CN118159641A - 电穿孔设备和细胞转染方法 - Google Patents

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Abstract

提供了使用具有电穿孔室的电穿孔器具转染细胞，例如哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞的系统和方法，该电穿孔室包括第一电极、第二电极和在该电穿孔室中限定的路径。该电穿孔器具包括允许细胞和货物通过进入该电穿孔室的第一输入以及允许来自该电穿孔室的经电穿孔的细胞通过的第一输出。

Description

电穿孔设备和细胞转染方法
相关申请的交叉引用
本申请是PCT国际申请，要求2021年10月28日提交的美国专利申请序列号17/513,007的权益和优先权，该美国专利申请序列号17/513,007是2020年7月8日提交的美国专利申请序列号16/923,606的部分继续申请，美国专利申请序列号16/923,606是2019年7月9日提交的美国专利申请序列号16/506,190的部分继续申请，美国专利申请序列号16/506,190要求2018年7月9日提交的美国临时专利申请序列号62/695,436的权益。上述每个申请的全部披露内容均通过引用并入本文。
技术领域
本发明的领域涉及转染系统和方法，尤其涉及电穿孔系统和方法。
背景技术
背景描述包括可用于理解本文中呈现的方法和技术的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与本文呈现的主题相关，也不承认具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
转染可用于将核酸引入细胞以产生基因修饰的细胞。存在用于转染细胞的多种物理、化学和病毒方法，包括光电穿孔、利用磷酸钙的基于聚合物的方法、显微注射、电穿孔、病毒转导和脂质介导的方法(例如，使用脂质体-DNA复合物)。
电穿孔涉及在相对短的持续时间内向细胞施加受控的直流(DC)电脉冲。电脉冲被认为引起跨膜电位，该跨膜电位引起细胞膜的有序结构的可逆破坏，从而导致在膜中形成孔。然后，目的分子可以通过孔进入细胞，直到孔关闭，这典型地在几毫秒到几秒钟内。孔的形成可以通过调节各种参数来控制，尤其是间隙宽度(例如，平行电极板之间的距离)、电脉冲波形、电场强度、温度和电脉冲长度。
电穿孔通常以实验室规模使用(例如，使用容量为约0.5mL的小比色杯)，但是由于缺乏效率和成本高，这种基于实验室的技术不适合大规模临床级生产。也经常使用其他转染方法，比如使用Lipofectamine 2000TM的基于脂质的技术，但其由于成本高而具有类似的缺点。另外，基于脂质的方法不适用于一些临床目的的细胞类型，例如NK细胞，比如haNK。已使用mRNA和电穿孔对NK细胞进行了转染，例如，以便遗传操纵原代NK细胞以表达嵌合抗原受体(CAR-参见Leuk Res.[白血病研究](2009)33：1255-9)或表达用于自分泌型生长刺激的细胞因子(Cytotherapy[细胞疗法](2008)10：265-74)。虽然存在用于大规模转染(例如，反应体积大于1mL)的商业产品(比如Maxcyte)，但这些产品也很昂贵和/或缺乏高通量能力。类似地，这些商业产品对于转染NK细胞不是最佳的，通常导致产率低和/或细胞活率低的问题。典型的电穿孔速率可产生2％-5％的DNA转染效率，其中细胞活率为约10％-20％。
使用常规技术，如图1A所示，可以使用两个平行板电极进行电穿孔。在这种构造中，细胞典型地在两个平行板之间流动。但是，电场是不均匀的，室的中部的细胞(如(a)所示)经历更均匀的电场，而电极附近的细胞(如(b)所示)则经历不均匀的电场并且尤其经历电极边界处存在的电场尖峰。其他技术利用微网电极的平行板，如图1B所示(Selmeczi，D.等人，“Efficient large volume electroporation of dendritic cells throughmicrometer scale manipulation of flow in a disposable polymer chip[通过微米级处理一次性聚合物芯片中的流动，有效地进行树突状细胞的大量电穿孔]，”BiomedMicrodevices[生物医学微型设备]，13：383-392(2011))，其中细胞穿过上微网电极和下微网电极。尽管与通过两个平行电极板之间相比，此技术提供更均匀的电场(如室(a)中部和室(b)边界附近的细胞的相似轨迹所示)，但上微网电极和下微网电极之间的室宽度或距离受到限制，导致转染效率低。图1A和1B中所示的构造利用了约1-1.3kV/cm的电场强度(例如，对于平行板为200V/2mm，对于平行微网电极为40V/400um)。
在其他方面，单细胞电穿孔芯片已用于转染。在该技术中，硅芯片可以包含多个线性通道，每个通道具有放置在通道的相对侧上的相对的电极。细胞穿过通道并暴露于电场中。通过这种类型的技术，已经实现了约68％的DNA转染效率和约79％的细胞活率。
尽管存在用于哺乳动物细胞的多种转染系统和方法，但是这类技术具有一个或多个缺点。因此，仍然需要提供改进的电穿孔系统和方法，特别是对于高通量大规模的制造过程。
发明内容
本文呈现的技术针对用于细胞比如哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞的电穿孔的各种设备、系统和方法，例如，用于大规模连续制造过程。特别地，使用电穿孔器具进行细胞电穿孔的系统和方法可以提供高效率和活率，该电穿孔器具包括与第一输出分开偏移距离的第一输入。
在一些方面，提供了一种在有货物情况下电穿孔细胞的方法。该方法包括使细胞与货物一起流入电穿孔室。电穿孔室包括第一电极、第二电极、允许细胞和货物通过进入电穿孔室的第一输入、允许来自电穿孔室的经电穿孔的细胞通过的第一输出、以及在第一电极和第二电极之间的在其中具有限定的路径的流体通道区域，以使细胞和货物流动。进一步地，将细胞悬浮在电穿孔介质中，并且可以具有约1x106细胞/ml至约500x106细胞/ml的细胞密度。该方法进一步包括向电穿孔室内的细胞施加多个电脉冲，其中：(i)每个电脉冲具有指数放电波形或方波形的形式，(ii)以约0.3kV/cm至约3kV/cm的场强施加多个电脉冲；(iii)以约15V至约100V的电压施加场强；(iv)每个电脉冲之间的持续时间是约0.1秒至约10秒；以及(v)每个电脉冲具有约10μs至约10,000μs的脉冲宽度。
在另一方面，提供了一种在有货物情况下电穿孔细胞的器具。所述器具包括一个或多个电穿孔室。每个电穿孔室包括第一电极、第二电极、允许细胞和货物通过进入电穿孔室的第一输入、允许来自电穿孔室的经电穿孔的细胞通过的第一输出、以及在第一电极和第二电极之间的在其中具有限定的路径的流体通道区域，以使细胞和货物流动。
在另一方面，提供了用于细胞转染的试剂盒。试剂盒包括如本文所述的用于电穿孔的器具，用于容纳用于转染的细胞、和货物的第一容器，用于容纳经电穿孔的细胞的第二容器，用于将第一容器和第二容器流体连接至用于电穿孔细胞的器具的管道，以及任选的试剂(比如用于转染的细胞、电穿孔介质、或其组合)。
根据优选实施方案的以下详细描述以及附图(其中相同的附图标记表示相同的部件)，本文描述的主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加清楚。
附图说明
专利或申请文件包含至少一张彩色附图。本专利或专利申请公开的带有一个或多个彩色附图的副本将根据要求并且并支付必要的费用后由官方提供。
图1A和1B示出了常规的电穿孔设备，其包括平行板电极(如图1A所示)和微网电极，其中在输入和输出之间没有偏移(如图1B所示)。
图2A和2B示出了根据本文提供的一些实施方案的用于电穿孔的器具的方面。
图2C示出了根据本文提供的一些实施方案的第一电极和第二电极的方面。
图2D是根据本文提供的一些实施方案的用于产生电脉冲并将电脉冲提供给电穿孔器具中的细胞的器具的框图。
图2E是根据本文提供的一些实施方案的用于产生电脉冲并将电脉冲提供给如本文所述的电穿孔器具中的细胞的另一器具的框图。
图3A-3D示出了包括根据本文提供的一些实施方案的电穿孔设备的用于电穿孔的器具的方面。图3A示出了输入输出室偏移电穿孔设备的结构的图示。图3B示出了输入输出室偏移电穿孔设备的电场的图示。图3C示出了电场强度与通过输入输出室偏移电穿孔设备的细胞行进距离的关系。图3D示出了根据本文提供的一些实施方案的电穿孔器具的替代构造。
图3E-3G示出了根据本文提供的一些实施方案的电穿孔室中的路径的方面。
图3H-3J示出了根据本文提供的一些实施方案的电穿孔器具的替代构造。
图3K-3L示出了根据本文提供的一些实施方案的用于分选细胞的示例性微流体室。
图3M-3S是示出根据本文提供的一些实施方案的微流体室内的柱的几何形状和位置的各个方面的图示。
图3T示出了根据本文提供的一些实施方案的用于更换缓冲液的示例性微流体室。
图3U示出了根据本文提供的一些实施方案的示例性微流体设备，其具有两个分开的室，一个室用于细胞分选，并且另一个室用于缓冲液更换。
图3V和3W示出了根据本文提供的一些实施方案的电穿孔器具的替代构造。
图3X示出了包括根据本文提供的一些实施方案的电穿孔器具的电穿孔系统的模块化构造。
图4示出了与根据本文提供的一些实施方案的室偏移电穿孔设备相关的参数表。
图5示出了根据本文提供的一些实施方案，可施加至流动通过室偏移电穿孔设备的细胞的流体流动波形(泵)和电波形(刺激)的实例。
图6示出了适于与根据本文提供的一些实施方案的室偏移电穿孔设备一起使用的由不同材料形成的微网的各种实例。
图7A-7E示出了使用本文描述的方法和设备的针对haNK细胞和相应参数的电穿孔实验的结果。
图8A-8D示出了使用本文描述的方法和设备的针对haNK细胞和相应参数的电穿孔实验的另外结果。
图9A-9D示出了使用本文描述的方法和设备的针对EC7细胞和相应参数的电穿孔实验的结果。
图10A-10E示出了使用本文描述的方法和设备的针对EC7细胞和相应参数的电穿孔实验的另外结果。
图11A-11C示出了电穿孔的EC7细胞的显微图像。
图12A-12B示出了使用本文描述的方法和设备转染EC7细胞的另外结果。
图13A-13D示出了使用本文描述的方法和设备针对不同细胞系的各种转染效率。
图14A-14E示出了使用本文所述的PbAE将mRNA引入T细胞的转染实验的结果。
图15A和15B示出了在有和没有如本文所述的电穿孔的情况下将mRNA引入T细胞的转染实验的结果。
图16A-16D示出了使用本文描述的方法和设备针对脂肪来源的间充质干细胞(AD-MSC)和相应参数的转染实验的结果。
图17是根据本披露的另一示例性实施方案的电穿孔器具的框图。
图18是根据本披露的另一个示例性实施方案，可用于图17的电穿孔器具中的电穿孔室的分解视图。
图19是图18的电穿孔室的立体视图，其中各层组装在一起。
图20是图18的电穿孔室的流体通道层的前视图。
图21是根据本披露的另一个示例性实施方案的流体通道层的前视图，该流体通道层具有与图20的流体通道层不同的流体体积。
图22是根据本披露的另一个示例性实施方案的具有直线流体通道的流体通道层的前视图。
图23是图20的流体通道层的前视图，示出了流体通道的示例性尺寸。
具体实施方式
