KR20210089640A - 세포의 고처리량 고효율 형질 주입을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

세포의 고처리량 고효율 형질 주입을 위한 방법 및 장치 Download PDF

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비샬 탄돈
찰스 에이 리쌘드렐로
제나 엘. 베일스트리니
조나단 알. 코페타
패트리샤 에이. 스워크
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더 차레스 스타크 드레이퍼 래보레이토리, 인코포레이티드
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Abstract

유전 물질들 및 다른 물질들을 세포들로 전달하는 것은 핸즈 프리의 자동화된 고처리량 연속 공정으로 수행된다. 유체 역학적 미세 유체 시스 유동 구성을 사용하는 시스템은 세포 배양 배지를 포함하는 측면 스트림들로부터 전기 천공 버퍼를 포함하는 중앙 스트림으로 세포들을 밀어내는 배열들을 포함한다. 전기 천공은 두 개 이상의 미세 유체 채널들이 병렬 구성으로 제공되고 다양한 층들이 함께 적층되어 라미네이트형 구조를 형성할 수 있는 어셈블리에서 수행된다.

Description

세포의 고처리량 고효율 형질 주입을 위한 방법 및 장치
본 발명은 세포의 고처리량 고효율 형질 주입을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
생물학, 의학, 제약 연구 및 기타 분야에서의 많은 응용 기술은 유전 물질이 세포에 도입되는 기술을 사용한다. "형질 전환(transformation)"이라는 용어는 박테리아 또는 식물 세포를 포함한 비 동물성 진핵 세포와 함께 작업할 때 자주 사용된다. "형질 주입(transfection)"은 거의 항상 진핵 세포에 대한 작업을 지칭하는 반면, "형질 도입(transduction)"은 일반적으로 진핵 세포로의 바이러스 매개 유전자 전달에 적용된다.
관심 물질은 DNA, siRNA, mRNA, RNP 복합체뿐만 아니라 항체와 같은 소분자 또는 단백질을 포함할 수 있다. 많은 경우에, 이러한 "카고(cargo)" 물질의 전달은 세포막의 일시적인 구멍 또는 "홀(hole)"을 열어 흡수를 허용하여 세포들을 변경하거나 유전적으로 변형하는 것을 포함한다.
일시적으로 세포들을 투과화시키기 위해 사용되는 하나의 일반적인 기술은 전기 천공법(electroporation)이다. 전기 천공 절차를 개발할 때 고려되는 매개 변수는 세포 특성(예를 들어, 세포 크기, 모양, 막 구조, 표면 전하), 세포 환경 및 인가된 전기장의 속성(예를 들어, 펄스 강도, 펄스 수, 펄스 지속 시간, 펄스 모양 및/또는 주파수)을 포함한다. 일반적으로 전기 천공 동안 막 투과화(permeabilization)는 인가된 전기장이 막 횡단 전위의 임계 값 또는 "전기 천공 임계 값"을 유도한 후에 발생하고, 주어진 인가 전기장에서 성공적인 전기 천공법을 위해 펄스 수와 펄스 길이에 대한 임계 값이 있다고 믿어진다. 슈반(Schwan) 방정식 및 관련된 유도 식들은 인가된 장, 세포 크기, 배지의 전도성, 세포의 시토졸(cytosol), 세포막 및 막 두께를 포함한 관련된 실험적 매개 변수에 반응하여 발생하는 세포의 막 횡단 전위를 추정하는 데 자주 사용된다(“구형 세포의 전기장에 의해 유도된 막 횡단 전압의 분석적 설명(Analytical Description of Transmembrane Voltage Induced by Electric Fields on Spheroidal Cells)”, Biophysical Journal, Volume 79 August 2000 670-679 참조).
본 발명의 목적은 핸즈 프리의 자동화된 고처리량 연속 공정으로 유전 물질들 및 다른 물질들을 세포들로 전달하는 전기 천공 어셈블리, 이를 포함하는 시스템 또는 이들을 이용하는 방법을 제공하는 데 있다.
전통적으로, 전기 천공법에 의한 세포들의 유전적 변형은 큐벳을 사용하는 대량(bulk), 일괄(batch) 공정으로 수행되어 왔다. 유동 구성을 사용할 수 있는 덜 보편적인 상업용 장치에는 일부 자동화 기능들이 없다.
예를 들어, 기존의 전기 천공 공정들은 특히 장기간 노출 시 세포 생존성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 특수한 저전도성 버퍼들을 종종 사용한다. 그러므로, 일괄 공정은 몇 가지 버퍼 교환들 및 세척 단계들을 필요로 하며, 접근 방식이 노동 집약적이고, 증가하는 대규모 일괄 제조 요구 사항들을 충족하기 위해 확장하기 어렵다. 수동 세척 및/또는 여과 단계들은 느리고, 세포들은 분 단위 내지 시간 단위로 여전히 전기 천공 버퍼에 노출된다. 이러한 단계들은 종종 세포 손실(낮은 세포 회복)과 관련이 있다. 고처리량의 형질 주입 시스템도 없다.
세포 요법이 자가 유래(autologous) 세포 공급원보다는 동종 유래(allogeneic) 세포 공급원을 사용하는 대규모 생산으로 이동함에 따라, 대량 방법을 사용하는 세포 요법의 바이오 프로세싱이 점점 더 어려워지고 있다.
게다가, 상업적으로 이용 가능한 전기 천공 장치들은 생물학적 제제를 전극과 직접 접촉시켜 국소적인 가열 및 패러데이 부산물들(하이드로늄 이온, 하이드록실 이온, 염소, 자유 라디칼 및 전극 파손 부산물(예를 들어, 알루미늄 이온 및 미립자))로 인한 잠재적 손상을 초래한다. 미세 유체가 없으면, 많은 전통적인 전기 천공 접근법들이 열에 민감한 생물학적 개체로부터 열을 멀리 전달할 수 없거나 이를 효율적으로 수행할 수 없다. 어떤 경우에는, 세포들(또는 다른 기질들)과 페이로드(payload)(또는 카고)의 공동 국재화(co-localization)가 부족하여, (가치 있는) 물질들의 비효율성 및 손실이 발생한다.
그러므로, 상술한 문제들 중 적어도 일부를 다루는 장비 및 절차에 대한 요구가 존재한다.
본 명세서는 유전 물질들 또는 다른 물질들을 세포들로 전달하는 것이 핸즈 프리의 자동화된 고처리량 연속 공정으로 수행되는 접근법이 설명한다.
일부 실시예들은 유체 역학적 미세 유체 시스(sheath) 유동 구성에 의존하고, 예를 들어 세포 배양 배지를 포함하는 측면 스트림들로부터 전기 천공 버퍼를 포함하는 중앙 스트림으로 세포들을 밀어내기 위한 배열들을 포함한다. 전기 천공법은 두 개 이상의 미세 유체 채널들이 병렬 구성으로 제공되고 다양한 층들이 함께 적층되어 라미네이트형 구조를 형성할 수 있는 어셈블리에서 수행될 수 있다. 각 미세 유체 채널들에는 한 쌍의 전극들이 제공되며, 바람직하게는 오래 지속되고 연속적이며 고처리량 동작들을 견딜 수 있도록 구성된다.
일 실시예에서, 장치는 공통 저장소, 저장소로 및/또는 저장소로부터 유체를 구동하기 위한 펌핑 시스템, 전기 천공을 위한 전압 생생기 및 시스템의 부분적 또는 완전한 자동화를 위한 컨트롤러를 포함하는 시스템의 일부이다. 적어도 하나의 인큐베이터를 세포들의 저장에 사용할 수 있다. 특정한 배열들에는 세포들이 침전되는 것을 방지하기 위한 교반이 포함된다.
다른 실시예들은 인큐베이터로부터의 세포들이 세포 배양 조건으로부터 전기 천공 버퍼로 구동되고 전기 천공되는 장치로 향하게 하는 방법을 특징으로 한다. 카고를 포함하는 세포들은 배양 조건으로 다시 전달되고(또는 전달되거나) 수집될 수 있다. 특정한 실시예들에서, 페이로드를 포함하는 세포들은 진단, 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 투여된다.
일부 실시예들에서, 본 발명은 세포 요법 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 기술 및 장비는 mRNA를 갖는 1차 T 세포들(primary T cells)의 전기 형질 주입에 사용될 수 있다. 다른 실시예들에서, 본 명세서에 개시된 접근법을 사용하여 생산된 카고를 포함하는 세포들은 치료, 예방 또는 진단이 필요한 대상에게 투여된다.
본 발명을 실행하는 것은 기존의 시스템들에서 발생하는 문제를 해결할 수 있고 많은 이점들을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 장비 및 기술은 비 이상적인 조건(전기 천공 버퍼, 실온)에 세포들이 노출되는 지속 시간 및 통상적인 버퍼 교환들과 관련된 세포들 및/또는 유전 물질의 손실을 줄이거나 최소화할 수 있다. 예를 들어, 형질 주입 효율 및 세포 건강은 모두 실온에서 전기 천공 버퍼에 보관하는 장기간 노출(약 30분 이상)에 의해 해로운 영향을 받는다는 것이 입증되었다. 본 명세서에 개시된 접근법은 이러한 유형의 노출을 약 1분 미만으로 감소시킬 수 있거나, 용액 내 세포들의 체류 시간을 연속 방식으로 정확한 원하는 길이로 정밀하게 제어할 수 있다(예를 들어, 용액 A에서 20분, 용액 B에서 3분, 용액 C에서 1분).
많은 실시예들에서, 세포 취급은 형질 주입 절차와 같이, 세포들 또는 다른 막 결합 기질들로 카고를 전달하기 위한 전체 공정 동안 자동화된다. 따라서 기존의 상업용 장치들과 달리, 본 명세서에 개시된 시스템은 공정 플로우의 일부로서 자동화된 방식으로 세포들을 세포 배양 조건 하에서 수용할 수 있다. 버퍼 교환들은 더 이상 세포들의 원심 분리 및 재현탁을 사용하여 수동으로 수행되지 않는다. 오히려, 많은 실시예들에서, 본 발명은 버퍼 교환들을 달성하는 자동화된 방법을 제공한다. 전달되는 세포들 및/또는 물질들이 전기 천공 전극들과의 직접 접촉으로부터 보호될 수 있는 구성들도 가능하다.
본 명세서에 개시된 기술을 통해, 많은 수의 세포들이 고처리량으로 장기간 동안 연속적으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 병렬 구성내에서 다중 미세 유체 채널들을 포함하는 어셈블리들은 공통 저장소, 펌핑 시스템, 전기장 생성기 등과 같은 일반적인 구성 요소를 활용하여 전체 레이아웃을 단순화할 수 있다.
견고하고 유연하며 다재다능한 본 발명의 실시예들은 다양한 유형의 카고, 세포들 또는 기타 막-결합 기질들(다른 유형의 소포(vesicle) 또는 엑소좀(exosome)과 같은 구조들)에 쓰이거나 적용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 전기 천공 및/또는 다른 모듈들은 일회용(예를 들어, 1회 사용 후 버리게 되어있는)일 수 있지만, 그 디자인들은 반복 사용을 위해 충분히 강하고 튼튼한 수득 장치를 제시한다.
본 명세서에 개시된 원리는 또한 세포들 또는 다른 막 결합 구조들에 보유된 내용물들의 일부 또는 전부를 제거하도록 사용될 수 있다. 즉, 기공을 열고 내부 내용물들이 수동적으로 또는 음향 영동력(acoustopheretic force) 또는 전기 영동력(electrophoretic force)과 같은 능동 메커니즘을 통해 확산되도록 한다.
일반적으로, 일 실시예에 따르면, 본 발명은 페이로드를 세포들에 도입하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 제1 인큐베이터로부터 다중 미세 유체 장치들을 포함하는 어셈블리로 세포들을 향하게 하는 것, 세포 배양 배지로부터 전기 천공 배지로 세포들을 구동하는 것, 전기 천공 배치가 중앙 스트림 내에서 흐르는 시스 유동 구성에서 전기 천공 배지 내의 세포들에 전기장을 인가하는 것, 및 페이로드를 세포들로 전달하거나 전달을 허용하는 것을 포함한다.
실시예들에서, 상기 방법은 페이로드를 포함하는 세포들을 전기 천공 유체로부터 세포 배양 유체로 구동하는 것을 더 포함할 수 있다. 또한 페이로드를 포함하는 세포들은 제2 인큐베이터에 저장된다.
