존력으로 2 내지 5% DNA 형질 감염 효율을 낼 수 있다.
도 1a에 나타난 종래 기술을 이용하여, 전기 천공은 2 개의 평행한 판 전극을 사용하여 수행된다. 이 구성에서, 세포는 전형적으로 2 개의 평행한 판 사이를 흐른다. 그러나, 전기장은 균일하지 않으며, (a)로 나타나는, 챔버 중앙에 있는 세포는 보다 균일한 전기장을 경험하는 반면, (b)로 나타나는, 전극 근처의 세포는 균일하지 않은 전기장을 경험하고, 특히 전극의 경계에 존재하는 전기장 스파이크(spike)를 경험한다. 다른 기술은, 도 1b에 나타난, 마이크로메쉬 전극의 평행 판을 사용하며(Selmeczi, D. et al., "Efficient large volume electroporation of dendritic cells through micrometer scale manipulation of flow in a disposable polymer chip," Biomed Microdevices, 13: 383-392 (2011)), 여기서 세포는 상부 마이크로메쉬 전극 및 하부 마이크로메쉬 전극을 통과한다. 이 기술은, 챔버 중앙(a) 및 챔버 경계 근처(b)에 있는 세포의 유사한 궤적에 의해 나타난 바와 같이, 2 개의 평행 전극 판 사이를 통과하는 것보다 더욱 균일한 전기장을 제공하지만, 챔버 너비 또는 상부 마이크로메쉬 전극과 하부 마이크로메쉬 전극 사이의 거리가 제한되어, 낮은 형질 감염 효율로 이어진다. 도 1a 및 도 1b에 나타난 구성은 약 1 내지 1.3 kV/cm의 전기장 강도를 사용한다(예를 들어 평행 판의 경우 200 V/2 mm, 평행한 마이크로메쉬 전극의 경우 40 V/400 um).
다른 양태에서, 단일 세포 전기 천공 칩이 형질 감염에 사용되었다. 이 기술에서, 실리콘 칩은 복수의 선형 채널을 포함할 수 있으며, 각각의 채널은 채널의 반대편에 배치된 대향 전극들을 갖는다. 세포는 채널을 통과하고 전기장에 노출된다. 이 유형의 기술을 사용하여, 약 79%의 세포 생존력으로 약 68%의 DNA 형질 감염 효율이 달성되었다.
포유류 세포에 대한 다양한 형질 감염 시스템 및 방법이 존재하지만, 이러한 기술은 하나 이상의 단점을 초래한다. 따라서, 특히 고 처리량, 대규모 제조 프로세스를 위해 개선된 전기 천공 시스템 및 방법을 제공할 필요가 여전히 존재한다.
본원에 제시된 기술은, 예를 들어 대규모 연속 제조 프로세스를 위해, 포유류 세포 및 비포유류 세포와 같은 세포의 전기 천공을 위한 다양한 디바이스, 시스템, 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 단차(offset) 거리만큼 제1 배출부로부터 분리된 제1 투입부를 포함하는 전기 천공 장치를 사용하는 세포의 전기 천공을 위한 시스템 및 방법은 높은 효율 및 생존력을 제공할 수 있다.
일부 양태에서, 화물(cargo)을 사용하여 세포를 전기 천공하는 방법이 제공된다. 방법은 화물과 함께 세포를 전기 천공 챔버 내로 유동시키는 단계를 포함한다. 전기 천공 챔버는 제1 전극, 제2 전극, 세포 및 화물의 전기 천공 챔버 내로의 통과를 가능하게 하는 제1 투입부, 전기 천공 챔버로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는 제1 배출부, 및 세포 및 화물이 유동하도록 제1 전극과 제2 전극 사이에서 내부에 정의된 경로를 갖는 유체 채널 영역을 포함한다. 추가로, 세포는 전기 천공 매질에 현탁되고 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 500x106 개 세포/ml의 세포 밀도를 가질 수 있다. 방법은 전기 천공 챔버 내의 세포에 다수의 전기 펄스를 인가하는 단계를 추가로 포함하며, (i) 각각의 전기 펄스는 지수적으로 방전하는 파형 또는 구형파형(square waveform)의 형태를 갖고, (ii) 다수의 전기 펄스는 약 0.3 kV/cm 내지 약 3 kV/cm의 전계 강도로 인가되고; (iii) 전계 강도는 약 15 V 내지 약 100 V의 전압에서 인가되고; (iv) 각각의 전기 펄스 사이의 지속 시간은 약 0.1 초 내지 약 10 초이고; (v) 각각의 전기 펄스는 약 10 μs 내지 약 10,000 μs의 펄스 폭을 갖는다.
또 다른 양태에서, 화물을 사용하여 세포를 전기 천공하기 위한 장치가 제공된다. 장치는 하나 이상의 전기 천공 챔버를 포함한다. 각각의 전기 천공 챔버는 제1 전극, 제2 전극, 세포 및 화물의 전기 천공 챔버 내로의 통과를 가능하게 하는 제1 투입부, 전기 천공 챔버로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는 제1 배출부, 및 세포 및 화물이 유동하도록 제1 전극과 제2 전극 사이에서 내부에 정의된 경로를 갖는 유체 채널 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 세포 형질 감염을 위한 키트가 제공된다. 키트는 본원에 기재된 전기 천공을 위한 장치, 형질 감염을 위한 세포 및 화물을 수용하기 위한 제1 용기, 전기 천공된 세포를 수용하기 위한 제2 용기, 세포를 전기 천공하기 위한 장치에 제1 용기 및 제2 용기를 유체 연결하기 위한 관류(tubing), 및 선택적으로, 형질 감염을 위한 세포, 전기 천공 매질, 또는 이들의 조합과 같은 시약을 포함한다.
본원에 기재된 대상의 다양한 목적, 특징, 양태 및 장점은 유사한 번호가 유사한 구성 요소에 해당하는 첨부 도면과 함께 바람직한 실시형태에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 청구 및 필요한 수수료의 지불 시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1a 및 도 1b는 평행한 판 전극(도 1a에 나타남) 및 투입부와 배출부 사이에 단차가 없는 마이크로메쉬 전극(도 1b에 나타남)을 포함하는 종래의 전기 천공 디바이스를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공을 위한 장치의 양태를 나타낸다.
도 2c는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 제1 전극 및 제2 전극의 양태를 나타낸다.
도 2d는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라 본원에 기재된 전기 천공 장치에서 전기 펄스를 생성하고 세포에 제공하기 위한 장치의 블록선도이다.
도 2e는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라 본원에 기재된 전기 천공 장치에서 전기 펄스를 생성하고 세포에 제공하기 위한 추가 장치의 블록선도이다.
도 3a 내지 도 3d는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 디바이스를 포함하는 전기 천공을 위한 장치의 양태를 나타낸다. 도 3a는 투입 배출 챔버 단차 전기 천공 디바이스 구조의 도해를 나타낸다. 도 3b는 투입 배출 챔버 단차 전기 천공 디바이스의 전기장의 도해를 나타낸다. 도 3c는 투입 배출 챔버 단차 전기 천공 디바이스를 통한 세포 이동 거리의 함수로서 전기장 강도를 나타낸다. 도 3d는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 장치의 대안적인 구성을 나타낸다.
도 3e 내지 도 3g는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 챔버 내 경로의 양태를 나타낸다.
도 3h 내지 도 3j는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 장치의 대안적인 구성을 나타낸다.
도 3k 내지 도 3l은 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라 세포를 분류하기 위한 예시적인 미세 유체 챔버를 도해한다.
도 3m 내지 도 3s는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 미세 유체 챔버 내에서 기둥(post)의 기하학적 구조 및 위치결정의 다양한 양태를 나타내는 도해이다.
도 3t는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라 완충액을 변경하기 위한 예시적인 미세 유체 챔버를 도해한다.
도 3u는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 2 개의 별개 챔버, 세포 분류를 위한 한 챔버 및 완충액 변경을 위한 또 다른 챔버를 갖는 예시적인 미세 유체 디바이스를 도해한다.
도 3v 및 도 3w는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 장치의 대안적인 구성을 나타낸다.
도 3x는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 장치를 포함하는 전기 천공 시스템의 모듈식 구성을 나타낸다.
도 4는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른, 챔버 단차 전기 천공 디바이스와 관련된 파라미터 표를 나타낸다.
도 5는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라, 챔버 단차 전기 천공 디바이스를 통해 유동하는 세포에 인가될 수 있는 유체 유동 파형(펌프) 및 전기 파형(자극(stim))의 예를 나타낸다.
도 6은 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른, 챔버 단차 전기 천공 디바이스와 함께 사용하기에 적합한 상이한 재료로 형성된 마이크로메쉬의 다양한 예를 나타낸다.
도 7a 내지 도 7e는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여, haNK 세포에 대한 전기 천공 실험 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여, haNK 세포에 대한 전기 천공 실험의 추가적 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여, EC7 세포에 대한 전기 천공 실험 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10e는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여, EC7 세포에 대한 전기 천공 실험의 추가적 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 전기 천공된 EC7 세포의 현미경 이미지를 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여 EC7 세포를 형질 감염시킨 추가적 결과를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용한, 상이한 세포주에 대한 다양한 형질 감염 효율을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14e는 본원에 기재된 PbAE를 사용하여, T-세포로 mRNA를 도입하기 위한 형질 감염 실험의 결과를 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 본원에 기재된, 전기 천공을 사용하여 및 사용하지 않고 T-세포로 mRNA를 도입하기 위한 형질 감염 실험의 결과를 나타낸다.
도 16a 내지 도 16d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용한, 지방-유래 중간엽 줄기 세포(AD-MSC)에 대한 형질 감염 실험의 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 17은 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른 전기 천공 장치의 블록선도이다.
도 18은 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른 도 17의 전기 천공 장치에서 사용될 수 있는 전기 천공 챔버의 전개도이다.
도 19는 층들이 어셈블된 도 18의 전기 천공 챔버의 등각도이다.
도 20은 도 18의 전기 천공 챔버의 유체 채널층의 정면도이다.
도 21은 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른, 도 20의 유체 채널층과 상이한 유체 부피를 갖는 유체 채널층의 정면도이다.
도 22는 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른, 직선 유체 채널을 갖는 유체 채널층의 정면도이다.
도 23은 유체 채널의 예시적인 치수를 도해한 도 20의 유체 채널층의 정면도이다.
도 1a 및 도 1b는 평행한 판 전극(도 1a에 나타남) 및 투입부와 배출부 사이에 단차가 없는 마이크로메쉬 전극(도 1b에 나타남)을 포함하는 종래의 전기 천공 디바이스를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공을 위한 장치의 양태를 나타낸다.
도 2c는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 제1 전극 및 제2 전극의 양태를 나타낸다.
도 2d는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라 본원에 기재된 전기 천공 장치에서 전기 펄스를 생성하고 세포에 제공하기 위한 장치의 블록선도이다.
도 2e는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라 본원에 기재된 전기 천공 장치에서 전기 펄스를 생성하고 세포에 제공하기 위한 추가 장치의 블록선도이다.
도 3a 내지 도 3d는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 디바이스를 포함하는 전기 천공을 위한 장치의 양태를 나타낸다. 도 3a는 투입 배출 챔버 단차 전기 천공 디바이스 구조의 도해를 나타낸다. 도 3b는 투입 배출 챔버 단차 전기 천공 디바이스의 전기장의 도해를 나타낸다. 도 3c는 투입 배출 챔버 단차 전기 천공 디바이스를 통한 세포 이동 거리의 함수로서 전기장 강도를 나타낸다. 도 3d는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 장치의 대안적인 구성을 나타낸다.
도 3e 내지 도 3g는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 챔버 내 경로의 양태를 나타낸다.
도 3h 내지 도 3j는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 장치의 대안적인 구성을 나타낸다.
도 3k 내지 도 3l은 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라 세포를 분류하기 위한 예시적인 미세 유체 챔버를 도해한다.
도 3m 내지 도 3s는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 미세 유체 챔버 내에서 기둥(post)의 기하학적 구조 및 위치결정의 다양한 양태를 나타내는 도해이다.
도 3t는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라 완충액을 변경하기 위한 예시적인 미세 유체 챔버를 도해한다.
도 3u는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 2 개의 별개 챔버, 세포 분류를 위한 한 챔버 및 완충액 변경을 위한 또 다른 챔버를 갖는 예시적인 미세 유체 디바이스를 도해한다.
도 3v 및 도 3w는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 장치의 대안적인 구성을 나타낸다.
도 3x는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른 전기 천공 장치를 포함하는 전기 천공 시스템의 모듈식 구성을 나타낸다.
도 4는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른, 챔버 단차 전기 천공 디바이스와 관련된 파라미터 표를 나타낸다.
도 5는 본원에 제공된 일부 실시형태에 따라, 챔버 단차 전기 천공 디바이스를 통해 유동하는 세포에 인가될 수 있는 유체 유동 파형(펌프) 및 전기 파형(자극(stim))의 예를 나타낸다.
도 6은 본원에 제공된 일부 실시형태에 따른, 챔버 단차 전기 천공 디바이스와 함께 사용하기에 적합한 상이한 재료로 형성된 마이크로메쉬의 다양한 예를 나타낸다.
도 7a 내지 도 7e는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여, haNK 세포에 대한 전기 천공 실험 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여, haNK 세포에 대한 전기 천공 실험의 추가적 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여, EC7 세포에 대한 전기 천공 실험 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10e는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여, EC7 세포에 대한 전기 천공 실험의 추가적 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 전기 천공된 EC7 세포의 현미경 이미지를 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여 EC7 세포를 형질 감염시킨 추가적 결과를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용한, 상이한 세포주에 대한 다양한 형질 감염 효율을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14e는 본원에 기재된 PbAE를 사용하여, T-세포로 mRNA를 도입하기 위한 형질 감염 실험의 결과를 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 본원에 기재된, 전기 천공을 사용하여 및 사용하지 않고 T-세포로 mRNA를 도입하기 위한 형질 감염 실험의 결과를 나타낸다.
도 16a 내지 도 16d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용한, 지방-유래 중간엽 줄기 세포(AD-MSC)에 대한 형질 감염 실험의 결과 및 상응하는 파라미터를 나타낸다.
도 17은 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른 전기 천공 장치의 블록선도이다.
도 18은 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른 도 17의 전기 천공 장치에서 사용될 수 있는 전기 천공 챔버의 전개도이다.
도 19는 층들이 어셈블된 도 18의 전기 천공 챔버의 등각도이다.
도 20은 도 18의 전기 천공 챔버의 유체 채널층의 정면도이다.
도 21은 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른, 도 20의 유체 채널층과 상이한 유체 부피를 갖는 유체 채널층의 정면도이다.
도 22는 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른, 직선 유체 채널을 갖는 유체 채널층의 정면도이다.
도 23은 유체 채널의 예시적인 치수를 도해한 도 20의 유체 채널층의 정면도이다.
세포, 예를 들어 포유류 세포(예를 들어 NK 세포, EC-7 세포, T 세포 등) 및 비포유류 세포의 전기 천공을 위한 시스템 및 방법이, 고효율 및 생존력을 제공하는 상응하는 전기 천공 프로토콜과 함께 제공된다. 일부 양태에서, 전기 천공 프로토콜은 세포를 다수의 전기 펄스, 스테핑(stepping) 유체 유동, 저전도율 및 저삼투압 전기 천공 완충액, 비교적 중도의 커패시턴스, 및/또는 비교적 중도의 시간 상수에 적용하는 것을 포함한다.
다양한 양태에서, 화물을 사용하여 포유류 세포를 전기 천공하기 위한 장치가 제공된다. 장치는 하나 이상의 전기 천공 챔버를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 전기 천공 챔버는 제1 전극, 제2 전극, 및 제1 전극과 제2 전극 사이에서 내부에 정의된 경로를 갖는 유체 채널 영역을 포함한다. 제1 전극 및 제2 전극 각각은 고체 전극, 또는 마이크로메쉬 전극과 같은 메쉬 전극일 수 있다. 장치는 또한 세포 및 화물의 전기 천공 챔버 내로의 통과를 가능하게 하는 제1 투입부, 및 전기 천공 챔버로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는 제1 배출부를 포함한다. 본원에 사용된 "전기 천공된 세포"는 형질 감염된 세포, 죽은 세포, 및 형질 감염되지 않은 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 투입부 및 제1 배출부는 단차 거리만큼 분리될 수 있다. 제1 전극은 제1 재료에 의해 경계지어질 수 있고 제2 전극은 동일하거나 상이할 수 있는 제2 재료에 의해 경계지어질 수 있다.
예를 들어, 도 2a는 전기 천공 장치(700a)를 포함하는, 화물을 사용하여 세포를 전기 천공하기 위한 예시적인 장치를 도해한다. 전기 천공 장치(700a)는 2 개의 전극, 예를 들어 서로 정렬되는 것으로 본원에 나타난, 제1 전극(740(1)) 및 제2 전극(740(2))을 포함하는 전기 천공 챔버(720)를 포함한다. 전기 천공 장치(700a)는 세포 및 화물의 전기 천공 챔버(720) 내로의 통과를 가능하게 하는 제1 투입부(710), 및 전기 천공 챔버(720)로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는 제1 배출부(730)를 추가로 포함한다. 제1 투입부(710) 및 제1 배출부(730)는 전기 천공 챔버(720)를 통한 측 방향으로의 세포의 유동을 용이하게 하기 위해 단차 거리(d)만큼 분리될 수 있다. 유체 채널 영역(725)은 전기 천공 챔버(720) 내에 존재하고, 유체 채널 영역(725)은 세포 및 화물이 유동하도록 제1 전극(740(1))과 제2 전극(740(2)) 사이에서 내부에 정의된 경로(735)를 포함한다. 나타나지는 않았지만, 경로(735)는 세포 및 화물의 경로(735) 내로의 통과를 가능하게 하는 제1 투입부에 대응하는 경로 입구뿐만 아니라 경로(735)로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는 제1 배출부(730)에 대응하는 경로 출구를 가질 수 있다.
임의의 실시형태에서, 제1 투입부는 제1 전극, 제2 전극, 또는 유체 채널 영역에 존재하거나 정의될 수 있다. 추가적으로, 제1 배출부는 제1 전극, 제2 전극, 또는 유체 채널 영역에 존재하거나 정의될 수 있다. 제1 투입부 및 제1 배출부는 둘 모두 제1 전극 또는 제2 전극에 존재할 수 있다. 예를 들어, 도 2a에 나타난 바와 같이, 제1 투입부(710) 및 제1 배출부(730)는 둘 모두 제2 전극(740(2))에 존재한다. 대안적으로, 제1 투입부는 제1 전극에 존재할 수 있고 제1 배출부는 제2 전극에 존재할 수 있거나 제1 투입부는 제2 전극에 존재할 수 있고 제1 배출부는 제1 전극에 존재할 수 있다. 유체 채널 영역의 경우, 제1 투입부, 제1 배출부, 또는 둘 모두가, 예를 들어 유체 채널 영역의 측벽에 존재할 수 있다는 것이 본원에서 고려된다.
추가로 도 2b에 도해된 바와 같이, 전기 천공 장치(700b)에서 제1 전극(740(1))의 상부 표면(706)은 제1 재료(715(1))에 의해 경계지어지거나 이에 연결될 수 있고 제2 전극(740(2))의 하부 표면(711)은 제2 재료(715(2))에 의해 경계지어지거나 이에 연결될 수 있다. 예를 들어, 제1 재료 및 제2 재료는 전기 천공 디바이스의 내부 챔버 내에, 구체적으로, 평행한 제1 전극과 제2 전극 사이의 전기 천공 챔버 내에 세포를 수용하기 위해, 예를 들어 폴리디메틸실록산(PDMS) 아크릴릭, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 아크릴 유리와 같은 비-공극성 재료일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 전기 천공 장치(700b)는 세포 및 화물의 전기 천공 챔버(720) 내로의 통과를 추가로 가능하게 하는 제1 외부 투입부(750), 및 전기 천공 챔버(720)로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 추가로 가능하게 하는 제1 외부 배출부(760)를 추가로 포함할 수 있다. 제1 외부 투입부는 제1 재료에 존재하거나 정의될 수 있고, 제1 외부 배출부는 제2 재료에 존재하거나 정의될 수 있다. 대안적으로, 제1 외부 투입부는 제2 재료에 존재하거나 정의될 수 있고 제1 외부 배출부는 제1 재료에 존재하거나 정의될 수 있다. 추가 실시형태에서, 제1 외부 투입부 및 제1 외부 배출부는 둘 모두 제1 재료 또는 제2 재료에 존재하거나 정의될 수 있다. 예를 들어, 도 2b에 도해된 바와 같이 제1 외부 투입부(750) 및 제1 외부 배출부(760)는 둘 모두 제2 재료(715(2))에 존재하거나 정의되며 화살표는 전기 천공 디바이스를 통과하는 세포, 및 화물 및 전기 천공 디바이스를 빠져나가는 전기 천공된 세포의 유동 방향을 나타낸다. 도 2a 및 도 2b에 나타나 있고 표지되지 않은 다른 개구 또는 구멍은, 당업자에게 알려진 바와 같이, 예를 들어 나사 및/또는 플러그를 통해, 전기 천공 장치의 다양한 구성 요소를 연결하기 위한 개구를 나타낸다.