提供了用于细胞(例如哺乳动物细胞(例如，NK细胞、EC-7细胞、T细胞等)和非哺乳动物细胞)电穿孔的系统和方法，连同提供了相应电穿孔方案，其提供高效率和活率。在一些方面，电穿孔方案涉及使细胞经受多个电脉冲，步进流体流动，低电导率且低渗量的电穿孔缓冲液，相对中等的电容和/或相对中等的时间常数。
在各个方面，提供了一种在有货物情况下电穿孔哺乳动物细胞的器具。所述器具可以包括一个或多个电穿孔室，其中每个电穿孔室包括第一电极、第二电极和在第一电极和第二电极之间的在其中具有限定的路径的流体通道区域。第一电极和第二电极中的每一个可以是固体电极或网状电极，例如微网电极。所述器具还包括允许细胞和货物进入电穿孔室的第一输入，以及允许来自电穿孔室的经电穿孔的细胞通过的第一输出。如本文所用，“经电穿孔的细胞”包括转染的细胞、死细胞和未转染的细胞。在一些实施方案中，第一输入和第一输出可以分开偏移距离。第一电极可以由第一材料包缚，第二电极可以由第二材料限制，所述第二材料可以相同或不同。
例如，图2A示出了用于在具有货物的情况下对细胞进行电穿孔的示例性器具，其包括电穿孔器具700a。电穿孔器具700a包括电穿孔室720，电穿孔室720包含两个电极，例如，第一电极740(1)和第二电极740(2)，例如，在此彼此对准地示出。电穿孔器具700a进一步包括：第一输入710，其允许细胞和货物进入电穿孔室720；以及第一输出730，其允许来自电穿孔室720的经电穿孔的细胞通过。第一输入710和第一输出730可以分开偏移距离(d)，以有助于细胞侧向地流过电穿孔室720。在电穿孔室720中存在流体通道区域725，并且流体通道区域725包括在其中限定的在第一电极740(1)和第二电极740(2)之间的路径735，以使细胞和货物流动。尽管未示出，但是路径735可以具有与第一输入相对应的路径入口以允许细胞和货物进入路径735，以及与第一输出730相对应的路径出口以允许经电穿孔的细胞从路径735通过。
在任何实施方案中，第一输入可以存在于或限定在第一电极、第二电极或流体通道区域中。另外，第一输出可以存在于或限定在第一电极、第二电极或流体通道区域中。第一输入和第一输出两者都可以存在于第一电极或第二电极中。例如，如图2A所示，第一输入710和第一输出730两者都存在于第二电极740(2)中。可替代地，第一输入可以存在于第一电极中，并且第一输出可以存在于第二电极中，或者第一输入可以存在于第二电极中，并且第一输出可以存在于第一电极中。对于流体通道区域，在本文中设想第一输入、第一输出或两者可以例如存在于流体通道区域的侧壁中。
如图2B进一步所示，在电穿孔器具700b中，第一电极740(1)的上表面706可以由第一材料715(1)包缚或连接到第一材料715(1)，第二电极740(2)的下表面711可以由第二材料715(2)包缚或连接到第二材料715(2)。例如，第一材料和第二材料可以是无孔材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)丙烯酸，聚乙烯，聚丙烯或丙烯酸玻璃，以在电穿孔设备的内部室中容纳细胞，并且尤其是在平行的第一电极和第二电极之间的电穿孔室内。另外地或可替代地，电穿孔器具700b可以进一步包括：第一外部输入750，其用于进一步允许细胞和货物进入电穿孔室720；以及第一外部输出760，其用于进一步允许来自电穿孔室720的经电穿孔的细胞通过。第一外部输入可以存在于或限定在第一材料中，并且第一外部输出可以存在于或限定在第二材料中。可替代地，第一外部输入可以存在于或限定在第二材料中，并且第一外部输出可以存在于或限定在第一材料中。在另一个实施方案中，第一外部输入和第一外部输出两者都可以存在于或限定在第一材料或第二材料中。例如，如图2B中所示，第一外部输入750和第一外部输出760都存在于或限定在第二材料715(2)中，其中箭头指示细胞和货物通过电穿孔设备和经电穿孔的细胞离开电穿孔设备的流动方向。如本领域技术人员所知，图2A和2B中所示的并且未标记的其他开口或孔代表用于例如通过螺钉和/或楔子连接电穿孔器具的各种部件的开口。
第一电极和第二电极各自可以是固体电极(例如固体板状电极)，或者是具有孔隙度的网状电极(例如微网电极)。在一个实施方案中，第一电极和第二电极两者都是固体电极，例如固体板状电极。在任何实施方案中，当第一电极、第二电极或两者是固体电极时，第一电极、第二电极或两者包含多个固体金属板或固体金属板阵列。例如，如图2C所示，第一电极741(1)和第二电极(741)(2)包括多个固体金属板745。每个固体金属板745可以被配置为施加独立的电场以形成特定的电场图案。可以形成第一电极和第二电极的合适的材料包括但不限于不锈钢、聚酰亚胺、硅、贵金属、第4族金属、导电材料及其组合。合适的贵金属的实例包括但不限于钌(Ru)、铑(Rh)、钯(Pd)、银(Ag)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)和金(Au)。第4族金属的实例包括钛(Ti)、锆(Zr)、铪(Hf)和鈩(Rf)。合适的导电材料的实例包括但不限于氧化铟锡(ITO)，碳纳米管(CNT)和导电聚合物，例如聚(3，4-亚乙基二氧基噻吩)聚苯乙烯磺酸盐(PEDOT:PSS)。
在任何实施方案中，本文披露的任何一种电穿孔器具可以包括用于在具有本文描述的电穿孔参数的电穿孔过程期间向细胞提供电脉冲的部件。例如，图2D示出了用于生成电脉冲并将电脉冲提供给细胞的器具852，如本文中所解释的。具体来说，如图2D所示，器具852包括电源854和耦合到电源854的控制电路858。电源854将电脉冲提供给电穿孔器具860(例如，本文披露的示例电穿孔器具中的任何一个)。
在图2D的实例中，电源854包括电源856，耦合至电源856的电源转换器862以及耦合在电源转换器862与电穿孔器具860之间的脉冲电路864。取决于例如由电源856提供的电力的类型，电源转换器862可以包括DC-DC电转换电路和/或AC-DC电转换电路。例如，电源转换器862可以从电源856(例如，一个或多个电池)接收DC电，并且向脉冲电路864输出经调节的DC电压。在这样的实例中，电源转换器862可以包括具有任何合适的转换器拓扑(例如，降压，升压等)的DC-DC电转换电路。在其他实例中，电源转换器862可以从电源856(例如，AC干线)接收AC电。在这样的实例中，电源转换器862可以包括具有任何合适的转换器拓扑(例如，AC-DC整流器，PFC升压等)的AC-DC电转换电路。
图2D的脉冲电路864从电源转换器862接收DC电压，并将DC电压转换为用于电穿孔器具860的DC电脉冲。例如，脉冲电路864可以包括一个或多个变换设备(未示出)，用于解释来自电源转换器862的DC电压并产生电脉冲。在其他实例中，脉冲电路864可以包括其他合适的电路，用于为电穿孔器具860生成电脉冲。
如图2D所示，控制电路858包括控制器866和耦合到控制器866的脉冲发生器868。控制器866接收表示电源转换器862的输出参数(例如，输出电压)的反馈信号870，并生成一个或多个控制信号872，以使电源转换器862基于反馈信号870控制电源转换器862中的一个或多个变换设备(未示出)。例如，控制器866可以控制电源转换器的变换设备以将电源转换器的输出电压调节为限定值(例如，电脉冲的期望幅度)。在一些实例中，控制器866可以基于反馈信号870和/或本文披露的其他信号来减小或增大输出电压。
此外，如图2D所示，控制器866可以为脉冲发生器868产生信号874，并且脉冲发生器868可以为脉冲电路864产生一个或多个控制信号876，以基于从控制器866接收的信号产生电脉冲。例如，信号874可以是指示脉冲发生器868开始产生电脉冲的开始和/或停止信号。在一些实例中，脉冲发生器868可基于从控制器866接收的信号来调整电脉冲的频率、脉冲宽度、占空比等。
在一些实例中，控制电路858可以接收一个或多个另外的信号，用于控制电源转换器862和/或脉冲发生器868。例如，如图2D所示，控制电路858中的脉冲发生器868可以任选地接收一个或多个信号878a。一个或多个信号878a可以是来自脉冲电路864、电穿孔器具860等的反馈信号，并用于控制脉冲电路864以产生电脉冲。另外，如图2D中所示，控制电路858中的控制器866可以任选地接收表示来自脉冲电路864、电穿孔器具860等的反馈信号的一个或多个信号880，和/或表示来自用户界面的用户定义指令的一个或多个信号882。在这样的实例中，一个或多个信号880和/或一个或多个信号882可以用于控制脉冲电路864和/或电源转换器862，监视脉冲时序等。在一些实例中，器具852可以包括一个或多个感测设备(未示出)，用于监视与电穿孔器具860相关联的芯片电压和/或芯片电流。在这样的实例中，脉冲发生器868和/或控制器866可以经由一个或多个信号878a、880接收感测的芯片电压和/或感测的芯片电流，并且然后基于所感测的芯片电压和/或电流控制脉冲电路864和/或电源转换器862。
控制电路858还可出于控制目的而产生一个或多个另外的信号。例如，控制器866可以任选地产生用于电穿孔器具的其他部件和/或电穿孔器具外部的部件的一个或多个信号884。在这样的实例中，一个或多个信号884可以表示提供给用户界面的用户反馈，用于控制器具中的流体泵、蠕动泵、夹管阀的马达(例如，步进马达)的控制信号。另外，脉冲电路864可以任选地产生用于电穿孔器具的其他部件和/或电穿孔器具外部的部件的一个或多个信号878b。例如，脉冲电路可以产生用于感测设备的一个或多个信号878b，以指示感测设备开始电压和电流监视。
图2E示出了用于产生电脉冲并将电脉冲提供给细胞的另一示例性器具886。如所示，器具886包括耦合至电穿孔器具860的电源888和用于控制电源888的控制电路890。图2E的电源888和控制电路890类似于图2D的电源854和控制电路858，但是包括另外的部件。例如，电源888包括图2D的电源856、电源转换器862和脉冲电路864，以及耦合在电源856和电源转换器862之间的滤波器892。滤波器892可包括一个或一个部件，例如电容器，电感器等(未示出)，用于平滑来自电源856的电信号。
另外，如图2E所示，控制电路890包括图2D的控制器866和脉冲发生器868，以及一个或多个耦合至脉冲发生器868的栅极驱动器894。在图2E的实例中，一个或多个栅极驱动器894从脉冲发生器868接收信号，并产生一个或多个脉冲宽度调制(PWM)控制信号896，用于控制脉冲电路864中的一个或多个变换设备(例如，MOSFET)。另外，控制电路890可以接收和/或产生图2D中引用的各种信号中的任何一个或多个。例如，控制器866可以接收反馈信号870，并产生用于控制电源转换器862中的一个或多个变换设备(例如，MOSFET)的一个或多个控制信号872，如上所解释。