종종, 페이로드를 포함하는 세포들은 진단, 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 투여된다.
일반적으로, 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 면역 요법을 위한 세포들의 제조 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 세포들을 세포 배양 배지인 제1 버퍼로부터 전기 천공 버퍼로 전달하는 것, 및 이후 전기 천공법에 의해 세포들을 투과화시키는 것을 포함한다. 이는 페이로드가 투과화된 세포들로 전달되도록 한다. 이후, 페이로드를 포함하는 세포들은 제2 버퍼로 전달된다. 본 발명은 자동화되고 연속적인 유동 모드를 수반하며, 처리량은 분당 4백만 세포 이상일 수 있다.
일반적으로, 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 카고를 세포들로 자동화된 연속 유동으로 전달하는 시스템을 특징으로 한다. 상기 시스템은 세포들을 저장하는 제1 인큐베이터, 병렬 구성으로 배치된 다중 미세 유체 채널들을 지지하는 층을 포함하는 전기 천공 어셈블리, 세포 배양 배지로부터 전기 천공 배지로 세포를 구동하는 제1 버퍼 교환기, 세포를 전기 천공 배지로부터 배양 배지로 구동하는 제2 버퍼 교환기 및 컨트롤러를 포함한다.
바람직하게는, 상기 시스템은 전기 천공 버퍼를 전기 천공 어셈블리로 전달하는 것, 세포들을 제1 버퍼 교환기로 전달하는 것 및/또는 세포들을 제2 버퍼 교환기로부터 제2 인큐베이터로 전달하는 것을 위한 펌프 시스템을 포함한다. 또한, 각 미세 유체 채널은 중앙 스트림 및 측면 시스 스트림들을 지지하도록 구성될 수 있는 삼분할된 입구들 및 출구들을 가질 수 있다.
일반적으로, 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 병렬 구성으로 배열된 적어도 두 개의 미세 유체 채널들을 포함하는 채널 층, 각 미세 유체 채널에 대한 한 쌍의 전극들을 포함하는 전극 층 및 미세 유체 채널들의 삼분할된 입구들 및 출구들로의 유체 연결을 위한 포트 층을 포함하는 전기 천공 어셈블리를 특징으로 한다. 이때, 층들은 라미네이트 구성으로 적층된다.
일반적으로, 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 세포들을 원하는 온도로 유지하는 인큐베이터, 세포들이 침전되는 것을 방지하는 교반 장치, 세포들을 전기 천공 버퍼로 이동시키는 버퍼 교환기, 카고를 전달하기 위해 전기 천공 버퍼 내에서 세포들을 전기 천공하기 위한 유동 전기 천공 장치 및 유동 전기 천공 장치로부터 세포들을 수용하기 위한 인큐베이터를 포함하는, 카고를 세포들로 대량 전달하는 시스템을 특징으로 한다.
교반 장치는 세포 저장소 내의 임펠러(impeller)를 포함할 수 있다. 게다가, 인큐베이터와 버퍼 교환기 사이에서 펌프가 사용될 수 있다. 또한, 전기 천공 버퍼를 버퍼 교환기로 흐르게 하는 펌프가 도움이 된다. 또한, 유체 커패시터는 인큐베이터와 버퍼 교환기 사이에서 도움이 된다.
구성 및 부품의 조합에 대한 다양한 신규 세부 사항 및 기타 이점을 포함하는 본 발명의 상술한 특징 및 다른 특징은 이하에서 첨부된 도면을 참조하여 보다 구체적으로 설명되고 청구항에서 지적될 것이다. 본 발명을 구현하는 특정한 방법 및 장치는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시로서 도시된 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 원리 및 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양하고 많은 실시예들에서 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 전기 천공 어셈블리, 이를 포함하는 시스템 또는 이들을 이용하는 방법은 핸즈 프리의 자동화된 고처리량 연속 공정으로 유전 물질들 및 다른 물질들을 세포들로 전달할 수 있다.
첨부된 도면에서, 참조 부호들은 다른 도면들에서 동일한 부분을 지칭한다. 도면의 비율은 반드시 실제와 같은 것은 아니며, 대신 본 발명의 원리를 설명하기 위해 강조된 것일 수 있다.
도 1은 세포들의 핸즈 프리 연속적 유동 형질 주입을 위한 장치를 나타내는 개략도이다.
도 2a는 인큐베이터에 보관되는 동안 세포들이 침전되는 것을 방지하기 위해 사용될 수 있는 교반 장치의 개략도이다.
도 2b는 도 2a의 장치의 분해도이다.
도 2c는 도 2a의 교반 장치에 사용될 수 있는 임펠러의 사시도이다.
도 2d는 도 1의 시스템에서 사용될 수 있는 유체 커패시터의 분해도이다.
도 2e는 도 2d의 조립된 유체 커패시터의 사시도이다.
도 2f, 도 2g 및 도 2h는 도 2d 및 도 2e의 유체 커패시터의 플레이트 구성 요소들의 사시도들이다.
도 3은 중앙 스트림 및 측면 스트림들을 사용하는 유동 배열을 지지하도록 구성된 장치 구성 요소를 보여주는 평면도이다.
도 4a는 세포들의 전기 천공에 사용될 수 있는 음향 구동, 신속 버퍼 교환 배열의 개략도이다.
도 4b, 도 4c 및 도 4d는 음향 구동, 신속 버퍼 교환 및 전기 천공 배열들의 개략도들이다.
도 5a(음향 꺼짐) 및 도 5b(음향 활성화)는 음향 구동, 신속 버퍼 교환 공정을 보여주는 현미경 이미지들이다.
도 6은 전기 천공 어셈블리 내의 구성 요소들의 분해도이다.
도 7 및 도 8은 도 6에 도시된 구성 요소들을 포함하는 전기 천공 어셈블리의 사시도들이다.
도 9 내지 도 13은 도 6 내지 도 8의 구성 요소들의 평면도들이다.
도 14a 및 도 14b는 각각 본 명세서에 개시된 절차에 따라 전기 천공된 T 세포들의 형질 주입 효율 및 생존성 데이터를 제공한다.
도 15는 2명의 공여자들로부터 획득되고 본 명세서에 개시된 절차에 따라 전기 천공된 세포들의 생존성 및 형질 주입 효율을 보여준다.
본 발명은 본 발명의 예시적인 실시예들이 도시된 첨부 도면을 참조하여 이하에서 보다 완전하게 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에 설명된 실시예들에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이러한 실시예들은 본 개시가 철저하고 완전하게, 본 발명의 범위를 통상의 지식을 가진 자에게 충분히 전달하도록 제공된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "및/또는"이라는 용어는 하나 이상의 연관된 나열된 항목들의 임의의 조합들 및 모든 조합들을 포함한다. 또한, 단수형 및 관사 "a", "an" 및 "the"는 달리 명시적으로 언급하지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용되는'포함한다','이루어진다','포함하는' 및/또는'이루어지는'과 같은 용어들은 언급된 특징, 정수, 단계, 연산, 요소 및/또는 구성 요소의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 연산, 요소, 구성 요소 및/또는 그들의 조합의 존재 또는 추가를 배제하지는 않는다. 또한, 세부 구성 요소들 또는 서브 시스템을 포함하는 요소가 다른 요소에 연결 또는 결합되는 것으로 언급 및/또는 도시될 때, 다른 요소에 직접 연결 또는 결합될 수 있거나 개재 요소가 존재할 수 있다.
본 명세서에서 "제1 " 및 "제2 "와 같은 용어가 다양한 요소들을 설명하기 위해 사용되었지만, 요소들은 이러한 용어에 의해 제한되지 않는다. 이 용어들은 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해 사용될 뿐이다. 따라서, 아래에서 논의되는 요소는 제2 요소로 명명될 수 있고, 유사하게, 제2 요소는 본 발명의 교시에서 벗어나지 않고 제1 요소로 명명될 수도 있다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함하여 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의된 용어와 같은 용어들은 관련 기술의 맥락에서 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며 본 명세서에 명시적으로 정의되어 있지 않는 한 이상화되거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되지 않을 것이다.
본 발명은 일반적으로 본 명세서에서 "카고" 또는 "페이로드"로 지칭되는 하나 이상의 물질(들) 또는 제제(들)를 세포들 내로 또는 세포들 밖으로 전달하기 위한 접근법에 관한 것이다. 많은 경우에, 세포들은 일반적으로 직경이 약 10 내지 약 100 ㎛ 범위인 진핵 세포들이다. 또한, 카고는, 예를 들어, 리포솜, 엑소좀, 미셀 등과 같은 다른 막 결합 구조들로 또는 그들로부터 전달될 수 있다.
카고 물질들의 예로는 소분자, 염색체, DNA, RNA(예를 들어, mRNA, siRNA, gRNA, ssRNA), 기타 유전 물질들, 올리고머(oligomers), 바이오 마커, 단백질, 트랜스포존(transposons), 생체 분자 복합체, 소분자, 치료용 약제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 종종 카고는 인간 또는 동물 대상의 상태를 치료, 예방 또는 진단하는 데 유용한 물질이다.
많은 실시예들에서, 본 발명은 카고를 세포들 또는 다른 기질들로 핸즈 프리 연속적 유동 전달을 지지하는 시스템에 관한 것이다. 시스템에서 수행되는 공정들은 부분적으로 또는 완전히 자동화될 수 있다.
도 1을 참조하면, 예를 들어, 인큐베이터(incubator, 12), (제1) 버퍼 교환기(buffer exchanger, 14), 전기 천공 어셈블리(electroporation assembly, 16), (제2) 버퍼 교환기(18), 및 (제2) 인큐베이터(20)와 같은 여러 구성 요소들 또는 모듈들을 포함하는 시스템(10)이 도시된다. 시스템은 예를 들어 저장소들(reservoirs, 22, 24, 26)과 같은 하나 이상의 저장소들 및 펌프들(pumps, 30, 32, 34, 36)을 더 포함할 수 있다. 전기 천공에 필요한 전압은 전기 함수 생성기(electrical function generator, 40)에 의해 제공되고, 음향 에너지는 음향 함수 생성기(acoustic function generator, 42)를 통해 제공된다. 시스템은 컨트롤러(controller, 44)에 의해 제어된다. 종종 컨트롤러는 단일 보드 컴퓨터 시스템과 같은 컴퓨터 시스템의 마이크로 프로세서이다. 다른 경우, 컨트롤러는 집적 메모리, 아날로그-디지털 변환기 및 디지털-아날로그 변환기가 있는 마이크로 컨트롤러이다.
인큐베이터들(12, 20)(각각, 전기 천공 어셈블리(16)의 상류 및 하류에 배치됨) 중 하나 또는 둘 모두는 전기 천공 전 및/또는 후에 세포들을 수용하도록 구성된 벤치 탑 배양 챔버들일 수 있으며, 약 0.3 내지 약 50 L의 내부 부피를 가질 수 있다. 대부분의 경우 하나 또는 두 개의 인큐베이터들은 소형화된 디자인을 가지고 있다.
일반적으로, 인큐베이터(12 및/또는 20)에는 인큐베이터로 및/또는 인큐베이터로부터 세포들을 전달하기 위한 수단들이 제공된다.
예를 들어, 인큐베이터(12)에는 세포 용기 또는 저장소(플라스크, 원뿔형 튜브 등)를 위한 리셉터클이 장착될 수 있다. 용기는, 예를 들어, 혈액 주머니와 같은 밀봉된 멸균 용기일 수 있다. 도시되는 예에서, TexMACS 또는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute)의 T 세포용 배지와 같은 고전도성(예를 들어, 약 1 내지 2 S/m(Siemens per meter)) 배양 버퍼에 현탁된 105 내지 5x108 cell/mL 농도의 세포들을 제공한다.
예를 들어, 인큐베이터 온도(종종 37 °C로 유지), 인큐베이터 가스 조성(예를 들어, CO2 및/또는 습도 레벨), 물질 대사(metabolic) 또는 일반적 프로세싱 판독(pH, O2 등)을 위한 센서 등의 세포 배양 조건들을 제어하는 폐쇄 루프 또는 다른 적절한 배열이 포함될 수 있다.