제1 전극 및 제2 전극은 각각, 고체 판 전극과 같은 고체 전극, 또는 마이크로메쉬 전극과 같은, 공극성을 갖는 메쉬 전극일 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 전극 및 제2 전극은 둘 모두, 고체 판 전극과 같은 고체 전극이다. 임의의 실시형태에서, 제1 전극, 제2 전극, 또는 둘 모두가 고체 전극인 경우, 제1 전극, 제2 전극, 또는 둘 모두는 복수의 고체 금속 판 또는 이의 어레이를 포함한다. 예를 들어, 도 2c에 도해된 바와 같이, 제1 전극(741(1)) 및 제2 전극(741(2))은 복수의 고체 금속 판(745)을 포함한다. 각각의 고체 금속 판(745)은 특정 전기장 패턴을 만들기 위해 독립적인 전기장을 인가하도록 구성될 수 있다. 제1 전극 및 제2 전극을 형성할 수 있는 적합한 재료로는 스테인레스 스틸, 폴리이미드, 실리콘, 귀금속, 4 족 금속, 전도성 재료, 및 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 귀금속의 예로는 루테늄(Ru), 로듐(Rh), 팔라듐(Pd), 은(Ag), 오스뮴(Os), 이리듐(Ir), 백금(Pt), 및 금(Au)이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 4 족 금속의 예로는 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf) 및 루테르포르듐(Rf)이 포함된다. 적합한 전도성 재료의 예로는 인듐 주석 옥사이드(ITO), 탄소 나노튜브(CNT), 및 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜) 폴리스티렌 설포네이트(PEDOT:PSS)와 같은 전도성 중합체가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
임의의 실시형태에서, 본원에 개시된 전기 천공 장치 중 임의의 하나는 본원에 기재된 전기 천공 파라미터를 사용하는 전기 천공 프로세스 동안 세포에 전기 펄스를 제공하기 위한 구성 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2d는, 본원에 설명된 바와 같이, 전기 펄스를 생성하고 세포에 제공하기 위한 장치(852)를 도해한다. 구체적으로, 그리고 도 2d에 나타난 바와 같이, 장치(852)는 전력공급장치(854) 및 전력공급장치(854)에 커플링된 제어 회로(858)를 포함한다. 전력공급장치(854)는 전기 천공 장치(860)(예를 들어, 본원에 개시된 예시적 전기 천공 장치 중 어느 하나)에 전기 펄스를 제공한다.
도 2d의 실시예에서, 전력공급장치(854)는 전력원(856), 전력원(856)에 커플링된 전력 컨버터(862), 및 전력 컨버터(862)와 전기 천공 장치(860) 사이에 커플링된 펄스 회로(864)를 포함한다. 전력 컨버터(862)는, 예를 들어 전력원(856)에 의해 제공되는 전력의 유형에 따라, DC-DC 전력 변환 회로 및/또는 AC-DC 전력 변환 회로를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전력 컨버터(862)는 전력원(856)(예를 들어, 하나 이상의 배터리)으로부터 DC 전력을 수신하고, 조절된 DC 전압을 펄스 회로(864)에 출력할 수 있다. 이러한 실시예에서, 전력 컨버터(862)는 임의의 적합한 컨버터 토폴로지(예를 들어, 벅(buck), 부스트(boost) 등)를 갖는 DC-DC 전력 변환 회로를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 전력 컨버터(862)는 전력원(856)(예를 들어, AC 메인)으로부터 AC 전력을 수신할 수 있다. 이러한 실시예에서, 전력 컨버터(862)는 임의의 적합한 컨버터 토폴로지(예를 들어, AC-DC 정류기, PFC 부스트 등)를 갖는 AC-DC 전력 변환 회로를 포함할 수 있다.
도 2d의 펄스 회로(864)는 전력 컨버터(862)로부터 DC 전압을 수신하고 DC 전압을 전기 천공 장치(860)를 위한 DC 전기 펄스로 변환한다. 예를 들어, 펄스 회로(864)는 전력 컨버터(862)로부터의 DC 전압을 해석하고 전기 펄스를 생성하기 위한 하나 이상의 스위칭 디바이스(나타나지 않음)를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 펄스 회로(864)는 전기 천공 장치(860)를 위한 전기 펄스를 생성하기 위한 다른 적합한 회로를 포함할 수 있다.
도 2d에 나타난 바와 같이, 제어 회로(858)는 제어기(866) 및 제어기(866)에 커플링된 펄스 생성기(868)를 포함한다. 제어기(866)는 전력 컨버터(862)의 출력 파라미터(예를 들어, 출력 전압)를 나타내는 피드백 신호(870)를 수신하고, 피드백 신호(870)에 기초하여 전력 컨버터(862)에서 하나 이상의 스위칭 디바이스(나타나지 않음)를 제어하도록 전력 컨버터(862)를 위한 하나 이상의 제어 신호(872)를 생성한다. 예를 들어, 제어기(866)는 정의된 값(예를 들어, 원하는 전기 펄스의 진폭)으로 전력 컨버터의 출력 전압을 조절하기 위해 전력 컨버터의 스위칭 디바이스를 제어할 수 있다. 일부 실시예에서, 제어기(866)는 피드백 신호(870) 및/또는 본원에 개시된 다른 신호에 기초하여 출력 전압을 감소시키거나 증가시킬 수 있다.
추가로, 도 2d에 나타난 바와 같이, 제어기(866)는 펄스 생성기(868)를 위한 신호(874)를 생성할 수 있고, 펄스 생성기(868)는 제어기(866)로부터 수신된 신호에 기초하여 전기 펄스를 생성하기 위해 펄스 회로(864)를 위한 하나 이상의 제어 신호(876)를 생성할 수 있다. 예를 들어, 신호(874)는 펄스 생성기(868)에 전기 펄스 생성을 시작하도록 지시하는 개시 및/또는 중지 신호일 수 있다. 일부 실시예에서, 펄스 생성기(868)는 제어기(866)로부터 수신된 신호에 기초하여 전기 펄스의 주파수, 펄스 폭, 듀티 사이클(duty cycle) 등을 조정할 수 있다.
일부 실시예에서, 제어 회로(858)는 전력 컨버터(862) 및/또는 펄스 생성기(868)를 제어하기 위한 하나 이상의 추가 신호를 수신할 수 있다. 예를 들어, 도 2d에 나타난 바와 같이, 제어 회로(858)에서의 펄스 생성기(868)는 선택적으로 하나 이상의 신호(878a)를 수신할 수 있다. 신호(들)(878a)는 펄스 회로(864), 전기 천공 장치(860) 등으로부터의 피드백 신호일 수 있고, 전기 펄스를 생성하기 위한 펄스 회로(864)를 제어하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 도 2d에 나타난 바와 같이, 제어 회로(858)에서의 제어기(866)는 선택적으로 펄스 회로(864), 전기 천공 장치(860) 등으로부터의 피드백 신호를 나타내는 하나 이상의 신호(880), 및/또는 사용자 인터페이스로부터의 사용자 정의 명령을 나타내는 하나 이상의 신호(882)를 수신할 수 있다. 이러한 실시예에서, 신호(들)(880) 및/또는 신호(들)(882)는, 펄스 회로(864) 및/또는 전력 컨버터(862)를 제어하고 펄스 타이밍을 모니터링하는 것 등에 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 장치(852)는 전기 천공 장치(860)와 관련된 칩 전압 및/또는 칩 전류를 모니터링하기 위한 하나 이상의 감지 디바이스(나타나지 않음)를 포함할 수 있다. 이러한 실시예에서, 펄스 생성기(868) 및/또는 제어기(866)는 신호(들)(878a, 880)를 통해 감지된 칩 전압 및/또는 감지된 칩 전류를 수신한 후, 감지된 칩 전압 및/또는 전류에 기초하여 펄스 회로(864) 및/또는 전력 컨버터(862)를 제어할 수 있다.
제어 회로(858)는 또한 제어 목적을 위해 하나 이상의 추가 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어, 제어기(866)는 전기 천공 장치의 다른 구성 요소, 및/또는 전기 천공 장치 외부의 구성 요소를 위한 하나 이상의 신호(884)를 선택적으로 생성할 수 있다. 이러한 실시예에서, 신호(들)(884)는 사용자 인터페이스에 제공된 사용자 피드백, 장치에서 유체 펌프의 모터(예를 들어, 스테퍼 모터), 연동 펌프, 핀치 밸브 등을 제어하기 위한 제어 신호를 나타낼 수 있다. 추가로, 펄스 회로(864)는 전기 천공 장치의 다른 구성 요소, 및/또는 전기 천공 장치 외부의 구성 요소를 위한 하나 이상의 신호(878b)를 선택적으로 생성할 수 있다. 예를 들어, 펄스 회로는 감지 디바이스가 전압 및 전류 모니터링을 시작하도록 지시하는 감지 디바이스를 위한 신호(들)(878b)를 생성할 수 있다.
도 2e는, 본원에 설명된 바와 같이, 전기 펄스를 생성하고 세포에 제공하기 위한 또 다른 예시적인 장치(886)를 도해한다. 나타나는 바와 같이, 장치(886)는 전기 천공 장치(860)에 커플링된 전력공급장치(888) 및 전력공급장치(888)를 제어하기 위한 제어 회로(890)를 포함한다. 도 2e의 전력공급장치(888) 및 제어 회로(890)는 도 2d의 전력공급장치(854) 및 제어 회로(858)와 유사하나, 추가 구성 요소를 포함한다. 예를 들어, 전력공급장치(888)는 도 2d의 전력원(856), 전력 컨버터(862) 및 펄스 회로(864), 및 전력원(856)과 전력 컨버터(862) 사이에 커플링된 필터(892)를 포함한다. 필터(892)는 전력원(856)으로부터의 전기 신호를 평활화하기 위한 커패시터, 인덕터 등(나타나지 않음)과 같은 하나 이상의 구성 요소를 포함할 수 있다.
추가적으로, 도 2e에 나타난 바와 같이, 제어 회로(890)는 도 2d의 제어기(866) 및 펄스 생성기(868), 및 펄스 생성기(868)에 커플링된 하나 이상의 게이트 드라이버(894)를 포함한다. 도 2e의 실시예에서, 게이트 드라이버(들)(894)는 펄스 생성기(868)로부터 신호를 수신하고, 펄스 회로(864)에서 하나 이상의 스위칭 디바이스(예를 들어, MOSFET)를 제어하기 위한 하나 이상의 펄스 폭 변조된(PWM) 제어 신호(896)를 생성한다. 추가적으로, 제어 회로(890)는 도 2d에서 참조된 다양한 신호 중 임의의 하나 이상을 수신 및/또는 생성할 수 있다. 예를 들어, 제어기(866)는, 상기 설명된 바와 같이, 피드백 신호(870)를 수신할 수 있고, 전력 컨버터(862)에서 하나 이상의 스위칭 디바이스(예를 들어, MOSFET)를 제어하기 위한 제어 신호(들)(872)를 생성할 수 있다.
본원에 개시된 제어 회로는 본원에 개시된 기능을 포함하여, 다양한 기능을 수행하기 위한 하드웨어 구성 요소 및/또는 프로그래밍된 소프트웨어 구성 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2d 및 도 2e의 제어 회로(858, 890) 중 임의의 하나는 전원 공급 장치(854, 888)(본원에 설명된 바와 같음)의 파라미터, 전기 천공 장치(860)와 관련된 파라미터 등을 모니터링하기 위한 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 파라미터에는 전원 공급 장치(854, 888) 및/또는 전기 천공 장치(860)와 관련된 전기 파라미터, 전기 천공 장치(860)와 관련된 유체 파라미터 등이 포함될 수 있다. 이러한 실시예에서, 제어 회로(858, 890)는 파라미터에 기초하여 전원 공급 장치(854, 888), 및/또는 장치(852, 886)의 다른 구성 요소(예를 들어, 유체 펌프 등)를 제어할 수 있다. 본원에 기재된 전원 공급 장치(854, 888) 중 임의의 하나 및 제어 회로(858, 890) 중 임의의 하나가 하기 추가로 기재되는 전기 펄스 및 전기 천공 파라미터, 예를 들어 파형, 전계 강도, 전압, 각각의 전기 펄스 사이의 지속 시간, 펄스 폭, 각각의 전기 펄스의 지속 등을 제공할 수 있음이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 제어 회로(858, 890) 중 임의의 하나는 다음 중 하나 이상을 제공할 수 있다: (i) 각각의 전기 펄스는 지수적으로 방전하는 파형 또는 구형파형의 형태를 가짐; (ii) 다수의 전기 펄스는 약 0.3 kV/cm 내지 약 3 kV/cm의 전계 강도로 인가됨; (iii) 전계 강도는 약 15 V 내지 약 100 V의 전압에서 인가됨; (iv) 각각의 전기 펄스 사이의 지속 시간은 약 0.1 초 내지 약 10 초임; 및 (v) 각각의 전기 펄스는 약 10 μs 내지 약 10,000 μs의 펄스 폭을 가짐.
일부 실시형태에서, 제1 전극은 상부 마이크로메쉬 전극일 수 있고 제2 전극은 하부 마이크로메쉬 전극일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 전기 천공 챔버는 상부 마이크로메쉬 전극, 하부 마이크로메쉬 전극, 및 세포 및 화물이 유동하도록 상부 마이크로메쉬 전극과 하부 마이크로메쉬 전극 사이에서 정의된 경로를 포함할 수 있다. 상부 마이크로메쉬 전극 및 하부 마이크로메쉬 전극은 각각, 예를 들어 전기 천공 챔버 내로 또는 외부로의 마이크로메쉬 전극을 통한 세포의 통과를 가능하게 하는 공극성을 갖는다. 예를 들어, 상부 마이크로메쉬 전극 및 하부 마이크로메쉬 전극은 각각 약 30% 내지 약 50%의 공극 면적(open area)의 공극성을 가질 수 있다. 상부 마이크로메쉬 전극 및 하부 마이크로메쉬 전극의 공극 개구의 너비는 약 70 μm 내지 약 140 μm일 수 있다. 상부 마이크로메쉬 전극은 제1 재료에 의해 경계지어질 수 있고, 하부 마이크로메쉬 전극은 제2 재료에 의해 경계지어질 수 있다. 제1 재료는 세포의 전기 천공 챔버 내로의 통과를 가능하게 하는 제1 투입부를 포함하고, 제2 재료는 전기 천공 챔버로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는 제1 배출부를 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세포 및/또는 화물이 상부 마이크로메쉬 전극의 공극을 통해 이동하여 전기 천공 챔버로 들어가는 대신에, 상부 마이크로메쉬 전극은 세포 및/또는 화물의 전기 천공 챔버 내로의 통과를 가능하게 하는 제2 투입부를 선택적으로 포함할 수 있다. 제2 투입부는 제1 재료의 제1 투입부와 실질적으로 정렬될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 전기 천공된 세포가 하부 마이크로메쉬 전극의 공극을 통해 이동하여 전기 천공 챔버를 빠져나가는 대신에, 하부 마이크로메쉬 전극은 전기 천공 챔버로부터의 전기 천공의 통과를 가능하게 하는 제2 배출부를 포함할 수 있다. 제2 배출부는 제2 재료의 제1 배출부와 실질적으로 정렬될 수 있다.
예를 들어, 도 3a는 마이크로메쉬 전극을 포함하는 IOCO 전기 천공 디바이스(200)를 포함하는, 화물을 사용하여 세포를 전기 천공하기 위한 예시적인 장치를 도해한다. IOCO 전기 천공 디바이스(200)는 2 개의 마이크로메쉬 전극, 상부 마이크로메쉬 전극(240(1)) 및 하부 마이크로메쉬 전극(240(2))을 포함하며, 서로 정렬되는 것으로 본원에 나타난다. 상부 마이크로메쉬 전극(240(1))의 상부 표면은 제1 재료에 의해 경계지어질 수 있고 하부 마이크로메쉬 전극(240(2))의 하부 표면은 제2 재료에 의해 경계지어질 수 있다. 예를 들어, 제1 재료 및 제2 재료는 전기 천공 디바이스의 내부 챔버 내에, 구체적으로, 2 개의 평행한 마이크로메쉬 전극 사이의 챔버(220) 내에 세포를 수용하기 위해, 폴리디메틸실록산(PDMS) 아크릴릭, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌과 같은 비-공극성 재료일 수 있다. 제1 투입부(210)는 상부 마이크로메쉬 전극(240(1)) 상(PDMS가 없는 영역)에 형성되고, 제1 배출부(230)는 하부 마이크로메쉬 전극(240(2)) 상(PDMS가 없는 영역)에 형성된다. 따라서, 본 실시예에서, 상부 및 하부 마이크로메쉬 전극(240(1) 240(2))은 전기 천공 챔버(220)의 길이에 걸쳐 있으며, 제1 재료(상부 PDMS 층) 및 제2 재료(하부 PDMS 층)에 의해 경계지어져, 챔버의 측 방향 거리를 따라 세포의 유동을 지시한다. 제1 재료(상부 PDMS 층)의 개구(제1 투입부(210)) 및 제2 재료(하부 PDMS 층)의 개구(제1 배출부(230))는 단차 거리(d)만큼 분리되어 전기 천공 챔버(220)를 통한 측 방향으로의 세포의 유동을 용이하게 한다.
임의의 실시형태에서, 상기 기재된 전기 천공 챔버는 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 또는 다각형을 포함하나 이에 한정되지 않는, 임의의 원하는 형상을 가질 수 있다.
임의의 실시형태에서, 전기 천공 챔버 너비(w)는 약 0.01 mm 내지 약 15 mm, 0.01 mm 내지 약 10 mm, 0.01 mm 내지 약 7.5 mm, 0.01 mm 내지 약 5 mm, 약 0.05 mm 내지 약 5 mm, 약 0.1 mm 내지 약 15 mm, 0.1 mm 내지 약 10 mm, 0.1 mm 내지 약 7.5 mm, 약 0.1 mm 내지 약 5 mm, 약 1 mm 내지 약 15 mm, 약 1 mm 내지 약 10 mm, 약 1 mm 내지 약 7.5 mm, 약 1 mm 내지 약 5 mm, 약 2 mm 내지 약 10 mm, 약 2 mm 내지 약 5 mm, 약 0.01 mm 내지 약 4 mm, 약 0.1 mm 내지 약 4 mm, 약 1 mm 내지 약 4 mm, 약 0.01 mm 내지 약 2 mm, 약 0.05 mm 내지 약 1 mm, 약 0.1 mm 내지 약 0.5 mm, 또는 약 0.2 mm 내지 약 0.4 mm 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 챔버 너비(w)는 약 0.3 mm 또는 약 4 mm이다.
일부 양태에서, 제1 투입부와 제1 배출부 사이의 단차 거리(d)는 약 0.1 cm 내지 약 10 cm, 약 0.1 cm 내지 약 5 cm, 약 0.1 cm 내지 약 4 cm, 약 1 cm 내지 약 3 cm 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 단차 거리(d)는 약 2 cm이다. 일부 양태에서 투입부와 배출부 사이에는 중첩이 없다.
제1 투입부 및/또는 제2 투입부는 전기 천공 챔버와 유체 연통하고, 전기 천공 챔버는 제1 배출부 및/또는 제2 배출부와 유체 연통한다. 투입부(들), 배출부(들), 및 전기 천공 챔버는 전기 천공 챔버를 통한 세포의 유동을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브, 조절기, 펌프, 또는 임의의 다른 미세 유체 구성 요소를 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 제1 투입부와 제1 배출부 사이에 적합한 단차 거리가 유지되면, 제1 투입부 및 제1 배출부 둘 모두는 상부 마이크로메쉬 전극 상의 제1 재료 내에 위치결정될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 제2 투입부 및 제2 배출부 둘 모두는 상부 마이크로메쉬 전극 내에 존재할 수 있다. 다른 양태에서, 제1 투입부와 제1 배출부 사이에 적합한 단차 거리가 유지되면, 제1 투입부 및 제1 배출부 둘 모두는 하부 마이크로메쉬 전극 상의 제2 재료 내에 위치결정될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 제2 투입부 및 제2 배출부 둘 모두는 하부 마이크로메쉬 전극 내에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 제1 방향으로 유동하여 제1 투입부에 들어갈 수 있다. 일단 제1 전극 또는 제2 전극을 통과하면, 세포의 유동은 방향을 변경하여, 제1 방향에 수직 또는 실질적으로 수직인 방향으로 전기 천공 챔버의 길이를 따라 경로에서 측 방향으로 유동할 수 있다. 일단 제1 배출부에 도달하면, 세포의 유동은 방향을 다시 변경하여, 제1 방향과 평행한 제2 방향으로, 전기 천공 챔버를 빠져나올 수 있다.
일부 양태에서, 약 0.3 kV/cm 내지 약 3 kV/cm 범위의 전기장을 생산하기에 적합한 전압은 평행한 제1 및 제2 전극을 가로질러 인가된다. 전형적인 전기장은 haNKS의 경우 약 1 내지 1.3 kV/cm(예를 들어 40 V/300 um), EC-7 세포의 경우 약 0.3 내지 1 kV/cm 범위이다. 일부 양태에서, 전압은 약 10 V, 약 20 V, 약 30 V, 약 40 V, 약 50 V, 약 75 V, 약 100 V, 또는 약 200 V, 또는 그 안에서 임의의 적합한 범위, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 양태에서, 제1 투입부, 제2 투입부, 제1 배출부 및 제2 배출부의 직경은 거의 동일할 수 있다. 다른 양태에서, 제1 투입부의 직경은 제1 배출부의 직경보다 크거나 작을 수 있고/있거나 제2 투입부의 직경은 제2 배출부의 직경보다 크거나 작을 수 있다. 예를 들어, 제1 투입부 및/또는 제2 투입부의 직경은 약 0.1 mm 내지 약 10 mm, 약 1 mm 내지 약 7 mm, 약 3 mm 내지 약 5 mm 범위일 수 있거나, 약 4 mm일 수 있다. 제1 배출부 및/또는 제2 배출부의 직경은 약 0.1 mm 내지 약 10 mm, 약 1 mm 내지 약 7 mm, 약 3 mm 내지 약 5 mm 범위일 수 있거나, 약 4 mm일 수 있다.
임의의 실시형태에서, 전기 천공 챔버의 길이(l)는 약 2 mm 내지 약 100 mm, 약 2 mm 내지 약 80 mm, 약 2 mm 내지 약 60 mm, 약 2 mm 내지 약 40 mm, 약 2 mm 내지 약 20 mm, 약 5 mm 내지 약 100 mm, 약 5 mm 내지 약 80 mm, 약 5 mm 내지 약 60 mm, 약 5 mm 내지 약 40 mm, 약 5 mm 내지 약 20 mm, 약 5 mm 내지 약 15 mm, 약 8 mm 내지 약 12 mm 범위일 수 있거나, 약 10 mm일 수 있다.
임의의 실시형태에서, 전기 천공 챔버의 높이(h)는 약 100 μm 내지 약 1000 μm, 약 100 μm 내지 약 750 μm, 약 100 μm 내지 약 500 μm, 약 100 μm 내지 약 300 μm, 약 100 μm 내지 약 200 μm, 약 200 μm 내지 약 1000 μm, 약 200 μm 내지 약 750 μm, 약 200 μm 내지 약 500 μm, 또는 약 200 μm 내지 약 300 μm 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 챔버 높이(h)는 약 284 μm이다.