本文披露的控制电路可以包括用于执行各种功能(包括本文披露的功能)的硬件部件和/或编程的软件部件。例如，图2D和2E的控制电路858、890中的任何一个可以包括一个或多个传感器，用于监视电源854、888的参数(如本文中所解释的)、与电穿孔器具860相关联的参数等。这些参数可以包括与电源854、888和/或电穿孔器具860相关联的电参数、与电穿孔器具860相关联的流体参数等。在这样的实例中，控制电路858、890可以基于参数来控制电源854、888和/或器具852、886的其他部件(例如，流体泵等)。本文中预期本文所述的电源854、888中的任何一个以及控制电路858、890中的任何一个可以提供电脉冲和电穿孔参数，如下文进一步描述，例如，波形、场强、电压、每个电脉冲之间的持续时间、脉冲宽度、每个电脉冲的持续时间等。例如，控制电路858、890中的任何一个可以提供以下中的一个或多个：(i)每个电脉冲具有指数放电波形或方波形的形式；(ii)以约0.3kV/cm至约3kV/cm的场强施加多个电脉冲；(iii)以约15V至约100V的电压施加场强；(iv)每个电脉冲之间的持续时间是约0.1秒至约10秒；以及(v)每个电脉冲具有约10μs至约10,000μs的脉冲宽度。
在一些实施方案中，第一电极可以是上微网电极，并且第二电极可以是下微网电极。在这样的实施方案中，电穿孔室可以包括上微网电极、下微网电极以及在上微网电极和下微网电极之间限定的路径，以使细胞和货物流动。上微网电极和下微网电极各自具有孔隙度，例如以允许细胞通过微网电极进入电穿孔室或从电穿孔室出来。例如，上微网电极和下微网电极可各自具有约30％至约50％的开口区域的孔隙度。上微网电极和下微网电极的孔开口的宽度可以是约70μm至约140μm。上微网电极可以由第一材料包缚，而下微网电极可以由第二材料包缚。第一材料包括允许细胞进入电穿孔室的第一输入，并且第二材料包括允许来自电穿孔室的经电穿孔的细胞通过的第一输出。另外地或可替代地，代替细胞和/或货物行进通过上微网电极的孔进入电穿孔室，上微网电极可以任选地包括第二输入，以允许细胞和/或货物进入电穿孔室。第二输入可以与第一材料中的第一输入基本对准。另外地或可替代地，代替经电穿孔的细胞行进通过下微网电极的孔以离开电穿孔室，下微网电极可以包括第二输出，以允许电穿孔从电穿孔室中出来。第二输出可以与第二材料中的第一输出基本对准。
例如，图3A示出了用于在具有货物的情况下对细胞进行电穿孔的示例性器具，所述器具包括具有微网电极的IOCO电穿孔设备200。IOCO电穿孔设备200包含两个微网电极，即上微网电极240(1)和下微网电极240(2)，此处显示彼此对准。上微网电极240(1)的上表面可以包缚第一材料，而下微网电极240(2)的下表面可以包缚第二材料。例如，第一材料和第二材料可以是无孔材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)丙烯酸、聚乙烯、聚丙烯，以在电穿孔设备的内部室中容纳细胞，并且特别是在两个平行的微网电极之间的室220内。在上微网电极240(1)上形成第一输入210(没有PDMS的区域)，并且在下微网电极240(2)上形成第一输出230(没有PDMS的区域)。因此，在该实例中，上和下微网电极240(1)240(2)跨越电穿孔室220的长度，并由第一材料(上PDMS层)和第二材料(下PDMS层)包缚，以沿室的侧向距离引导细胞流。第一材料(上PDMS层)中的开口(第一输入210)和第二材料(下PDMS层)中的开口(第一输出230)以偏移距离(d)分开，以有助于细胞侧向流过电穿孔室220。
在任何实施方案中，如上所述的电穿孔室可具有任何期望的形状，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形或多边形。
在任何实施方案中，电穿孔室的宽度(w)的范围可以从约0.01mm至约15mm、0.01mm至约10mm、0.01mm至约7.5mm、0.01mm至约5mm、约0.05mm至约5mm、约0.1mm至约15mm、0.1mm至约10mm、0.1mm至约7.5mm、约0.1mm至约5mm、约1mm至约15mm、约1mm至约10mm、约1mm至约7.5mm、约1mm至约5mm、约2mm至约10mm、约2mm至约5mm、约0.01mm至约4mm、约0.1mm至约4mm、约1mm至约4mm、约0.01mm至约2mm、约0.05mm至约1mm、约0.1mm至约0.5mm、或约0.2mm至约0.4mm。在一些方面，室宽度(w)是约0.3mm或约4mm。
在一些方面，第一输入和第一输出之间的偏移距离(d)的范围可以从约0.1cm至约10cm、从约0.1cm至约5cm、从约0.1cm至约4cm、从约1cm至约3cm，在一些方面，偏移距离(d)是约2cm。在一些方面，输入和输出之间没有重叠。
第一输入和/或第二输入与电穿孔室流体连通，并且电穿孔室与第一输出和/或第二输出流体连通。一个或多个输入、一个或多个输出和电穿孔室可另外包含一个或多个阀、调节器、泵或任何其他微流体部件，用于控制细胞流动通过电穿孔室。
在一些方面，只要在第一输入和第一输出之间保持适当的偏移距离，第一输入和第一输出两者都可以位于上微网电极上的第一材料中。另外地或可替代地，第二输入和第二输出两者都可以存在于上微网电极中。在其他方面，只要在第一输入和第一输出之间保持适当的偏移距离，第一输入和第一输出两者都可以位于下微网电极上的第二材料中。另外地或可替代地，第二输入和第二输出两者都可以存在于下微网电极中。
在一些实施方案中，细胞可以以第一方向流动进入第一输入。一旦穿过第一电极或第二电极，细胞的流动就可以改变方向，在垂直于或基本垂直于第一方向的方向上沿着电穿孔室的长度在路径中侧向流动。一旦达到第一输出，细胞的流动可以再次改变方向，以平行于第一方向的第二方向离开电穿孔室。
在一些方面，将电压施加在平行的第一和第二电极上，适合地产生在约0.3kV/cm至约3kV/cm范围内的电场。对于haNKS典型的电场范围是约1-1.3kV/cm(例如40V/300um)，对于EC-7细胞是约0.3-1kV/cm。在一些方面，电压可以是约10V、约20V、约30V、约40V、约50V、约75V、约100V或约200V，或其中的任何合适范围，或更高。
在一些方面，第一输入、第二输入、第一输出和第二输出的直径可以约相同。在其他方面，第一输入的直径可以大于或小于第一输出的直径和/或第二输入的直径可以大于或小于第二输出的直径。例如，第一输入和/或第二输入的直径可以在约0.1mm至约10mm、约1mm至约7mm、约3mm至约5mm的范围内，或者可以是约4mm。第一输出和/或第二输出的直径可在约0.1mm至约10mm、约1mm至约7mm、约3mm至约5mm的范围内，或者可以是约4mm。
在任何实施方案中，电穿孔室的长度(1)的范围可以从约2mm至约100mm、约2mm至约80mm、约2mm至约60mm、约2mm至约40mm、约2mm至约20mm、约5mm至约100mm、约5mm至约80mm、约5mm至约60mm、约5mm至约40mm、约5mm至约20mm约5mm至约15mm、从约8mm至约12mm，或者可以是约10mm。
在任何实施方案中，电穿孔室的高度(h)的范围可以从约100μm至约1000μm、约100μm至约750μm、约100μm至约500μm、约100μm至约300μm、约100μm至约200μm、约200μm至约1000μm、约200μm至约750μm、约200μm至约500μm、或约200μm至约300μm。在某些方面，室高度(h)是约284μm。
在任何实施方案中，长度(1)与宽度(w)的比率(1/w)可以是约1至约50、约1至约40、约1至约20或约1至约10。
在任何实施方案中，一旦细胞进入电穿孔室，细胞就暴露于均匀的电场直到离开电穿孔室。例如，图3B是IOCO电穿孔设备200中的电场的图示。位置(1)指输入(第一输入210)中的细胞，位置(2)指电穿孔室中的细胞，并且位置(3)指输出(第一输出230)中的细胞。
图3C是电场强度相比于通过IOCO电穿孔设备200的细胞行进距离的曲线图。位置(1)处所示的输入(第一输入210)中的细胞只有穿过微网电极进入电穿孔室后，才暴露于电场。在电穿孔室内，如位置(2)所示，细胞沿室的长度方向行进时会经历均匀的(最大强度)电场。一旦在位置(3)处所示的输出(第一输出230)中，细胞不暴露于电场。
图3D示出了本文呈现的包括电穿孔设备310-330的电穿孔器具的替代构造。在该实施方案中，代替在上网和下网之间具有线性(水平)流动路径，细胞可以在上网和下网之间采用弯曲或圆形(水平)流动路径。线性流动路径和弯曲流动路径可各自包括至少一个段，该至少一个段平行于由上网和下网中的至少一个的表面限定的平面延伸。
在该数量中，电穿孔设备310-330的各个层在图3D中示出。固体外部板310(1)和310(2)(例如，塑料、金属或任何其他合适的材料)封装所述设备。将粘合剂层或其他合适的材料(例如，双面胶带，压敏粘合剂材料等)320(1)(第一材料)放置在上部固体外板310(1)和上部网330(1)之间，并且将粘合剂层或其他合适的材料(例如，双面胶带，压敏粘合剂层等)330(2)(第二种材料)放置在下部外板310(2)和下部网330(2)之间。另一个粘合剂层(例如，压敏粘合剂材料或双面胶带等)(340)(其包含细胞和货物可通过的弯曲的通道或弯曲的路径335)位于上网和下网330(1)330(2)之间。流体可以由注射器350驱动通过电穿孔设备310-330。电穿孔设备310-330还可以与电穿孔器脉冲器360接口。在任何实施方案中，电穿孔设备310-330可以是连续电穿孔设备，其中细胞以连续方式流过所述设备。
细胞和货物流动通过电穿孔室的路径被限定在电穿孔室中，例如，在第一电极(例如，固体电极或上微网电极)和第二电极(例如，固体电极或下微网电极)之间的如上所述的流体通道区域中。应该理解的是，本文提供的实施方案预期了任何合适的路径，前提是该路径包括至少一个与第一电极(例如，固体电极或上微网电极)和第二电极(例如，固体电极或下微网电极)中至少一个平行的水平流动段。水平流动段可以形成在上微网电极和下微网电极之间延伸的路径的长度的大于或小于1/10、1/4、1/2、3/4、7/8或9/10中的任一个。在某些情况下，路径可以是线性、弯曲、分支、迂曲、曲折或其任意组合。弯曲路径的数量包括但不限于圆形路径、螺旋路径、圆锥形路径或其任何组合。例如，如图3B中所示，路径是线性的，其中箭头示出了细胞的流动。如图2A、2B、3D和3E中所示，路径是弯曲的，其中箭头示出了细胞的流动。如图3F中所示，路径可以是线性的，具有一个或多个方向的改变或之字形路线，箭头示出了细胞的流动。如图3G中所示，路径可以是圆形的并且具有一个或多个分支。如图3E-3G中所示，路径可包括：入口380(出平面)，其可对应于第一输入或与第一输入基本对准；以及一个或多个出口390(进平面)，其可对应于第一输出或与第一输出基本对准。取决于电穿孔过程的特定特征，可调节路径的长度，例如缩短或延长。
在任何实施方案中，本文所述的电穿孔器具可以包括用于产生细胞流从样品管进入电穿孔设备的电穿孔室以及流过该设备进入收集管的装置。例如，如图3H中所示，流产生装置520例如经由管道与包含用于转染的细胞和/或货物的样品管510和电穿孔设备530流体连通。流产生装置520可以通过管道产生细胞和/或货物的流动，从样品管510，通过电穿孔设备530并进入收集管550中。尽管未示出，但是空气过滤器设备可以与样品管510、收集管550或两者的内容物流体连通。流产生手段可以是任何合适的泵，例如蠕动泵或注射泵。本文中预期在电穿孔器具中可以存在一个以上的流产生手段520。例如，一个或多个流产生装置520可存在于样品管510和电穿孔设备530之间并与之流体连通，并且一个或多个流产生装置520可存在于收集管550与电穿孔设备530之间并与之流体连通。另外地或可替代地，电穿孔设备530和/或流产生装置520也可以与控制器540接口，例如包括电穿孔器脉冲器。