인큐베이터(12)에 수용될 수 있는 세포들의 예는 1차 T 세포, NK 세포, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cells)와 같은 현탁 세포들(suspension cells) 또는 MSC, CHO 세포 등과 같은 부착성 세포들(adherent cells)을 포함한다. 일 실시예에서, 인큐베이터(12 및/또는 20)는 리포솜, 엑소좀, 미셀 등과 같은 막 결합 구조들을 지지하도록 디자인되거나 조정된다. 이들 표적들을 안정하게 유지하는 적합한 버퍼 및 조건은 공지된 바와 같이 선택되고/되거나 실험적으로 결정될 수 있다.
배양 배지에서 중성 부력이 없을 수 있는 세포들(또는 다른 막 결합 구조들)의 경우, 인큐베이터는 세포들을 수용하는 용기 내에서 (부드러운) 움직임을 생성하며, 침전 또는 가라앉음을 줄이거나, 최소화하거나 또는 방지하는 교반 메커니즘을 장착할 수 있다. 이는 다운 스트림 작업들(배지 교환 및 전기 천공)로 전달되는 세포들의 농도를 제어하고 일관되게 하는 데 도움이 된다. 이하에서, 하나의 예시적인 디자인이 도 2를 참조하여 설명된다.
일부 실시예들에서, 공정의 시작 및 종료를 위해 별도의 인큐베이터 챔버들을 사용하는 대신(예를 들어, 도 1의 12, 20 참조), 전체 시스템이 인큐베이터 챔버 내에 수용된다.
본 명세서에 개시된 많은 실시예들에서, 전기 천공 어셈블리(16)는, 예를 들어, 미세 유체 채널에서 시스 유동 구성을 사용하여 연속적 방식으로 수행되는 전기 천공 공정들을 지지한다. 하나의 특정한 실시예는 일반적으로, 본 명세서에서 전기 천공 유체로도 지칭되는, 저전도성 유체를 사용하는 중앙 유동 또는 스트림에서 세포들과 카고를 접촉시킨다. 중앙 스트림은 일반적으로 고전도성 유체를 사용하는 두 개의 시스("측면" 또는 "측방"으로 지칭됨) 스트림 사이에서 흐른다. 중앙 및 측면 유체들 사이의 전도성 차이는 유동의 중앙 (저전도성) 영역 내에 전기장(전압 생성기(40)에 의해 공급됨)이 집중되어, 전기장 세기를 효과적으로 증폭하고, 세포들이 중앙 스트림에서 전극들과 물리적으로 접촉하는 것을 방지한다.
세포 배양을 위한 바람직한 배지는 일반적으로 높은 전기 전도성을 가지며, 상술한 시스 유동 배열은 바람직하게는 전기 천공 동안 저전도성 배지에 세포들을 위치시킨다는 점을 고려하면, 시스템(10)은 세포 배양 배지로부터 전기 천공 버퍼 배지로 세포들을 전달하는 버퍼 교환 배열(buffer exchange arrangement, 14)을 사용한다. 많은 실시예들에서, 도 1에서 구성 요소 14로 표현되는 신속 버퍼 교환은, 하나의 유동 스트림에서 다른 유동 스트림으로 세포들을 음향학적으로 구동하는 것을 포함하며, 음향 주파수들은 구성 요소 42를 통해 생성된다.
전기 천공 후, 세포들은 전기 천공 배지에서 세포 배지로 전달될 수 있다. 도 1에 도시된 하나의 접근법은 세포 농축 기능을 더 포함할 수 있는 버퍼 교환 모듈(buffer exchange module, 18)을 사용한다. 일반적으로, 세포 농축은 일반적으로 원심 분리를 사용하는 일괄 공정에서 달성되지만, 음향 영동, 유전 영동, 전기 영동, 관성 효과 또는 통합 다공성 막 또는 체를 사용하는 유동 구성들로 달성할 수 있다.
일 실시예에서, 버퍼 교환 장치들(14, 18) 중 적어도 하나는 신속 버퍼 교환 장치 및 세포 농축기이다. 다른 실시예는 하나 또는 둘 모두의 버퍼 교환 (스위칭) 모듈 및 전기 천공 장치(16)(상술한 시스 유동 구성을 사용할 수 있음)가 단일 장치에 통합된 디자인을 사용한다. 추가적인 실시예에서, 적어도 하나의 버퍼 교환은 전기 천공 장치와 분리된 장치에서 수행된다. 이 접근법의 한 예에서, 버퍼 교환기(14), 유동 전기 천공 어셈블리(16) 및 버퍼 교환기(18)는 이러한 구성 요소들 사이의 유체 연통을 제공할 수 있는 도관(conduits), 예를 들어 적절한 튜빙에 의해 서로 연결된다.
본 발명의 일부 실시예들은 장치들(14, 18) 모두에서 음향 구동 신속 버퍼 스위칭을 사용한다. 다른 실시예들에서, 비 음향 구동 버퍼 스위칭은 버퍼 교환 장치들 중 적어도 하나에서 사용된다. 하나의 실시예는 음향 구동 버퍼 교환 장치(14) 및 비 음향 구동 버퍼 교환 장치(18)를 사용한다.
음향 구동 버퍼 교환들을 위한 구성 및 작동 세부 사항들은'미세 입자들을 위한 음향 구동 버퍼 스위칭(Acoustically-driven buffer switching for microparticles)'이라는 제목의 2019년 3월 20일 출원된 미국 특허 출원 16/359,626에서 제공되며, 본 명세서에 참조로 개시되어 있다. 비 음향 구동 버퍼 스위칭을 위해 사용될 수 있는 기술들은 관성 기술들, 통합 다공성 막 또는 체가 있는 미세 채널들, 또는 확산-b 기반 기술들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
출력 세포들은 인큐베이터(20)에서 수집된다. 일 실시예에서, 이들 세포들은 mRNA를 함유하는 1차 인간 T 세포들이다. 이러한 세포들은 유전자 편집 응용들 또는 일시적인 치료 시스템들(mRNA CAR-T)로 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 출력 세포들은 단백질 또는 세포 외 소포 생산에 사용된다(예를 들어, 변형된 CHO 세포 또는 MSC).
시스템 전반에 걸쳐, 유동은 종종 연동 디자인의 상업용 기성품 펌프인 펌프들을 포함하는 펌프 시스템에 의해 구동(또는 작동)된다. 다른 적절한 펌프 유형을 사용할 수도 있다. 일반적으로, 하나의 펌프를 사용하여 제1 인큐베이션 챔버에서 나와 전체 시스템을 통과하는 세포 현탁액의 유동을 100 μL/min 내지 2 mL/min 범위의 유속으로 작동시킨다. 시스템에서 발생하는 각 버퍼 교환에 대해 하나의 추가 펌프가 필요하다. 명목상으로, 적어도 두 개의 펌프들이 필요하다. 하나는 세포들을 전기 천공 버퍼로 이동시키는 것과 관련된 펌프이고 다른 하나는 나중에 세포들을 배양 버퍼로 돌려보내는 펌프이다. 장치들 사이의 유속 차이를 방지하기 위해, 밸러스트(ballast) 역할을 하는 장치들 사이에 유체 커패시터들 또는 저장소들을 배치할 수 있다. 이 경우, 각 미세 유체 장치는 유속을 제어하는 자체 펌프 세트를 갖는다.
시스템(10)에서, 전기 천공될 세포들은 유체 유동을 제어할 수 있는 주사기 펌프일 수 있는 펌프(26)를 사용하여 인큐베이터(12)로부터 회수된다. 시스템(10)은, 또한, 저장소(22) 및 전기 천공 배열(16)에 전기 천공 버퍼를 공급하는 펌프(32)(예를 들어, 주사기 펌프)를 포함한다. 시스 유동을 위한 고전도성 유체는 펌프(34)(예를 들어, 주사기 펌프)에 의해 저장소(24)로부터 추가될 수 있다. 세포 배지는 펌프(36)(예를 들어, 주사기 펌프)를 사용하여 저장소(26)로부터 버퍼 교환 모듈(18)로 공급된다.
시스템(10)은 세포들로(또는 다른 유형의 막 결합 구조들로) 통합될 카고를 수용하는 저장소에 관한 다양한 옵션들을 제공한다. 1차 인간 T 세포들을 사용하는 일 실시예에서, 전기 천공 버퍼의 mRNA는 저장소(22)로부터 배지 교환 장치(14)로 도입되며, 이는 세포들이 전기 천공 장치(16)로 흐르기 전에 mRNA가 적재된 전기 천공 배지로 전달된다. 다른 배열들은 플라스미드 DNA, 단일 가닥 선형 DNA, 이중 가닥 선형 DNA, 선형화 플라스미드 DNA, 단일 가닥 공여자 올리고뉴클레오티드(donor oligonucleotides), 리보 핵 단백질(ribonucleoproteins)(예를 들어, 가이드 RNA와 복합된 Cas9 단백질), 단백질 또는 저장소(22)의 소분자들과 같은 카고를 공급한다. 또한 세포들은 카고가 적재된 전기 천공 배지에 수동으로 현탁되고, 인큐베이터(12)에 도입되며, 유동 전기 천공 장치(16)로 직접 흐를 수 있다.
다양한 모듈들(또는 구성 요소들) 사이의 유체 연통을 제공하는 일부 또는 모든 연결들을 위해 실라스틱(silastic) 또는 다른 적절한 튜브가 사용될 수 있다.
컨트롤러(44)는 부분적 또는 완전한 자동화에 도달하기 위해 시스템(10) 또는 그의 구성 요소들의 동작을 제어하기 위한 하나 이상의 컴퓨터, 하드웨어, 소프트웨어, 센서, 인터페이스 등을 포함할 수 있다. 많은 실시예들에서, 컨트롤러(44)는 전기 천공에 적용되는 전기적 매개 변수들 및/또는 버퍼 교환 장치(14) 및 선택적으로 버퍼 교환 장치(18)에서 사용되는 음향 주파수들을 제어한다. 컨트롤러(44)는 인큐베이터 매개 변수들, 하나 이상의 펌프들(30, 32, 34 및/또는 36)의 작동, 상술한 중앙 및/또는 시스 스트림들의 유동 및 매개 변수들 등을 모니터링하거나 제어할 수 있다.
시스템(10) 및/또는 그의 동작에 포함될 수 있는 다양한 실시예들이 이하에서 더 설명된다.
예를 들어, 상술한 바와 같이, 시스템(10)은 인큐베이터에서 유지된 세포가 침전되는 것을 방지하는 하나 이상의 교반기(agitator)를 사용할 수 있다. 예가 도 2a 및 도 2b에 도시된다. 이들 도면들에는 인큐베이터(12, 도 1)에 수용될 수 있는 전단 교반 장치(front end agitator apparatus, 11)가 도시된다. 교반 장치(11)는 적절한 세포 버퍼 내의 세포들을 버퍼 교환기(14, 도 1) 및 임펠러(impeller, 15)에 공급하는 세포 저장소(13)를 포함하여, 세포들을 저어주고 세포들이 침전되는 것을 방지한다. 특정한 실시예들에서, 세포 저장소(13)는 원통형(관형) 상부 섹션(cylindrical(tubular) upper section, 17) 및 원뿔형 하부 섹션(conical lower section, 19)을 포함한다. 출구(outlet, 21)는 도 1의 펌프(30)에 대한 세포 저장소(13)의 원뿔형 하부 섹션(19) 사이의 유체 연통을 제공한다. 뚜껑(lid, 23)은 섹션(17)의 상부 개구를 덮는다.
세포 저장소(13)는 약 15 mL 내지 약 1 L 범위 내의 부피를 가질 수 있다.
많은 경우에, 적절한 임펠러 디자인을 선택하는 것은 세포 저장소의 과도한 전단력(shear forces)으로부터 세포들을 보호하는 동시에 세포들이 세포 저장소의 바닥으로 가라앉는 것을 줄이거나 최소화하거나 완전히 방지할 수 있도록 충분한 교반을 촉진할 필요성을 고려한다. 도 2a 및 도 2b의 특정한 실시예에서, 임펠러(15)는 세포 저장소(13)의 프로파일과 유사한 프로파일을 가지며, 도 2c에 도시된 바와 같이 상부 섹션(upper section, 25) 및 테이퍼진 하부 섹션(tapered lower section, 27)을 포함한다. 도 2c의 실시예에서, 임펠러는 세포 저장소(13) 내부에 맞도록 구성된 얇고 평평한 구조이다. 테이퍼 정도, 섹션들(25, 27)의 상대적 길이 및 기타 매개 변수들은 실험적으로 최적화될 수 있다. 또한 다른 유형의 임펠러들이 사용될 수 있다.