임의의 실시형태에서, 길이(l) 대 너비(w)의 비(l/w)는 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 20 또는 약 1 내지 약 10일 수 있다.
임의의 실시형태에서, 일단 세포가 전기 천공 챔버에 들어가면, 세포는 전기 천공 챔버를 빠져나갈 때까지 균일한 전기장에 노출된다. 예를 들어, 도 3b는 IOCO 전기 천공 디바이스(200)에서의 전기장의 도해이다. 위치(1)는 투입부(제1 투입부(210))에서의 세포를 지칭하고, 위치(2)는 전기 천공 챔버 내의 세포를 지칭하며, 위치(3)는 배출부(제1 배출부(230))에서의 세포를 지칭한다.
도 3c는 전기장 강도 대 IOCO 전기 천공 디바이스(200)를 통한 세포 이동 거리의 도표이다. 위치(1)에 나타난, 투입부(제1 투입부(210))에서의 세포는 전기 천공 챔버 내로 마이크로메쉬 전극을 통과할 때까지 전기장에 노출되지 않는다. 위치(2)로 나타난, 전기 천공 챔버 내에서 세포는 챔버의 길이를 따라 이동하는 동안 균일한(최대 강도) 전기장을 경험한다. 위치(3)에 나타난, 배출부(제1 배출부(230))에 있을 때, 세포는 전기장에 노출되지 않는다.
도 3d는 전기 천공 디바이스(310 내지 330)를 포함하는 본원에 제시된 전기 천공 장치의 대안적인 구성을 나타낸다. 본 실시형태에서, 상부 메쉬와 하부 메쉬 사이에 선형(수평) 유동 경로를 갖는 대신, 세포는 상부 메쉬와 하부 메쉬 사이에 곡선형 또는 원형(수평) 유동 경로를 취할 수 있다. 선형 유동 경로 및 곡선형 유동 경로는 각각 상부 및 하부 메쉬 중 적어도 하나의 표면에 의해 정의되는 평면에 대해 평행하게 연장되는 적어도 하나의 세그먼트를 포함할 수 있다.
본 실시예에서, 전기 천공 디바이스(310 내지 330)의 다양한 층이 도 3d에 나타나 있다. 고체 외부 판(310(1) 및 310(2))(예를 들어, 플라스틱, 금속, 또는 임의의 다른 적합한 재료)은 디바이스를 캡슐화한다. 점착층 또는 다른 적합한 재료(예를 들어 양면 테이프, 감압 점착 재료 등)(320(1))(제1 재료)는 상부 고체 외부 판(310(1))과 상부 메쉬(330(1)) 사이에 놓이고, 점착층 또는 다른 적합한 재료(예를 들어 양면 테이프, 감압 점착 층 등)(330(2))(제2 재료)는 하부 외부 판(310(2))과 하부 메쉬(330(2)) 사이에 배치된다. 세포 및 화물이 유동할 수 있는 곡선형 채널 또는 곡선형 경로(335)를 포함하는 또 다른 점착층(예를 들어 감압 점착 재료 또는 양면 테이프 등)(340)은 상부 및 하부 메쉬(330(1) 330(2)) 사이에 위치결정된다. 유체는 시린지(350)에 의해 전기 천공 디바이스(310 내지 330)를 통해 추진될 수 있다. 전기 천공 디바이스(310 내지 330)는 또한 전기 천공기 펄서(360)와 인터페이스 연결될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 전기 천공 디바이스(310 내지 330)는 세포가 연속적인 방식으로 디바이스를 통해 유동하는 연속적 전기 천공 디바이스일 수 있다.
세포 및 화물이 전기 천공 챔버를 통해 유동하는 경로는 전기 천공 챔버, 예를 들어 제1 전극(예를 들어, 고체 전극 또는 상부 마이크로메쉬 전극)과 제2 전극(예를 들어, 고체 전극 또는 하부 마이크로메쉬 전극) 사이의 상기 기재된 유체 채널 영역에 정의된다. 경로가 제1 전극(예를 들어, 고체 전극 또는 상부 마이크로메쉬 전극) 및 제2 전극(예를 들어, 고체 전극 또는 하부 마이크로메쉬 전극) 중 적어도 하나에 평행한 적어도 하나의 수평 유동 세그먼트를 포함하면, 임의의 적합한 경로가 본원에 제공되는 실시형태에 의해 고려되는 것으로 이해된다. 수평 유동 세그먼트는 상부 마이크로메쉬 전극과 하부 마이크로메쉬 전극 사이에서 연장되는 경로 길이의 1/10, 1/4, 1/2, 3/4, 7/8, 또는 9/10 중 임의의 것보다 크거나 작게 형성될 수 있다. 일부 경우에, 경로는 선형, 곡선형, 분지형, 순환형, 구불구불형, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 곡선형 경로의 예로는 원형 경로, 나선형 경로, 원추형 경로, 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 도 3b에 도해된 바와 같이, 경로는 선형이며 여기서 화살표는 세포의 유동을 도해한다. 도 2a, 도 2b, 도 3d 및 도 3e에 도해된 바와 같이, 경로는 곡선형이며 여기서 화살표는 세포의 유동을 도해한다. 도 3f에 도해된 바와 같이, 경로는 하나 이상의 방향 변화 또는 지그재그 선로(switch-back)를 갖는 선형일 수 있으며 화살표는 세포의 유동을 도해한다. 도 3g에 도해된 바와 같이, 경로는 원형일 수 있고 하나 이상의 분지를 가질 수 있다. 도 3e 내지 도 3g에 나타난 바와 같이, 경로는, 제1 투입부에 상응하거나 실질적으로 제1 투입부와 정렬될 수 있는 (평면 외부로의) 입구(380), 및 제1 배출부에 상응하거나 실질적으로 제1 배출부와 정렬될 수 있는, 하나 이상의 (평면 내로의) 출구(390)를 포함할 수 있다. 경로의 길이는 전기 천공 프로세스의 특정 특성에 따라, 조정, 예를 들어 단축 또는 연장될 수 있다.
임의의 실시형태에서, 본원에 기재된 전기 천공 장치는 샘플 튜브로부터 전기 천공 디바이스의 전기 천공 챔버로의 세포의 유동 및 디바이스를 통한 수집 튜브로의 유동을 생성하는 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3h에 도해된 바와 같이, 유동 생성 수단(520)은, 예를 들어 관류를 통해, 형질 감염을 위한 세포 및/또는 화물을 수용하는 샘플 튜브(510) 및 전기 천공 디바이스(530)와 유체 연통한다. 유동 생성 수단(520)은 샘플 튜브(510)로부터 관류를 통해 전기 천공 디바이스(530)를 통과하여 수집 튜브(550) 내로 세포 및/또는 화물이 유동하는 것을 생성할 수 있다. 나타나지 않았지만, 공기 필터 디바이스는 샘플 튜브(510), 수집 튜브(550), 또는 둘 모두의 내용물과 유체 연통할 수 있다. 유동 생성 수단은 임의의 적합한 펌프, 예를 들어 연동 펌프 또는 시린지 펌프일 수 있다. 하나 초과의 유동 생성 수단(520)이 전기 천공 장치에 존재할 수 있음이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 하나 이상의 유동 생성 수단(520)은 샘플 튜브(510)와 전기 천공 디바이스(530) 사이에 유체 연통하며 존재할 수 있고 하나 이상의 유동 생성 수단(520)은 수집 튜브(550)와 전기 천공 디바이스(530) 사이에 유체 연통하며 존재할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 전기 천공 디바이스(530) 및/또는 유동 생성 수단(520)은 또한, 예를 들어 전기 천공기 펄서를 포함하는, 제어기(540)와 인터페이스 연결될 수 있다.
임의의 실시형태에서, 본원에 기재된 전기 천공 장치는 또한 필요에 따라 프라이밍 완충액을 전달하기 위해 전기 천공 디바이스와 유체 연통하는 프라이밍 완충액 튜브를 포함할 수 있다. 적합한 프라이밍 완충액의 예로는 증류수, 탈이온수, 등장성 완충액, 및 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 도 3i에 도해된 바와 같이, 프라이밍 완충액 튜브(560)는 전기 천공 디바이스(530)와 유체 연통한다. 유동 생성 수단(520)을 통해 전기 천공 디바이스(530)에 프라이밍 완충액을 전달하기 위해 밸브(570)가 개방될 수 있거나, 전달을 중단하기 위해 밸브(570)가 폐쇄될 수 있다. 유동 생성 수단(520)을 통해 전기 천공 디바이스(530)에 세포 및/또는 화물을 전달하기 위해 밸브(575)가 개방될 수 있거나, 전달을 중단하기 위해 밸브(575)가 폐쇄될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 및 프라이밍 완충액을 전달하기 위해 밸브(570 및 757) 둘 모두가 개방될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 완충액이 먼저 전달된 후 세포 및/또는 화물이 전달될 수 있다.
임의의 실시형태에서, 본원에 기재된 전기 천공 장치는 또한 전기 천공 디바이스의 전기 천공 챔버에 들어가기 전에 세포를 분류하기 위한 제1 미세 유체 디바이스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3j에 도해된 바와 같이, 제1 미세 유체 디바이스(580)는 전기 천공 디바이스(530), 형질 감염을 위한 세포를 수용하는 샘플 튜브(510), 및 선택적으로 완충액 분류 튜브(577)와 유체 연통할 수 있다. 유동 생성 수단(520)은 샘플 튜브(510)로부터의 세포 및/또는 분류 튜브(577)로부터의 완충액이 전기 천공 디바이스(530)를 통과하여 수집 튜브(550)로 유동하는 것을 생성할 수 있다. 제1 미세 유체 디바이스(580)는, 예를 들어 세포의 크기에 기초하여, 샘플 튜브(510)로부터 전기 천공 디바이스(530)로 세포를 사전-분류할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 제1 미세 유체 디바이스(580)는 샘플 튜브(510)로부터 세포의 완충액 변경을 달성할 수 있다. 분류되고 전기 천공 디바이스(530)로 전달되지 않은 세포를 함유하는 스트림(stream)(590)은 폐기물 스트림이거나, 상이한 파라미터를 갖는 또 다른 전기 천공 디바이스로 보내질 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 제2 미세 유체 디바이스(585)는 전기 천공 디바이스(530) 및 수집 튜브(550)와 유체 연통할 수 있다. 제2 미세 유체 디바이스(585)는 수집 튜브(550)에서의 수집 전에, 예를 들어 전기 천공된 세포의 크기에 기초하여, 전기 천공된 세포를 분류할 수 있다. 스트림(595)은, 분류되고 수집 튜브(550)로 전달되지 않은 전기 천공된 세포를 함유한다.
2 개의 미세 유체 디바이스가 도 3j에 나타나 있지만, 예를 들어 전기 천공 챔버에 들어가기 전에 세포를 분류하거나 전기 천공 챔버를 빠져나가는 전기 천공된 세포를 분류하기 위해, 오직 하나의 미세 유체 디바이스가 전기 천공 장치에 존재할 수 있음이 본원에서 고려된다.
도 3k는 예시적인 미세 유체 디바이스(예를 들어, 미세 유체 디바이스(580), 미세 유체 디바이스(585))의 도해이다. 본 실시예에서, 세포(100)(예를 들어, 형질 감염을 위한 세포, 전기 천공된 세포, 형질 감염된 세포)를 포함하는 용액은 투입 메커니즘(110)에서 챔버(105)로 들어간다. 세포는 원으로 도해된다. 세포는, 기울기를 갖는 복수의 선을 따라 분포되는 직사각형 구조로 본원에 나타난, 기둥(115)의 매트릭스를 포함하는 챔버(105)를 통과한다. 세포가 챔버에서 대각선으로 배향된 기둥 열 사이에서 통과할 때, 세포는 제2 배출 메커니즘(122)을 향해 측 방향으로 편향된다. 챔버 중 일부의 측면도가 도 3l에 나타나 있으며, 여기서 챔버는 바닥(160)을 가지며 선택적으로, 기둥(115)과 동일한 재료 또는 상이한 재료로 된 것일 수 있는 천장(150)을 갖는다. 세포(검은색 원)는 기둥의 매트릭스를 통과하여 유동하는 것으로 나타난다. 기둥 열은 또한 곡선으로 이루어진 방식으로 배열될 수 있으며, 또한 그에 따라 세포가 챔버의 측면을 향하게 될 것이라는 점이 이해된다.
본 실시예에는, 챔버에 대해 2 개의 배출 메커니즘이 나타나 있다. 제1 배출 메커니즘(120)(하나 초과의 미세 유체 디바이스가 존재하는 경우, 제3 배출 메커니즘으로도 지칭될 수 있음)을 통해 챔버를 빠져나가는 용액에는 세포가 고갈되어 있는 반면, 제2 배출 메커니즘(122)(하나 초과의 미세 유체 디바이스가 존재하는 경우 제4 배출 메커니즘으로도 지칭될 수 있음)을 통해 챔버를 빠져나가는 용액에는 세포가 강화되어 있다. 임의의 실시형태에서, 제2 배출 메커니즘은, 예를 들어 제1 투입부를 갖는 전기 천공 챔버와 유체 연통할 수 있다. 고갈은 배출 메커니즘(120)을 통해 챔버를 빠져나가는 용액 내 세포 농도가 투입 메커니즘(110)에서 챔버로 들어가는 용액 내 세포 농도와 비교할 때 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 감소된 상태를 지칭한다. 강화 또는 농축은 배출 메커니즘(122)을 통해 챔버를 빠져나가는 용액 내 세포 농도가 투입 메커니즘(110)에서 챔버로 들어가는 용액 내 세포 농도와 비교할 때 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상만큼 증가된 상태를 지칭한다. 세포가 배출 메커니즘(122)을 향하도록, 챔버의 편향 지점(130)은 빠져나가는 세포가 배출 메커니즘(122)(배출 메커니즘(120)이 아님)으로 보내지도록 위치되어야 한다. 일반적으로, 배출 메커니즘(122)은 배출 메커니즘(120)보다 더 큰 단면적을 갖도록 구성된다. 일반적으로, 배출 메커니즘은, 세포 또는 디바이스를 손상시킬 높은 압력을 생산하지 않으면서, 본원에 기재된 유속의 유체 유동을 위해 충분히 큰 단면적을 가질 것이다.
일부 실시형태에서, 배출 메커니즘(120)의 폭은 배출 메커니즘(122)의 폭보다 더 크다. 예를 들어, 배출 메커니즘(120)의 폭은 배출 메커니즘(122) 폭의 1.5x, 2x, 2.5x, 3x, 3.5x, 4x, 4.5x, 5x, 5.5x, 6x, 6.5x, 7x, 7.5x, 8x, 8.5x, 9x, 9.5x이다. 다른 실시형태에서, 배출 메커니즘의 단면적의 총합은 투입 메커니즘의 단면적 총합보다 크거나 그와 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세 유체 디바이스는 표준 펌프 또는 시린지 등이 미세 유체 디바이스에 연결되어 세포를 포함하는 용액을 디바이스를 통해 유동시키는 것을 가능하게 하도록 구성된다. 디바이스를 통한 용액의 유동에 영향을 미칠 수 있는 파라미터로는 챔버(105)의 치수, 기둥(115)의 평면 내 및 평면 외 치수, 열 내 기둥의 간격(dx), 기둥의 회전(Φ), 기둥 열 사이의 거리(dy), 투입 메커니즘의 직경, 및 배출 메커니즘의 직경(하기 도 3m 내지 도 3q 참고)이 포함된다. 일부 실시형태에서, 이들 파라미터의 치수는 디바이스를 통한 용액의 유동을 추진하는 시린지 또는 표준 펌프(예를 들어, 연동 펌프, 다이어프램(diaphragm) 펌프, 시린지 펌프, 로브(lobe) 펌프 등)의 수동 작동으로부터 인가되는 압력과 양립되도록 선택된다. 압력이 미세 유체 디바이스 또는 세포를 손상시키지 않는 경우, 다양한 압력이 허용된다.
일반적으로, 세포는 직렬로(한 번에 하나 그리고 특정 경로로) 또는 다중으로(다수 경로로 유동하는 다수 세포) 미세 유체 디바이스 내로 유동할 수 있다.
도 3m은 챔버(105) 구획의 하향식 도면의 도해이며, 여기서 구획은 각각 7 개의 기둥의 2 개 열을 포함한다. 세포 유동은 경로(p)를 따라 나타난다. 본 도해는 미세 유체 디바이스의 챔버 구획에서의 기둥(115)의 위치결정을 나타낸다. 일반적으로 기둥은 간격(dx)을 두고 각도(θ)로 정의된 기울기를 갖는 선을 따라 정렬되며, 이는 고정될 수 있거나, 변동이 기둥 사이의 경로(p)로부터의 세포의 탈출을 야기하지 않는 경우 변동될 수 있다.
일부 실시형태에서, 챔버의 너비는 1 mm, 2.5 mm, 5 mm, 7.5 mm, 10 mm, 12.5 mm, 15 mm, 17.5 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm, 50 mm, 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 크기이다. 개별 경로의 너비(p)는 유선의 특성을 제어한다. 임의의 수의 경로, 예를 들어 1, 2, 4, 8, 12, 16, 32 개 등, 또는 그 사이의 임의의 범위가 챔버의 너비에 따라 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 챔버를 통과하는 유체의 유속은 1 mL/hr, 2 mL/hr, 3 mL/hr, 4 mL/hr, 5 mL/hr, 6 mL/hr, 7 mL/hr, 8 mL/hr, 9 mL/hr, 10 mL/hr, 15 mL/hr, 20 mL/hr, 25 mL/hr, 30 mL/hr, 40 mL/hr, 50 mL/hr 등일 수 있다. 챔버는 바람직하게는 직사각형이지만, 원형, 반-원형, V자-형, 또는 임의의 다른 적절한 형상일 수도 있다.
각도(θ)는 기울기가 0인 수평 축과 기둥이 분포되는 기울기를 갖는 선 사이의 각도이다(본 실시예에서, 각도는 기둥 열의 음의 기울기(tan(θ) = Δy/Δx) 측정을 제공한다). 본 실시예에서, 기둥은 기둥의 각각의 열이 대각선으로 배열될 때, 양의 또는 음의 기울기를 가질 수 있음이 이해된다. 본원에서, 대각선은 챔버에 평행 또는 수직이 아닌 임의의 배향, 예를 들어 1도 내지 89도, 91도 내지 179도, 181도 내지 269도, 또는 271도 내지 359도의 각도, 시계 방향 또는 반 시계 방향을 포함할 수 있음이 이해된다. 다른 예시적인 각도 범위는 1 내지 10도, 11 내지 20도, 21 내지 30도, 31 내지 40도, 41 내지 50도, 51 내지 60도, 61 내지 70도, 71 내지 80도, 81 내지 90도, 91 내지 100도, 101 내지 110도, 111 내지 120도, 121 내지 130도, 131 내지 140도, 141 내지 150도, 151 내지 160도, 161 내지 170도, 또는 171 내지 180도일 수 있다.
일반적으로, 다수 열의 기둥이 챔버 내에 존재하고, 각각의 열은 각도(θ)로 정의된 것과 동일한 기울기 또는 실질적으로 동일한 기울기를 갖는다. 세포(100)가 미세 유체 디바이스의 챔버(105)에 들어갈 때, 세포는 챔버의 측면에 도달할 때까지, 챔버(105)의 측면을 향해, 측 방향 방식으로 기둥(115) 사이의 복수의 경로(p)를 통해 유동한다. 농축한 세포의 경우, 세포는 일반적으로 기둥의 열을 가로지르지 않고, 오히려 세포는 전형적으로 특정 경로(p)를 따라 이동한다. 그 후 세포는 배출 메커니즘(122)을 통해 미세 유체 챔버를 빠져나간다. 다른 실시형태에서, 기둥은 챔버(105)의 길이를 따라 곡선으로 이루어진 구성 요소를 가질 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "기둥"은 연관된 평면-내 치수, 평면-외 치수, 회전 각도, 및 형상을 갖는 챔버 내의 구조를 지칭한다. 평면-내 치수는 기둥의 길이(l) 및 너비(w)를 지칭할 수 있으며, 평면-외 치수는 기둥의 높이(h)를 지칭할 수 있다. 기울어진 각도 또는 회전 각도(Φ)는 챔버에 대한 기둥의 회전을 지칭한다.
형상은 기둥의 3-D 특성표시, 예를 들어 원통형, 원추형, 피라미드형, 입방형 또는 장방형 등을 지칭한다. 일반적으로, 기둥은 그의 축(평면-외 치수)이 그것이 부착되는 표면에 수직이도록 위치결정될 것이다. 일부 실시형태에서, 챔버 내의 모든 기둥은 동일한 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 기둥의 치수는 공간의 함수로서, 예컨대 기둥의 높이(h)를 따라 측정되는 위치에 따라 달라진다. 일반적으로, 기둥은 임의의 형상을 가질 수 있으며, 본원에 제시된 특정 기하학적 형상으로 한정되지 않는다. 기둥 형상은, 예를 들어 반복되는 일정한 간격 또는 반복되는 가변적인 간격으로, 축 길이(l) 및 너비(w), 및 축 길이를 따라 위치결정되는, 곡률과 관련된 복수의 반경(r4 내지 r12)으로 표시되는 도 3r에 나타난 바와 같이, 임의적일 수 있다. 임의의 수의 상이한 기하학적 구조는 복수의 반경으로 기재될 수 있다. 추가적으로, 도 3r 및 도 3s를 참조하면, 기둥의 하나 이상의 측면은 직선 형상일 수 있다. 따라서, 기둥은 곡선 및/또는 직선으로 구성된 임의의 적합한 형상을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 기둥은 기울기를 갖는 선을 따라 간격(dx)을 두고 배열되며, 여기서 간격은 규칙적으로 이격되거나 고정된다. 예를 들어, 기둥은 농축될 세포의 크기에 따라 5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm 등(이들 범위 사이의 임의의 값을 포함함)마다 배치될 수 있다.