在任何实施方案中，本文所述的电穿孔器具还可包括与电穿孔设备流体连通的引发缓冲液管，以根据需要递送引发缓冲液。合适的引发缓冲液的数量包括但不限于蒸馏水、去离子水、等渗缓冲液及其组合。例如，如图3I中所示，引发缓冲液管560与电穿孔设备530流体连通。可以打开阀570以经由流产生装置520将引发缓冲液递送至电穿孔设备530，或者可以关闭阀570以停止递送。可以打开阀575以经由流产生装置520将细胞和/或货物递送至电穿孔设备530，或者可以关闭阀575以停止递送。在一些实施方案中，阀570和757来自都可以被打开以递送细胞和引发缓冲液。在一些实施方案中，可首先递送引发缓冲液，然后递送细胞和/或货物。
在任何实施方案中，本文描述的电穿孔器具还可以包括第一微流体设备，用于在进入电穿孔设备的电穿孔室之前分选细胞。例如，如图3J中所示，第一微流体设备580可以与电穿孔设备530、包含用于转染的细胞的样品管510以及任选地缓冲液分选管577流体连通。流产生装置520可以产生样品管510的细胞和/或分选管577的缓冲液的流动，通过电穿孔设备530进入收集管550。第一微流体设备580能够例如基于细胞的大小从样品管510预分选细胞至电穿孔设备530。另外地或可替代地，第一微流体设备580能够完成来自样品管510的细胞的缓冲液更换。流590包含分选出的并且未递送至电穿孔设备530的细胞，可以是废物流或被发送至具有不同参数的另一电穿孔设备。另外地或可替代地，第二微流体设备585可以与电穿孔设备530和收集管550流体连通。第二微流体设备585能够在收集到收集管550中之前，例如基于经电穿孔的细胞的大小，对经电穿孔的细胞进行分选。流595包含分选出的但未传递到收集管550中的经电穿孔的细胞。
尽管在图3J中示出了两个微流体设备，在本文中预期在电穿孔器具中仅可以存在一个微流体器具，例如，以在进入电穿孔室之前对细胞进行分选或对离开电穿孔室的经电穿孔的细胞进行分选。
图3K是示例性微流体设备(例如，微流体设备580，微流体设备585)的图示。在该实例中，包含细胞100(例如，用于转染的细胞，经电穿孔的细胞，转染的细胞)的溶液进入输入机构110处的室105。细胞显示为圆。细胞穿过室105，室105包含柱115的矩阵，在此示出为沿着具有斜率的多条线分布的矩形结构。当细胞通过室中成对角的成排的柱之间时，细胞向第二输出机构122侧向偏转。在图3L中示出了室的一部分的侧视图，其中室具有底部160并且任选地具有顶部150，其可以与柱115具有相同的材料或不同的材料。细胞(黑色圆)显示为流过柱矩阵。应当理解，成排的柱也可以以曲线的方式布置，这也将导致细胞被引导向室的一侧。
在该实例中，示出了用于室的两个输出机构。经由第一输出机构120(当存在多于一个微流体设备时，也可以称为第三输出机构)离开室的溶液中的细胞被耗尽，而经由第二输出机构122离开室的溶液(当存在多于一个微流体设备时，也可以称为第四输出机构)富集细胞。在任何实施方案中，第二输出机构可以与电穿孔室例如与第一输入流体连通。耗减是指这样一种状态，其中与在输入机构110进入室的溶液中的细胞浓度相比，通过输出机构120离开室的溶液中的细胞浓度降低50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98或99％。富集或浓缩是指这样一种状态，其中与在输入机构110进入室的溶液中的细胞浓度相比，通过输出机构122离开室的溶液中的细胞浓度增加50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。对于将被引导至输出机构122的细胞，室的偏转点130应被定位成使得离开的细胞的路径是至输出机构122(而非输出机构120)。通常，输出机构122被配置为具有比输出机构120更大的横截面积。通常，输出机构的横截面积对于以本文所述的流速的流体流动将是足够大的，而不产生会损坏细胞或设备的高压。
在一些实施方案中，输出机构120的宽度大于输出机构122的宽度。例如，输出机构120的宽度是输出机构122的宽度的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍。在其他实施方案中，输出机构的横截面积的总和可以等于或大于输入机构的横截面积的总和。
在一些实施方案中，微流体设备被配置成允许标准泵或注射器等连接到微流体设备以使包含细胞的溶液流过该设备。可以影响溶液流动通过设备的参数包括室105的尺寸、柱115的平面内和平面外尺寸、柱在排内的间距(dx)、柱的旋转(φ)、柱的排之间的距离(dy)、输入机构的直径和输出机构的直径(参见下图3M-3Q)。在一些实施方案中，选择这些参数的尺寸以与来自驱动溶液流动通过设备的注射器或标准泵(例如，蠕动泵、隔膜泵、注射泵、瓣叶泵等)的手动操作所施加的压力兼容。允许一定范围的压力，条件是所述压力不损坏微流体设备或细胞。
通常，细胞可以串联(一次一个并进入特定路径)或多个(多个细胞流入多个路径)流入微流体设备。
图3M是室105的一部分的俯视图的图示，其中所述部分包括两排柱，每排七个。沿路径(p)显示了细胞流动。该图示示出了柱115在微流体设备的室的一部分中的定位。通常，柱沿着具有由角度(θ)定义的斜率的线以间隔(dx)排列，间隔可以是固定的或可变的，条件是变化不会导致细胞脱离柱之间的路径(p)。
在一些实施方案中，室的宽度是1mm、2.5mm、5mm、7.5mm、10mm、12.5mm、15mm、17.5mm、20mm、30mm、40mm，50mm或更大，或者在之间的任何大小。各个路径(p)的宽度控制流线的特性。取决于室的宽度，可以采用任何数量的路径，例如1、2、4、8、12、16、32等，或者在之间的任何范围。在其他实施方案中，通过室的流体的流速可以是1mL/hr、2mL/hr、3mL/hr、4mL/hr、5mL/hr，6mL/hr、7mL/hr，8mL/hr、9mL/hr、10mL/hr、15mL/hr、20mL/hr、25mL/hr、30mL/hr、40mL/hr、50mL/hr，等。室令人期望地是矩形，但是也可以是圆形、半圆形、V形或任何其他合适的形状。
角度(θ)是斜率为零的水平轴线与柱沿其分布的具有斜率的线之间的角度。(在此实例中，角度提供了对一排柱的负斜率(tan(θ)＝Δy/Δx)的度量。)在该实例中，应当理解，由于每排柱对角地布置，所以柱可以具有正斜率或负斜率。在这里，应当理解，对角线可以包括不平行于或不垂直于室的任何取向，例如，在1至89度之间、在91至179度之间、在181至269度之间、或在271度至359度之间的角度，顺时针或逆时针。其他示例性角度范围可以是1至10度、11至20度、21至30度、31至40度、41至50度、51至60度、61至70度、71至80度、81至90度、91至100度、101至110度、111至120度、121至130度、131至140度、141至150度、151至160度、161至170度、或171至180度。
通常，在室中存在多排柱，并且每排具有如角度(θ)所定义的相同的斜率或基本相同的斜率。当细胞100进入微流体设备的室105时，细胞以侧向方式朝向室105的一侧流过柱115之间的多个路径(p)，直到到达室的一侧。为了浓缩细胞，细胞通常不穿过成排的柱，而是细胞典型地沿特定路径(p)行进。然后细胞通过输出机构122离开微流体室。在其他实施方案中，柱可具有沿着室105的长度的曲线部件。
如本文所用，术语“柱”是指室内的结构，其具有关联的平面内尺寸、平面外尺寸、旋转角度和形状。平面内尺寸可以指柱的长度(l)和宽度(w)，而平面外尺寸可以指柱的高度(h)。倾斜角或旋转角(φ)是指柱相对于室的旋转。
形状是指柱的3D特征，例如圆柱形、圆锥形、金字塔形、立方形或长方形等。通常，柱的位置应使其轴线(平面外尺寸)垂直于其附着的表面。在一些实施方案中，室内的所有柱具有相同的尺寸。在其他实施方案中，柱的尺寸根据空间而变化，例如取决于沿着柱的高度(h)测量的位置。通常，柱可以是任何形状，并且不限于在此呈现的特定几何形状。柱形状可以是任意的(如图3R中所示，由轴向长度(1)和宽度(w)以及与曲率相关联的多个半径(r4-r12)表示)，沿着轴向长度例如以重复恒定间隔或重复变化间隔定位。任何数量的不同几何形状可以通过多个半径描述。另外，参考图3R和3S，柱的一侧或多侧可以是直线形状。因此，柱可以具有由曲线和/或直线构成的任何合适的形状。
在一些实施方案中，柱沿着具有斜率的线以间隔(dx)布置，其中所述间隔是规则地隔开或固定的。例如，可以每5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等放置柱，包括在这些范围之间的任何值，这具体取决于要浓缩的细胞的大小。
在其他实施方案中，柱沿着具有斜率的线分布，使得间隔不是固定的，而是在任何两个连续的柱之间变化。允许任何间隔(dx)，条件是所述间隔足够小以防止细胞脱离路径(p)。例如，对于可变间隔，可以将第一柱放置在特定位置，将第二柱放置在距第一柱5μm的位置，将第三柱放置在距第二柱4um的位置，依此类推。可以根据细胞的大小选择间隔。
在一些实施方案中，可以将间隔选择为足够大以允许浓缩特定类型的细胞，同时允许较小的细胞经由输出机构120离开。例如，血液样品可以包含大小相对较小的多种不同的细胞类型，包括红细胞、嗜中性粒细胞(例如直径为12-14μm)、嗜酸性粒细胞(例如直径为12-17μm)、嗜碱性粒细胞(例如直径为14-16μm)、淋巴细胞(例如直径为10-14μm)和单核细胞(例如直径为20μm)。人体中其他类型的细胞更大，例如直径在40至100μm或更大的范围内。在这种情况下，柱可以隔开以允许红细胞和白细胞通过，同时浓缩较大的细胞(例如，正常细胞，肿瘤细胞等)。柱的构造(间距)是根据要分离的细胞的类型确定。不同的鞘流比样品流比率可以影响基于大小的分选性能。
每个柱具有相关联的长度(l)、宽度(w)(也称为平面内尺寸)和高度(h)(也称为平面外尺寸)(也参见图3N)。在一些实施方案中，柱的宽度可以是5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等，或在之间的任何值。柱的长度可以是5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等，或在之间的任何值。通常，柱可以是任何形状(如从俯视方向观察，以及相对于尺寸w和l)，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形等。
在本文呈现的实例中，柱具有椭圆形或矩形形状。在一些实施方案中，柱的长度比柱的宽度大1.1至10倍；比柱的宽度大1.1至5倍；比柱的宽度大2至4倍；比柱的宽度大3至4倍；或比柱的宽度大2-3倍。在一些实施方案中，长度和宽度的比率可以大于或小于20比1、18比1、16比1、14比1、12比1、10比1、9比1、8比1、7比1、6比1、5比1、4比1、3比1、2比1、1.1比1中的任何一个，或更大或更小的比率。
在一些实施方案中，柱的横截面可以由柱与平行于壁的平面的相交处限定，柱从所述壁以高度(h)延伸。横截面可沿着长度方向(l)和宽度方向(w)之一或两者对称。
在仍其他实施方案中，矩阵中每个柱的长度和宽度是相同的。在又其他实施方案中，如果柱是圆形的，则矩阵中每个柱的半径是相同的。