임펠러(15)는 자기 커플링(magnetic coupling, 31)을 통해 모터(29)에 연결된다.
모터, 자기 커플링 및 세포 저장소는 일부 실시예에서 알루미늄 브레드보드로 제조되는 플랫폼(33) 상에 설치될 수 있다. 세포 저장소(13)는 안정화 플레이트(stabilization plate, 35)에 의해 안정화되는 반면, 홀더 플레이트(holder plate, 37)는 덮개(23)에서 세포 저장소(13)를 붙잡는다. 홀더 플레이트(37)는, 예를 들어, 세포 저장소를 로딩 및 언로딩하고 교반 동안 안정적으로 유지하는 U자형 개구를 가질 수 있다. 안정화 플레이트(35) 및 홀더 플레이트(37)는 기둥들 또는 다른 적절한 수단을 사용하여 플랫폼(33) 상에 장착될 수 있다. 도 2a 및 도 2b의 실시예에서, 장치(11)는 길이가 6 인치일 수 있는 세 개의 수컷/암컷 기둥들(male/female pillar posts, 39)을 포함한다.
세 개의 나사들(screws, 43)을 포함할 수 있는 모터 서브 어셈블리(motor subassembly, 41)는, 예를 들어, 길이가 3 인치일 수 있는 수컷/암컷 기둥들(45)을 사용하여 홀더 플레이트(37) 상에 장착된다. 모터는 임펠러에 자기적으로 결합되는 자석을 회전시켜, 직접 접촉 없이 세포 저장소 내에서 회전하게 한다.
임펠러(15)를 작동시키기 위한 매개 변수들은 세포들이 세포 저장소의 바닥에 가라앉거나 침전되는 것을 방지하면서 과도한 전단으로부터 세포들을 보호할 필요성을 고려한다. 특정한 실시예들에서, 임펠러(15)는 분당 160 회전으로 작동되고, 약 2 dyne/cm2의 최대 전단 응력을 세포들에 부여한다. 전단 응력이 약 10 dyne/cm2 미만으로 유지되는 것이 중요하다.
연동 펌프(peristaltic pump)가 출구(21)로부터 유체를 구동하는 데 사용되는 경우, 펌프에 의해 생성된 유동 진동들을 완화하는 순응성 구조가 일렬로 배치되어, 상류 장치들에 부드러운 유동을 제공할 수 있다. 순응성 구조는, 예를 들어, 유체 커패시터(fluidic capacitor), 즉 유체 압력에 반응하여 변형되는 폴리머 막과 같은 순응성 물질로 제조된 바닥 및/또는 천장이 있는 미세 채널일 수 있다. 그 예가 도 2d(유체 커패시터(61)의 분해도) 및 도 2e(조립된 유체 커패시터의 도면)에 도시된다. 이 도면들에서 볼 수 있듯이, 유체 커패시터(61)는, 예를 들어, 고순도 및 고온의 실리콘 고무 또는 다른 적합한 물질로 제조될 수 있는 두 개의 폴리머 막들(polymer membranes), 즉 시트들(sheets, 69)에 의해 분리된 상부(천장) 플레이트(top(ceiling) plate, 63), 중간 플레이트(middle plate, 65) 및 하부(바닥) 플레이트(bottom(floor) plate, 67)를 포함한다. 상부 플레이트(63), 제1 시트(69), 중간 플레이트(65), 제2 시트(69) 및 바닥 플레이트(67)는 나사형 홀들(threaded holes, 73)에 나사형 결합될 수 있는 나사들(71)에 의해 함께 고정된다. 플레이트들 및 시트들을 함께 클램핑하기 위한 다른 배열들이 사용될 수 있다. 포트들(ports, 75)은 다른 시스템 구성 요소들 사이에서 유체 연통을 제공한다. 일 예에서, 출구(21, 도 2a 및 2b)는 제1 (입구) 포트(first (inlet) port, 75)에 연결되고, 제2 (출구) 포트(second (outlet) port, 75)는 펌프(30, 도 1)에 연결된다.
도 2f, 도 2g 및 도 2h는 각각 플레이트들(63, 65, 67)을 도시한다. 보다 상세하게, 미세 채널(microchannel, 77)이 중간 플레이트(65)를 통해 절단된다. 관통 홀들(through holes, 79)은 나사들(71)을 수용하고 관통 홀들(81)은 입구/출구 포트들(75)에 맞도록 구성된다.
작동 중에, 미세 채널(77)을 통해 흐르는 유체는 유동을 원활하게 하기 위해 유동적이고 체적 변동을 수용할 수 있는 시트들(69) 사이에 끼워진다.
도 3은 상술한 바와 같은 시스 유동 구성을 지지할 수 있는 예시적인 전기 천공 어셈블리(16)의 평면도이다. 이 배열은 도 3의 삼분할 입구들(trifurcating inlets, 46a, 46b, 46c) 및 삼분할 출구들(trifurcating outlets, 46a', 46b', 46c')을 갖는 미세 유체 중앙 채널(microfluidic center channel, 46)을 포함한다.
미세 유체 채널(46)은 경질 플라스틱(많은 물질들에 대해 장치를 일회용으로 만드는)과 같은 기판(52)으로 제조될 수 있다. 예들은 사이클릭 올레핀 코폴리머(cyclic olefin copolymer, COC) 열가소성 수지, Kapton®과 같은 폴리이미드 필름, 폴리스티렌, Ultem®과 같은 PEI(폴리에테르이미드), 또는 다양한 폴리머들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유리, 석영, 실리콘, 적합한 세라믹 등과 같은 다른 물질들도 사용될 수 있다.
채널은 폭이 500 ㎛ 내지 3 mm, 길이가 1 cm 내지 5cm, 높이가 125 ㎛ 내지 500㎛인 크기를 가질 수 있다. 한 쌍의 공면 장사방형 전극들(coplanar rhomboid-shaped electrodes, 48a, 48b)은 외부 접근을 위해 전극들을 노출시키는 폴리머 층들의 컷 아웃들로 정의된 정사각형 와이어 본드 또는 솔더 패드 영역들을 사용하여 미세 채널의 바닥 아래의 폴리머 층에 패터닝된다. 마스킹 층은 전극 층과 미세 유체 채널(46) 사이에 배치되며, 컷 아웃들은 미세 채널 내의 유체에 노출되는 전극의 부분을 정의한다. 일반적으로, 전극들은 백금 금속(Pt)과 같이 전기 화학적으로 안정한 물질로 형성된다. 채널 내의 유체에 노출되는 전극들의 부분은 폭이 100 내지 250 μm 및 길이가 8 내지 45 mm인 크기를 가지며, 정사각형 솔더링 패드들(soldering pads, 50a 및 50b, 도 3)에 대한 연결을 통해 전기 함수 생성기(40)에 접속된다.
도 3과 같은 배열에서, 중앙 대 측면 스트림들의 상대 유속들이 튜닝될 수 있다. 일 예에서, 전극들이 오직 측면 스트림들과 접촉하도록 상대 유속이 조정된다. 총 유속은 375 μL/min에서 6 ml/min까지의 범위에 있다. 특정한 예들에서, 측면 스트림들 대 중앙 스트림의 유량비는 일반적으로 1:0.5 내지 1:1(단일 측면:중앙)의 범위에 있다. 중앙 스트림을 포함하는 용액의 전도성이 측면 스트림들을 포함하는 용액의 전도성보다 훨씬 낮을 때(예를 들어, 10배 이상), 중앙 스트림이 회로의 전기 저항을 지배하므로, 전극들에 전압이 인가될 때, 전압은 대부분 중앙 스트림을 통해 떨어진다.
전압(도 1의 전기 함수 생성기(40)로부터의 전압)은 정사각형 솔더링 패드들(50a, 50b)에 걸쳐 인가되고, 10 ns 내지 10 ms 범위의 주기를 갖는 사인파(sinusoids) 또는 펄스 폭이 10 ns 내지 10 ms인 펄스 트레인(pulse trains) 형태를 가질 수 있다. 인가된 전압의 크기는 중앙 스트림에 약 2 내지 1000 kV/m 범위의 전기장을 생성하고 10 ns 내지 10 ms 범위의 펄스 폭을 생성하도록 변할 수 있다. 펄스 트레인의 주파수도 변할 수 있으며, 예를 들어, 세포 체류 시간당 1 펄스 내지 체류 시간당 10 펄스 또는 그 이상의 범위가 될 수 있다.
도 3과 같은 배열은 다른 버퍼들의 사용을 지지할 수 있다. 특정한 실시예들에서, 시스 측면 스트림들은, 예를 들어, 약 1 내지 약 2 S/m 범위의 높은 전기 전도성(σ)을 특징으로 하는 반면, 중앙 시스 스트림은, 예를 들어, 10 내지 1000 μS/cm 범위 내의 낮은 σ를 갖는다. 이 접근법은 세포 배양에 적합한 버퍼들 및/또는 전기 천공에 적합한 버퍼들의 사용과 호환된다.
따라서, 일 실시예에서, 바람직한 버퍼에 있는 세포들은 중앙 시스 스트림(46c)을 통해 제공된다. 두 개의 측면 스트림들(46a, 46b)은 도 1의 펌프(34)에 의해 고전도성 배지 저장소(high conductivity media reservoir, 24)로부터 공급된다. 이러한 세포에 바람직한 버퍼는, 예를 들어, 약 10,000 내지 약 20,000 μS/cm 범위의 높은 σ를 갖는 것이 일반적이다.
낮은 σ의 전기 천공 버퍼는 중앙 스트림(46c)으로 흐르고 도 1의 펌프(32)에 의해 전기 천공 저장소(22)로부터 공급된다.
전기 천공 모듈(16, 도 3)에 들어가기 전에, 인큐베이터(12)로부터 나오는 세포들은 도 4a의 음향 배지 교환 모듈(acoustic media exchange module)의 측면 스트림 포트(110)로 흘러 들어가, 고전도성 측면 시스 스트림들로부터 낮은 σ의 전기 천공 버퍼 및 카고를 포함하는 중앙 스트림까지, 예를 들어 음향학적으로, 구동되거나 밀린다. 그 결과, 세포들은 중앙의 전기 천공 버퍼에서 현탁된다(그러면 모듈(16)의 중앙 스트림 포트(46c)로 전달됨). 하나의 버퍼에서 다른 버퍼로 세포들을 구동하기 위한 음향 에너지는 음향 함수 생성기(42)로부터 채널 기판(channel substrate, 152)에 부착된 음향 변환기(acoustic transducer, 154)로 공급된다.
전기 천공 작업(도 1 및 도 3의 전기 천공 어셈블리(16)에서 수행됨) 후, 카고를 포함하는 생성물 세포들은 중앙 스트림 내에 현탁 상태로 남아있을 수 있고, 출구(46c')로부터 수집될 수 있다. 출구들(46a', 46b')로부터 얻은 유체는 폐기물로 취급되거나 재활용된다. 다른 실시예들에서, 제2 버퍼 교환(도 1의 버퍼 교환기(18) 참조)은 카고를 포함하는 생성물 세포들을 중앙 스트림의 낮은 σ의 전기 천공 버퍼로부터 측면 스트림의 높은 σ의 유체로 이동시키기 위해 수행될 수 있다. 이 구성에서, 카고를 포함하는 생성물 세포들은 출구들(46a', 46b')에서 수집될 수 있다. 출구(46c')로부터의 유체는 폐기물로 취급되거나 재사용을 위해 수집 장치로 향하게 된다.