다른 실시형태에서, 기둥은, 간격이 고정되지는 않지만 대신 임의의 2 개의 연속하는 기둥 사이에서 달라지도록, 기울기를 갖는 선을 따라 분포된다. 세포가 경로(p)를 탈출하는 것을 방지할 정도로 간격이 충분히 작으면, 임의의 간격(dx)이 허용된다. 예를 들어, 가변적 간격의 경우, 제1 기둥은 특정 위치에 배치될 수 있고, 제2 기둥은 제1 기둥으로부터 5 μm에 배치될 수 있고, 제3 기둥은 제2 기둥으로부터 4 um에 배치될 수 있으며, 이와 같은 방식이 계속 이어진다. 간격은 세포의 크기에 기초하여 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 간격은 특정 유형의 세포의 농축을 가능하게 하는 한편 더 작은 세포는 배출 메커니즘(120)을 통해 빠져나가는 것을 가능하게 하기에 충분히 크도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은, 적혈구, 호중구(예를 들어 직경 12 내지 14 μm), 호산구(예를 들어 직경 12 내지 17 μm), 호염기구(예를 들어 직경 14 내지 16 μm), 림프구(예를 들어 직경 10 내지 14 μm), 및 단핵구(예를 들어 직경 20 μm)를 포함하는, 비교적 작은 크기의 복수의 상이한 세포 유형을 포함할 수 있다. 인체 내의 다른 유형의 세포는 훨씬 더 크며, 예를 들어 직경이 40 내지 100 μm 범위이거나 그 이상이다. 이러한 경우, 기둥은 적혈구 및 백혈구의 통과를 가능하게 하면서 더 큰 세포(예를 들어 정상 세포, 종양 세포 등)를 농축시키도록 이격될 수 있다. 기둥의 구성(간격)은 단리되는 세포의 유형에 기초하여 구성된다. 상이한 덮개(sheath)-대-샘플 유동 비율은 크기-기반 분류 성능에 영향을 미칠 수 있다.
각각의 기둥은 평면-내 치수라고도 지칭되는, 관련 길이(l), 너비(w), 및 평면 외 치수라고도 지칭되는 높이(h)를 갖는다(도 3n 또한 참고). 일부 실시형태에서, 기둥의 너비는 5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm 등 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 기둥의 길이는 5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm 등 또는 그 사이의 임의의 값일 수 있다. 일반적으로 기둥은, 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 임의의 형상(위에서 아래로 볼 때, 치수 w 및 l과 관련하여)을 가질 수 있다.
본원에 제시된 실시예에서, 기둥은 타원형 또는 직사각형 형상을 갖는다. 일부 실시형태에서, 기둥의 길이는 기둥의 너비보다 1.1 내지 10 배 더 크거나; 기둥의 너비보다 1.1 내지 5 배 더 크거나; 기둥의 너비보다 2 내지 4 배 더 크거나; 기둥의 너비보다 3 내지 4 배 더 크거나; 기둥의 너비보다 2 내지 3 배 더 크다. 일부 실시형태에서, 길이 및 너비는 20 대 1, 18 대 1, 16 대 1, 14 대 1, 12 대 1, 10 대 1, 9 대 1, 8 대 1, 7 대 1, 6 대 1, 5 대 1, 4 대 1, 3 대 1, 2 대 1, 1.1 대 1, 또는 더 작거나 더 큰 비율 중 임의의 것보다 더 크거나 작은 비율을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 기둥의 단면은 기둥이 높이(h)로 연장되는 벽에 평행한 평면과 기둥의 교차에 의해 정의될 수 있다. 단면은 길이(l) 및 너비(w) 방향 중 하나 또는 둘 모두를 따라 대칭일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 매트릭스 내 각각의 기둥의 길이 및 너비는 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 기둥이 원형인 경우, 매트릭스 내 각각의 기둥의 반경은 동일하다.
추가의 특성으로는 기둥의 회전 각도(Φ), 기둥의 높이 또는 평면 외 치수, 열 사이의 간격(dy), 및 열의 단차(xo)가 포함되며, 이는 도 3n 내지 도 3q 및 출원 전체에 걸쳐 추가로 상세하게 기재된다. 본원에서 사용된 용어 "회전 각도"는 챔버에서의 기둥의 위치에 대한 기둥의 회전 정도를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 기둥은 너비보다 더 큰 길이를 갖는다. 본 실시형태에서, 0의 회전 각도는 기둥의 길이가 챔버의 측면에 수직인 축과 정렬됨을 의미한다. 상이한 회전 각도를 기술하기 위해, 기둥이 시계 방향 또는 반 시계 방향으로 회전될 수 있다. 예로서, 도 3m 내지 도 3q에서의 기둥은 반 시계 방향의 움직임으로 약 35 도 회전되어 이들 도면에 나타난 기둥의 기하학적 구조에 도달한다.
도 3n을 참조하여, 각각의 기둥은, 위쪽의 경로로 유동함으로써(예를 들어, 기둥의 상단을 넘어 상이한 경로 내로) 세포가 경로(p)로부터 탈출하는 것을 방지할 정도로 기둥이 충분히 높도록, 연관된 높이(h) 또는 평면 외 치수를 가진다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 기둥은 미세 유체 챔버의 높이에 걸쳐 있을 것으며, 그에 따라 이러한 기둥은 챔버의 바닥(160) 및 챔버의 천장(150)과 접촉될 것이다. 다른 실시형태에서, 기둥의 높이 또는 평면 외 치수는 미세 유체 디바이스의 전체 높이의 일부에 걸쳐 있을 수 있다. 예를 들어 기둥은 1 μm, 3 μm, 5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm 등, 또는 그 사이의 임의의 값의 높이를 가질 수 있다.
도 3o를 참조하여, 각각의 기둥은 하향식 도면에 나타난 바와 같이, 연관된 회전 각도(Φ) 또는 경사를 갖는다. 본 실시예에서, 기둥의 회전은, 기둥의 길이가 챔버의 측면에 수직인 제1 축과 정렬되고 기둥의 너비가 챔버의 측면과 일직선을 이루는 제2 축과 정렬된 배향에서 시작하여, 원하는 회전에 도달할 때까지, 반 시계 방향으로, 예를 들어 본 실시예에서는, 반 시계 방향으로 약 35도 기둥을 회전시킴으로써, 결정된다. 경로(p)를 통한 세포의 유동을 용이하게 하는 임의의 회전 각도가 이용될 수 있으며, 이러한 모든 회전 각도가 본원에서 고려된다. 일부 실시형태에서, 회전 각도는 1 도 내지 179 도, 1 도 내지 89 도, 5 도 내지 85 도, 10 도 내지 80 도, 15 도 내지 75 도, 20 도 내지 70 도, 25 도 내지 65 도, 30 도 내지 60 도, 35 도 내지 55 도, 40 도 내지 50 도, 30 도 내지 40 도, 32 도 내지 38 도, 34 도 내지 36 도, 또는 35 도이다. 다른 실시형태에서, 회전 각도는 91도 내지 179도, 95도 내지 175도, 100도 내지 170도, 105도 내지 165도, 110도 내지 160도, 115도 내지 155도, 120도 내지 150도, 125도 내지 145도, 130도 내지 140도, 또는 135도일 수 있다.
이전에 표시된 바와 같이, 기둥은 음의 기울기를 갖는 선을 따라 분포된다. 이 선을 따라 세포를 배향함으로써, 경로(p)를 통해 유동하는 세포는 챔버의 측면을 향해, 측 방향으로 향하며, 세포가 원래 현탁되어 있는 용액은 배출 메커니즘(120)을 통해 미세 유체 챔버를 빠져나가는 방식으로(예를 들어 거의 수평으로 또는 수평으로) 유동할 수 있다.
도 3p를 참조하여, 또 다른 실시형태에서, 기둥의 열은 간격(dy)을 두고 이격된다. 일부 실시형태에서, 기둥은 수직선을 따라 간격(dy)을 두고 배열되며, 간격은 규칙적으로 이격되거나 고정된다. 예를 들어, 기둥은 농축될 세포의 크기에 따라 그 사이의 임의의 값을 포함하여, 5 μm, 10 μm, 15 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm, 50 μm, 55 μm, 60 μm, 65 μm, 70 μm, 75 μm, 85 μm, 90 μm, 95 μm, 100 μm 등마다 배치될 수 있다.
다른 실시형태에서, 기둥은, 간격(dy)이 고정되지는 않지만 대신 임의의 2 개의 연속하는 기둥 열 사이에서 달라지도록, 수직선을 따라 분포된다. 예를 들어, 수직선에 대해 정렬되어, 제1 기둥 열은 특정 위치에 배치될 수 있고, 제2 기둥 열은 제1 기둥 열로부터 5 μm에 배치될 수 있고, 제3 기둥 열은 제2 기둥 열로부터 4 um에 배치될 수 있으며, 이와 같은 방식이 계속 이어진다. 간격(dy)은 농축될 세포의 크기에 기초하여 선택될 수 있다. 미세 유체 디바이스를 손상시킬 수 있는 고압을 필요로 하지 않으면서, 챔버를 통과하는 용액의 유동을 가능하게 할 정도로 간격이 충분히 넓다면, 임의의 간격(dy)이 허용된다. 일부 실시형태에서, 연속하는 기둥 열은 제로 단차(xo)를 가질 수 있다.
도 3q를 참조하여, 연속하는 기둥 열은 간격(dx)에 비례하여 단차(xo)를 가질 수 있다. 예를 들어, 열(r)은 특정 위치에 자리잡을 수 있다(예를 들어 데카르트 좌표계 x, y를 사용). (r+1)번째 열은 일정 양(xo)만큼 오른쪽으로 옮겨질 수 있다. (r+2)번째 열은 일정 양(2xo)만큼 오른쪽으로 옮겨질 수 있다. (r+3)번째 열은 일정 양(3xo)만큼 오른쪽으로 옮겨질 수 있으며, 이와 같은 방식이 계속 이어져 간격(dx)까지 옮겨질 수 있다. 단차는 고정된 방식으로 발생할 수 있고, 그에 따라 각각의 연속하는 열은 고정된 양만큼 동일한 방향으로 옮겨진다. 대안적으로, 각각의 연속하는 열이 가변적인 양만큼(양(dx)까지) 동일한 방향으로 옮겨지도록, 단차는 가변적인 방식으로 발생할 수 있다. 다른 실시형태에서, 단차는, 열(r)에 대하여, (r+1)번째 열이 일 방향으로 고정 또는 가변 단차를 갖고, (r+2)번째 열은 반대 방향으로 고정 또는 가변 단차를 갖도록, 교대 방향으로 적용될 수 있다(예를 들어 일 단차는 오른쪽으로 있고 다음 단차는 왼쪽으로 있음).
기둥은 폴리(디메틸실록산)(PDMS), 유리, 플라스틱, 엘라스토머, 실리콘 등을 포함하는 임의의 적합한 재료로 만들어질 수 있다. 일반적으로 PDMS는 마이크론-이하 분해능을 갖도록 제작될 수 있다(예를 들어 0.1 μm 미만 특징). 일부 실시형태에서, 챔버(105) 및/또는 기둥(115)은 PDMS로 만들어질 수 있다. 다른 실시형태에서, 챔버는 유리 및/또는 실리콘 및/또는 플라스틱으로 제작될 수 있고, 기둥은 PDMS를 사용하여 제작될 수 있다(예를 들어, 챔버의 저부는 유리 또는 실리콘일 수 있고 챔버의 상단은 유리 또는 플라스틱일 수 있다). 당업계에 잘 알려진, 리소그래피는 본원에 기재된 챔버 및 기둥을 제작하는 데 이용될 수 있다. PDMS와 유사한 특성을 갖는 재료 또한 본원에 제시된 미세 유체 디바이스를 구성하는 데 사용될 수 있다.
추가적으로, 특정 실시형태는 밸브(예를 들어, 투입 메커니즘과 챔버 사이, 챔버와 배출 메커니즘 사이, 배출 메커니즘과 또 다른 투입 메커니즘 또는 또 다른 챔버 사이 등의), 펌프 및 믹서를 포함하는 다수의 추가적 특징을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밸브는 큐레이션 동안 PDMS로 배치될 수 있다.
미세 유체 디바이스를 제작하기 위해 다양한 기술이 사용될 수 있다. 미세 유체 디바이스는 다음 재료 중 하나 이상으로부터 형성될 수 있다: 폴리(메틸메타크릴레이트)(PMMA), 폴리카르보네이트, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리올레핀, 실리콘(예를 들어, 폴리(디메틸실록산)(PDMS)), 실리콘, 및 이들의 조합. 기타 재료가 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 참조된 재료를 사용하여 기둥 및 미세 유체 디바이스를 갖는 챔버를 제작하는 방법은 또한 당업계에 알려져 있으며 엠보싱, 레이저 미세 기계 가공, 밀링(milling), 몰딩(예를 들어, 열가소성 사출 성형, 또는 압축 성형), 포토리소그래피(예를 들어 스테레오리소그래피 또는 x-레이 포토리소그래피), 실리콘 미세 기계 가공, 습식 또는 건식 화학 에칭 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포토리소그래피에 이어 습식(KOH) 또는 건식 에칭(불소 또는 기타 반응성 기체를 사용한 반응성 이온 에칭)을 사용하는 실리콘 제작 기술이 유리 재료에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 유리 마스터는 종래의 포토리소그래피에 의해 형성될 수 있으며, 이는 플라스틱 또는 PDMS-기반 디바이스를 생성하는 몰딩 기술을 위한 마스터 형판 역할을 한다.
미세 유체 디바이스는, 예를 들어 점착제, 클램프, 열, 용매 등에 의해 함께 연결되는 하나 이상의 층으로 제작될 수 있다. 대안적으로, 미세 유체 디바이스는, 예를 들어, 스테레오리소그래피 또는 다른 3-차원 제작 기술을 사용하여, 단일의 부품(single piece)으로서 제작될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포의 변형성으로 인해, 농축되는 세포의 크기(예를 들어, 직경)와 비교하여 약 5 μm 이하인 갭 거리가 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 분류되는 세포의 크기(예를 들어, 직경)와 비교하여 약 5 μm 이상인 갭 거리가 선택될 수 있다. 변형 가능한 세포와 동일하거나 유사한 직경을 갖는 경질 세포 또는 미소 구체의 경우, 동일한 직경의 변형 가능한 세포에 대한 갭 거리와 비교하여 갭 거리가 상이할 수 있다(예를 들어, 경질 세포의 경우 더 큼).
도 3t는 또 다른 예시적 미세 유체 세포 농축기의 도해이다. 본 실시예에서, 세포(100)를 포함하는 제1 용액은 제1 투입 메커니즘(110)에서 챔버(105)로 들어간다. 세포는 원으로 도해된다. 세포는, 기울기를 갖는 선을 따라 분포되는 직사각형 구조로 본원에 나타난, 기둥(115)의 매트릭스를 포함하는 챔버(105)를 통과한다. 세포가 챔버에서 대각선으로 배향된 기둥 열 사이에서 통과할 때, 세포는 챔버의 측면을 향해 측 방향으로 편향된다. 도 3l과 유사하게, 챔버는 바닥(160)(나타나지 않음), 및 기둥(115)과 동일한 재료 또는 상이한 재료로 된 것일 수 있는 선택적인 천장(150)을 갖는다.
본 실시예에서, 제2 투입 메커니즘(112)이 본 시스템에 존재한다. 제2 용액(예를 들어, 제1 투입 메커니즘(110)을 통해 챔버로 들어가는 제1 용액과 상이한 완충액)은 제2 투입 메커니즘(112), 예를 들어 완충액 튜브(577)로부터의 완충액을 통해 챔버로 들어간다. 일부 실시형태에서, 제1 용액과 제2 용액은 실질적으로 혼합되지 않으므로, 챔버(155)의 상부 영역은 제1 용액을 포함하며 제2 용액(존재하는 경우)은 거의 갖지 않는 반면, 챔버(165)의 하부 영역은 제2 용액을 포함하며 제1 용액(존재하는 경우)은 거의 갖지 않는다. 따라서, 세포가 측 방향으로 편향되고 배출 메커니즘(122)을 통해 챔버를 빠져나갈 때, 배출 메커니즘(122)을 통해 챔버를 빠져나가는 용액은 제2 용액 완충액으로 존재한다.
일부 양태에서, 완충액 변경은 도 3u에 나타난 바와 같이, 캐스케이드 설계로 순차적으로 발생할 수 있다. 본 실시예에서, 세포(100)를 포함하는 제1 용액은 제1 투입 메커니즘(110(1))에서 제1 챔버(105(1))로 들어간다. 세포는 원으로 도해된다. 세포는, 기울기를 갖는 선을 따라 분포되는 직사각형 구조로 본원에 나타난, 기둥(115(1))의 매트릭스를 포함하는 챔버(105(1))를 통과한다. 세포가 챔버에서 대각선으로 배향된 기둥 열 사이에서 통과할 때, 세포는 측 방향으로 편향된다. 도 3l과 유사하게, 챔버는 바닥(160)(나타나지 않음), 및 기둥(115)과 동일한 재료 또는 상이한 재료로 된 것일 수 있는 선택적인 천장(150)을 갖는다. 세포(강화된)는 배출부(122(1))를 통해 챔버를 빠져나가고, 이는 투입 메커니즘(110(2)) 내로 유동하며, 여기서 제2 투입 메커니즘(112)이 시스템에 들어간다.
제1 투입 메커니즘(110(1))을 통해 챔버로 들어가는 제1 용액과 상이한 제2 용액(예를 들어, 완충액)은 제2 투입 메커니즘(112)을 통해 챔버로 들어간다. 일부 실시형태에서, 제1 용액과 제2 용액은 실질적으로 혼합되지 않으므로, 챔버(155)의 상부 영역은 제1 용액을 포함하며 제2 용액(존재하는 경우)은 거의 갖지 않는 반면, 챔버(165)의 하부 영역은 제2 용액을 포함하며 제1 용액(존재하는 경우)은 거의 갖지 않는다. 세포(강화되고 투입 메커니즘(112)으로부터의 완충액 내에 있음)는 배출 메커니즘(122(2))을 통해 챔버(105(2))를 빠져나간다.
다른 양태에서, 완충액 변경은 병렬적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 유동 경로는 샘플이 다수의 챔버 내로 유동하도록 분할될 수 있으며, 여기서 각각의 챔버는 완충액에 대한 투입 메커니즘을 포함한다. 이 구성으로, 세포가 동일한 완충액 내로 농축되도록, 동일한 완충액이 병렬 챔버 각각에 공급될 수 있다. 대안적으로, 세포가, 예를 들어 상이한 다운스트림 분석을 위해 상이한 완충액 내로 농축되도록, 병렬 챔버 각각은 상이한 완충액을 이용하여 공급될 수 있다.
일반적으로, 투입 메커니즘은 시린지 펌프에 의해 또는 시린지의 수동 누름에 의해 구동될 수 있다. 일부 양태에서, 다중 투입부에 대해, 하나 이상의 시린지 펌프가 사용되어 자동화된 방식으로 각각의 투입부를 구동할 수 있다. 다른 양태에서, 다중 투입부의 대해, 하나 이상의 시린지 수동 누름이 사용되어 수동으로 각각의 투입부를 구동할 수 있다.
임의의 실시형태에서, 상이한 전기 천공 효과를 제공할 수 있는 전기 천공 장치가 본원에 기재된다. 예를 들어, 도 3v에 도해된 바와 같이, 3 개의 전극(640(1), 640(2), 640(3))을 갖는 전기 천공 디바이스(600)가 제공된다. 전기 천공 디바이스(600)는 세포 및 화물이 이동하는 2 개의 경로, 전극(640(1))과 전극(640(2)) 사이의 제1 경로 및 전극(640(2))과 전극(640(3)) 사이의 제2 경로를 포함하며, 여기서 화살표는 세포의 유동을 표시한다. 세포는 입구(620)에서 전기 천공 챔버에 들어가고, 출구(630)를 통해 빠져나갈 수 있다. 나타나지는 않았지만, 하나 초과의 출구가 존재할 수 있고, 예를 들어 각각의 출구는 상이한 유형의 세포를 수집할 수 있음이 본원에서 고려된다. 상이한 전극 갭 길이(L1, L2, L3, L4)가 전기 천공 디바이스(600)에 존재한다. 상이한 전극 갭 길이 및 상이한 경로는 상이한 커패시턴스를 초래하며; 따라서, 각각의 경로에서 이동하는 세포에 대해 상이한 전기장 강도 및 전기 천공 효과가 달성될 수 있다. 예를 들어, L2는 L4보다 클 수 있으며, 이러한 경우, 제1 경로에서의 커패시턴스(C1)는 제2 경로에서의 커패시턴스(C2)보다 클 수 있다(C1>C2). 임의의 실시형태에서, 세포(동일하거나 상이한 유형)는, 예를 들어 상기 기재된 미세 유체 디바이스를 사용하여, 사전-분류 및/또는 선택되어 제1 경로 또는 제2 경로에 들어갈 수 있다.
본원에 기재된 전기 천공 디바이스는, 원하는 길이 및 기하학적 구조의 경로를 제공하도록 서로 유체 연통될(예를 들어, 연결될, 쌓일) 수 있는 카트리지로서 존재할 수 있음이 또한 본원에서 고려된다. 예를 들어, 도 3w에 도해된 바와 같이, 카트리지(410)는 각각 제1 전극(440(1)) 및 제2 전극(440(2))을 포함하는 전기 천공 챔버를 포함하고, 여기서 카트리지는 직렬로 쌓일 수 있으며 화살표는 카트리지를 통한 세포의 유동을 나타낸다. 예를 들어, 최상단 카트리지(410)의 출구는 중간 카트리지(410)의 입구와 유체 연통하고 중간 카트리지(410)의 출구는 최하부 카트리지(410)의 입구와 유체 연통한다.