其他特征包括柱的旋转角度(φ)，柱的高度或平面外尺寸，排之间的间距(dy)和排的偏移(xo)，在图3N-3Q和整个申请中对此进行了更详细的描述。如本文所用，术语“旋转角度”是指柱相对于其在室中的位置的旋转的角度。在一些实施方案中，柱的长度大于其宽度。在该实施方案中，旋转角度为零意味着柱的长度与垂直于室的侧面的轴线对准。为了描述不同的旋转角度，柱可以沿顺时针或逆时针方向旋转。作为实例，图3M-Q中的柱可以逆时针方向运动旋转约35度，以达到这些图中所示的柱的几何形状。
参考图3N，每个柱具有相关联的高度(h)或平面外尺寸，使得柱足够高以防止细胞通过以向上的路径流动(例如在柱的顶部上方进入不同的路径)而从路径(p)脱离。例如，在一些实施方案中，柱将跨微流体室的高度，使得柱与室160的底部和室150的顶部接触。在其他实施方案中，柱的高度或平面外尺寸可以跨微流体设备的总高度的一部分。例如，柱的高度可以是1μm、3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等，或在之间的任何值。
参考图3O，每个柱具有相关联的旋转角度(φ)或倾斜度，如从俯视图所示。在本实例中，以如下取向开始：其中柱的长度与垂直于室的侧面的第一轴线对准并且柱的宽度与跟室的侧面成一直线的第二轴线对准，通过沿逆时针方向旋转柱(例如在此实例中，逆时针旋转约35度)直到达到期望的旋转来确定柱的旋转。可以使用有助于细胞流动通过路径(p)的任何旋转角度，并且本文考虑了所有这样的旋转角度。在一些实施方案中，旋转角度在1度至179度之间、在1度至89度之间、在5度至85度之间、在10度至80度之间，在15度至75度之间、在20度至70度之间，在25度至65度之间、在30度至60度之间、在35度至55度之间，在40度至50度之间、在30度至40度之间、在32度至38度之间、在34度至36度之间、或35度。在其他实施方案中，旋转角度可以在91度至179度之间、在95度至175度之间、在100度至170度之间、在105度至165度之间、在110度至160度之间、在115度至155度之间、在120度至150度之间、在125度至145度之间、在130度至140度之间、或135度。
如前所述，柱沿着具有负斜率的线分布。通过沿该线定向细胞，流动通过路径(p)的细胞被侧向引导朝向室的一侧，而最初悬浮细胞的溶液能够以某种方式(例如接近水平地或水平地)流动以经由输出机构120离开微流体室。
参考图3P，在仍其他实施方案中，柱的各排以间隔(dy)隔开。在一些实施方案中，柱沿垂直线以间隔(dy)布置，其中所述间隔是规则地隔开或固定的。例如，可以每5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等放置柱，包括在之间的任何值，这具体取决于要浓缩的细胞的大小。
在其他实施方案中，柱沿垂直线分布，使得间隔(dy)不固定，而是在柱的任何两个连续排之间变化。例如，可以将第一排柱放置在特定位置，可以将第二排柱放置在距离第一排柱5μm的位置，可以将第三排柱放置在距离第二排柱4um的位置，以此类推，相对于垂直线对准。间隔(dy)可以根据要浓缩的细胞的大小进行选择。允许任何间隔(dy)，条件是所述间隔足够宽以允许溶液流动通过室而无需高压，高压可能会损坏微流体设备。在一些实施方案中，柱的连续排可以具有零偏移(xo)。
参考图3Q，柱的连续排可以相对于间隔(dx)具有偏移(xo)。例如，可以在特定位置(使用笛卡尔坐标系x、y)建立排(r)。第(r+1)排可以向右移动量(xo)。第(r+2)排可以向右移动量(2xo)。第(r+3)排可以向右移动量(3xo)，依此类推，直到间隔(dx)。偏移可以固定的方式发生，使得每个连续的排在相同的方向上位移固定的量。可替代地，偏移可以以可变的方式发生，使得每个连续的排在相同的方向上位移可变的量(直到(dx)的量)。在其他实施方案中，可以在交替的方向上施加偏移，使得关于行(r)，第(r+1)排在一个方向上具有固定或可变的偏移，并且第(r+2)排在相反的方向上具有固定或可变的偏移(例如，一个偏移向右，并且下一个偏移向左)。
柱可以由任何合适的材料制成，包括聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、玻璃、塑料、弹性体、硅等。通常，PDMS可以制造为具有亚微米分辨率(以下0.1μm特征)。在一些实施方案中，室105和/或柱115可以由PDMS制成。在其他实施方案中，室可以由玻璃和/或硅和/或塑料制成，并且柱可以使用PDMS来制造(例如，室的底部可以是玻璃或硅并且室的顶部可以是玻璃或塑料)。如在此描述的，可以利用本领域众所周知的光刻技术来制造室和柱。具有与PDMS相似性质的材料也可以用于构建本文阐述的微流体设备。
另外，特定实施方案可包含多个另外特征，包括阀(例如，在输入机构与室之间，在室与输出机构之间，在输出机构与另一输入机构或另一室之间，等等)、泵和搅拌器。在一些实施方案中，可以在固化期间将阀放入PDMS中。
可以采用多种技术来制造微流体设备。微流体设备可以由以下材料中的一种或多种形成：聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚烯烃、硅酮(例如，聚(二甲基硅氧烷)(PDMS))、硅及其组合。其他材料是本领域众所周知的。
使用本文中提及的材料来制造具有柱的室和微流体设备的方法在本领域中也是已知的，并且包括但不限于压印、激光微机械加工、铣削、模制(例如、热塑性注塑成型或模压成型)、光刻法(例如、立体光刻法或x射线光刻法)、硅微机械加工、湿法或干法化学蚀刻等。
对于玻璃材料，可以采用硅制造技术，所述硅制造技术使用光刻法，然后湿法(KOH)或干法蚀刻(使用氟或其他反应性气体进行反应性离子蚀刻)。例如，玻璃母版可以通过常规的光刻法形成，其用作模制技术的母版模板，以产生基于塑料或PDMS的设备。
可将微流体设备制造为一层或连接在一起的多层，例如通过粘合剂、夹具、热、溶剂等。可替代地，可以例如利用立体光刻或其他三维制造技术将微流体设备制造为单件。
在一些实施方案中，由于细胞的可变形性，与被浓缩的细胞的大小(例如，直径)相比，可以选择约5μm或更小的间隙距离。在其他实施方案中，与被分选的细胞的大小(例如，直径)相比，可以选择约5μm或更大的间隙距离。对于具有与可变形细胞相同或相似直径的刚性细胞或微球体，与具有相同直径的可变形相比的间隙距离相比，间隙距离可以不同(例如，对于刚性细胞而言更大)。
图3T是另一示例性微流体细胞浓缩器的图示。在该实例中，包含细胞100的第一溶液在第一输入机构110处进入室105。细胞显示为圆。细胞穿过室105，室105包含柱115的矩阵，在此示出为沿着具有斜率的线分布的矩形结构。当细胞通过室中成对角的成排的柱之间时，细胞向室的一侧侧向偏转。类似于图3L，室具有底部160(未示出)和任选的顶部150，其可以与柱115具有相同的材料或不同的材料。
在该实例中，在该系统中存在第二输入机构112。第二溶液(例如，与通过第一输入机构110进入室的第一溶液不同的缓冲液)通过第二输入机构112进入室，例如来自缓冲液管577的缓冲液。在一些实施方案中，第一溶液和第二溶液基本上不混合，因此，室155的上部区域包含第一溶液并且具有很少第二溶液(如果有的话)，而室165的下部区域包含第二溶液并且具有很少第一溶液(如果有的话)。因此，当细胞侧向偏转并通过输出机构122离开室时，经由输出机构122离开室的溶液在第二溶液缓冲器中。
在一些方面，如图3U所示，在级联设计中，缓冲液更换可以顺序地发生。在该实例中，包含细胞100的第一溶液在第一输入机构110(1)处进入第一室105(1)。细胞显示为圆。细胞穿过室105(1)，室105(1)包含柱115(1)的矩阵，在此示出为沿着具有斜率的线分布的矩形结构。当细胞通过室中成对角的成排的柱之间时，细胞向侧向偏转。类似于图3L，室具有底部(160)(未示出)和任选的顶部(150)，其可以与柱115具有相同的材料或不同的材料。细胞(富集的)通过输出122(1)离开室，其流入输入机构110(2)，在这里第二输入机构112进入系统。
与通过第一输入机构110(1)进入室的第一溶液不同的第二溶液(缓冲液)通过第二输入机构(112)进入室。在一些实施方案中，第一溶液和第二溶液基本上不混合，因此，室(155)的上部区域包含第一溶液并且具有很少第二溶液(如果有的话)，而室(165)的下部区域包含第二溶液并且具有很少第一溶液(如果有的话)。细胞(富集并在来自输入机构112的缓冲液中)通过输出机构122(2)离开室105(2)。
在其他方面，缓冲液更换可以平行发生。例如，可以划分流动路径，使得样品流入多个室，其中每个室包括针对缓冲液的输入机构。利用这种构造，可以将相同的缓冲液提供给每个平行的室，使得细胞被浓缩到相同的缓冲液中。可替代地，每个平行室可以被提供不同的缓冲液，使得细胞被浓缩到不同的缓冲液中，例如，用于不同的下游测定。
通常，输入机构可以通过注射泵或通过注射器的手动压下来驱动。在一些方面，对于多个输入，可以使用一个或多个注射泵以自动方式驱动每个输入。在其他方面，对于多个输入，可以使用一个或多个注射器的手动压下来手动驱动每个输入。
在任何实施方案中，本文描述了能够提供不同电穿孔效果的电穿孔器具。例如，如图3V所示，提供了具有三个电极640(1)、640(2)、640(3)的电穿孔设备600。电穿孔设备600包括用于细胞和货物行进的两条路径，电极640(1)和电极640(2)之间的第一路径以及电极640(2)和电极640(3)之间的第二路径，其中箭头指示细胞的流动。细胞可以在入口620进入电穿孔室并通过出口630离开。尽管未示出，但是本文中预期存在多于一个出口，例如，每个出口可以收集不同类型的细胞。电穿孔设备600中存在不同的电极间隙长度(L1、L2、L3、L4)。不同的电极间隙长度和不同的路径导致不同的电容；因此，对于每条路径中行进的细胞，可以实现不同的电场强度和电穿孔效果。例如，L2可以大于L4，并且在这种情况下，第一路径中的电容(C1)可以大于第二路径中的电容(C2)(C1>C2)。在任何实施方案中，可例如使用上述微流体设备对细胞(相同或不同类型)进行预分选和/或选择，以进入第一路径或第二路径。
本文还预期了本文描述的电穿孔设备可以作为盒存在，其可以彼此流体连通(例如，连接，堆叠)，以提供具有期望的长度和几何形状的路径。例如，如图3W所示，盒410各自包括电穿孔室，所述电穿孔室包括第一电极440(1)和第二电极440(2)，其中所述盒可以串联堆叠，箭头示出细胞通过所述盒的流动。例如，最顶部盒410的出口与中间盒410的入口流体连通，并且中间盒410的出口与最下部盒410的入口流体连通。