고전도성 세포 버퍼를 함유하는 시스 스트림들로부터 중앙 스트림 내에 흐르는 저전도성 전기 천공 버퍼로 세포들을 이동시키는 (제1) 버퍼 교환기(14)의 하나의 배열이 도 4a에 개략적으로 도시된다. 바람직한 배지, 즉 세포 버퍼내의 세포들은 세포 입구(110)를 통해 도입된다. 스트림은 펌프(30)에 의해 인큐베이터(12)로부터 공급된다. 입구로 입력되는 배지는 두 개의 세포 서브 채널들(cell subchannels, 110A, 110B)로 분기된다. 세포 서브 채널들(110A, 110B)은 y축 방향으로 서로 갈라진 후 양의 x축 방향으로 진행함에 따라 합쳐진다. 세포들은 시스 세포 버퍼 스트림들로부터 음향 포커싱 영역(acoustic focusing region, 119) 내의 중앙 전기 천공 버퍼 스트림으로 음향 구동된다. 전기 천공 버퍼는 펌프(32)에 의해 전기 천공 버퍼 저장소(22)로부터 공급된다. 음향 에너지는 음향 함수 생성기(42)로부터 채널 기판(152)에 부착된 음향 변환기(154)로 공급된다. 출력 세포들은 중앙 출구(121)로부터 수집되는 반면, 세포 버퍼는 출구들(123A, 123B)에서 폐기물로 수집되거나 재사용을 위해 수집 장치로 향하게 된다. 상술한 바와 같이, 하나의 구성에서, 출구(121)로부터의 출력 세포들은 도 3의 전기 천공 모듈(16)의 중앙 시스 스트림(46c)에 공급된다.
도 4b는 세포들의 전기 천공에 사용되는 2단계의 음향 구동 신속 버퍼 교환 시스템(rapd buffer exchange system, 100)을 도시하며, 이는 도 1에 설명된 제1 버퍼 교환기(14), 전기 천공 어셈블리(16) 및 제2 버퍼 교환기(18)의 기능들을 수행한다.
이 예는 두 개 이상의 연결된 미세 채널들(102, 104)을 포함한다. 일반적으로, 채널들은 경질 폴리머 기판 또는 폴리스티렌과 같은 기판들(108), 또는 실리콘, 유리 및 석영과 같은 다른 경질 기판들로부터 제조된다. 여기에서 프로토 타입 2-채널 시스템에 대해 설명하지만, 추가적인 채널들이 추가될 수 있다.
도시된 예에서, 각각의 미세 채널들(102, 104)은 별도의 기판(108-1, 108-2) 내에 제조된다.
각 미세 채널(102, 104)은 양측의 중앙 스트림(124) 및 스트림들(126)이 있는 시스 또는 공동 유동(co-flow)을 지지한다. 특정한 예들에서, 중앙 스트림(124)은 측면 스트림들(126)의 조성과 다른 조성을 갖는다. 유동은 층류 영역(laminar regime)에서 유지되고, 스트림들 간의 혼합이 최소화된다.
이러한 층류 유동(laminar flow)을 유지하기 위해, 중앙 스트림(124) 및 시스 또는 측면 스트림들(126)의 유체 속도들은, 수렴 영역(convergence region, 127) 내의 삼분할된 입구들의 영역 내에서, 시스템 내의 레이놀즈 수(Reynolds number, Re)가 작은 정도이다(Re<<~2000). 바람직하게는, Re는 500 미만이고, 더욱 바람직하게는 10 미만이다.
미세 채널들(102, 104)은 폭 및 높이가 100 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위인 크기를 갖는 직사각형 단면을 가질 수 있다. 각각의 미세 채널들(102, 104)의 길이는 5mm 내지 30mm의 범위이다.
그러나, 다른 실시예들도 가능하다. 다른 예는 시스 스트림(126)이 모든 측면들에서 중앙 스트림(124)을 둘러싸는 동심 유동 형상을 갖는다. 예를 들어, 입구 포트(110)와 같은 입력 영역에서 하나 이상의 시스 스트림들(126)로 초기에 도입된 세포들(10)과 같은 입자들은 직경이 100 nm 내지 25 ㎛ 범위일 수 있다. 예를 들어, 전기 천공 형질 주입의 일반적인 입자인 T 세포의 크기는 약 6 μm 내지 12 μm이다.
일 응용에서, 시스템(100)은 세포들을 특수 전기 천공 버퍼 안팎으로 빠르게 이동시키는 데 사용되며, 각 미세 채널은 두 개의 입구들(110, 112) 및 삼분할된 출구(114)를 갖는다. 전기 천공 버퍼는 입구(112)를 통해 제1 미세 채널(102) 내로 직접 도입되고, 중앙 스트림을 형성하거나 포함한다. 전기 천공 버퍼는 도 1의 펌프(32)에 의해 전기 천공 버퍼 저장소(22)로부터 공급된다. 바람직한 배지, 즉 세포 버퍼의 세포들은 세포 입구(110)를 통해 도입된다. 세포들은 펌프(30)에 의해 인큐베이터(12)로부터 공급된다. 입구로 입력되는 배지는 두 개의 세포 서브 채널들(110A, 110B)로 분기된다. 세포 서브 채널들(110A, 110B)은 y축 방향으로 서로 갈라진 후, 양의 x축 방향으로 진행함에 따라 합쳐진다.
세포 버퍼 및 전기 천공 버퍼는 일반적으로 세포들이 각각의 버퍼들에서 얼마나 오래 생존할 수 있는지의 정도가 서로 다르다. T 세포용 세포 버퍼의 예는 TexMACS(Miltenyi Biotec Inc. 판매) 또는 RPMI(Thermo Fisher Scientific Inc. 판매)이다. 이러한 세포 버퍼는 일반적으로 세포 삼투압 및 영양소와 일치하는 생리학적 염 농도를 갖는다. 한편, 전기 천공 버퍼의 예는 BTX 저전도성 버퍼(BTX 판매)이다. 이러한 전기 천공 버퍼는 일반적으로 전도성을 감소시키기 위해 더 낮은 염 농도를 갖지만 세포들에 대한 삼투 충격을 감소시키기 위해 당이 첨가된다.
세포 서브 채널들(110A, 110B)은 서브 채널(112A)로부터 흐르는 전기 천공 버퍼의 양측에서 서로를 향해 모여들며, 수렴 영역(127)에 삼분할된 입구를 생성한다. 이러한 방식으로, 모든 세 개의 서브 채널들(110A, 110B, 112A)은 그의 유동을 스위칭 채널(switching channel, 125)로 전달한다. 세포들을 포함하는 스트림들(126)의 유동은 유동의 두 측면 시스 스트림들로 중앙 스트림(124) 주위에서 모여든다.
제1 미세 채널(102)의 다른 말단에서, 스위칭 채널(125)은 발산 영역(divergence region, 129) 내의 두 개의 측면 출구 서브 채널들(side outlet subchannels, 130A, 130B)로 유동을 전달한다. 여기서, 서브 채널들(130A, 130B)은, x축 방향으로 진행하고 또한 중앙 출구 서브 채널(center outlet subchannel, 132)로부터 갈라짐에 따라, y축 방향으로 서로 갈라진다. 두 개의 측면 출구 서브 채널들(130A, 130B)은 원래의 시스 입력 스트림들(sheath input streams, 126)로부터 대부분의 유동을 운반하고 폐기물로서 배출되거나 재사용을 위해 수집된다.
중앙 출구 서브 채널(132)은 스위칭 채널의 중앙 스트림으로부터의 유동을 운반한다. 그것은 전기 천공 버퍼 내의 세포들(10)을 포함한다.
여기서, 층류 유동도 바람직하게 유지된다. 발산 영역(129) 내의 유체 속도들은, 발산 영역(129) 내의 삼분할된 출구들의 영역 내에서, 시스템 내의 레이놀즈 수(Re)가 작은 정도이다(Re<<~2000). 바람직하게는, Re는 500 미만이고, 더욱 바람직하게는 10 미만이다.
제1 미세 채널(102)의 중앙 출구 서브 채널(132)은 바람직하게는 별도의 기판(108-2) 내에 제조된 제2 미세 채널(104)의 입구(134)로 유동을 향하게 한다. 제2 미세 채널 입구(134)는 두 개의 세포 서브 채널들(134A, 134B)로 분기된다. 세포 서브 채널들(134A, 134B)은 y축 방향으로 서로 갈라진 후, 양의 x축 방향으로 진행함에 따라 다시 합쳐진다.
세포들의 바람직한 배지 또는 이차 배지(형질 주입될 다른 바이오 마커 또는 카고를 포함할 가능성이 있음)는 제2 미세 채널(104)의 다른 입구(116)로 도입된다. 이 배지는 도 1의 펌프(36)에 의해 세포 배지 저장소(26)로부터 공급된다. 전기 천공된 세포 서브 채널들(134A, 134B)은 양의 x축 방향으로 유동 배지를 운반하는 세포 버퍼 서브 채널(116A)의 양측에서 서로를 향해 모여든다.
전기 천공된 세포 서브 채널들(134A, 134B) 및 세포 버퍼 서브 채널(116A)은 그들의 유동을 제2 스위칭 채널(140)로 전달한다. 여기서, 세포들(10)은 측면 스트림들(162)로부터 제2 미세 채널(104)의 제2 스위칭 채널(140)의 중앙 스트림(160)으로 향하게 된다. 이전과 같이, 레이놀즈 수(Re)는 수렴 영역(127) 내의 삼분할된 입구들의 영역 내에서 작다(Re<<~2000). 바람직하게는, Re는 500 미만이고, 더욱 바람직하게는 10 미만이다.
세포들은 제2 미세 채널(104)의 중앙 출구 서브 채널(142)로부터 수집될 수 있다. 미세 채널(142)로부터 수집된 세포들은 도 1에 도시된 인큐베이터(20)로 전달된다. 스위칭 채널(140)의 단부 및 중앙 출구 서브 채널(142)의 양측에 있는 두 개의 측방 출구 서브 채널들(lateral outlet subchannels, 144A, 144B)은 유체를 폐기물 또는 재사용을 위한 수집 장치로 운반한다.
대안적으로, 원하는 버퍼 교환들의 수에 따라 세포들이 추가 미세 채널 등으로 향할 수 있다. 일반적인 입력 유속 범위는 1 μl/min 내지 1 ml/min이다.
일 예에서, 기판들(108-1, 108-2)은 시아노아크릴레이트 접착제(cyanoacrylate adhesive)를 사용하여, 별도의 납 지르코네이트 티타네이트 압전 변환기들(lead zirconate titanate piezoelectric transducers, 118-1, 118-2)에 결합되며, 미세 채널보다 짧다. 변환기들(118-1, 118-2)은 도 1에 도시된 음향 함수 생성기(42)의 별도의 드라이버들(150-1, 150-2)에 연결되고, 이에 의해 구동된다. 이들 각각은, 각각의 채널(102, 104)을 여기시키는 사인파 신호를 생성하는 함수 생성기에 의해 구동되는 무선 주파수 증폭기(radio frequency amplifier)를 포함한다. 이 장치 구성은, 안정된 정압파(standing pressure waver)가 각각의 스위칭 채널들(125, 140)의 폭을 가로 질러 생성되는, 900 내지 990 kHz 사이의 음향 공진 주파수를 지지하는 것으로 나타난다. 또한 바람직하게는, 변환기들 및 미세 채널 기판들은 히트 싱크(heat sink) 역할을 하는 알루미늄 플레이트들에 장착된다. 열전 냉각기(thermoelectric cooler, TEC) 요소 및 베이스 플레이트는 알루미늄 플레이트 아래에 있다. 서미스터(thermistor)는 TEC와 함께 TEC 컨트롤러에 연결된 미세 채널 근처의 변환기 상에 연결되어, 폐쇄 루프 온도 제어 시스템을 만든다. 온도는 바람직하게는 약 26 °C로 유지된다.
음향 분리기(acoustic isolator, 146)는 각각의 음향 변환기들(118-1, 118-2)로부터의 음향 에너지가 다른 미세 채널에 영향을 미치는 것을 방지한다. 이를 통해 두 개의 미세 채널들 간의 크로스 토크(cross-talk)를 방지하고, 개별적으로 구동 및 튜닝될 수 있다. 이 예에서, 분리는 별도의 기판들(108-1, 108-2) 내에서 미세 채널들(102, 104)을 제조한 후, 음향 크로스 토크를 피하기 위해 기판들을 가요성 튜브와 연결함으로써 달성된다.
이들 변환기들(118-1, 118-2)은 도 1의 음향 함수 생성기(42)의 별도의 드라이버들(150-1, 150-2)에 의해 작동된다. 이들 드라이버들 각각은, 예를 들어, 개별적으로 조정 가능한 사인파 변화 전압을 적용한다. 주파수는 각각의 미세 채널(102, 104)의 각 스위칭 채널(125, 140)의 폭을 가로 질러(유체 유동 방향을 가로질러) 안정된 정압파가 생성되도록 선택된다. 이러한 방식으로, 변환기들(118-1, 118-2)은, 도 4b의 2단계의 음향 구동 신속 버퍼 교환 시스템 내에서, 각각 (제1) 버퍼 교환기(14, 도 1) 및 제2 버퍼 교환기(18, 도 1)의 동작을 구동한다.