추가 실시형태에서, 본원에 기재된 전기 천공 디바이스를 포함하는 모듈식 시스템이 제공된다. 예를 들어, 도 3x에 도해된 바와 같이, 모듈식 시스템(800)은, 서로와 유체 연통하거나 연결되도록 구성된 3 개의 모듈, 제1 모듈(805), 제2 모듈(815), 및 제3 모듈(825)을 포함한다. 제1 모듈(805)은 형질 감염을 위한 세포 및/또는 화물을 수용하기 위한 제1 용기(807)(예를 들어, 샘플 튜브)뿐만 아니라 제1 용기(807)를 제2 모듈(815)과 유체 연결하기 위한 관류(810)를 포함한다. 제1 모듈(805)은 또한 선택적으로 공기 필터 디바이스(809) 및 공기 필터 디바이스(809)를 제1 용기(807)에 유체 연결하기 위한 관류(810)를 포함할 수 있다. 제2 모듈(815)은 전기 천공 디바이스(820) 및 전기 천공 디바이스를 제1 모듈(805), 예를 들어, 제1 용기(807), 및 제2 모듈(825)에 유체 연결하기 위한 관류(810)뿐만 아니라, 본원에 기재된 유동 생성 수단(예를 들어, 연동 펌프)을 전기 천공 디바이스(820) 및 제1 모듈(805), 예를 들어, 제1 용기(807)와 유체 연결하기 위한 관류(810)를 포함한다. 제3 모듈(825)은 전기 천공된 세포를 수집하기 위한 제2 용기(830)(예를 들어 수집 튜브)뿐만 아니라 제2 용기(830)를 제2 모듈(815), 예를 들어, 전기 천공 디바이스(820)와 유체 연결하기 위한 관류(810)를 포함한다. 제3 모듈(825)은 또한 선택적으로 공기 필터 디바이스(809) 및 공기 필터 디바이스(809)를 제2 용기(830)에 유체 연결하기 위한 관류(810)를 포함할 수 있다. 선택적으로, 루어락(luer lock)과 같은 커넥터(850)는 모듈을 함께, 예를 들어 제1 모듈(805)을 제2 모듈(815)과 그리고 제2 모듈(815)을 제3 모듈(825)과 연결할 수 있다. 제1 모듈(805), 제2 모듈(815), 및 제3 모듈(825)은 각각 개별적으로 패키징되고 멸균될 수 있음이 본원에서 고려된다.
본원에 기재된 전기 천공 장치는 도 1b에 나타난 구성과 같은 메쉬-기반 전기 천공 디바이스에 비해 많은 이점을 갖는다. 첫째, 전기 천공 챔버의 제1 투입부로부터 제1 배출부까지 측정되는, 전기 천공 챔버를 통과하는 이동 거리는 전기장의 상응하는 증가를 야기하지 않으면서 증가될 수 있다. 따라서, 세포는 완전히 선형인 유동 경로에서보다 더 긴 시간 동안 균일한 전기장에 노출되며, 이는 생존력의 상응하는 감소없이, 개선된 전기 천공 효율로 이어진다.
도 1b에서는 상부 메쉬 전극과 하부 메쉬 전극 사이의 전기 천공 챔버 너비(w)가 증가되어 더 긴 이동 거리를 제공할 수 있었지만, 더 큰 전기 천공 챔버 너비는 더 큰 임피던스를 가질 것이고, 적합한 전기장을 생성하기 위해 더 높은 전압이 인가될 필요가 있을 것이다. 추가적으로, 더 큰 전압은 세포 생존력에 대한 유해한 영향을 가질 가능성이 있을 것이다. 추가로, 도 1a에서와 같은, 평행한 판 전극 구성의 경우, 전기장 분포는 균일하지 않을 것이다.
따라서, 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 전기 천공 장치는 단차 투입 배출 설계로 인해 더 짧은 전극 쌍을 가질 수 있으며, 이는 전극 쌍 거리를 증가시키지 않으면서 전기 천공 챔버 길이를 연장시킨다.
도 4는 본원에 기재된 전기 천공 디바이스와 선행 기술의 전기 천공 디바이스 사이의 차이를 도해하는 표를 제공한다. 이러한 차이에는, (1) 투입 배출 단차 거리의 존재, (2) BTX 및 RPMI와 같은 상업적으로 이용 가능한 전기 천공 매질 대신, 저전도도 저삼투압 전기 천공 매질의 사용, (3) 일련의 전기 펄스로 인가되는, 지수적으로 방전하는 파형, 및 (4) 스테핑 유체 유동 설계가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
도 3a 내지 도 3c의 실시예는 스테인레스 스틸 마이크로메쉬 전극을 사용하나, 전극은 임의의 특정 재료에 한정되지 않으며 임의의 적합한 재료로 형성될 수 있다. 예를 들어 도 6에 나타난 바와 같이, 적합한 재료로는 실리콘 및 폴리이미드가 포함된다. 실리콘 및 폴리이미드가 사용되어 적합한 마이크로메쉬 전극을 형성할 수 있지만, 이러한 재료는 전형적으로 당업계에 알려진 미세제작 프로토콜을 사용하여 클린 룸 시설에서 처리된다. 대조적으로, 스테인레스 스틸 마이크로메쉬 전극은 설치가 용이하고, 클린 룸과 같은 특수 시설을 요하지 않는다.
마이크로메쉬가 세포의 통과를 가능하게 하는 공극을 갖고(예를 들어, 마이크로메쉬 공극이 세포보다 큼), 마이크로메쉬 공극이 공극 개구 주변의 전극 패턴화와 양립되는 경우, 임의의 적합한 재료가 사용될 수 있음이 이해된다.
전기 천공 방법 및 파라미터
예를 들어 상기 기재된 전기 천공 장치로, 화물을 사용하여 세포를 전기 천공하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 화물과 함께 세포를 전기 천공 챔버 내로 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 전기 천공 챔버는 제1 전극(예를 들어, 고체 전극), 제2 전극(예를 들어, 고체 전극), 및 제1 전극과 제2 전극 사이에서 내부에 정의된 경로를 갖는 유체 채널 영역을 포함하며, 모두 본원에 기재되어 있다. 장치는 또한, 본원에 기재된 바와 같이 세포 및 화물의 전기 천공 챔버 내로의 통과를 가능하게 하는 제1 투입부, 및 본원에 기재된 바와 같이 전기 천공 챔버로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는 제1 배출부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 투입부 및 제1 배출부는 단차 거리만큼 분리될 수 있다. 세포는 전기 천공 매질에 현탁될 수 있다. 제1 전극은 본원에 기재된 제1 재료에 의해 경계지어질 수 있고 제2 전극은 본원에 기재된 제2 재료에 의해 경계지어질 수 있으며, 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 재료 및 제2 재료는 또한 본원에 기재된 제1 외부 투입부 및 본원에 기재된 제1 외부 배출부를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 전기 천공 챔버는 본원에 기재된 상부 마이크로메쉬 전극, 본원에 기재된 하부 마이크로메쉬 전극, 및 본원에 기재된 세포 및 화물이 유동하도록 상부 마이크로메쉬 전극과 하부 마이크로메쉬 전극 사이에서 정의된 경로를 포함한다. 상부 마이크로메쉬 전극 및 하부 마이크로메쉬 전극은 각각 본원에 기재된 공극성을 갖는다. 추가로, 상부 마이크로메쉬 전극은 본원에 기재된 제1 재료에 의해 경계지어질 수 있다. 제1 재료는 전기 천공 챔버 내로의 세포의 통과를 가능하게 하는 본원에 기재된 제1 투입부를 포함할 수 있다. 하부 마이크로메쉬 전극은 제2 재료에 의해 경계지어질 수 있다. 제2 재료는 전기 천공 챔버로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 하는, 본원에 기재된 제1 배출부를 포함할 수 있다. 제1 투입부 및 제1 배출부는 본원에 기재된 단차 거리에 의해 분리된다. 세포는 전기 천공 매질에 현탁될 수 있다. 선택적으로, 상부 마이크로메쉬 전극은 본원에 기재된 제2 투입부를 추가로 포함할 수 있고/있거나 하부 마이크로메쉬 전극은 본원에 기재된 제2 배출부를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 실시형태에서, 세포 및 화물의 유동은 단계적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 전기 천공 챔버의 총 부피의 약 절반 이상의 유체 부피는 지정된 시간 간격으로 전기 천공 챔버 내로 펌핑될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전기 천공 챔버의 총 부피와 거의 동일한 유체 부피가 전기 천공 챔버 내로 펌핑될 수 있다. 도 5는 예시적인 일련의 전기 펄스(자극) 및 예시적인 스테핑 유체 유동 설계(펌프)를 나타낸다. 스테핑 유체 유동 설계의 경우, 챔버 부피는 약 22 μL이다. 매초마다, 11 μL가 전기 천공 챔버 내로 펌핑되어, 부피의 절반을 대체한다. 이것은 원하는 양의 세포를 처리하는 데 필요한 만큼 길게 반복될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 스테핑 유체 유동 설계를 위해 임의의 적합한 시간 간격이 임의의 적합한 부피와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 시간 간격은 약 0.1 초 내지 약 10 초, 약 0.5 초 내지 약 5 초, 약 1 초 내지 약 2 초, 또는 그 사이의 임의의 기간 범위일 수 있거나, 더 긴 간격을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 시간의 함수로서 전기 천공 챔버 내로 펌핑되는 유체의 양은 투입 챔버 부피의 3/4, 전기 천공 챔버 부피의 1/2, 전기 천공 챔버 부피의 1/4, 전기 천공 챔버 부피의 1/8, 또는 더 작을 수 있다. 세포 및 화물의 임의의 적합한 유속은 본원에 기재된 파라미터와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 전기 천공 매질에서 세포 및 화물의 유속은 약 0.1 ml/분 이상, 약 0.5 ml/분 이상, 약 1 ml/분 이상, 약 2.5 ml/분 이상, 약 5 ml/분 이상, 약 7.5 ml/분 이상, 약 10 ml/분 이상, 약 12.5 ml/분 이상, 또는 약 15 ml/분, 또는 약 0.1 ml/분 내지 약 15 ml/분, 약 0.5 ml/분 내지 약 15 ml/분, 약 1 ml/분 내지 약 15 ml/분, 약 1 ml/분 내지 약 12.5 ml/분, 약 1 ml/분 내지 약 10 ml/분, 약 1 ml/분 내지 약 7.5 ml/분, 약 1 ml/분 내지 약 5 ml/분, 또는 약 1 ml/분 내지 약 2.5 ml/분일 수 있다.
임의의 실시형태에서, 세포는 전기 천공 챔버 내에서 균일하거나 실질적으로 균일한 전기장에 노출된다. 다수의 전기 펄스가 전기 천공 챔버 내의 세포에 인가될 수 있으며, 여기서 각각의 전기 펄스는 동일하거나 상이하다. 일부 실시형태에서, 직류(DC) 전기 펄스가 인가된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 교류(AC) 전기 펄스가 인가된다. 임의의 실시형태에서, 각각의 펄스는 지수적으로 방전하는 파형 또는 구형파형의 형태를 가질 수 있다. 임의의 실시형태에서, 다수의 전기 펄스는 지수적으로 방전하는 파형 또는 구형파형을 둘 모두를 포함할 수 있다.
일련의 전기 펄스를 위해, 100 ms 내지 5000 ms마다(예를 들어, 100 ms마다, 250 ms마다, 500 ms마다, 1000 ms마다, 2000 ms마다, 3000 ms마다 등), 전압은 주어진 강도의 전기장을 생성하기 위해 전극에 인가될 수 있다. 이것은 원하는 양의 세포를 처리하는 데 필요한 만큼 길게 반복될 수 있다. 따라서, 양태는 연속적 유동으로 지칭될 수 있지만, 연속적 유동은 정의된 시간 간격에 따라 유체가 전기 천공 챔버 내로 연속적으로 펌핑되는 스테핑 유체 유동 설계를 포함하는 것임이 이해된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 전기 천공 챔버 내의 세포에 대해 전기 펄스 사이의 임의의 적합한 지속 시간이 임의의 적합한 전기 펄스 지속 시간과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각의 펄스 사이의 지속 시간은 약 0.1 초 내지 약 15 초, 약 0.1 초 내지 약 10 초, 약 0.1 초 내지 약 5 초, 약 0.2 초 내지 약 1 초, 약 0.4 초 내지 약 0.6 초, 또는 그 사이의 임의의 기간 범위일 수 있으며, 더 긴 간격을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 전기 펄스의 지속 시간은 약 10 ms 내지 약 10 s, 약 10 ms 내지 약 5 s, 약 10 ms 내지 약 1 s, 약 10 ms 내지 약 500 ms, 약 10 ms 내지 약 250 ms, 약 50 ms 내지 약 150 ms, 약 75 ms 내지 약 125 ms, 약 100 ms 내지 약 10 s, 약 100 ms 내지 약 5, 약 100 ms 내지 약 1 s, 약 100 ms 내지 약 500 ms, 약 100 ms 내지 약 250 ms, 또는 그 사이의 임의의 범위의 범위일 수 있다.
적합한 펄스 수 및 펄스-대-펄스 간격과 관련하여, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 펄스는 단일 펄스보다 바람직한 결과를 제공할 수 있다. 따라서, 펄스는 2 내지 10 개 펄스, 2 내지 6 개 펄스, 6 내지 8 개 펄스, 또는 2 내지 3 개 펄스 범위일 수 있음이 고려된다. 일부 경우에는 훨씬 더 긴 간격이 사용될 수 있지만, 가장 전형적으로, 펄스는 비교적 짧은 간격, 전형적으로 0.5 초 내지 15 초만큼 후속 펄스와 분리된다.
임의의 실시형태에서, 약 0.1 kV/cm 내지 약 5 kV/cm, 약 0.1 kV cm 내지 약 3 kV/cm, 약 0.1 kV/cm 내지 약 2 kV/cm, 약 0.1 kV/cm 내지 약 1 kV/cm, 약 0.1 kV/cm 내지 약 0.5 kV/cm, 약 0.3 kV/cm 내지 약 5 kV/cm, 약 0.3 kV/cm 내지 약 3 kV/cm, 약 0.3 kV/cm 내지 약 2 kV/cm, 약 0.3 kV/cm 내지 약 1 kV/cm, 약 0.3 kV/cm 내지 약 0.5 kV/cm, 약 0.5 kV/cm 내지 약 3 kV/cm, 약 0.5 kV/cm 내지 약 2 kV/cm, 약 0.5 kV/cm 내지 약 1 kV/cm, 약 0.8 kV/cm 내지 약 3 kV/cm, 약 0.8 kV/cm 내지 약 2 kV/cm, 약 0.8 kV/cm 내지 약 1 kV/cm, 약 1 kV/cm 내지 약 3 kV/cm, 또는 약 1 kV/cm 내지 약 2 kV/cm의 전계 강도를 생산하기에 적합한 전압에서 다수의 전기 펄스가 인가될 수 있다. 적합한 전압은 약 10 V, 약 15 V, 약 20 V, 약 30 V, 약 40 V, 약 50 V, 약 75 V, 약 100 V, 또는 약 200 V, 또는 약 10 V 내지 약 200 V, 약 10 V 내지 약 100 V, 약 10 V 내지 약 75 V, 약 10 V 내지 약 50, 약 10 V 내지 약 40 V, 약 10 V 내지 약 30 V, 약 15 V 내지 약 200 V, 약 15 V 내지 약 100 V, 약 15 V 내지 약 75 V, 약 15 V 내지 약 50, 약 15 V 내지 약 40 V, 약 15 V 내지 약 30 V, 약 20 V 내지 약 50, 약 20 V 내지 약 40 V, 약 20 V 내지 약 30 V, 약 30 V 내지 약 50 V, 약 30 V 내지 약 40 V, 또는 그 안의 임의의 적합한 범위일 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 각각의 전기 펄스는 약 10 μs 이상, 약 50 μs 이상, 약 75 μs 이상, 약 100 μs 이상, 약 250 μs 이상, 약 500 μs 이상, 약 750 μs 이상, 약 1,000 μs 이상, 약 5,000 μs 이상, 또는 약 10,000 μs; 또는 약 10 μs 내지 약 10,000 μs, 약 10 μs 내지 약 5,000 μs, 약 10 μs 내지 약 1,000 μs, 약 10 μs 내지 약 750 μs, 약 10 μs 내지 약 500 μs, 약 10 μs 내지 약 250 μs, 약 10 μs 내지 약 100 μs, 약 10 μs 내지 약 50 μs, 약 100 μs 내지 약 1000 μs, 약 100 μs 내지 약 750 μs, 약 100 μs 내지 약 500 μs, 약 100 μs 내지 약 250 μs, 약 250 μs 내지 약 1000 μs, 약 250 μs 내지 약 750 μs, 약 250 μs 내지 약 500 μs, 약 500 μs 내지 약 1000 μs, 또는 약 500 μs 내지 약 750 μs의 펄스 폭을 가질 수 있다.
임의의 적합한 세포, 예를 들어, 포유류 세포, 비포유류 세포 또는 둘 모두는 화물로 형질 감염될 수 있다. 적합한 포유류 세포의 예로는 NK 세포(예를 들어, haNK 세포, 일차 NK 세포, 활성화된(aNK) 세포), EC-7 세포(아데노바이러스를 생산하도록 변형된, HEK 293 세포의 유도체), T 세포(예를 들어, 일차 CD4/CD8 T 세포), CHO-S 세포, 수지상 세포, 배아 세포, 줄기 세포(예를 들어 지방-유래 중간엽 줄기 세포(AD-MSC)), 상피 세포, 림프구, 대식세포, 생식 세포, 및 섬유모세포가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 비포유류 세포의 예로는 박테리아 세포, 및 효모 세포가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 임의의 적합한 화물, 예를 들어 핵산이 사용될 수 있다. 핵산은 RNA(예를 들어 합성 RNA, mRNA, 시험관내 전사된 RNA, GFP-mRNA 등) 및/또는 DNA(예를 들어 합성 DNA, GFP-DNA, 플라스미드 DNA 등)일 수 있다. 구체적으로, NK 세포, EC-7 세포(아데노바이러스를 생산하도록 변형된, HEK 293 세포의 유도체) 및 T 세포는 본원에 기재된 전기 천공 장치를 사용하여 RNA(예를 들어, 합성 RNA, mRNA, 시험관내 전사된 RNA, GFP-mRNA 등) 및/또는 DNA(예를 들어, 합성 DNA, GFP-DNA, 플라스미드 DNA 등)로 형질 감염될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 전기 천공 장치가 시험관내 수정을 수행하는 데 사용될 수 있음이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 난자 및 정자는 본원에 기재된 전기 천공 디바이스를 통해 유동하여 난자의 수정을 달성할 수 있다.
추가로 고려되는 양태에서, 세포가 형질 감염되는 매질 또는 전기 천공 완충액은 저전도율 및 저삼투압 매질이며, 선택적으로 하나 이상의 영양소를 함유한다. 임의의 실시형태에서, 전기 천공 매질은 약 0.05 mS/m 이상, 약 1 mS/m 이상, 약 5 mS/m 이상, 약 10 mS/m 이상, 약 15 mS/m 이상, 약 mS/m 이상, 약 25 mS/m 이상, 약 30 mS/m 이상, 약 50 mS/m 이상, 약 100 mS/m 이상, 약 150 mS/m 이상, 또는 약 200 mS/m; 또는 약 0.05 mS/m 내지 약 200 mS/m; 약 1 mS/m 내지 약 30 mS/m, 약 1 mS/m 내지 약 20 mS/m, 약 1 mS/m 내지 약 10 mS/m, 약 1 mS/m 내지 약 5 mS/m, 약 3 mS/m 내지 약 30 mS/m, 약 5 mS/m 내지 약 20 mS/m, 또는 약 5 mS/m 내지 약 15 mS/m의 전도도를 가질 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 전기 천공 매질은 약 50 mOsm/l 이상, 약 100 mOsm/l 이상, 약 150 mOsm/l 이상, 약 200 mOsm/l 이상, 약 250 mOsm/l 이상, 약 300 mOsm/l 이상, 약 350 mOsm/l 이상, 또는 약 400 mOsm/l; 또는 약 50 mOsm/l 내지 약 400 mOsm/l, 약 50 mOsm/l 내지 약 300 mOsm/l, 약 50 mOsm/l 내지 약 200 mOsm/l, 약 100 mOsm/l 내지 약 400 mOsm/l, 약 100 mOsm/l 내지 약 300 mOsm/l, 약 200 mOsm/l 내지 약 400 mOsm/l, 약 200 mOsm/l 내지 약 300 mOsm/l, 약 250 mOsm/l 내지 약 400 mOsm/l, 또는 약 250 mOsm/l 내지 약 300 mOsm/l의 삼투압을 가질 수 있다.
임의의 실시형태에서, 전기 천공 매질은 하나 이상의 염, 당, 및 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 염으로는 금속 할로겐화물 염, 인산 염, 금속 황산 염, 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 금속 할로겐화물 염의 예로는 포타슘 클로라이드(KCl), 소듐 클로라이드(NaCl), 리튬 클로라이드(LiCl), 칼슘 클로라이드(CaCl2), 크로뮴 클로라이드(CrCl3), 포타슘 브로마이드(KBr), 소듐 브로마이드(NaBr), 마그네슘 클로라이드(MgCl2), 마그네슘 브로마이드(MgBr2), 마그네슘 플루오라이드(MgF2), 마그네슘 요오다이드(MgI2) 리튬 브로마이드(LiBr), 포타슘 요오다이드(KI), 소듐 요오다이드(NaI), 및 리튬 요오다이드(LiI)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 인산 염의 예로는 모노소듐 포스페이트(NaH2PO4), 디소듐 포스페이트(Na2HPO4), 트리소듐 포스페이트(Na3PO4), 모노마그네슘 포스페이트(Mg(H2PO4)2), 디마그네슘 포스페이트(MgHPO4), 트리마그네슘 포스페이트(Mg3(PO4)2, 모노포타슘 포스페이트(KH2PO4), 디포타슘 포스페이트(K2HPO4), 트리포타슘 포스페이트(K3PO4), 모노칼슘 포스페이트(Ca(H2PO4)2), 디칼슘 포스페이트(CaHPO4), 트리칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 및 크로뮴 포스페이트(CrPO4)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 금속 황산 염의 예로는 소듐 설페이트(Na2SO4), 마그네슘 설페이트(MgSO4), 포타슘 설페이트(K2SO4), 칼슘 설페이트(CaSO4), 및 크로뮴 설페이트(Cr2(SO4)3)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 염은 포타슘 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 디소듐 포스페이트, 모노포타슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 및 이들의 조합일 수 있다.