在进一步的实施方案中，提供了包括本文所述的电穿孔设备的模块化系统。例如，如图3X所示，模块化系统800包括三个模块，第一模块805、第二模块815和第三模块825，其被配置为彼此流体连通或连接。第一模块805包括用于容纳用于转染的细胞和/或货物的第一容器807(例如，样品管)，以及用于将第一容器807与第二模块815流体连接的管道810。第一模块805还可以任选地包括空气过滤器设备809和用于将空气过滤器设备809与第一容器807流体连接的管道810。第二模块815包括电穿孔设备820和用于将电穿孔设备与第一模块805(例如，第一容器807)和第二模块825流体连接的管道810，以及用于将本文所述的流产生装置(例如蠕动泵)与电穿孔设备820和第一模块805(例如，第一容器807)流体连接的管道810。第三模块825包括用于收集经电穿孔的细胞的第二容器830(例如，收集管)以及用于将第二容器830与第二模块815(例如，电穿孔设备820)流体连接的管道810。第三模块825还可以任选地包括空气过滤器设备809和用于将空气过滤器设备809与第二容器830流体连接的管道810。任选地，连接器850(例如鲁尔锁)可以将模块连接在一起，例如，第一模块805与第二模块815以及第二模块815与第三模块825。本文中预期的是，第一模块805、第二模块815和第三模块825可以各自被分开地包装和灭菌。
与基于网的电穿孔设备(例如图1B所示的构造)相比，本文所述的电穿孔器具具有许多优点。首先，如从电穿孔室的第一输入到第一输出所测量的通过电穿孔室的行进距离可以增加而不会导致电场的相应增加。因此，与在严格的线性流动路径中相比，细胞暴露在均匀的电场中持续更长的时间，这导致改善的电穿孔效率，而活率没有相应降低。
尽管在图1B中可以增加上网状电极和下网状电极之间的电穿孔室宽度(w)以提供更长的行进距离，但是更大的电穿孔室宽度将具有更大的阻抗，并且需要施加更高的电压以产生合适的电场。此外，较大的电压可能会对细胞活率产生不利影响。此外，对于平行板电极构造，如lA中所示，电场分布将不均匀。
因此，根据实施方案，由于偏移输入输出设计，本文所述的电穿孔器具可以具有较短的电极对，这在不增加电极对距离的情况下延长了电穿孔室的长度。
图4提供了表格，其示出了本文所述的电穿孔设备与现有技术中的电穿孔设备之间的差异。此类差异包括但不限于：(1)输入输出偏移距离的存在；(2)使用低电导低渗量的电穿孔介质代替可商购的电穿孔介质(例如BTX和RPMI)，(3)指数放电波形，以一系列电脉冲应用，以及(4)步进流体流动方案。
虽然在图3A-3C中的实例利用不锈钢微网电极，电极不限于任何特定的材料，并且可以由任何合适的材料形成。例如并且如图6中所示，合适的材料包括硅和聚酰亚胺。可以使用硅和聚酰亚胺来形成合适的微网电极，但是，典型地使用本领域已知的微制造方案在洁净室设施中加工这类材料。相比之下，不锈钢微网电极易于建立，并且不需要专门的设施，如洁净室。
应当理解，可以使用任何合适的材料，只要微网具有允许细胞通过的孔(例如，微网的孔比细胞更大)，并且微网的孔与孔开口周围的电极图案相容。
电穿孔方法和参数
本文提供了例如使用如上所述的电穿孔器具在有货物情况下对细胞进行电穿孔的方法。所述方法可以包括使细胞与货物一起流入电穿孔室。电穿孔室包括第一电极(例如，固体电极)、第二电极(例如，固体电极)以及在第一电极和第二电极之间的具有在其中限定的路径的流体通道区域，所有如本文所述。所述器具还包括允许细胞和货物进入如本文所述的电穿孔室的第一输入，以及允许来自如本文所述的电穿孔室的经电穿孔的细胞通过的第一输出。在一些实施方案中，第一输入和第一输出可以分开偏移距离。可以将细胞悬浮在电穿孔介质中。第一电极可以由本文所述的第一材料包缚，并且第二电极可以由本文所述的第二材料包缚，并且可以相同或不同。第一材料和第二材料还可包括如本文所述的第一外部输入和如本文所述的第一外部输出。
在一些实施方案中，电穿孔室包括如本文所述的上微网电极、如本文所述的下微网电极、以及在上微网电极和下微网电极之间限定的路径，所述路径用于如本文所述的细胞和货物流动。上微网电极和下微网电极各自具有如本文所述的孔隙度。另外，上微网电极可以由如本文所述的第一材料包缚。第一材料可包括如本文所述的第一输入，其允许细胞通过进入电穿孔室。下微网电极可以由第二材料包缚。第二材料可包括如本文所述的第一输出，其允许来自电穿孔室的经电穿孔的细胞通过。第一输入和第一输出被如本文所述偏移距离分开。可以将细胞悬浮在电穿孔介质中。任选地，上微网电极可以进一步包括如本文所述的第二输入，和/或下微网电极可以进一步包括如本文所述的第二输出。
在任何实施方案中，细胞和货物的流动可以以步进方式进行。例如，可以在指定的时间间隔将大于或等于电穿孔室总体积的约一半的流体体积泵入电穿孔室中。在一些实施方案中，可以将约等于电穿孔室的总体积的流体体积泵入电穿孔室中。图5示出了示例性的一系列电脉冲(刺激)和示例性的步进流体流动方案(泵)。对于步进流体流动方案，室体积是约22μL。每秒将11μL泵入电穿孔室，替换一半体积。只要需要，可以重复进行此操作以处理期望数量的细胞。
另外地或可替代地，可以将任何合适的时间间隔与任何适当的体积一起用于步进流体流动方案。例如，时间间隔可以在约0.1秒至约10秒、从约0.5秒至约5秒、从约1秒至约2秒的范围内，或者在之间的任何时间段，或者可以包括更长的间隔。在一些方面，随时间的变化，泵入电穿孔室的流体的量可以是输入室的体积的四分之三、电穿孔室的体积的一半、电穿孔室的体积的四分之一、电穿孔室的体积的八分之一或更小。细胞和货物的任何合适的流速可以与本文描述的参数一起使用。例如，电穿孔介质中的细胞和货物的流速可以大于或等于约0.1ml/min、大于或等于约0.5ml/min、大于或等于约1ml/min、大于或等于约2.5ml/min、大于或等于约5ml/min、大于或等于约7.5ml/min、大于或等于约10ml/min、大于或等于约12.5ml/min、或约15ml/min、或从约0.1ml/min至约15ml/min、约0.5ml/min至约15ml/min、约1ml/min至约15ml/min、约1ml/min至约12.5ml/min、约1ml/min至约10ml/min、约1ml/min至约7.5ml/min、约1ml/min至约5ml/min、或约1ml/min至约2.5ml/min。
在任何实施方案中，细胞暴露于电穿孔室内的均匀或基本均匀的电场。可以将多个电脉冲施加到电穿孔室内的细胞，其中每个电脉冲相同或不同。在一些实施方案中，施加直流(DC)电脉冲。另外地或可替代地，施加交流电(AC)电脉冲。在任何实施方案中，每个脉冲可以具有指数放电波形或方波形的形式。在任何实施方案中，多个电脉冲可以包括指数放电波形或方波形两者。
对于一系列电脉冲，每100ms至5000ms(例如每100ms、每250ms、每500ms、每1000ms、每2000ms、每3000ms等)可以施加电压至电极上以产生给定强度的电场。只要需要，可以重复进行此操作以处理期望数量的细胞。因此，尽管各方面可被称为连续流，但应理解，连续流包括步进流体流动方案，其中根据限定的时间间隔将流体连续泵入电穿孔室。
另外地或可替代地，可以将电脉冲之间的任何合适的持续时间与细胞在电穿孔室中的任何合适的电脉冲持续时间一起使用。例如，每个脉冲之间的持续时间的范围可以从约0.1秒至约15秒、从约0.1秒至约10秒、从约0.1秒至约5秒、从约0.2秒至约1秒、从约0.4秒至约0.6秒，或在之间的任何时间段，并且可包含更长的间隔。在一些方面，电脉冲的持续时间的范围可以从约10ms至约10s、从约10ms至约5s、从约10ms至约1s、从约10ms至约500ms、从约10ms至约250ms、从约50ms至约150ms、从约75ms至约125ms、从约100ms至约10s、从约100ms至约5、从约100ms至约1s、从约100ms至约500ms、从约100ms至约250ms，或在之间的任何范围。
关于合适的脉冲数和脉冲间间隔，与单个脉冲相比，至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个脉冲可以提供更令人期望的结果。因此，可以预期，脉冲的范围可以是2-10个脉冲、2-6个脉冲、6-8个脉冲或2-3个脉冲。最典型地，脉冲与后续脉冲由相对短的间隔分开，典型地在0.5秒和15秒之间，尽管在某些情况下甚至可以使用更长的间隔。
在任何实施方案中，可以在合适的电压下施加多个电脉冲以产生以下场强：约0.1kV/cm至约5kV/cm、约0.1kV/cm至约3kV/cm、约0.1kV/cm至约2kV/cm、约0.1kV/cm至约1kV/cm、约0.1kV/cm至约0.5kV/cm、约0.3kV/cm至约5kV/cm、约0.3kV/cm至约3kV/cm、约0.3kV/cm至约2kV/cm、约0.3kV/cm至约1kV/cm、约0.3kV/cm至约0.5kV/cm、约0.5kV/cm至约3kV/cm、约0.5kV/cm至约2kV/cm、约0.5kV/cm至约1kV/cm、约0.8kV/cm至约3kV/cm、约0.8kV/cm至约2kV/cm、约0.8kV/cm至约1kV/cm、约1kV/cm至约3kV/cm、或约1kV/cm至约2kV/cm。合适的电压可以是约10V、约15V、约20V、约30V、约40V、约50V、约75V、约100V、或约200V，或从约10V至约200V、约10V至约100V、约10V至约75V、约10V至约50、约10V至约40V、约10V至约30V、约15V至约200V、约15V至约100V、约15V至约75V、约15V至约50、约15V至约40V、约15V至约30V、约20V至约50、约20V至约40V、约20V至约30V、约30V至约50V、约30V至约40V，或其中的任何合适范围。
另外地或可替代地，每个电脉冲的脉冲宽度可以大于或等于约10μs、大于或等于约50μs、大于或等于约75μs、大于或等于约100μs、大于或等于约250μs、大于或等于约500μs、大于或等于约750μs、大于或等于约1,000μs、大于或等于约5,000μs、或约10,000μs；或从约10μs至约10,000μs、约10μs至约5,000μs、约10μs至约1,000μs、约10μs至约750μs、约10μs至约500μs、约10μs至约250μs、约10μs至约100μs、约10μs至约50μs、约100μs至约1000μs、约100μs至约750μs、约100μs至约500μs、约100μs至约250μs、约250μs至约1000μs、约250μs至约750μs、约250μs至约500μs、约500μs至约1000μs、或约500μs至约750μs。
可以用货物转染任何合适的细胞，例如哺乳动物细胞，非哺乳动物细胞或两者。合适的哺乳动物细胞的实例包括但不限于NK细胞(例如，haNK细胞、原代NK细胞、活化的(aNK)细胞)、EC-7细胞(HEK293细胞的衍生物，经修饰以产生腺病毒)、T细胞(例如，原代CD4/CD8T细胞)、CHO-S细胞、树突状细胞、胚胎细胞、干细胞(例如脂肪衍生的间充质干细胞(AD-MSC))、上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、配子细胞和成纤维细胞。合适的非哺乳动物细胞的实例包括但不限于细菌细胞和酵母细胞。可以使用任何合适的货物，例如核酸。核酸可以是RNA，例如合成RNA、mRNA、体外转录的RNA、GFP-mRNA等)和/或DNA(例如合成DNA、GFP-DNA、质粒DNA等)。特别是，可以用RNA(例如合成RNA、mRNA、体外转录的RNA、GFP-mRNA等)和/或DNA(例如合成DNA、GFP-DNA、质粒DNA等)使用本文所述的电穿孔器具转染NK细胞、EC-7细胞(HEK 293细胞的衍生物，经修饰以产生腺病毒)和T细胞。本文还预期了本文所述的电穿孔器具可用于进行体外受精。例如，卵和精子可以流动通过如本文所述的电穿孔设备以实现卵的受精。