기본적인 포커싱 모드의 경우, 유체 내에 단일 압력 노드(single pressure node)가 있다. 음향 복사 압력(acoustic radiation pressure)은 압력 노드 방향으로 세포들에 힘을 가한다. 이로 인해 채널 단면의 중심선을 향해 측면 스트림들에서 중앙 스트림으로 세포들이 이동한다. 제1 미세 채널(102)에서, 이러한 동작은 세포들이 그들의 바람직한 버퍼로부터 전기 천공 버퍼로 이동하여 전기 천공되게 한다. 제2 미세 채널(104)에서, 이러한 동작은 세포들이 전기 천공 버퍼로부터 그들의 바람직한 버퍼 또는 새로운 버퍼로 다시 이동하게 한다. 이는 전기 천공 버퍼 내에서의 세포들의 체류 시간이 몇 초 이하가 되게 한다.
한 쌍의 전기 천공 전극들(120)은 도 4b의 2단계의 음향 구동 신속 버퍼 교환 시스템(100) 내에서 전기 천공 어셈블리(16, 도 1)의 동작을 구동한다. 전기 천공 전극들(120)은 제1 미세 채널(102)의 삼분할된 입구 및 삼분할된 출구 사이의 영역에 위치할 수 있고, 예를 들어, 삼분할 입구 및 삼분할 출구 사이의 중간 지점에 위치할 수 있다. 여러 개의 순차적 페이로드들이 필요한 여러 단계들의 전기 천공이 필요한 경우, 최종 미세 채널이 세포들을 바람직한 버퍼로 반환하는 한, 전극들은 2차 및 추가적인 미세 채널들 내에 제조될 수도 있다. 전극들(120)은 세포들이 스위칭 채널(125)의 중앙 스트림(124)에 있는 전기 천공 버퍼에 포커싱된 후에 전기 천공 필드를 통과하도록 배치된다. 전극들은 도 1에 도시된 전기 함수 생성기(40)에 의해 구동된다.
전극들(120)은 포토 리소그래피 공정을 사용하여 스위칭 채널(125)의 바닥 및 천장, 또는 채널(125)의 측벽들 상에 패터닝될 수 있다. 전극 영역(특히 채널의 유동 축(도 4b의 x축 방향)을 따른 관점에서) 및 유속은 전기장 내에서의 세포들의 체류 시간을 결정한다. 선택된 체류 시간들은 100 μs 내지 약 1 s까지 변할 수 있다. 대안적으로, 개방 포트들로부터 메인 채널로의 유체 연결들 및 포트들 내에 배치된 와이어 전극들(전극을 통과하는 패러데이 전류를 필요로 함)을 포함하는 "원격 전극들(remote electrodes)"이 사용될 수 있다. AC(예를 들어, 주기/펄스 폭이 10 ns 내지 100 s 범위의 마이크로초 단위인 사인파 또는 펄스 트레인) 또는 DC 전기장이 설정되고, 세포들이 장치를 통과하는 동안 활성 상태를 유지한다. 필드의 크기는 투과화를 달성하기에 충분한 값으로 특정람 세포 유형에 맞게 조정되며 일반적으로 2 내지 200 kV/m 범위이다.
카고는 입구(112)에서 제1 미세 채널(102)로 도입된 전기 천공 버퍼에 혼합될 수 있거나, 세포 입구(110)로 도입되는 바람직한 세포 버퍼 내의 세포들과 혼합될 수 있다. 전자는, 제2 미세 채널로의 이동 타이밍을 조정함으로써, 세포들이 카고에 노출되는 시간들의 튜닝을 가능하게 한다.
일부 실시예들에서, 개별적인 미세 채널들은 별도로 제조되고, 폴리머 튜브에 의해 유체적으로 연결되고, 독립적으로 음향 작동된다. 개별적인 미세 채널들은 동일한 기판 상에 제조되고 단일 압전 변환기를 사용하여 함께 작동될 수도 있다. 일부 실시예들에서, 세포들의 바람직한 배지를 포함하는 제1 미세 채널(102)로부터의 두 개의 측면 출구 서브 채널들(130A, 130B) 내의 "폐기물" 스트림들은 제2 미세 채널(104)의 입구(116)를 통해 중앙 스트림으로 향하게 되고 결합된다(제2 미세 채널의 중앙 스트림으로 직접 배지를 전달하는 제2 펌프 대신에). 일부 실시예들에서, 여러 순차적인 미세 채널 셋업들은 세포들 및 버퍼를 도입하여 처리량을 증가시키기 위한 매니폴드들과 병렬로 배치된다.
도 4c 및 도 4d는 신속 버퍼 교환 시스템(100)의 두 개의 대안적인 실시예들을 도시한다. 여기서, 복합 미세 채널(compound microchannel, 106) 내에서, 세포들은 전기 천공을 위해 중앙 스트림으로 포커싱된 후, 수집을 위해 외부 스트림으로 다시 포커싱된다(여기서는 "디 포커싱(de-focused)"으로 지칭됨).
보다 상세하게, 전기 천공 버퍼(도 1의 펌프(32)에 의해 전기 천공 버퍼 저장소(22)로부터 공급됨)는 입구(112)를 통해 복합 미세 채널(106)로 직접 도입되고, 도 4c에 도시된 바와 같이 시스 유동의 중앙 스트림을 포함한다. 바람직한 배지(도 1의 펌프(30)에 의해 인큐베이터(20)로부터 공급됨) 내에 있는 세포들은 세포 입구(110)를 통해 도입된다. 입구로 입력되는 배지는 두 개의 세포 서브 채널들(110A, 110B)로 분기된다. 세포 서브 채널들(110A, 110B)은 y축 방향으로 서로 갈라진 후, 양의 x축 방향으로 진행함에 따라 합쳐진다.
세포 서브 채널들(110A, 110B)은 전기 천공 버퍼 서브 채널(112A)의 양측에서 서로를 향해 모여들며, 삼분할된 입구를 생성한다. 이러한 방식으로, 서브 채널들(110A, 110B, 112A)은 그들의 유동을 복합 스위칭 채널(125)로 전달한다. 세포들을 포함하는 유동(126)은 이전 실시예들과 같이 유동의 두 측면 시스 스트림들로 중앙 스트림(124) 주위에서 모여든다.
제1 미세 채널(102)의 다른 말단에서, 스위칭 채널(125)은 두 개의 측면 출구 서브 채널들(130A, 130B)로 유동을 전달하며, 이는 x축 방향으로 진행함에 따라 y축 방향으로 서로 갈라진다. 두 개의 측면 출구 서브 채널들(130A, 130B)은 원래의 시스 스트림들(126)로부터 대부분의 유동을 운반하지만, 이 예에서, 세포들은 측면 출구 서브 채널들(130A, 130B)의 상류에 있는 시스 스트림들(126)로 이동된다.
긴 복합 스위칭 채널(125)은 삼분할된 입구로부터 x축을 따라 측정된 거리(L1)(예를 들어, 20 내지 40mm 범위)에서 채널의 양측 측면 상의 전기 천공 전극들(120)의 세트에 의해 두 개의 영역으로 분할된다. 채널은 420 내지 740 μm 범위의 폭(w)을 갖는다. 일반적으로 400 내지 1000 kHz 범위를 갖는 주파수(f1)에서의 음향 작동은 도 1의 음향 함수 생성기(42)에 의해 제공되고, 제1 드라이버(150-1)에 의해 제1 음향파 변환기들(118-1)에 적용되고, 전기 천공 전극들(120)의 상류에 있는 중앙의 저전도성 스트림으로 세포들을 구동하는 데 사용된다. 전극들(120)의 하류 영역에서, 예를 들어, 일반적으로 f1보다 1.5배 내지 2.5배만큼 큰 상이한 주파수(f2)(예를 들어, 도 1의 음향 함수 생성기(42)와 유사한 제2 음향 함수 생성기에 의해 제공됨)가 제2 드라이버(150-2)에 의해 중앙 스트림으로부터 세포들을 구동하는 데 사용되는 제2 음향파 변환기(118-2)에 적용된다.
미세 채널(102)의 말단에 있는 중앙 출구 서브 채널(132)은, 예를 들어, 폐기물 또는 재활용으로 스위칭 채널의 중앙 스트림으로부터 유동을 운반한다.
도 4c에서, 단일 음향 구동 주파수가 사용되지만, 전극들(120)의 하류 채널은 w1(전극들(120)의 상류 폭)보다 1.5배 내지 2.5배만큼 큰 폭(w2)을 갖는다. 이는 채널 내에서 음파들의 노드 구조를 변경하고, 세포들이 측면 스트림들에 대해 유사한 강제력을 갖도록 한다.
도 4c 및 도 4d의 두 실시예들에서, 유체 채널의 폭(w, w1, w2)에 대한 기판(108)의 폭(t)은 중요한 파라미터이다. 이는 550 내지 1050 μm이다.
또 다른 실시예에서, 미세 채널(들)은 미세 채널(들) 내에서 미세 입자들(또는 세포들)에 작용하는 음향 스탠딩 모드를 생성하기 위해 압전 변환기(또는 표면 음향파 변환기)의 맨위에 계속 위치한다. 그러나, 이 실시예는 유체 내에 전기장들을 생성하는 전기 천공 전극들의 세트를 사용하지 않는다. 예를 들어, 전기 천공 전극들이 없는 이러한 구성은 세포들을 "세척"하거나 한 배지에서 다른 배지로 세포들을 전달하는 데 유용한다. 이는 원심 분리기 내에서 미세 입자들(세포들)을 회전시키고, 상청액(supernatant)을 제거하고, 제2 버퍼를 추가하고, 미세 입자들를 재현탁하는 기존 방법에 대한 좋은 대안이 될 수 있다.
도 5a 및 도 5b는 음향 구동되는 신속 버퍼 교환을 보여주는 현미경 이미지들을 도시한다. 음향이 꺼지면(도 5a), 측면 스트림들의 세포들은 편향되지 않고 통과하여 그들의 버퍼 내에 남아 있다. 음향이 활성화되면(도 5b), 세포들은 측면 스트림들로부터 중앙 스트림으로 편향되며, 이는 다른 버퍼를 포함하거나 다른 시약들(reagents)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시예들에서, 도 1에 도시된 시스템은 도 3에 도시된 것과 같은 적어도 하나의 미세 채널 배열(장치)로 기본적으로 구성되거나 이를 포함하는 전기 천공 어셈블리(16)를 사용한다.
전기 천공 어셈블리는 또한 이하에서 추가로 설명되는 바와 같이 병렬 구성으로 둘 이상의(즉, 여러 개의 또는 다수의) 전기 천공 배열들을 포함할 수 있다. 이러한 어셈블리는 도 1에 도시된 고처리량, 고효율 연속 유동 시스템들에서뿐만 아니라, 기존의 수단들(예를 들어, 원심 분리 및 재현탁)을 사용하는 적절한 저전도성 전기 천공 버퍼에 로드된 세포들(또는 엑소좀 등과 같은 다른 표적들)의 형질 주입을 위한 유동 전기 천공 장치로서 다른 시스템들에서, 또는 독립적으로 사용될 수 있다. 이 구성에서 형질 주입된 세포들은 출력에서 수집되고, 수동적으로 배양 또는 저장 조건으로 돌아간다. 추가적인 실시예들은 음향 구동 버퍼 교환들을 사용하지 않는 시스템들 내의 병렬 채널들이 있는 전기 천공 어셈블리를 활용한다.
도 6은 도 8 내지 도 12에서 추가로 설명되는 여러 층들 또는 플레이트들(즉, 층들(210, 230, 250, 270, 290))을 포함하는 어셈블리(200)의 분해도이다. 층들은, 도 7(상면도) 및 도 8(하면도)에 도시된 바와 같이, 적층된 구성으로 라미네이트될 수 있다. 일 실시예에서, 라미네이트는 인접한 플레이트들 사이에 배치된 적합한 접착 필름을 경화시켜 제조된다.
도 9에 도시된 개별적인 층들로 돌아가면, 전극들(48a, 48b)에 대한 솔더 결합을 위한 접근을 제공하고 10 mm의 두께를 가질 수 있는 개구들(212)을 포함하는 층(210)이 도시된다. 일 예에서, 층(210)은 Ultem® 물질로 만들어진다.