적합한 당의 예로는 단당류, 이당류, 또는 이들의 조합이 포함된다. 적합한 단당류로는 글루코스, 프룩토스, 및 갈락토스가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 이당류로는 글루코스, 프룩토스, 및 갈락토스 중 2 개로부터 형성되는 이당류가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 적합한 이당류는 수크로스, 락토스, 말토스, 테르할로스, 또는 이들의 조합일 수 있다. 적합한 완충제의 예로는 HEPES, 트리스(하이드록시메틸), 및 PBS(포스페이트 완충 염수)가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
임의의 실시형태에서, 하나 이상의 염 각각은 약 0.1 mM 내지 약 200 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 0.1 mM 내지 약 100 mM, 약 0.1 mM 내지 약 80 mM, 약 0.1 mM 내지 약 60 mM, 약 0.1 mM 내지 약 40 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 전기 천공 매질에 존재할 수 있다. 예를 들어, KH2PO4, Na2HPO4, 및 MgSO4와 같은 염은 각각 약 0.1 mM 내지 약 20 mM의 농도로 전기 천공 매질에 존재할 수 있다. 당은 약 20 mM 내지 약 300 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 200 mM의 농도로 전기 천공 매질에 존재할 수 있다. 완충제는 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 30 mM의 농도로 전기 천공 매질에 존재할 수 있다.
다른 적합한 매질로는, 표 1에 나타낸 바와 같이, Cw100(0.11 S/m, 0.12 osm/l) 또는 Cw240이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 상업적으로 이용 가능한 전기 천공 매질이 사용될 수 있으나, 차선인 것으로 나타났다. 이러한 상업적으로 이용 가능한 매질로는 RPMI(1.37 S/m, 0.28 osm/l), BTX(8 mS/m, 0.27 osm/l), DMEM(둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)), 희석된 PBS, 또는 HEPES가 있거나 없는 PBS가 포함된다. 매질은 일반적으로 전기 전도성 매질이며 또한 멸균될 수 있다.
[표 1]
전기 천공 매질의 조성
임의의 실시형태에서, 전기 천공을 위한 세포는 약 1x106 개 세포/ml 이상, 약 10x106 개 세포/ml 이상, 약 50x106 개 세포/ml 이상, 약 100x106 개 세포/ml 이상, 약 150x106 개 세포/ml 이상, 약 200x106 개 세포/ml 이상, 약 250x106 개 세포/ml 이상, 약 300x106 개 세포/ml 이상, 약 400x106 개 세포/ml 이상 또는 약 500x106 개 세포/ml; 또는 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 300x106 개 세포/ml, 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 250x106 개 세포/ml, 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 200x106 개 세포/ml, 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 150x106 개 세포/ml, 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 100x106 개 세포/ml, 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 50x106 개 세포/ml, 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 300x106 개 세포/ml, 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 250x106 개 세포/ml, 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 200x106 개 세포/ml, 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 150x106 개 세포/ml, 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 100x106 개 세포/ml, 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 50x106 개 세포/ml, 약 100x106 개 세포/ml 내지 약 300x106 개 세포/ml, 약 100x106 개 세포/ml 내지 약 250x106 개 세포/ml, 약 100x106 개 세포/ml 내지 약 200x106 개 세포/ml, 또는 약 100x106 개 세포/ml 내지 약 150x106 개 세포/ml의 세포 밀도로 전기 천공 매질 내에 존재할 수 있다.
적합한 커패시턴스와 관련하여, 커패시턴스는 약 1 μF 내지 약 150 μF 범위일 수 있음이 고려된다. 일부 실시형태에서, 커패시턴스는 약 1 내지 100 μF, 약 5 내지 약 75 μF, 약 5 내지 약 50 μF, 약 10 내지 약 40 μF, 또는 약 10 내지 약 30 μF, 또는 약 10 내지 약 25 μF 범위일 수 있다. 다른 실시형태에서, 커패시턴스는 약 10 μF이다.
일부 실시형태에서, 상응하는 짧은 시간 상수와 함께, 다수의 전기 펄스가 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 30 msec 미만, 20 msec 미만, 10 msec 미만, 또는 5 msec 미만의 시간 상수가 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 시간 상수는 약 0.5 내지 30 msec, 약 1 내지 20 msec, 및 약 5 내지 15 msec; 또는 약 10 msec 범위일 수 있다.
일부 양태에서, 전기 천공을 위한 전기장 강도는 약 0.3 내지 3 kV/cm이다. 더 낮은 전기장 강도(예를 들어 약 0.5 내지 1 kV/cm)가 EC-7 세포에 적합한 것으로 밝혀졌고, 더 높은 전기장 강도(예를 들어 약 1 내지 3 kV/cm)가 hank 세포에 적합한 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 약 0.1 내지 약 5 kV/cm 범위의 전기 천공을 위한 전기장 강도가 본원에서 고려된다. 전압은 적합한 전기장 강도를 생성하도록 선택될 수 있다.
일반적으로, 임피던스(Rp)는 약 200 Ω으로부터 무한대까지, 또는 다른 경우에, 약 200 Ω으로부터 약 1k까지의 범위일 수 있다.
전기 천공 반응에 첨가되는 화물, 예를 들어 세포 내로 운반될 물질의 농도는 약 50 μg/ml 이상, 약 100 μg/ml 이상, 약 200 μg/ml 이상, 약 300 μg/ml 이상, 약 400 μg/ml 이상, 또는 약 500 μg/ml; 약 50 μg/ml 내지 약 500 μg/ml, 약 50 μg/ml 내지 약 400 μg/ml, 약 50 μg/ml 내지 약 300 μg/ml, 약 50 μg/ml 내지 약 200 μg/ml, 약 50 μg/ml 내지 약 100 μg/ml, 약 100 μg/ml 내지 약 500 μg/ml, 약 100 μg/ml 내지 약 400 μg/ml, 약 100 μg/ml 내지 약 300 μg/ml, 또는 약 100 μg/ml 내지 약 200 μg/ml의 농도를 갖는다. 일부 양태에서, 약 50 μg/ml, 60 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 100 내지 300 μg/ml, 50 내지 100 μg/ml 농도의 GFP-mRNA 또는 GFP-DNA가 전기 천공 매질에 첨가되었고, 다른 실시형태에서는, 약 50 μg/ml 농도의 덱스트란 500k가 전기 천공 반응에 첨가되었다.
일부 양태에서, 30 분 내에 4x107 개 세포/ml(13.2 mL(5.28x108 세포))로 7.33 uL/s까지 단일 챔버 디바이스에서 달성될 수 있다. 30 분 내에 20x109 개 세포에 도달하기 위해, 세포 밀도가 4-배 증가될 수 있고/있거나 병렬적 처리가 다수의 전기 천공 챔버를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 및 하기 제공된 실시예에 더하여, 전기 천공 전자 장치 및 파라미터는 NK 세포(예를 들어, haNK 세포, 일차 NK 세포, 활성화된(aNK) 세포), EC7 세포, 수지상 세포, CHO-S 세포, T 세포(예를 들어 일차 CD4/CD8 T 세포), 및 줄기 세포(예를 들어 AD-MSC 세포)의 전기 천공을 위해 특별히 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 NK 세포(예를 들어, haNK 세포, 일차 NK 세포, 활성화된(aNK) 세포), EC7 세포, 수지상 세포, CHO-S 세포, T 세포(예를 들어, 일차 CD4/CD8 T 세포), 및 줄기 세포(AD-MSC 세포) 중 하나 이상이고, 전기 천공 파라미터 중 하나 이상은 다음과 같다: (i) 전계 강도는 약 20 V 내지 약 50 V의 전압에서 인가됨; (ii) 펄스 폭은 약 10 μs 내지 약 750 μs임; (iii) 전기 천공 매질에서의 세포의 세포 밀도는 약 5x106 개 세포/ml 내지 약 300x106 개 세포/ml임.
일부 실시형태에서, 세포는 EC-7 세포이고, 화물은 DNA이고, 전기 천공 파라미터 중 하나 이상은 다음과 같다: (i) 전계 강도는 약 20 V 내지 약 50 V, 약 20 V 내지 40 V, 또는 약 20 V 내지 약 30 V의 전압에서 인가됨; (ii) 펄스 폭은 약 10 μs 내지 약 100 μs, 10 μs 내지 약 75 μs, 또는 10 μs 내지 약 50 μs임; (iii) 펄스의 수는 2 내지 6 또는 2 내지 3임 및 (iv) 전기 천공 매질에서의 세포의 세포 밀도는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 250x106 개 세포/ml, 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 100x106 개 세포/ml, 또는 약 50x106 개 세포/ml 내지 약 100x106 개 세포/ml임. 추가적으로 또는 대안적으로, DNA 화물을 사용하여 전기 천공된 EC-7 세포는 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 95%의 형질 감염 효율로 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%의 생존력을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 CHO-S 세포이고, 화물은 DNA이고, 전기 천공 파라미터 중 하나 이상은 다음과 같다: (i) 전계 강도는 약 20 V 내지 약 50 V, 또는 약 30 V 내지 50 V, 약 40 V 내지 약 50 V의 전압에서 인가됨; (ii) 펄스 폭은 약 100 μs 내지 약 750 μs, 약 250 μs 내지 약 750 μs, 또는 약 500 μs 내지 약 750 μs임; (iii) 펄스의 수는 2 내지 6 또는 2 내지 3임 및 (iv) 전기 천공 매질에서의 세포의 세포 밀도는 약 50x106 개 세포/ml 내지 약 250x106 개 세포/ml, 약 50x106 개 세포/ml 내지 약 125x106 개 세포/ml, 또는 약 50x106 개 세포/ml 내지 약 100x106 개 세포/ml임. 추가적으로 또는 대안적으로, DNA 화물을 사용하여 전기 천공된 CHO-S 세포는 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%의 형질 감염 효율로 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 생존력을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 T 세포(예를 들어, 일차 CD4/CD8 T 세포)이고, 화물은 DNA 또는 RNA이고, 전기 천공 파라미터 중 하나 이상은 다음과 같다: (i) 전계 강도는 약 20 V 내지 약 50 V, 또는 약 30 V 내지 50 V, 약 40 V 내지 약 50 V의 전압에서 인가됨; (ii) 펄스 폭은 약 100 μs 내지 약 750 μs, 약 100 μs 내지 약 500 μs, 또는 약 200 μs 내지 약 400 μs임; (iii) 펄스의 수는 2 내지 10 또는 2 내지 6임 및 (iv) 전기 천공 매질에서의 세포의 세포 밀도는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 300x106 개 세포/ml, 약 20x106 개 세포/ml 내지 약 250x106 개 세포/ml, 또는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 200x106 개 세포/ml임. 추가적으로 또는 대안적으로, DNA 또는 RNA 화물을 사용하여 전기 천공된 T 세포(예를 들어, 일차 CD4/CD8 T 세포)는 적어도 약 20%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 99%의 형질 감염 효율로 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 생존력을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 NK 세포(예를 들어, haNK 세포, 일차 NK 세포, 활성화된(aNK) 세포)이고, 화물은 DNA 또는 RNA이고, 전기 천공 파라미터 중 하나 이상은 다음과 같다: (i) 전계 강도는 약 20 V 내지 약 50 V, 또는 약 30 V 내지 50 V, 약 40 V 내지 약 50 V의 전압에서 인가됨; (ii) 펄스 폭은 약 100 μs 내지 약 750 μs, 약 200 μs 내지 약 750 μs, 또는 약 200 μs 내지 약 600 μs임; (iii) 펄스의 수는 2 내지 6 또는 2 내지 3임; 및 (iv) 전기 천공 매질에서의 세포의 세포 밀도는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 300x106 개 세포/ml, 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 250x106 개 세포/ml, 또는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 100x106 개 세포/ml임. 추가적으로 또는 대안적으로, DNA 또는 RNA 화물을 사용하여 전기 천공된 NK 세포(예를 들어, haNK 세포, 일차 NK 세포, 활성화된(aNK) 세포)는 적어도 약 10%, 적어도 약 50%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 형질 감염 효율로 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 생존력을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 수지상 세포이고, 화물은 DNA 또는 RNA이고, 전기 천공 파라미터 중 하나 이상은 다음과 같다: (i) 전계 강도는 약 20 V 내지 약 50 V, 또는 약 30 V 내지 50 V, 약 30 V 내지 약 40 V의 전압에서 인가됨; (ii) 펄스 폭은 약 100 μs 내지 약 750 μs, 약 100 μs 내지 약 500 μs, 또는 약 200 μs 내지 약 400 μs임; (iii) 펄스의 수는 2 내지 10 또는 6 내지 8임; 및 (iv) 전기 천공 매질에서의 세포의 세포 밀도는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 100x106 개 세포/ml, 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 50x106 개 세포/ml, 또는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 25x106 개 세포/ml임. 추가적으로 또는 대안적으로, DNA 또는 RNA 화물을 사용하여 전기 천공된 수지상 세포는 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 형질 감염 효율로 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 생존력을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포(예를 들어, AD-MSC 세포)이고, 화물은 DNA이고, 전기 천공 파라미터 중 하나 이상은 다음과 같다: (i) 전계 강도는 약 20 V 내지 약 50 V, 또는 약 30 V 내지 50 V, 약 30 V 내지 약 40 V의 전압에서 인가됨; (ii) 펄스 폭은 약 50 μs 내지 약 250 μs, 약 50 μs 내지 약 100 μs, 또는 약 100 μs 내지 약 200 μs임; (iii) 펄스의 수는 2 내지 10 또는 6 내지 8임; 및 (iv) 전기 천공 매질에서의 세포의 세포 밀도는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 100x106 개 세포/ml, 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 50x106 개 세포/ml, 또는 약 10x106 개 세포/ml 내지 약 25x106 개 세포/ml임. 추가적으로 또는 대안적으로, DNA 화물을 사용하여 전기 천공된 줄기 세포(예를 들어, AD-MSC 세포)는 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 형질 감염 효율로 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 생존력을 가질 수 있다.
본원에 기재된 방법은 일시적 형질 감염 또는 안정적 형질 감염에 적용될 수 있다. 용어 "일시적 형질 감염"은, 제한된 기간 동안만 세포에 존재하고 게놈으로 통합되지 않는 핵산의 도입 또는 형질 감염을 지칭한다. 용어 "안정적 형질 감염"은 형질 감염된 핵산의 핵 게놈 내로의 통합, 또는 세포 내에서 염색체 외 복제 에피솜으로서의 형질 감염된 플라스미드의 유지를 통해 관심 유전자의 영구적인 발현을 초래하는 형질 감염을 지칭한다.
임의의 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은, 예를 들어 본원에 기재된 미세 유체 디바이스를 사용하여, 제1 세포 분류 단계 및/또는 제2 세포 분류 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제1 세포 분류 단계는, 세포를 포함하는 제1 용액으로 하여금 본원에 기재된 복수의 기둥 열을 포함하는 본원에 기재된 미세 유체 챔버를 통해 유동하도록 압력을 가하고, 세포를 기둥 열을 지나 챔버의 측면으로 편향시켜 본원에 기재된 제1 배출 메커니즘을 빠져나가는 용액으로부터 세포를 고갈시키며, 본원에 기재된 제2 배출 메커니즘을 빠져나가는 용액 내 세포를 강화시킴으로써, 전기 천공 챔버로의 도입 전에 세포를 분류할 수 있다. 제2 배출 메커니즘을 빠져나가는 세포는 화물과 함께 전기 천공 챔버로 도입될 수 있다. 제2 세포 분류 단계는, 전기 천공된 세포를 포함하는 제4 용액으로 하여금 본원에 기재된 복수의 기둥 열을 포함하는 본원에 기재된 미세 유체 챔버를 통해 유동하도록 압력을 가하고, 전기 천공된 세포를 기둥 열을 지나 챔버의 측면으로 편향시켜 본원에 기재된 제3 배출 메커니즘을 빠져나가는 용액으로부터 전기 천공된 세포를 고갈시키며, 본원에 기재된 제4 배출 메커니즘을 빠져나가는 용액 내 전기 천공된 세포를 강화시킴으로써, 전기 천공 챔버를 빠져나간 후의 전기 천공된 세포를 분류할 수 있다.
본원에 제공된 기술 및 방법은 다양한 디바이스 또는 플랫폼 내로 작업 흐름의 일환으로서 통합될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 전기 천공 장치는, 예를 들어 카트리지 형태로, 자동화된 디바이스 내로 통합될 수 있으며, 여기서 전기 천공은 세포에 대한 하나 이상의 다른 자동화된 처리와 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 자동화된 전기 천공은, 그 전체가 참조로 포함된, 미국 특허 공개 번호 2017/0037357에 기재된 자동화된 세포 배양 및 수확과 함께 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 생체내 형질 감염 방법이 제공되며, 여기서 상기 기재된 방법이 수행되고, 예를 들어 등장성 완충액과 혼합된, 형질 감염된 세포가 질병 또는 장애를 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 질병의 예로는 미토콘드리아 장애, 심장 기능 장애, 심부전, 자폐증, 진성 당뇨병, 및 청각 장애가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본원에 기재된 전기 천공 장치는 약물 또는 제형의 전달을 돕기 위해, 예를 들어 인슐린 또는 당뇨병 치료를 위한 약물의 전달을 돕기 위해, 대상체의 표적 조직에 대한 적용을 위해 개조될 수 있음이 본원에서 또한 고려된다. 예를 들어, 전기 천공용 전극이 피부 상에 적용되거나 바늘-유사 전극 쌍이 피하 투여될 수 있다. 전기 천공 장치 및 방법은 아데노바이러스 생산, 단백질 생산, 세포 면역 요법, 또는 재생 의학에 사용될 수 있음이 본원에서 또한 고려된다.
키트 또한 본원에서 제공된다. 예를 들어, 키트는 본원에 기재된 전기 천공 장치, 형질 감염을 위한 세포 및 화물을 수용하기 위한 제1 용기, 전기 천공된 세포를 수용하기 위한 제2 용기, 제1 용기 및 제2 용기를 전기 천공 장치, 및 선택적으로, 적합한 시약에 유체 연결하기 위한 관류를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는, 예를 들어 제1 용기 및 관류의 제1 부분을 수용하는, 제1 모듈(예를 들어, 제1 모듈 805)을 포함하는 제1 패키지를 포함할 수 있다. 키트는, 예를 들어 전기 천공 장치 및 관류의 제2 부분을 수용하는, 제2 모듈(예를 들어, 제2 모듈 815)을 포함하는 별도의 제2 패키지를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한, 예를 들어, 제2 용기 및 관류의 제3 부분을 수용하는, 제3 모듈(예를 들어, 제3 모듈 825)을 포함하는 별도의 제3 패키지를 포함할 수 있다. 선택적으로, 시약은 별도의 제4 패키지에 존재할 수 있다. 제1, 제2, 제3, 및 제4 패키지는 멸균될 수 있다. 적합한 시약으로는 본원에 기재된 형질 감염을 위한 세포, 본원에 기재된 전기 천공 매질, 및 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 키트는 전기 천공 칩, 연결 관류, 장치, 전기 천공용 툴, 전기 천공 완충액, 보충제, 시약, 및 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1. haNK 세포의 형질 감염.
일부 양태에서, haNK 세포의 전기 천공을 위한 조건이 하기 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
haNK 세포의 전기 천공을 위한 조건
도 7a 내지 도 7e는 전기 천공 반응의 실험 결과를 나타낸다. 도 7a는 변화하는 효율 및 생존력을 갖는 다양한 실험 조건을 나타낸다. 특히, IOCO 전기 천공 디바이스를 사용하는 1.5 kv/cm, Rp 1k, 10 uF의 조건은, haNK 세포로의 GFP-mRNA 전기 천공과 관련하여, 70% 초과의 생존력으로 80% 초과의 효율을 나타냈다. 칭호 "reg"는 원래의 마이크로메쉬를 지칭하며, "단차"는 단차 마이크로메쉬를 지칭한다. 도 7b는 hank 세포 내로 전기 천공된 GFP-mRNA의 현미경 이미지를 나타낸다. 도 7c 및 도 7d는 세포 분류의 결과를 나타내며, 도 7c는 살아있는 세포를 나타내고 도 7d는 전기 천공된 세포를 나타낸다. 도 7e는 세포 분류 결과에 상응하는 히스토그램을 나타내며, 대조군 세포 및 GFP를 이용하여 전기 천공된 세포를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8d는, 50% 초과의 효율 및 70% 초과의 생존력을 갖는, 변화하는 전기 천공 실험 조건 하에서의, haNK 내로의 GFP-mRNA 전기 천공 실험 결과의 또 다른 세트를 나타낸다. 도 8b 및 도 8c는 세포 분류의 결과를 나타내며, 도 8b는 살아있는 세포를 나타내고 도 8c는 전기 천공된 세포를 나타낸다. 도 8d는 세포 분류 결과에 상응하는 히스토그램을 나타내며, 대조군 세포 및 GFP를 이용하여 전기 천공된 세포를 나타낸다. GFP 발현은 살아있는 세포 내에서 계산하였다(프로피듐-요오다이드 음성, PI-). CTL은 대조군 실험을 나타낸다.
실시예 2. EC7 세포의 형질 감염.
EC7 세포의 전기 천공을 위한 전형적인 조건은 하기 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
EC7 세포의 전기 천공을 위한 조건
도 9a 내지 도 9d는 EC-7 세포의 전기 천공 반응의 실험 결과를 나타낸다. 도 9a는 변화하는 효율 및 생존력을 갖는 다양한 실험 조건을 나타낸다. 특히, IOCO 전기 천공 디바이스를 사용하는 1 kv/cm, Rp 200, 10 uF의 조건은, EC-7 세포로의 GFP-DNA 전기 천공의 약 90% 초과의 효율 및 약 50% 초과의 생존력을 초래하였다. 도 9b 및 도 9c는 세포 분류의 결과를 나타내며, 도 9b는 살아있는 세포를 나타내고, 도 9c는 전기 천공된 세포를 나타낸다. 도 9d는 세포 분류 결과에 상응하는 히스토그램이며, 대조군 세포 및 GFP를 이용하여 전기 천공된 세포를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10e는, 변화하는 전기 천공 실험 조건 하에서의, EC-7 세포의 실험 결과의 추가 세트를 나타낸다. 도 10b, 도 10c, 및 도 10d는 세포 분류의 결과를 나타내며, 도 10b는 살아있는 세포를 나타내고 도 10c 및 도 10d는 전기 천공된 살아있는 세포를 나타낸다. 도 10d는 세포 분류 결과에 상응하는 히스토그램을 나타내며, 대조군 세포 및 GFP를 이용하여 전기 천공된 세포를 나타낸다. GFP 발현은 살아있는 세포 내에서 계산하였다(프로피듐-요오다이드 음성, PI-). CTL은 대조군 실험을 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 도 3a 내지 도 3c의 단차 챔버 전기 천공 디바이스를 사용하여 EC-7 세포로 성공적으로 전기 천공된 GFP-DNA의 이미지를 나타낸다.