在进一步预期的方面，其中转染细胞的培养基或电穿孔缓冲液是低电导率且低渗量的培养基，任选地包含一种或多种营养物。在任何实施方案中，电穿孔介质的电导可以大于或等于约0.05mS/m、大于或等于约1mS/m、大于或等于约5mS/m、大于或等于约10mS/m、大于或等于约15mS/m、大于或等于约mS/m、大于或等于约25mS/m、大于或等于约30mS/m、大于或等于约50mS/m、大于或等于约100mS/m、大于或等于约150mS/m、或约200mS/m；或从约0.05mS/m至约200mS/m；约1mS/m至约30mS/m、约1mS/m至约20mS/m、约1mS/m至约10mS/m、约1mS/m至约5mS/m、约3mS/m至约30mS/m、约5mS/m至约20mS/m、或约5mS/m至约15mS/m。另外地或可替代地，电穿孔介质的渗量可以大于或等于约50mOsm/l、大于或等于约100mOsm/l、大于或等于约150mOsm/l、大于或等于约200mOsm/l、大于或等于约250mOsm/l、大于或等于约300mOsm/l、大于或等于约350mOsm/l、或约400mOsm/l；或从约50mOsm/l至约400mOsm/l、约50mOsm/l至约300mOsm/l、约50mOsm/l至约200mOsm/l、约100mOsm/l至约400mOsm/l、约100mOsm/l至约300mOsm/l、约200mOsm/l至约400mOsm/l、约200mOsm/l至约300mOsm/l、约250mOsm/l至约400mOsm/l、或约250mOsm/l至约300mOsm/l。
在任何实施方案中，电穿孔介质可包含一种或多种盐、糖和缓冲剂。合适的盐包括但不限于金属卤化物盐、磷酸盐、金属硫酸盐及其组合。合适的金属卤化物盐的实例包括但不限于氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化铬(CrCl3)、溴化钾(KBr)、溴化钠(NaBr)、氯化镁(MgCl2)、溴化镁(MgBr2)、氟化镁(MgF2)、碘化镁(MgI2)、溴化锂(LiBr)、碘化钾(KI)、碘化钠(NaI)和碘化锂(LiI)。合适的磷酸盐的实例包括但不限于磷酸一钠(NaH2PO4)、磷酸二钠(Na2HPO4)、磷酸三钠(Na3PO4)、磷酸一镁(Mg(H2PO4)2)、磷酸二镁(MgHPO4)、磷酸三镁(Mg3(PO4)2)、磷酸一钾(KH2PO4)、磷酸二钾(K2HPO4)、磷酸三钾(K3PO4)、磷酸一钙(Ca(H2PO4)2)、磷酸二钙(CaHPO4)、磷酸三钙(Ca3(PO4)2)和磷酸铬(CrPO4)。合适的金属硫酸盐的实例包括但不限于硫酸钠(Na2SO4)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸钙(CaSO4)和硫酸铬(Cr2(SO4)3)。在一些实施方案中，一种或多种盐可以是氯化钾、氯化镁、磷酸二钠、磷酸一钾、硫酸镁及其组合。
合适的糖的实例包括单糖、二糖或其组合。合适的单糖包括但不限于葡萄糖、果糖和半乳糖。合适的二糖包括但不限于由葡萄糖、果糖和半乳糖中的两种形成的二糖。例如，合适的二糖可以是蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或其组合。合适的缓冲剂的实例包括但不限于HEPES、三(羟甲基)和PBS(磷酸盐缓冲盐水)。
在任何实施方案中，一种或多种盐的每一种可以以约0.1mM至约200mM、约0.1mM至约150mM、约0.1mM至约100mM、约0.1mM至约80mM、约0.1mM至约60mM、约0.1mM至约40mM、约0.1mM至约20mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约20mM、或约1mM至约10mM的浓度存在于电穿孔介质中。例如，盐例如KH2PO4、Na2HPO4和MgSO4可以各自以约0.1mM至约20mM的浓度存在于电穿孔介质中。糖可以约20mM至约300mM、约20mM至约200mM或约40mM至约200mM的浓度存在于电穿孔介质中。缓冲剂可以约1mM至约100mM、约10mM至约50mM或约15mM至约30mM的浓度存在于电穿孔介质中。
其他合适的培养基包括但不限于：Cw100(0.11S/m，0.12osm/l)或Cw240，如表1所示。可以使用可商购的电穿孔介质，但是显示其是次优的。此类可商购的培养基包括：RPMI(1.37S/m，0.28osm/l)、BTX(8mS/m，0.27osm/l)、DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium))、稀释的PBS、或有或没有HEPES的PBS。培养基通常是导电培养基，并且还可以是无菌的。
表1.电穿孔介质的组成
在任何实施方案中，用于电穿孔的细胞可以按以下细胞密度存在于电穿孔介质中：大于或等于约1x106个细胞/ml、大于或等于约10x106个细胞/ml、大于或等于约50x106个细胞/ml、大于或等于约100x106个细胞/ml、大于或等于约150x106个细胞/ml、大于或等于约200x106个细胞/ml、大于或等于约250x106个细胞/ml、大于或等于约300x106个细胞/ml、大于或等于约400x106个细胞/ml或约500x106个细胞/ml；或从约1x106个细胞/ml至约300x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至约250x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至约200x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至约150x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至约100x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至约50x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至约300x106个细胞/ml、约1x106个细胞/ml至约250x106个细胞/ml、约10x106个细胞/ml至约200x106个细胞/ml、约10x106个细胞/ml至约150x106个细胞/ml、约10x106个细胞/ml至约100x106个细胞/ml、约10x106个细胞/ml至约50x106个细胞/ml、约100x106个细胞/ml至约300x106个细胞/ml、约100x106个细胞/ml至约250x106个细胞/ml、约100x106个细胞/ml至约200x106个细胞/ml、或约100x106个细胞/ml至约150x106个细胞/ml。
关于合适的电容，可以预期，电容的范围可以从约1μF至约150μF。在一些实施方案中，电容的范围可以从约1μF-100μF、从约5μF至约75μF、从约5μF至约50μF、从约10μF至约40μF、或从约10μF至约30μF或从约10μF至约25μF。在其他实施方案中，电容是约10μF。
在一些实施方案中，可以利用多个电脉冲连同相应的短时间常数。在一些方面，可以使用小于30毫秒、小于20毫秒、小于10毫秒或小于5毫秒的时间常数。在其他方面，时间常数的范围可以从约0.5到30毫秒、从约1到20毫秒、以及从约5到15毫秒；或约10毫秒。
在一些方面，电穿孔的电场强度是约0.3-3kV/cm。发现较低的电场强度(例如，约0.5-1kV/cm)适合EC-7细胞，而发现较高的电场强度(例如，约1-3kV/cm)适用于汉克细胞(hank cell)。通常，本文预期电穿孔的电场强度的范围从约0.1至约5kV/cm。可以选择电压以产生合适的电场强度。
通常，阻抗(Rp)的范围可以从约200Ω到无穷大，或者在其他情况下，从约200Ω到约1k。
添加到电穿孔反应中的货物浓度(例如，要运输到细胞中的材料)的浓度大于或等于约50μg/ml、大于或等于约100μg/ml、大于或等于约200μg/ml、大于或等于约300μg/ml大于或等于约400μg/ml、或约500μg/ml；从约50μg/ml至约500μg/ml、约50μg/ml至约400μg/ml、约50μg/ml至约300μg/ml、约50μg/ml至约200μg/ml、约50μg/ml至约100μg/ml、约100μg/ml至约500μg/ml、约100μg/ml至约400μg/ml、约100μg/ml至约300μg/ml、或约100μg/ml至约200μg/ml。在一些方面，将浓度约50μg/ml、60μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、100-300μg/ml、50-100μg/ml的GFP-mRNA或GFP-DNA添加到电穿孔介质中，而在其他实施方案中，将浓度约50μg/ml的右旋糖酐500k添加到电穿孔反应中。
在一些方面，在单室设备中可以实现在30分钟内以4x107个细胞/ml高达7.33uL/s(13.2mL(5.28x108个细胞))。为了在30分钟内达到20x109细胞，可以将细胞密度提高四倍，和/或可以使用多个电穿孔室进行平并行处理。
在一些方面，以及下面提供的实例中，电穿孔电子器件和参数可以专门设计用于电穿孔NK细胞(例如，haNK细胞、原代NK细胞、活化的(aNK)细胞)、EC7细胞、树突状细胞、CHO-S细胞、T细胞(例如原代CD4/CD8 T细胞)和干细胞(例如AD-MSC细胞)。
在一些实施方案中，细胞是以下中的一种或多种：NK细胞(例如，haNK细胞、原代NK细胞、活化的(aNK)细胞)、EC7细胞、树突状细胞、CHO-S细胞、T细胞(例如，原代CD4/CD8 T细胞)和干细胞(AD-MSC细胞)，并且电穿孔参数中的一个或多个如下：(i)以约20V至约50V的电压施加场强；(ii)脉冲宽度是约10μs至约750μs；以及(iii)电穿孔介质中细胞的细胞密度是约5x106个细胞/ml至约300x106个细胞/ml。
在一些实施方案中，细胞是EC-7细胞，货物是DNA，并且电穿孔参数中的一个或多个如下：(i)以约20V至约50V、约20V至40V或约20V至约30V的电压施加场强；(ii)脉冲宽度是约10μs至约100μs、10μs至约75μs或10μs至约50μs；(iii)脉冲数是2-6或2-3，以及(iv)电穿孔介质中细胞的细胞密度是约10x106个细胞/ml至约250x106个细胞/ml、约10x106个细胞/ml至约100x106个细胞/ml、或约50x106个细胞/ml至约100x106个细胞/ml。另外地或可替代地，具有DNA货物的经电穿孔的EC-7细胞可以在至少约70％、至少约80％、或至少约95％的转染效率的情况下具有至少约60％、至少约70％或至少约80％的活率。