도 10은 기본적으로 도 2b를 참조하여 설명된 바와 같이, 각각 중앙 및 측면 스트림들의 삼분할된 입구들 및 출구들과 미세 유체 중앙 채널(46)을 갖는 복수(4개가 도시됨)의 유체 미세 채널들을 포함하는 유체 채널 층(fluidic channel layer, 230)을 도시한다.
상술한 특정한 실시예는 4개의 평행한 유체 미세 채널들을 갖는다. 바람직한 배열에서, 이들은 단일 공통 인큐베이터(12)로부터 세포들을 처리하기 위해 병렬로 사용될 것이다. 병렬 미세 채널들의 사용은 분당 4백만 세포보다 높은 처리량과 같은 더 높은 처리량을 허용한다.
일반적으로, 전기장들이 몇 개 또는 심지어 단일 세포들에 걸쳐 최적으로 배치되기 때문에, 미세 채널들은 단순히 더 넓게 만들어질 수 없다. 따라서, 추가적인 실시예들에서, 더 많은 수의 병렬 유체 미세 채널들이 단일 어셈블리(200) 내에 제조된다. 일 실시예는 변형된 세포들을 공통 출력 인큐베이터(20)로 출력하는 입력 공통 인큐베이터(12) 사이에서 병렬로 작동되는 적어도 10, 20, 30, 40, 50개 또는 그 이상의 유체 미세 채널들을 포함한다.
보다 상세하게, 각각의 유체 미세 채널은 삼분할된 입구들(232a, 232b, 232c)와 삼분할된 출구들(232a', 232b', 232c')을 갖는다. 이러한 입구들/출구들에 삽입되고 에폭시로 밀봉된 피하 스테인리스 스틸 튜브(hypodermic stainless steel tubing)(예를 들어, 명목상으로 25 게이지 튜브, 0.4 인치 길이)는 세포들 및 유체들을 도입하는 장치에 대한 인터페이스로 기능할 수 있다. 플라스틱 튜브(예를 들어, 내경 0.38mm, 비닐)는 스테인리스 스틸 튜브 상에 압입될 수 있다. 도시된 바와 같이, 유체 미세 채널들은 병렬 구성으로 배열된다. 유체 채널 플레이트(230)는 약 10 mm의 두께를 가질 수 있으며, 예를 들어 Ultem®으로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 채널들, 특히 미세 유체 중앙 채널(46)은 층을 통해 슬롯들을 완전히 형성함으로써 유체 채널 층(230) 내에 제조된다. 슬롯들에 대해 다른 기술들이 사용될 수 있다. 현재의 실시예에서 슬롯들은 레이저 가공으로 형성된다. 몇 가지 예를 나열하자면, 다른 옵션은 기계 밀링 및 포토 리소그래피 공정들이다.
도 11에 도시된 층은 전극 슬롯들(또는 트렌치들)(254a, 254b)이 제공된 전극 프레임(electrode frame, 250)이다. 이러한 슬롯들은 상술한 제조 기술을 사용하여 전극 프레임(250)을 통해 완전히 형성된다. 슬롯들은 장사방형 전극들 각각의 근위(긴) 가장자리들과 미세 유체 중앙 채널(46)의 유체 사이의 유체 연통을 가능하게 한다. 전극 프레임은 Ultem® 또는 Kapton®으로 만들어질 수 있으며, 예를 들어 약 1 mm의 두께를 가질 수 있다. 적층 정렬 장부 맞춤 핀들(lamination alignment dowel pins)을 위해 홀들(256)이 제공된다.
도 12는 공면 장사방형 전극들(48a, 48b)의 쌍들을 형성하는 네 쌍의 장사방형 금속화들(metalizations, 272a, 272b)을 포함하는 전극 층(270)을 도시한다. 금속화들은, 예를 들어, 5 mm의 Ultem® 필름 상에 전기 화학적으로 안정한 물질인 백금 금속을 증착(예를 들어, 섀도우 마스크를 통한 스퍼터링)하여 제조될 수 있다. 기점 마커들(fiducial markers, 274)은 전극 층의 제조에 사용되는 증착 마스크의 정렬을 위해 제공된다.
예를 들어 3/32" 두께의 Ultem® 물질로 만들어지고 삼분할된 입구들(46a, 46b, 46c, 도 2b 및 도 9)에 접근하는 개구들(292a, 292b, 292c) 및 삼분할된 출구들(46a', 46b', 46c', 도 2b 및 도 10)에 접근하는 개구들(292a', 292b', 292c')이 제공된 포트 플레이트(290)가 도 13에 도시된다. 이들 개구들은 도 5에 도시된 튜브들(300)을 수용할 수 있는 크기를 갖는다. 상술한 바와 같이, 피하 스테인리스 스틸 튜브(예를 들어, 명목상으로 25 게이지 튜브, 0.4 인치 길이)는 이들 개구들을 통해 삽입되고, 미세 채널들의 입구들/출구들에 연결되고, 에폭시로 밀봉되어 세포들 및 유체들을 도입하는 장치에 대한 인터페이스를 형성할 수 있다. 적합한 게이지 플라스틱 튜브가 스테인리스 스틸 튜브 상에 압입될 수 있다.
조립 및 제조 동안 적절한 배향을 위해, 플레이트들(210, 230, 250, 270, 290)은 챔버(297)에 의해 표시될 수 있다. 플레이트들은 바람직하게는 서로 접착된다. 일 예에서, R/flex 1000 시트들과 같은 접착 필름은 레이저 가공 전에 일부 플레이트들에 부착된다. 이후 접착 시트들은, 예를 들어, 고온 및 압력으로 경화된다.
예를 들어, 도 2 내지 도 4d 및 도 6 내지 도 13을 참조하여 상술한 서브 어셈블리들 중 하나 이상을 선택적으로 포함하는 시스템(10, 도 1)과 같은 시스템은 다음과 같이 동작할 수 있다. 혈액 주머니와 같은 세포 용기는 제1 인큐베이터(12)에 도입되고 세포들이 퇴적 작용(sedimentation)으로 인해 침전하는 것을 방지하는 교반 메커니즘에 부착된다. 실라스틱 튜브는 혈액 주머니와 제1 신속 버퍼 교환 모듈 사이에 유체 연결을 만들고, 연동 펌프(30)는 세포들의 유동을 버퍼 교환 장치로 구동한다. 버퍼 교환 장치의 입구에서, 유동은 시스 유동의 외부 스트림들을 형성하도록 분기된다. 제2 펌프(32)(예를 들어, 주사기 펌프)는 저장소(22)로부터 버퍼 교환 장치 내의 시스 유동의 중앙 스트림으로 카고를 포함하는 전기 천공 버퍼의 유동을 구동하여, 세포들(mRNA, pDNA, RNP 등)로 전달한다. 장치에 부착된 음향 함수 생성기(42)에 의해 구동되는 압전 액추에이터에 의해 구동되는 음향 필드는 외부 스트림들로부터 중앙 스트림으로, 카고를 포함하는 저전도성 전기 천공 버퍼로 세포들을 구동한다. 이후 전체적인 시스 유동은 유동 전기 천공 모듈(버퍼 교환 장치에 직접적으로 통합될 수 있음)로 전달되며, 여기서 외부 스트림들과 접촉하는 전극들에 에너지를 공급하여 세포들을 전기장들에 노출시킨다. 다른 배열들에서, 전기 천공 장치로 전달되는 것은 중앙 스트림 뿐이며, 새로운 고전도성 버퍼가 측면 스트림들에 도입된다. 이후 외부 스트림들은 폐기물로 흐르고 중앙 스트림은 제2 버퍼 교환 장치로 도입된다. 제2 버퍼 교환 장치의 입구에서, 전기 천공 모듈에서 나오는 유동이 분기되어 시스 유동의 외부 스트림들을 형성한다. 펌프(36)(예를 들어, 주사기 펌프)는 세포 배지 저장소(26)로부터 세포 배양 또는 회복 버퍼를 제2 신속 버퍼 교환 장치로 펌핑하여 시스 유동의 중앙을 형성한다. 이후 음향 함수 생성기(42)에 의해 구동되는 압전 액추에이터에 의해 구동되는 음향 필드는 외부 스트림들로부터 중앙 스트림으로 세포들을 구동하여, 이들을 제1 인큐베이터 내의 혈액 주머니 내의 초기 버퍼와 같거나 다를 수 있는 배양 버퍼로 되돌린다. 이후 세포들은 제2 배양 챔버(20)의 수집 용기로 흐른다.
투과화된 세포들로의 페이로드 전달을 촉진하거나 향상시키기 위해, 음향 에너지를 인가하면(예를 들어, 초음파 처리기(sonicator)를 사용하여) 세포들과 카고 물질 사이의 충돌이 증가하여 세포와 카고 물질을 가까이 근접시켜 카고를 세포들 내에 적재하는 확률을 높일 수 있다. 세포들과 카고 사이의 충돌 비율 증가는 기계적 교반 또는 기타 적절한 수단들을 사용하여 얻을 수도 있다. 이는 음향 버퍼 교환 모듈들에서 자연스럽게 발생하지만, 추가적인 음향 교반이 도 3에 도시된 유동 전기 천공 장치에 추가될 수 있다(예를 들어, 장치의 외부에 결합된 압전 변환기를 사용하여).
일부 실시예들은 세포들이 인큐베이터 내의 배양 버퍼로 복귀하기 전에 발생하는 다중 버퍼 교환들 및/또는 다중 전달 이벤트들(다중 전기 천공 동작들)을 제공한다. 이는 추가적인 버퍼 교환 모듈들, 유동 전기 천공 모듈들 및 펌프들을 필요로 할 수 있다. 전기 천공 버퍼(들)로의 세포들의 다양한 전달, 전기 천공, 및 전기 천공 버퍼(들)로부터 세포들을 적절한 세포 배양 버퍼로 다시 전달하는 것 중 적어도 일부는 단일 모듈로 통합될 수 있다.
많은 실시예들에서, 시스템(10) 내에서 수행되는 공정들은 연속적인 방식으로 수행된다. 시스템은 모듈식이 될 수 있기 때문에, 애플리케이션에 따라 맞춤화할 수 있다. 예를 들어, 일부 공정들은 단일 버퍼 교환만 필요로 하는 반면, 다른 공정들은 여러 페이로드들을 순차적으로 전달하는 여러 개의 순차적 버퍼 교환들 및 여러 전기 천공 이벤트들을 필요로 할 수 있다.
또 다른 실시예들에서, 세포들 및/또는 시약들은 다중 통과를 위해 재순환된다.
본 명세서에 개시된 원리는 또한 세포들 또는 다른 막 결합 구조들에 보유된 일부 또는 모든 내용물들을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 즉, 구멍을 열고 내부 내용물들이 수동적으로 또는 능동적인 힘을 통해 확산되도록 한다.
기존의 대량 전기 천공 기술들과 마찬가지로, 본 명세서에 개시된 유동 배열은 작은 집단들 내에서의 세포들의 전기 천공과 호환 가능하다. 그러나 이는 시간 집약적이고 노동 집약적이며 대규모 공정에서는 다루기 어려울 것이다.
본 명세서에 개시된 장비 및 기술들은 처리량을 증가시키고(및/또는 전달시키거나) 카고가 세포들 또는 다른 막 결합 구조들로 전달되는 효율성을 향상시킬 수 있다. 상술한 바와 같이, 전기 천공 공정의 전, 중 및 후에 세포들을 보호하기 위해 다양한 조치가 취해져 세포 생존성이 향상된다.
따라서, 일부 실시예들에서, 세포 전기 천공은 적어도 분당 4백만 세포의 속도로 처리되는 처리량, 예를 들어 분당 약 4백만 내지 약 5천만 세포 범위의 처리량으로 수행될 수 있다. mRNA와 같은 유전적 카고에 대한 1차 인간 T 세포에 대한 형질 주입 효율은, 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 측정된 형광 리포터 단백질의 발현에 의해 보여지는 바와 같이, 약 65% 내지 약 90% 범위 내에서, 90%(세포 생존성이 5% 미만 감소)까지 높을 수 있다. 일부 경우에, 카고 농도를 높이고, 세포들과 카고 사이의 충돌을 촉진하고, 전기장 선량(dose)을 늘리고(잠재적으로 생존성을 희생하여) 전기 천공 버퍼를 최적화함으로써, 카고를 세포들로 전달하는 효율성을 높일 수 있다.