도 11a는 전기 천공 20 시간 후에 촬영하였으며, GFP-DNA 및 GFP-AD5(AD5 바이러스 생산을 위해 인코딩하는 DNA)의 EC-7 세포 내로의 전기 천공을 나타낸다. 도 11b는 전기 천공 44 시간 후에 촬영하였으며, GFP-DNA 및 DNA 셔틀 벡터의 EC-7 세포 내로의 전기 천공을 나타낸다. 도 11c는 전기 천공 6 일 후에 촬영하였으며 마이크로메쉬 대 큐벳을 사용한 전기 천공 결과의 비교를 나타낸다.
도 11c는 또한, 본원에 제시된 실시형태에 따라, EC7 세포에서의 AD5 바이러스 생산의 초기 단계 동안의 혜성 모양의 형태(comet formation)를 나타낸다. 이 일련의 이미지에서, 세포는 클러스터, 또는 '혜성'-형상의 플라크를 형성하며, 개별 세포의 형상은 더욱 둥글게 된다.
이들 일련의 이미지에 나타난 바와 같이, EC-7 세포를 형광 태그된 바이러스 DNA(AD5 바이러스 생산용)로 성공적으로 전기 천공하였고 바이러스 생산을 개시할 수 있었으며, 이는 본원에 제공된 기술 및 시스템이 (예를 들어 바이러스 백신 및 바이러스 단백질 생산에서의 사용을 위한) 아데노바이러스 생산에 적합함을 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용하여 EC7 세포를 형질 감염시킨 추가적 결과를 나타낸다. 도 12a는 전기 천공 파라미터의 표를 나타내며, 여기서 화물의 양은 전기 천공 실행들 간에 달랐다. 도 12b에서, 전기 천공 6 일 후의 이미지가 나타난다. 전기 천공 14 일 후까지, 약 70 내지 80% 효율을 관찰하였다. 형질 감염 후 다수의 '혜성' 형상 클러스터를 관찰하였다. 약 240 mS/m의 전도도를 갖는, 전기 천공 완충액 cw100에서 약 40 m/ml의 세포 농도로 약 1,700만 내지 1,800만 개 세포/분이 EC7 세포 내로 형질 감염될 수 있다.
실시예 3. 다양한 세포 유형의 전기 천공.
다른 양태에서, 본원에 제공된 방법 및 시스템은 다양한 상이한 세포 유형을 형질 감염시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 최대 108 개 또는 그 이상의 세포가 본원에 제공된 방법 및 시스템에 의해 형질 감염될 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 시스템은 EC7 세포, haNK 세포, CHO 세포, 및 T 세포를 형질 감염시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 방법 및 기술은 4x107 개 세포/ml의 세포 농도로 0.6 ml/분의 유속을 사용하여 EC7 세포를 형질 감염시키는 데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본원에 제시된 방법 및 기술은 3x107 개 세포/ml의 세포 농도로 0.36 ml/분의 유속을 사용하여 haNK 세포를 형질 감염시키는 데 사용될 수 있다. 또한 또 다른 실시예에서, 본원에 제공된 방법 및 기술은 2.5x107 개 세포/ml의 세포 농도로 0.45 ml/분의 유속을 사용하여 CHO 세포를 형질 감염시키는 데 사용될 수 있다. T 세포의 경우, 본원에 제시된 방법 및 기술은 약 2x107 개 세포/ml의 세포 농도로 0.44 ml/분의 유속에서 T 세포를 형질 감염시키는 데 사용될 수 있다. 이들 조건은 최적의 조건을 달성하기 위해 추가로 달라질 수 있다.
도 13a 내지 도 13d는 본원에 기재된 방법 및 디바이스를 사용한, 이들 상이한 세포주에 대한 다양한 형질 감염 효율을 나타낸다. 도 13a는 haNK 세포(GFP mRNA로 형질 감염됨)에 대해 90% 초과의 세포 생존력으로 95% 초과의 형질 감염 효율을 나타낸다. 1억 2,700만 개 세포/분까지 형질 감염시켰다. 도 13b는 CHO 세포(GFP pmax DNA로 형질 감염됨)에 대해 50% 초과의 세포 생존력으로 90% 초과의 형질 감염 효율을 나타낸다. 1,500만 개 세포/분까지 형질 감염시켰다. 도 13c는 EC7 세포(GFP 아데노바이러스 DNA로 형질 감염됨)의 50% 초과의 세포 생존력으로 95% 초과의 형질 감염 효율을 나타낸다. 2,000만 개 세포/분 이상까지 형질 감염시켰다. 도 13d는 T 세포(GFP mRNA로 형질 감염됨)의 80% 초과의 세포 생존력으로 90% 초과의 형질 감염 효율을 나타낸다. 880만 개 세포/분까지 형질 감염시켰다.
실시예 4. 일차 T 세포의 형질 감염
다른 양태에서, 본원에 제시된 방법 및 시스템은 폴리(β-아미노 에스테르)에 부착된 mRNA를 이용하여 일차 T-세포를 전기 천공하는 데 사용되었다. 일정 폴리(β-아미노 에스테르) 폴리머는 효과적인 RNA 형질 감염 제제로 작용하는 것으로 나타났다.
RNA 및 폴리(β-아미노 에스테르) 폴리머를 포함하는 나노 입자는 mRNA를 T 세포에 전달하는 데 사용되어왔다(예를 들어, Moffett, et al., Nature Communications(2017) 8:389 참고). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 나노 입자는 폴리 글루탐산(PGA)-기반 쉘을 이용하여 생성될 수 있다. 표적화 분자(예를 들어, 항체의 결합 도메인)는 PGA 분자에 부착되어 나노 입자를 적절한 표적에 표적화할 수 있다. 예를 들어, 나노 입자를 T 세포에 표적화하기 위해, 항-CD3/항-CD28 결합 도메인이 PGA 분자에 부착될 수 있다. PGA 또는 임의의 다른 적합한 음으로 하전된 분자가 표적화에 사용될 수 있다. 나노 입자의 흡수는 특이적 표적화 또는 양이온 막 결합에 의해 발생할 수 있다.
나노 입자의 내부는 mRNA, 및 폴리(β-아미노 에스테르)와 같은 담체 분자를 포함할 수 있다. 일단 나노 입자가 세포 내로 흡수되면, mRNA는 나노 입자의 분해, 삼투성 팽창, 또는 일부 다른 적합한 과정에 의해 세포 내로 방출되고 mRNA는 그의 각각의 단백질로 전사된다. 일부 경우에, 합성 mRNA가 사용되어 mRNA 분해를 감소시킬 수 있다.
본원에 제공된 방법은, 예를 들어 mRNA 및 폴리(β-아미노 에스테르)(PbAE) 담체를 사용하거나 mRNA 및 폴리(β-아미노 에스테르) 담체를 캡슐화하는 나노 입자를 사용함으로써, mRNA를 세포 내로 형질 감염시키는 데 사용될 수 있다. 도 14a 내지 도 14e는 mRNA와 복합체화된 PbAE를 사용한(유리 mRNA가 아니고, 전기 천공 없이) T 세포 형질 감염을 나타낸다. 도 13a는 본원에 제공된 기술과 함께 사용하기에 적합한 폴리(β-아미노 에스테르)의 구조를 나타낸다. 도 14b는 PbAE를 사용한 mRNA로 형질 감염된 T 세포의 유세포 분석을 사용하여 세포 분류 결과를 나타낸다. 도 14c는 mRNA 대 담체 분자의 변화하는 비율에 기초한, 살아있는 세포에 대한 정규화 결과를 나타내는 그래프이다. 도 14d 및 도 14e는 자극된 T 세포(도 14d) 및 자극되지 않은 T 세포(도 14e)에서의 GFP-mRNA 형질 감염에 대한 다양한 조건 하에서의 세포 생존력 결과를 나타낸다. 이들 실험에서, 60:1 PbAE:RNA의 비율은 높은 GFP 전달율을 제공하면서 높은 수준의 생존 가능한 세포로 이어졌다.
도 15a 및 도 15b는 대조군 세포(전기 천공 없음) 및 전기 천공된 세포를 사용한 T 세포 GFP mRNA 형질 감염을 나타낸다. 구체적으로, 도 15a는 대조군 세포(전기 천공 없음)를 나타내며, 여기서 배경 형광이 주로 관찰된다. 도 15b는 전기 천공된 세포를 나타내며, 여기서, 히스토그램에 의해 나타낸 바와 같이, GFP-mRNA는 대다수의 세포에서 검출된다.
실시예 5. 지방-유래 중간엽 줄기 세포(AD-MSC)의 형질 감염
지방-유래 중간엽 줄기 세포(AD-MSC)는 밀리리터 당 약 1x10^5백만 개 밀도로 분리 및 수확하였다. 세포를 PBS 및 전기 천공 완충액으로 세척하고, 밀리리터 당 330만 개 세포의 밀도로 전기 천공 완충액에 현탁시켰다. 각각의 조건은 30 μg의 DNA를 사용하여 0.1 밀리리터의 최종 세포 밀도로 전기 천공하였다. 전기 천공 조건은 다음과 같다: 펄스 폭 = 100 us, 펄스 주기 = 340 ms, 전기장 강도는 하기 표 4에 나타난 바와 같이 0.9로부터 1.6 kV/cm까지 변화되었다.
[표 4]
전기 천공 전계 강도 조건
전기 천공 후, 세포를 제곱 센티미터 당 30x10^3 개 세포의 밀도로 시딩하였다. GFP 발현 효율은 전기 천공 24 시간 후에 유세포 분석으로 확인하였다. 결과는 도 16a 내지 도 16d에 나타나 있다. 도 16a 내지 도 15c 각각에서 1 내지 8의 x-축 값은 표 4에 나타나 있는 전계 강도에 해당하고 "CTL"은 전기 천공 없는 대조군에 해당한다. 도 16a는 전기 천공 24 시간 후의 세포 생존력을 나타낸다. 전기장 강도가 낮을수록, 더 많은 생존 가능한 세포가 존재한다. 도 16b는 전기 천공 24 시간 후에, 세포 형질 감염 효율 측정을 위한 유세포 분석에 의해 판독된 GFP(녹색 형광 단백질) 발현을 나타낸다. 전기장이 강할수록, 더 높은 퍼센트의 살아있는 세포가 GFP를 발현하였다. 도 16c는 GFP 형광의 중간값을 나타내며, 이는 유세포 분석 측정에서 GFP가 얼마나 밝았는지를 의미한다. 전기장이 강할수록, 더 밝은 GFP가 측정되었다. 결과는 1.1 내지 1.3 kv/cm의 전기장 강도가 생존력과 효율 사이에서 최고의 성능을 제공할 수 있음을 시사했다. 본원에서 생존력은 진정한 전체 생존력을 반영하기 위해 부착된 세포 및 상청액 둘 모두를 포함한다는 것에 주목한다. 도 16d는 MSC 형질 감염 결과의 사진이다. 왼쪽 사진은 MSC의 형태를 나타내고 오른쪽 이미지는 동일한 광학장에 대한 형광 이미지이며, 세포 대부분이 녹색 형광 단백질(녹색)을 발현함을 나타낸다.
실시예 6. EC-7 세포, CHO-S 세포, 일차 CD4/CD8 T 세포, haNK 세포, 일차 NK 세포, 활성화된 NK 세포, 수지상 세포, AD-MSC 세포의 형질 감염.
EC-7 세포, CHO-S 세포, 일차 CD4/CD8 T 세포, haNK 세포, 일차 NK 세포, 활성화된 NK 세포, 수지상 세포, AD-MSC 세포를, 하기 표 5에 나타난 전기 천공 파라미터를 이용하여, 도 2a에 도시된 장치와 유사한 장치에서 전기 천공하였다.
[표 5]
전기 천공 파라미터
표 5에서 사용된 전기 천공 매질("전기 매질") 1 및 2의 조성은 하기 표 6 및 표 7에 나타나 있다.
[표 6]
전기 천공 매질 1 조성
[표 7]
전기 천공 매질 1 조성
주어진 파라미터에 따라 표 5의 세포를 전기 천공한 결과는 하기 표 8에 제공된다.
[표 8]
전기 천공 결과
도 17은 본 개시내용의 또 다른 예시적인 실시형태에 따른 예시적인 전기 천공 시스템(1700)을 도해한 것이다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 시스템(1700)은 2 개의 I/O 카트리지(1703) 사이에 위치된 펌프용 마운트(1701) 및 칩 어셈블리(1720)(전기 천공 챔버로 지칭될 수 있음)를 포함한다. 예를 들어, 칩 어셈블리(1720)는 관류 및 무균 커넥터(1704) 중 하나를 통해 2 개의 I/O 카트리지(1703) 중 하나의 배출부에 연결될 수 있다. 다양한 구현예에서, 상시 폐쇄형 커넥터를 사용하여 관류를 연결할 수 있다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 각각의 I/O 카트리지(1703)는 벤트(vent)(1702)에 연결되어, 과잉 공기가 I/O 카트리지(1703)에서 빠져나오는 것을 가능하게 할 수 있다.
펌프(1701)는 관류 및 무균 커넥터(1704) 중 다른 하나를 통해 I/O 카트리지(1703) 중 하나의 투입부에 연결될 수 있다. 하나 이상의 펌프(1701)를 사용하여 칩 어셈블리(1720)를 통과하는 유체 흐름을 생성할 수 있다. 칩 어셈블리(1720)는 선택적으로 시스템(1700)에 커플링되고, 이로부터 디커플링되어, 상이한 칩 어셈블리가 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 시스템(1700)에서 사용되게 할 수 있다. 예를 들어, 시스템(1700)은 상이한 칩 어셈블리를 제거 가능하게 장착(mount)하는 칩 홀더 구조를 포함할 수 있으며, 선택적인 칩 센서는 칩 홀더 구조에 인접하게 위치된다.
시스템(1700)은 칩 어셈블리(1720)를 사용하여 수행될 작업(들)을 선택하는 것 등을 위해 시스템(1700)에 배치된 칩 어셈블리(1720)를 식별하거나 검증하도록 프로그래밍될 수 있는 스캐너, 사용자 인터페이스 등을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 칩 어셈블리(1720)는 감마선 조사와 양립 가능할 수 있다. 시스템(1700)은 칩 어셈블리(1720)와 함께 사용될 다양한 소모품, 완충액 등의 사용을 가능하게 할 수 있다. 일 실시형태에서, 각각의 칩 어셈블리(1720)를 위한 시스템(1700)은 세포 샘플의 용이한 무균 연결 및 분리를 위해, 투입부 및 배출부 용기에 대한 상시 폐쇄형 루어(Luer) 커넥터를 갖는 일회용, 폐쇄형 시스템 설계이다. 다양한 구현예에서, 예를 들어, 후드의 외측에 연결된 경우 무균 연결을 제공하기 위해 무균 커넥터, 예컨대 CPC AseptiQuick이 사용될 수 있다.
도 18은 전기 천공 챔버(1820)(칩 또는 칩 어셈블리로 지칭될 수 있음)를 포함하는, 화물로 세포를 전기 천공하기 위한 예시적인 장치를 도해한다. 전기 천공 챔버(1820)는 제1 전극(1840) 및 제2 전극(1842)을 포함하며, 3개의 유체 채널층(1825, 1826 및 1827)이 전극(1840 및 1842) 사이에 위치된다. 각각의 유체 채널층(1825, 1826 및 1827)은 유체 채널(1835)(경로로 지칭될 수 있음)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포(및 선택적으로 화물)를 함유하는 유체는 유체 채널(1835)을 통해 전기 천공 챔버(1820)를 통과하여 측방으로 유동할 수 있는 반면, 유체 채널(1835)의 형상은 유체가 이동하는 특정 경로를 정의한다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 유체 채널층(1825, 1826 및 1827)은 서로 정렬될 수 있으므로, 각 층(1825, 1826 및 1827)의 유체 채널(1835)도 정렬된다. 전극(1840 및 1842)은 서로 그리고 층(1825, 1826 및 1827)과 정렬되어 각 전극(1840 및 1842)의 둘레와 각 채널층(1825, 1826 및 1827)의 둘레가 실질적으로 동일한 샌드위치 배열을 형성할 수 있다. 다양한 구현예에서, 채널층(1825, 1826 및 1827) 중 하나 이상의 길이 및/또는 너비는 전극(1840 및 1842)의 길이 및/또는 너비보다 더 클 수 있어, 전극(1840 및 1842)이 의도하지 않게 서로 접촉하여, 단락을 생성하는 것을 억제할 수 있다.
전기 천공 챔버(1820)는 제1 지지층(1815) 및 제2 지지층(1816)을 포함할 수 있다. 도 18에 도시된 바와 같이, 전극(1840 및 1842) 및 채널층(1825, 1826 및 1827)은 지지층(1815 및 1816) 사이에 위치될 수 있다. 전기 천공 챔버(1820)는 또한 제1 판(1817) 및 제2 판(1818)(하우징 플레이트 또는 커버 플레이트로 지칭될 수 있음)을 포함한다. 판(1817 및 1818)은 도 18에 도시된 바와 같이 전기 천공 챔버(1820)의 최외층으로서 배열될 수 있다.
지지층(1815 및 1816) 및 판(1817 및 1818)은 전극(1840 및 1842) 및 채널층(1825, 1826 및 1827)에 구조적 지지를 제공할 수 있다. 지지층(1815 및 1816)은 각 층의 둘레가 전기 천공 챔버(1820)에서 대략 동일한 풋프린트(footprint)를 갖도록 전극(1840 및 1842) 및 채널층(1825, 1826 및 1827)과 정렬될 수 있다. 다양한 구현예에서, 지지층(1815 및 1816)은 전극(1840 및 1842)보다 더 큰 길이 및/또는 너비를 가져, 전극(1840 및 1842)이 또 다른 전도성 표면과 접촉하여 단락을 생성하는 것을 억제할 수 있다.
판(1817 및 1818)은 각 층의 둘레가 전기 천공 챔버(1820)에서 대략 동일한 풋프린트를 갖도록 지지층(1815 및 1816), 전극(1840 및 1842) 및 채널층(1825, 1826 및 1827)과 정렬될 수 있다. 다양한 구현예에서, 판(1817 및 1818)은 다른 층보다 더 큰 길이 및/또는 너비를 가져(예를 들어, 도 18에 도시된 바와 같음), 전극(1840 및 1842) 또는 다른 층이 외부 부재와 접촉하는 것을 억제할 수 있다. 전기 천공 챔버의 다른 실시형태는 도 18에 예시된 것보다 더 많거나 더 적은 층을 가질 수 있다. 예를 들어, 더 많거나 더 적은 유체 채널층, 더 많거나 더 적은 지지층(또는 이의 부재) 등이 존재할 수 있다.
도 18에 도시된 바와 같이, 전기 천공 챔버는 투입부(1810) 및 배출부(1830)를 포함한다. 투입부(1810)는 전기 천공 챔버(1820) 내로의 세포 및 화물의 통과를 가능하게 할 수 있는 반면, 배출부(1830)는 전기 천공 챔버(1820)로부터의 전기 천공된 세포의 통과를 가능하게 한다. 투입부(1810) 및 배출부(1830)는 단차 거리만큼 분리되어, 전기 천공 챔버(1820)를 통과하는, 예컨대 채널층(1825, 1826 및 1827)의 유체 채널(1835)의 경로를 통과하는 측방으로의 세포의 유동을 용이하게 할 수 있다.
예를 들어, 투입부(1810) 및 배출부(1830)는 판(1818)(전기 천공 챔버가 전기 천공 장치에 수용될 때 상부 판으로 간주될 수 있음)에서 개구를 정의할 수 있다. 도 18에 도시된 바와 같이, 지지층(1816) 및 전극(1842)은 또한 투입부(1810) 및 배출부(1830)와 정렬된 개구를 포함한다. 따라서, 세포 및 화물은 투입부(1810)를 통과하여 전기 천공 챔버(1820) 내로 유동하고, 지지층(1816) 및 전극(1842)에서 해당하는 개구를 통과하여 진행되고, 유체 채널(1835)에 도달할 수 있다. 세포 및 화물을 포함하는 유체는 이어서, 이것이 전기 천공을 겪을 때 유체 채널(1835)을 통과하고, 전극(1842) 및 지지층(1816) 내의 해당하는 구멍을 통해 배출부(1830)를 통과하여 빠져나간다.
도 18에 나타나 있고 표지되지 않은 다른 개구 또는 구멍은, 예를 들어, 나사, 플러그 등을 통해, 전기 천공 챔버의 다양한 구성 요소를 연결하기 위한 개구를 나타낼 수 있다. 일 실시형태에서, 판(1817 및 1818)은 바나나 플러그를 위한 4개의 구멍 및 루어 소켓(예를 들어, 유체를 관류를 통해 전기 천공 챔버(1820)로, 그리고 그로부터 공급하기 위함)을 연결하기 위한 2개의 나사산 구멍을 포함할 수 있다.
채널층(1825, 1826 및 1827)은 유체 채널(1835) 내의 유체 유동을 가능하게 하기 위한 임의의 적합한 재료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 채널층(1825, 1826 및 1827)은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 재료, 감압성 점착제(PSA) 재료, 실리콘 가스켓 재료 등을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 중간 채널층(1825)은 PET 재료를 포함할 수 있는 한편, 외부 채널층(1826 및 1827)은 PSA 재료를 포함하여, 채널층(1825, 1826 및 1827)을 함께 접착시킬 수 있다.
예를 들어, 외부 채널층(1826 및 1827)은 약 100 마이크로미터의 두께를 갖는 양면 PSA 재료일 수 있고, 여기서 채널층(1825)은 약 100 마이크로미터의 두께를 갖는 PET 필름이고, 그에 따라 전체 채널 구조는 약 300 마이크로미터의 두께를 갖게 되며, 전극(1840 및 1842) 사이에 밀봉을 제공한다. 다양한 구현예에서, 유체 채널(1835)의 높이(즉, 채널층(1825, 1826 및 1827)의 두께)는 유체 채널(1835)의 전체 길이(예를 들어, 투입부에서 배출부까지)에 걸쳐 균일하여, 전기 천공 동안 세포에 인가되는 전기장을 결정할 수 있다. 다른 실시형태에서, 임의의 적합한 유체 채널 높이, 예컨대 약 100 마이크로미터, 200 마이크로미터, 400 마이크로미터, 500 마이크로미터, 1 밀리미터 등이 사용될 수 있다.
전극(1840 및 1842)은 고체 전극, 예컨대 고체 판 전극, 또는 다공성을 갖는 메쉬 전극, 예컨대 마이크로메쉬 전극을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 전극(1840 및 1842)은 둘 모두 고체 전극, 예컨대 고체 판 전극이다. 다양한 구현예에서, 전극(1840 및 1842)은 도 2c에 도해된 판과 유사한 고체 금속 판의 어레이를 포함할 수 있다. 각 고체 금속 판은 독립적인 전기장을 인가하여 특정 전기장 패턴을 만들도록 구성될 수 있다.
전극(1840 및 1842)이 형성될 수 있는 적합한 재료로는 스테인레스 스틸, 폴리이미드, 실리콘, 귀금속, 4 족 금속, 전도성 재료, 및 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 귀금속의 예로는 루테늄(Ru), 로듐(Rh), 팔라듐(Pd), 은(Ag), 오스뮴(Os), 이리듐(Ir), 백금(Pt), 및 금(Au)이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 4 족 금속의 예로는 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf) 및 루테르포르듐(Rf)이 포함된다. 적합한 전도성 재료의 예로는 인듐 주석 옥사이드(ITO), 탄소 나노튜브(CNT), 및 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜) 폴리스티렌 설포네이트(PEDOT:PSS)와 같은 전도성 중합체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 전극(1840 및 1842)은 각각 약 0.004 인치의 두께를 갖는 316 스테인레스 스틸 심 스톡(shim stock)으로 제조된다.
지지층(1815 및 1816) 및 판(1817 및 1818)은 예를 들어, 전극(1840 및 1842)에 구조적 지지를 제공하는 것, 유체 채널층(1825, 1826 및 1827) 내에 세포를 포함하는 유체를 수용하는 것 등을 위한 임의의 적합한 재료를 포함할 수 있다. 예에는 예를 들어, 폴리디메틸실록산(PDMS) 아크릴릭, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌과 같은 비-공극성 재료, 금속 판, 감압성 점착제(PSA), PET 재료, 아크릴릭 유리, 사출 성형 플라스틱 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 각각의 지지층(1815 및 1816)은 판(1817 및 1818)을 전극(1840 및 1842)과 점착시키기 위해 양면 PSA 재료를 포함하며, 각 판(1817 및 1818)은 1/4인치 두께의 아크릴릭 시트이다.
도 19는 층들이 함께 압축된 어셈블된 형식의 전기 천공 챔버(1820)(또는 칩 어셈블리)를 도해한다. 도 19에 도시된 바와 같이, 판(1817 및 1818)은 어셈블리의 외부 측면을 형성하고, 다른 층은 판(1817 및 1818) 사이에 개재된다. 판(1818)은 세포를 함유하는 유체를 (예를 들어, 관류 또는 또 다른 적합한 유체 전달 시스템을 통해) 전기 천공 챔버(1820)에 공급하기 위한 투입부(1810) 및 전기 천공된 세포를 (예를 들어, 관류 또는 또 다른 적합한 유체 전달 시스템을 통해) 전기 천공 챔버(1820) 밖으로 공급하기 위한 배출부(1830)를 포함한다.
도 19에 도해된 칩 어셈블리는 전기 천공 장치, 예컨대 도 17의 시스템(1700) 내에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중 칩 어셈블리는 다양한 세포의 전기 천공을 위해 시스템으로 선택적으로 삽입될 수 있다. 각 전기 천공 프로세스 후에 또는 전기 천공을 위해 새로운 세포 유형이 요구되는 것 등의 경우에, 도 19의 칩 어셈블리는 전기 천공 시스템으로부터 제거되고, 또 다른 칩 어셈블리로 교체될 수 있다.
하기에 추가로 설명되는 바와 같이, 상이한 칩 어셈블리는 상이한 부피의 유체 채널(1835), 상이한 형상의 유체 채널(1835)의 유동 경로 등을 가질 수 있다. 다양한 칩 어셈블리는 동일한 크기 또는 풋프린트를 가질 수 있고, 그에 따라 상이한 부피 또는 유동 경로 칩 어셈블리는 전기 천공 시스템에서 상호 교환될 수 있다. 하나의 예시적인 구현예에서, 큰 부피의 칩 어셈블리(예를 들어, 유체 채널(1835)의 부피가 대략 500 마이크로리터임), 중간 부피의 칩 어셈블리(예를 들어, 유체 채널(1835)의 부피가 대략 250 마이크로리터임) 및 작은 부피의 칩 어셈블리(예를 들어, 유체 채널(1835)의 부피가 대략 50 마이크로리터임)를 사용하여, 3가지 상이한 부피의 유체 채널을 갖는 칩 어셈블리는 전기 천공 시스템으로 선택적으로 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, 더 많거나 더 적은 칩 어셈블리 설계가 전기 천공 시스템과 사용될 수 있으며, 각각의 칩 어셈블리는 상기 제공된 것보다 더 크거나 더 작은 부피의 유체 채널 등을 가질 수 있다.
도 20은 전기 천공 챔버, 예컨대 도 18의 전기 천공 챔버(1820)의 일부일 수 있는 예시적인 채널층(2025)을 도해한다. 채널층(2025)은 다수의 굽힘(bend) 부분 및 다수의 직선 경로 부분을 갖는 유체 채널(2035)(S자형 경로로 지칭될 수 있음)을 포함한다. 도 20은 8개의 굽힘 부분 및 9개의 직선 부분(7개의 전체 길이, 및 유체 채널(2035)의 각 단부에 위치하는 2개의 절반 길이를 가짐)을 갖는 유체 채널(2035)을 도해한다. 유체 채널(2035)은 단일의 S자형 곡선 패턴의 4개의 완전한 사이클의 절반으로 간주될 수 있다.
채널층(2025)이 전기 천공 시스템에 수용되는 경우, 세포를 포함하는 유체는 유체 채널(2035)의 하나의 투입구 단부 내로 공급되고, 유체 채널(2035)의 S-곡선을 통과하여 이동하여 전기 천공을 겪고, 유체 채널의 다른 배출구 단부를 통해 빠져나갈 수 있다. 유체 채널(2035)의 부피는 채널 내의 유체의 부피 유량을 결정할 수 있고, 전기 천공 프로세스의 전기 펄싱과 동기화될 수 있다. 일부 구현예에서, 유체 채널(2035)은 대략 500 마이크로리터의 부피를 가질 수 있다(예를 들어, 특정 기간 내에 최대 20억 개 이상의 세포 처리가 가능할 수 있음). 다른 구현예에서, 유체 채널(2035)은 더 크거나 더 작은 유체 부피(예를 들어, 약 25 마이크로리터, 50 마이크로리터, 100 마이크로리터, 200 마이크로리터, 250 마이크로리터, 300 마이크로리터, 400 마이크로리터, 750 마이크로리터, 1 밀리리터 등), 더 굽어 있거나 덜 굽어 있는 부분, 더 두껍거나 더 좁은 채널 너비, 더 길거나 더 짧은 채널 부분 길이, 다른 적합한 경로 형상 등을 포함할 수 있다.
도 21은 전기 천공 챔버, 예컨대 도 18의 전기 천공 챔버(1820)의 일부일 수 있는 예시적인 채널층(2125)을 도해한다. 채널층(2125)은 다수의 굽힘 부분 및 다수의 직선 경로 부분(S자형 경로로 지칭될 수 있음)을 갖는 유체 채널(2135)을 포함한다. 도 20의 유체 채널(2035)과 유사하게, 도 21은 8개의 굽힘 부분 및 9개의 직선 부분(7개의 전체 길이, 및 유체 채널(2135)의 각 단부에 위치하는 2개의 절반 길이를 가짐)을 갖는 유체 채널(2135)을 도해한다.
도 20의 유체 채널(2035)과 비교하여, 도 21의 유체 채널(2135)은 굽힘 부분에 비해 더 짧은 길이 부분을 갖는다. 그러므로, 유체 채널(2135)은 도 20의 유체 채널(2135)보다 더 작은 유체 부피를 가질 수 있다. 예를 들어, 유체 채널(2135)은 대략 250 마이크로리터의 유체 부피를 가질 수 있다(예를 들어, 특정 기간 내에 약 5억 개 세포 처리가 가능할 수 있음). 다른 구현예에서, 유체 채널(2135)은 더 크거나 더 작은 유체 부피, 더 굽어 있거나 덜 굽어 있는 부분, 더 두껍거나 더 좁은 채널 너비, 더 길거나 더 짧은 채널 부분 길이, 다른 적합한 경로 형상 등을 포함할 수 있다.
도 22는 전기 천공 챔버, 예컨대 도 18의 전기 천공 챔버(1820)의 일부일 수 있는 예시적인 채널층(2225)을 도해한다. 채널층(2225)은 (다수의 굽힘 부분을 갖는 도 20 및 도 21의 유체 채널(2035 및 2135)의 S자형 곡선과 대조적으로) 단일의 직선 부분을 갖는 유체 채널(2235)을 포함한다. 그러므로, 도 22의 유체 채널(2235)은 도 20 및 도 21의 유체 채널(2035 및 2135)보다 더 작은 유체 부피를 가질 수 있다.
채널층(2225)이 전기 천공 시스템에 수용되는 경우, 세포를 포함하는 유체는 유체 채널(2235)의 하나의 단부로 공급되고, 유체 채널(2235)의 직선을 통과하여 이동하여 전기 천공을 겪고, 유체 채널의 다른 단부를 통해 빠져나갈 수 있다. 일부 구현예에서, 유체 채널(2235)은 대략 50 마이크로리터의 부피를 가질 수 있다(예를 들어, 특정 기간 내에 약 5천만 개의 세포 처리가 가능할 수 있음). 다른 구현예에서, 유체 채널(2235)은 더 크거나 더 작은 유체 부피, 더 두껍거나 더 좁은 채널 너비, 더 길거나 더 짧은 채널 길이, 다른 적합한 경로 형상 등을 포함할 수 있다.
도 23은 유체 채널(2335)을 포함하는 또 다른 예시적인 채널층(2325)을 도해한다. 예시적인 치수가 예시 목적으로만 도 23에 제공되어 있다. 예를 들어, 유체 채널(2335)은 3 밀리미터의 너비를 갖는다. 채널 너비는 상이한 부피를 갖는 상이한 칩 어셈블리에 걸쳐 달라질 수 있지만, 하나의 채널층(2325)의 단일의 유체 채널(2335) 내에서, 채널 너비는 채널의 투입부로부터 배출부까지 일정하게 유지될 수 있다. 이는 유체 채널(2335) 내에서 일정한 세포 유동 속도의 유지를 용이하게 할 수 있다. 도 23에 도해된 유체 채널(2335)의 직선 및 굽힘 부분의 치수에 기초하여, 유체 채널(2335)은 대략 500 마이크로리터의 총 유체 부피를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 채널층(2325) 및 유체 채널(2335)은 임의의 다른 적합한 치수를 가질 수 있다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 유체 채널(2335)의 너비는 약 1 밀리미터, 2 밀리미터, 4 밀리미터, 5 밀리미터, 10 밀리미터 등일 수 있다.
일부 실시형태에서, 일정 실시형태를 기술하고 청구하는 데 사용되는 성분의 양, 농도와 같은 특성, 반응 조건 등을 표현하는 숫자는 용어 "약(about)"에 의해 일부 경우에 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 서면에 의한 기재 및 첨부된 청구 범위에 제시된 수치 파라미터는 특정 실시형태에 의해 획득하고자 하는 원하는 특성에 따라 변화할 수 있는 근사치이다. 일부 실시형태에서 수치 파라미터는, 보고된 유효 자릿수의 수를 고려하고 통상의 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 일부 실시형태의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 파라미터는 근사치이기는 하지만, 특정 실시예에서 제시되는 수치는 가급적 정확하게 보고된다. 일부 실시형태에서 제시되는 수치는 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 필연적으로 초래되는 일정 오류를 포함할 수 있다.
본원의 설명에서 및 뒤따르는 청구 범위 전체에 걸쳐 사용된 "a", "an," 및 "the"의 의미는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수형의 언급을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용된 "에(in)"의 의미는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 "내에(in)" 및 "상에(on)"를 포함한다. 문맥상 반대로 지시되지 않는 한, 본원에 제시된 모든 범위는 끝점을 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 개방형 범위는 상업적으로 실현 가능한 값을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 모든 값 목록은 문맥상 반대로 지시되지 않는 한 중간 값을 포함하는 것으로 고려되어야 한다.
또한, 본원에서 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 본원에 이미 기재된 것 외에 더욱 많은 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 명백해야 한다. 더욱이, 명세서 및 청구 범위 둘 모두를 해석함에 있어서 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 구체적으로, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 비-배타적인 방식으로 요소, 구성 요소, 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 하며, 언급된 요소, 구성 요소 또는 단계가, 명확히 언급되지 않은 다른 요소, 구성 요소, 또는 단계와 함께 존재하거나, 사용되거나, 결합될 수 있음을 나타낸다. 명세서 청구 범위가 A, B, C .... 및 N으로 구성된 군으로부터 선택되는 무언가 중 적어도 하나를 언급하는 경우, 본문은, A + N, 또는 B + N 등이 아니라, 군으로부터의 오직 하나의 요소를 요하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (20)
- 화물(cargo)로 세포를 전기 천공하기 위한 칩 어셈블리로서, 칩 어셈블리는
제1 전극;
제2 전극;
제1 전극과 제2 전극 사이에 위치된 유체 채널층으로서, 유체 채널층이 전기 천공 프로세스 동안 세포 및 화물을 함유하는 유체의 유동을 가능하게 하도록 유채 채널을 정의하는, 유체 채널층;
제1 하우징 판으로서, 제1 하우징 판이 세포 및 화물을 함유하는 유체를 수용하고 수용된 유체를 유체 채널층의 유체 채널에 공급하기 위한 투입부 개구를 정의하며, 제1 하우징 판이 유체 채널로부터 칩 어셈블리 외부로의 전기 천공된 세포의 유동을 용이하게 하기 위한 배출구 개구를 정의하는, 제1 하우징 판;
제2 하우징 판;
제1 하우징 판과 제1 전극 사이에 위치된 제1 지지층으로서, 제1 지지층 및 제1 전극이 각각 제1 하우징 판의 투입부 개구에 해당하는 제1 개구, 및 제1 하우징 판의 배출부 개구에 해당하는 제2 개구를 정의하는, 제1 지지층;
제2 전극과 제2 하우징 판 사이에 위치된 제2 지지층을 포함하는, 칩 어셈블리. - 제1항에 있어서, 유체 채널층이 제1 유체 채널층이며, 칩 어셈블리는
제1 유체 채널층과 제1 전극 사이에 위치된 제2 유체 채널층으로서, 제2 유체 채널층이 제1 유체 채널층의 유체 채널과 동일한 형상을 갖는 유체 채널을 정의하는 제2 유체 채널층; 및
제1 유체 채널층과 제2 전극 사이에 위치된 제3 유체 채널층으로서, 제2 유체 채널층이 제1 유체 채널층의 유체 채널과 동일한 형상을 갖는 유체 채널을 정의하고, 제1 유체 채널층, 제2 유체 채널층 및 제3 유체 채널층의 유체 채널이 서로 정렬되는, 제3 유체 채널층을 추가로 포함하는, 칩 어셈블리. - 제2항에 있어서,
제2 유체 채널층 및 제3 유체 채널층이 각각 감압성 점착제를 포함하며;
제1 유체 채널층이 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 재료를 포함하는, 칩 어셈블리. - 제2항에 있어서, 제1 유체 채널층, 제2 유체 채널층 및 제3 유체 채널층의 정렬된 유체 채널의 높이가 정렬된 유체 채널의 투입구로부터 정렬된 유체 채널의 배출구까지 균일하여 전기 천공 프로세스 동안 정렬된 유체 채널 내의 유체에 균일한 전기장을 인가하는, 칩 어셈블리.
- 제4항에 있어서, 제1 유체 채널층, 제2 유체 채널층 및 제3 유체 채널층의 정렬된 유체 채널의 높이가 300 마이크로미터인, 칩 어셈블리.
- 제1항에 있어서, 정의된 유체 채널의 너비가 유체 채널의 투입부로부터 유체 채널의 배출부까지 균일하여, 유체 채널을 통과하는 일정한 세포 유동 속도를 용이하게 하는, 칩 어셈블리.
- 제6항에 있어서, 정의된 유체 채널의 너비가 3 밀리미터인, 칩 어셈블리.
- 제1항에 있어서, 정의된 유체 채널이 채널의 투입부와 채널의 배출부 사이에 S자형 곡선 배열을 가지며, S자형 곡선 배열이 8개의 굽힘 부분을 포함하는, 칩 어셈블리.
- 제1항에 있어서, 정의된 유체 채널이 500 마이크로리터의 부피를 갖는, 칩 어셈블리.
- 제1항에 있어서, 정의된 유체 채널이 250 마이크로리터의 부피를 갖는, 칩 어셈블리.
- 제1항에 있어서, 정의된 유체 채널이 채널의 투입부로부터 채널의 배출부까지 직선 경로인, 칩 어셈블리.
- 제1항에 있어서, 정의된 유체 채널이 50 마이크로리터의 부피를 갖는, 칩 어셈블리.
- 제1항에 있어서,
제1 전극 및 제2 전극이 각각 스테인리스 스틸을 포함하며;
제1 지지층 및 제2 지지층이 각각 감압성 점착제(PSA) 재료를 포함하며;
제1 하우징 판 및 제2 하우징 판이 각각 아크릴릭 재료를 포함하는, 칩 어셈블리. - 제1항에 있어서, 제1 하우징 판의 투입부 개구 및 배출부 개구가 정의된 유체 채널로의 그리고 정의된 유체 채널로부터의 유체의 유동을 용이하게 하기 위해 관류를 연결하기 위한 루어(Luer) 커넥터를 수용하도록 구성되는, 칩 어셈블리.
- 화물과 함께 세포를 전기 천공 챔버 내로 유동시키는 단계로서, 전기 천공 챔버는,
제1 전극;
제2 전극;
제1 전극과 제2 전극 사이에 위치된 유체 채널층으로서, 유체 채널층이 전기 천공 프로세스 동안 세포 및 화물을 함유하는 전기 천공 매질의 유동을 가능하게 하도록 유채 채널을 정의하는 유체 채널층;
제1 하우징 판으로서, 제1 하우징 판이 세포 및 화물을 함유하는 전기 천공 매질을 수용하고 수용된 전기 천공 매질을 유체 채널층의 유체 채널에 공급하기 위한 투입부 개구를 정의하며, 제1 하우징 판이 유체 채널로부터 전기 천공 챔버 외부로의 전기 천공된 세포의 유동을 용이하게 하기 위한 배출구 개구를 정의하는 제1 하우징 판;
제2 하우징 판;
제1 하우징 판과 제1 전극 사이에 위치된 제1 지지층으로서, 제1 지지층 및 제1 전극이 각각 제1 하우징 판의 투입부 개구에 해당하는 제1 개구, 및 제1 하우징 판의 배출부 개구에 해당하는 제2 개구를 정의하는 제1 지지층; 및
제2 전극과 제2 하우징 판 사이에 위치된 제2 지지층을 포함하며,
세포는 전기 천공 매질에 현탁되고 약 1x106 개 세포/ml 내지 약 500x106 개 세포/ml의 세포 밀도를 갖는, 단계; 및
다수의 전기 펄스를 전기 천공 챔버 내의 세포에 인가하는 단계로서,
(i) 각각의 전기 펄스는 지수적으로 방전하는 파형 또는 구형파형(square waveform)의 형태를 갖고;
(ii) 다수의 전기 펄스는 약 0.3 kV/cm 내지 약 3 kV/cm의 전계 강도로 인가되고;
(iii) 전계 강도는 약 15 V 내지 약 100 V의 전압에서 인가되고;
(iv) 각각의 전기 펄스 사이의 지속 시간은 약 0.1 초 내지 약 10 초이고;
(v) 각각의 전기 펄스는 약 10 μs 내지 약 10,000 μs의 펄스 폭을 갖는, 단계를 포함하는, 화물로 세포를 전기 천공하는 방법. - 제15항에 있어서, 유동은 단계적으로 수행되며, 전기 천공 챔버의 총 부피의 약 절반 이상의 유체 부피는 지정된 시간 간격으로 전기 천공 챔버 내로 펌핑되고 세포 및 화물의 유속은 약 0.1 ml/분 내지 약 15 ml/분인, 방법.
- 제15항에 있어서, 세포는 전기 천공 챔버 내에서 균일하거나 실질적으로 균일한 전기장에 노출되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 다수의 전기 펄스는 2 개 펄스 내지 10 개 펄스인, 방법.
- 제15항에 있어서, 화물은 핵산인, 방법.
- 제15항에 있어서,
유체 채널층이 제1 유체 채널층이며;
제2 유체 채널층이 제1 유체 채널층과 제1 전극 사이에 위치되고, 제2 유체 채널층이 제1 유체 채널층의 유체 채널과 동일한 형상을 갖는 유체 채널을 정의하며;
제3 유체 채널층이 제1 유체 채널층과 제2 전극 사이에 위치되고, 제2 유체 채널층이 제1 유체 채널층의 유체 채널과 동일한 형상을 갖는 유체 채널을 정의하고, 제1 유체 채널층, 제2 유체 채널층 및 제3 유체 채널층의 유체 채널이 서로 정렬되는, 방법.
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