예를 들어, 유세포 분석에 의해 측정된 세포 생존성은, 예를 들어, 약 80% 내지 약 95% 범위 내에서, 초기 세포 생존성의 95%만큼 높을 수 있다.
본 명세서에 개시된 특징들은 확장된, 상업적 제조 목표들과 일치하므로, 본 명세서에 개시된 실시예들은 많은 응용 분야들을 찾을 수 있다. 예들은 자가 유래(autologous) 또는 동종 유래(allogeneic) CAR-T, 동종 유래 또는 자가 유래 TCR, TRnC 세포들, 변형된 TIL, CAR-NKT, CAR-NK, CAR-Mac, CAR-CIK 또는 변형된 감마 델타 세포들의 생산을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 명세서에 개시된 특징들은 또한 카고가 적재된 엑소좀들을 조작하거나, 유전 질환들 또는 기능 이상들을 치료하기 위해 유전자 변형 줄기 또는 현탁 세포를 생산하는 데 사용될 수 있다.
하나의 예시적인 응용은 세포 요법 제조에 관한 것이다.
입양 세포 전달(adoptive cell transfer) 기반 면역 요법들의 최근 개발은 개선된 세포 바이오 프로세싱 및 유전자 전달 기술들에 대한 수요를 증가시켰다. 예를 들어, FDA는 특정한 혈액 암 치료를 위해 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 유전자들을 발현하도록 변형된 T 세포의 사용을 승인했다. 그러나, CAR T 세포 기반 치료제의 제조 체인에는 현재 유전자 전달을 위한 렌티 바이러스 기반 형질 도입(transduction)이 포함된다. 이러한 벡터들은 복잡하고 제조 비용이 많이 들고 페이로드 용량이 제한적이다. 제어되지 않은 방식으로 유전자 정보를 게놈에 통합하기 때문에, 이 접근법은 안전 문제도 나타낸다.
이러한 문제들 중 일부를 해결하기 위해, 세포 요법 제조를 위한 1차 인간 T 세포들의 전기 형질 주입에 있어 본 명세서에 개시된 실시예들을 사용하는 타당성을 조사하기 위해, 후술하는 비제한적인 실험들이 수행되었다.
[실험례]
실험들은 도 6 내지 도 13을 참조하여 상술한 것과 같은 어셈블리를 사용하여 수행되었다.
보다 상세하게, 어셈블리는 가공된 얇은 폴리머 층들의 스택을 함께 적층하여 구성되었다. 이후 폴리에테르이미드(PEI) 시트들은 기존의 CNC 밀링 머신 또는 자외선 레이저 커터 상에서 가공되었다. 각 층은 접착제 층으로 뒷받침된다.
개념의 증명하기 위해 사용된 배열은 단순화되었으며 버퍼 교환 기능을 포함시키지 않았다. 오히려, 1차 인간 T 세포 및 mCherry-인코딩 mRNA(CleanCap mCherry mRNA, TriLink Biotechnologies, San Diego, CA)를 포함하는 저전도성 전기 천공 버퍼를 중앙 입구(도 3의 입구(46c))를 통해 유도함으로써 유체 역학적 미세 유체 시스 유동 구성이 설정되었다. 두 개의 측면 입구들(도 3의 46a, 46b)을 통해 고전도성 배양 버퍼가 공급되었다.
세포들 및 배지는 각각 상류 및 하류 말단의 포트들을 통해 미세 채널로 들어오고 나갔다. 스테인리스 스틸(SS) 튜브가 삽입되었고, 유체 입구들 및 출구들이 에폭시 처리되었다. 각 입구와 출구는 안정된 시스 유동 구성의 생성을 허용하는 삼분할 설계를 가졌으며, 여기서 세포들은 저전도성 배지 내에서 중앙 입구로 들어가고 고전도성 버퍼가 중앙 유동을 둘러싸는 양측 입구들에서 도입되었다. 채널 바닥 상에 스퍼터 증착된 금속 전극들은 납땜된 와이어 리드들로 외부 제어 회로에 연결되었다. 패터닝된 전극들은 직사각형 구조를 가졌으며 시스 유체와만 접촉하도록 배치되었다. 이 배열은 저전도성 배지의 폭을 가로질러 전기장의 집중을 촉진하고(고전도성 버퍼를 가로지르는 무시할 수 있는 전압 강하), 세포들이 전극들 및 채널의 측벽들과 물리적으로 접촉하는 것을 방지했다. 이는 세포 회복과 생존성을 촉진하는 것으로 믿어졌다.
전기장 펄스 크기, 펄스 지속 시간 및 인가된 펄스 수가 1차 인간 T 세포들로의 mRNA의 형질 주입 효율, 및 세포 생존성 및 전체적인 세포 회복에 수반되는 변화들에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 실험들이 수행되었다. 더 높은 전기장 펄스 크기와 더 긴 노출 시간은 형질 주입 효율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 한 세트의 데이터에 따르면 67 kV/m 이하의 필드 크기에 대해서는 형질 주입이 관찰되지 않았다. 형질 주입 효율은 102 kV/m에서 시작하는 모든 경우에서 필드 크기가 증가함에 따라 증가했다. 이는 이 특정한 장치 내에서 mRNA를 1차 인간 T 세포로 형질 주입시키기 위해 67 kV/m에서 102 kV/m 사이의 임계 전기장 크기를 시사했다.
일반적으로, 데이터는 연속적인 유동 배열로 세포들을 전기 천공하는 것이 가능함을 보여주었다. mRNA 전달 24시간 후, 형광 리포터(mCherry)의 발현으로 측정된 바와 같이, 72%의 전기 천공 효율을 달성하면서 최대 분당 8x106개의 1차 세포들의 처리량을 처리할 수 있다. 세포 생존성은 전기 천공 공정에 의해 9%만 감소하는 것으로 관찰되었으며 세포들의 전체 시스템 회수율은 61%였다.
특정한 실시예들에서, 1차 인간 T 세포들은 0, 15 또는 60분 동안 BTX 전기 천공 배지 내에서 유지된 후, 상업적 대량 전기 천공 시스템을 사용하여 전기 천공되었다. 도 14a 및 도 14b에 도시되는 데이터는 3명의 독립적이고 건강한 공여자들로부터 복제된 평균을 보여준다. 오차 막대들은 평균의 표준 오차를 나타낸다. 도 14a에서 볼 수 있듯이, 전기 천공 후 24시간 동안 유세포 분석에 의해 측정된 형질 주입 효율은 T 세포가 mRNA와 함께 BTXpress 배지에 15분 동안 유지될 때 감소하고 유지 시간이 60분으로 증가하면 더 감소된다.
전기 천공 24시간 후 유세포 분석에 의해 측정된 형질 주입 후 생존성(도 14b)은 유지 시간이 증가함에 따라 감소했지만, 그 감소는 통계적으로 유의미하지 않았다.
도 15는 본 발명의 실시예들에 따라 연속 유동으로 유사하게 전기 천공된 두 개의 상이한 공여자들로부터 수득된 세포들에 대한 생존성 및 형질 주입 효율(세포들의 백분율)을 보여준다.
본 발명은 특히 그 바람직한 실시예들을 참조하여 도시되고 설명되었지만, 첨부된 청구항들에 포함된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음은 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해될 것이다.

Claims (20)

  1. 페이로드를 세포에 도입하는 방법에 있어서,
    제1 인큐베이터로부터 다수의 미세 유체 장치들을 포함하는 어셈블리로 세포들을 향하게 하는 것;
    세포 배양 배지로부터 전기 천공 배지로 세포들을 구동하는 것;
    상기 전기 천공 배지가 중앙 스트림 내에서 흐르는 시스 유동 구성으로 상기 전기 천공 배지 내의 세포들에 전기장을 인가하는 것; 및
    상기 페이로드를 상기 세포들로 전달하는 것 또는 전달되도록 하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 페이로드를 포함하는 세포들을 전기 천공 유체로부터 세포 배양 유체로 구동하는 것을 더 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 페이로드를 포함하는 세포들을 제2 인큐베이터에 저장하는 것을 더 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    진단, 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 상기 페이로드를 포함하는 세포들을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  5. 면역 요법용 세포들을 제조하는 방법에 있어서,
    세포들을 제1 버퍼로부터 전기 천공 버퍼로 전달하는 것으로서, 상기 제1 버퍼는 세포 배양 배지인 것;
    전기 천공에 의해 상기 세포들을 투과화시키는 것;
    페이로드가 상기 투과화된 세포들로 전달되도록 하는 것; 및
    상기 페이로드를 포함하는 상기 세포들을 제2 버퍼로 전달하는 것을 포함하되,
    상기 방법은 자동 연속 유동 모드에서 수행되고,
    처리량은 적어도 분당 4백만 개 이상의 세포인 방법.
  6. 카고를 세포들로 자동 연속 유동 전달하기 위한 시스템에 있어서,
    세포들을 저장하는 제1 인큐베이터;
    병렬 구성으로 배치된 다중 미세 유체 채널들을 지지하는 층을 포함하는 전기 천공 어셈블리;
    세포 배양 배지로부터 전기 천공 배지로 세포들을 구동하는 제1 버퍼 교환기;
    상기 전기 천공 배지로부터 배양 배지로 세포들을 구동하는 제2 버퍼 교환기; 및
    컨트롤러를 포함하는 시스템.
  7. 제 6 항에 있어서,
    전기 천공 버퍼를 상기 전기 천공 어셈블리로 전달하는 것, 세포들을 상기 제1 버퍼 교환기로 전달하는 것 및/또는 상기 제2 버퍼 교환기로부터 제2 인큐베이터로 세포들을 전달하는 것을 위한 펌프 시스템을 더 포함하는 시스템.
  8. 제 6 항에 있어서,
    각각의 미세 유체 채널은 삼분할된 입구들 및 출구들을 갖는 시스템.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 전기 천공 어셈블리는 전극 층을 더 포함하는 시스템.
  10. 제 6 항에 있어서,
    각각의 미세 유체 채널은 중앙 스트림 및 측면 시스 스트림들을 지지하도록 구성되는 시스템.
  11. 병렬 구성으로 배열된 적어도 두 개의 미세 유체 채널들을 포함하는 채널 층;
    각 미세 유체 채널을 위한 한 쌍의 전극들을 포함하는 전극 층; 및
    상기 미세 유체 채널들의 삼분할된 입구들 및 출구들로의 유체 연결을 위한 포트 층을 포함하되,
    상기 층들은 라미네이트 구성으로 적층되는 전기 천공 어셈블리.
  12. 제 11 항에 있어서,
    윈도우 층 및/또는 전극 프레임 층을 더 포함하는 전기 천공 어셈블리.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 층들은 서로 접착되는 전기 천공 어셈블리.
  14. 제 11 항의 상기 전기 천공 어셈블리를 사용하여 카고를 세포들로 전달하는 방법.
  15. 카고를 세포들로 대량 전달하기 위한 시스템에 있어서,
    상기 세포들을 원하는 온도로 유지하는 인큐베이터;
    상기 세포들이 상기 인큐베이터 내에 침전되는 것을 방지하는 교반 장치;
    상기 세포들을 전기 천공 버퍼로 이동시키는 버퍼 교환기;
    상기 카고를 전달하기 위해, 전기 천공 버퍼 내에서 상기 세포들을 전기 천공하는 유동 전기 천공 장치; 및
    상기 유동 전기 천공 장치로부터 상기 세포들을 수용하는 인큐베이터를 포함하는 시스템.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 교반 장치는 세포 저장소 내의 임펠러를 포함하는 시스템.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 인큐베이터 및 상기 버퍼 교환기 사이의 펌프를 더 포함하는 시스템.
  18. 제 17 항에 있어서,
    전기 천공 버퍼를 상기 버퍼 교환기로 유동시키는 펌프를 더 포함하는 시스템.
  19. 제 15 항에 있어서,
    상기 인큐베이터 및 상기 버퍼 교환기 사이의 유체 커패시터를 더 포함하는 시스템.
  20. 제 15 항에 있어서,
    상기 버퍼 교환기 내에서 버퍼 교환을 구동하는 음향 변환기 및 음향 드라이버를 더 포함하는 시스템.
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