在一些实施方案中，细胞是CHO-S细胞，货物是DNA，并且电穿孔参数中的一个或多个如下：(i)以约20V至约50V、或约30V至50V、约40V至约50V的电压施加场强；(ii)脉冲宽度是约100μs至约750μs、约250μs至约750μs或约500μs至约750μs；(iii)脉冲数是2-6或2-3，以及(iv)电穿孔介质中细胞的细胞密度是约50x106个细胞/ml至约250x106个细胞/ml、约50x106个细胞/ml至约125x106个细胞/ml、或约50x106个细胞/ml至约100x106个细胞/ml。另外地或可替代地，具有DNA货物的经电穿孔的CHO-S细胞可以在至少约70％、至少约80％、或至少约85％的转染效率的情况下具有至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的活率。
在一些实施方案中，细胞是T细胞(例如，原代CD4/CD8 T细胞)，货物是DNA或RNA，并且电穿孔参数中的一个或多个如下：(i)以约20V至约50V、或约30V至50V、约40V至约50V的电压施加场强；(ii)脉冲宽度为约100μs至约750μs、约100μs至约500μs或约200μs至约400μs；(iii)脉冲数是2-10或2-6，以及(iv)电穿孔介质中细胞的细胞密度是约10x106个细胞/ml至约300x106个细胞/ml、约20x106个细胞/ml至约250x106个细胞/ml、或约10x106个细胞/ml至约200x106个细胞/ml。另外地或可替代地，具有DNA或RNA货物的经电穿孔的T细胞(例如原代CD4/CD8 T细胞)可以在至少约20％、至少约80％、至少约90％或至少约99％的转染效率的情况下具有至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少90％的活率。
在一些实施方案中，细胞是NK细胞(例如，haNK细胞、原代NK细胞、活化的(aNK)细胞)，货物是DNA或RNA，并且电穿孔参数中的一个或多个如下：(i)以约20V至约50V、或约30V至50V、约40V至约50V的电压施加场强；(ii)脉冲宽度是约100μs至约750μs、约200μs至约750μs或约200μs至约600μs；(iii)脉冲数是2-6或2-3；以及(iv)电穿孔介质中细胞的细胞密度是约10x106个细胞/ml至约300x106个细胞/ml、约10x106个细胞/ml至约250x106个细胞/ml、或约10x106个细胞/ml至约100x106个细胞/ml。另外地或可替代地，具有DNA或RNA货物的经电穿孔NK细胞(例如，haNK细胞、原代NK细胞、活化的(aNK)细胞)可以在至少约10％、至少约50％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的转染效率的情况下具有至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的活率。
在一些实施方例中，细胞是树突状细胞，货物是DNA或RNA，并且电穿孔参数中的一个或多个如下：(i)以约20V至约50V、或约30V至50V、约30V至约40V的电压施加场强；(ii)脉冲宽度为约100μs至约750μs、约100μs至约500μs或约200μs至约400μs；(iii)脉冲数是2-10或6-8；以及(iv)电穿孔介质中细胞的细胞密度是约10x106个细胞/ml至约100x106个细胞/ml、约10x106个细胞/ml至约50x106个细胞/ml、或约10x106个细胞/ml至约25x106个细胞/ml。另外地或可替代地，具有DNA或RNA货物的经电穿孔的树突状细胞可以在至少约70％、至少约80％、或至少约90％的转染效率的情况下具有至少约70％、至少约80％或至少约90％的活率。
在一些实施方案中，细胞是干细胞(例如，AD-MSC细胞)，货物是DNA，并且电穿孔参数中的一个或多个如下：(i)以约20V至约50V、或约30V至50V、约30V至约40V的电压施加场强；(ii)脉冲宽度为约50μs至约250μs、约50μs至约100μs或约100μs至约200μs；(iii)脉冲数是2-10或6-8；以及(iv)电穿孔介质中细胞的细胞密度是约10x106个细胞/ml至约100x106个细胞/ml、约10x106个细胞/ml至约50x106个细胞/ml、或约10x106个细胞/ml至约25x106个细胞/ml。另外地或可替代地，具有DNA货物的经电穿孔的干细胞(例如，AD-MSC细胞)可以在至少约70％、至少约80％、或至少约90％的转染效率的情况下具有至少约70％、至少约80％或至少约90％的活率。
本文所述的方法可以应用于瞬时转染或稳定转染。术语“瞬时转染”是指核酸的引入或转染，该核酸仅在细胞中存在有限的一段时间，并且没有整合到基因组中。术语“稳定转染”是指以下转染，所述转染通过以下导致目的基因永久表达：转染的核酸整合到核基因组中，或维持转染的质粒作为细胞内额外的染色体复制附加体。
在任何实施方案中，本文所述的方法可以进一步包括第一细胞分选步骤和/或第二细胞分选步骤，例如，使用如本文所述的微流体设备。第一细胞分选步骤可以在引入电穿孔室之前通过以下分选细胞：施加压力以使包含细胞的第一溶液流动通过如本文所述的微流体室(所述微流体室包含如本文所述的多排柱)，并且利用多排柱使细胞偏转到室的一侧以耗尽来自离开如本文所述的第一输出机构的溶液的细胞并且富集离开如本文所述的第二输出机构的溶液中的细胞。离开第二输出机构的细胞可以与货物一起引入电穿孔室。第二细胞分选步骤可以在离开电穿孔室之后通过以下分选经电穿孔的细胞：施加压力以使包含经电穿孔的细胞的第四溶液流动通过如本文所述的微流体室(所述微流体室包含如本文所述的多排柱)，并且利用多排柱使经电穿孔的细胞偏转到室的一侧以耗尽来自离开如本文所述的第三输出机构的溶液的经电穿孔的细胞并且富集离开如本文所述的第四输出机构的溶液中的经电穿孔的细胞。
本文提供的技术和方法可以作为工作流的一部分集成到各种设备或平台中。例如，本文所述的电穿孔器具可以以例如盒形式并入自动化设备中，其中电穿孔可以与对细胞的一种或多种其他自动化过程一起进行。例如，自动电穿孔可以与如美国专利公开号2017/0037357(通过引用以其整体并入)中所述的自动细胞培养和收获一起进行。
在其他方面，提供了体内转染的方法，其中进行了上述方法，并且可以将例如与等渗缓冲液混合的转染细胞施用给患者以治疗疾病或障碍。疾病的实例包括但不限于线粒体障碍、心脏功能障碍、心力衰竭、自闭症、糖尿病和耳聋。本文还预期了本文所述的电穿孔器具可适于应用于受试者的靶组织以帮助递送药物或配制剂，例如帮助递送胰岛素或递送用于治疗糖尿病的药物。例如，可以将用于电穿孔的电极施加到皮肤上，或者可以皮下施用针样电极对。本文还预期了电穿孔器具和方法可用于腺病毒生产、蛋白质生产、细胞免疫疗法或再生医学。
本文还提供了试剂盒。例如，试剂盒可包括如本文所述的电穿孔器具，用于容纳用于转染的细胞和货物的第一容器，用于容纳经电穿孔的细胞的第二容器，用于将第一容器和第二容器流体连接至电穿孔器具的管道，以及任选地，合适的试剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包括第一包装，所述第一包装包括第一模块(例如，第一模块805)，所述第一模块例如容纳第一容器和管道的第一部分。试剂盒可进一步包括单独的第二包装，所述第二包装包括第二模块(例如，第二模块815)，所述第二包装例如容纳电穿孔器具和管道的第二部分。试剂盒还可包括单独的第三包装，所述第三包装包括第三模块(例如，第三模块825)，所述第三包装例如容纳第二容器和管道的第三部分。任选地，试剂可以存在于单独的第四包装中。第一、第二、第三和第四包装可以是无菌的。合适的试剂包括但不限于如本文所述的用于转染的细胞、如本文所述的电穿孔介质及其组合。另外地或可替代地，试剂盒可进一步包括电穿孔芯片、连接管道、器具、电穿孔工具、电穿孔缓冲液、补充剂、试剂及其组合。
实施例
实施例1.haNK细胞的转染。
在一些方面，haNK细胞电穿孔的条件如下表2中所示。
表2.haNK细胞电穿孔的条件
图7A-E示出了电穿孔反应的实验结果。图7A示出了具有变化的效率和活率的各种实验条件。值得注意的是，相对于GFP-mRNA电穿孔到haNK细胞中，使用IOCO电穿孔设备在1.5kv/cm、Rp 1k、10uF的条件下产生大于80％的效率和大于70％的活率。名称“reg”是指原始的微网，而“偏移”是指偏移的微网。图7B示出了已被电穿孔到汉克细胞中的GFP-mRNA的显微图像。图7C和7D示出了细胞分选的结果，其中图7C示出了活细胞，并且图7D示出了经电穿孔的细胞。图7E示出了与细胞分选结果相对应的直方图，示出了对照细胞和用GFP经电穿孔的细胞。
图8A-8D示出了在变化的电穿孔实验条件下的另一组实验结果，其中GFP-mRNA电穿孔到haNK中的效率大于50％、活率大于70％。图8B和8C示出了细胞分选的结果。其中图8B示出了活细胞，并且图8C示出了经电穿孔的细胞。图8D示出了与细胞分选结果相对应的直方图，示出了对照细胞和用GFP经电穿孔的细胞。在活细胞(碘化丙啶阴性，PI-)内计数GFP表达。CTL代表对照实验。
实施例2.EC7细胞的转染。
EC7细胞电穿孔的典型条件如下表3中所示
表3.EC7细胞电穿孔的条件
图9A-9D示出了EC-7细胞中电穿孔反应的实验结果。图9A示出了具有变化的效率和活率的各种实验条件。值得注意的是，使用IOCO电穿孔设备在1kv/cm、Rp 200、10uF的条件下导致GFP-DNA电穿孔进入EC-7细胞的效率大于约90％并且活率大于约50％。图9B-9C示出了细胞分选的结果，其中图9B示出了活细胞，并且图9C示出了经电穿孔的细胞。图9D是与细胞分选结果相对应的直方图，示出了对照细胞和用GFP经电穿孔的细胞。
图10A-10E示出了在变化的电穿孔实验条件下在EC-7细胞中的另外组的实验结果。图10B、10C和10D示出了细胞分选的结果，其中图10B示出了活细胞，并且图10C和10D示出了经电穿孔的活细胞。图10E示出了与细胞分选结果相对应的直方图，具有对照细胞和用GFP经电穿孔的细胞。在活细胞(碘化丙啶阴性，PI-)内计数GFP表达。CTL代表对照实验。
图11A-11C示出了使用图3A-C的偏移室电穿孔设备成功地电穿孔到EC-7细胞中的GFP-DNA的图像。
图11A是在电穿孔后20小时拍摄的，并且示出了GFP-DNA和GFP-AD5(编码用于AD5病毒产生的DNA)电穿孔到EC-7细胞中。图11B是在电穿孔后44小时拍摄，并且示出了GFP-DNA和DNA穿梭载体电穿孔到EC-7细胞中。图11C是在电穿孔后6天拍摄，并且示出了用微网相比于比色杯情况下电穿孔结果的比较。
图11C还示出了根据本文呈现的实施方案的在EC7细胞中AD5病毒产生的早期阶段期间的彗星状物形成。在这一系列图像中，细胞形成簇或“彗星”形的斑块，其中单个细胞的形状变得更圆。
如这些系列图像所示，EC-7细胞成功被用荧光标记的病毒DNA(用于AD5病毒的产生)电穿孔，并能够启动病毒的产生，表明本文提供的技术和系统适用于腺病毒的产生(例如，用于病毒疫苗中和病毒蛋白的产生)。
图12A和12B示出了使用本文描述的方法和设备转染EC7细胞的另外结果。图12A示出了电穿孔参数表，其中货物的量在电穿孔运行之间变化。在图12B中，示出了电穿孔六天后的图像。到电穿孔后十四天，观察到约70％-80％的效率。转染后观察到多个“彗星”状簇。可以在电穿孔缓冲液cw100中以约40m/ml的细胞浓度将约1700万-1800万个细胞/min转染到EC7细胞中，其电导是约240mS/m。
实施例3.各种细胞类型的电穿孔。
在其他方面，本文提供的方法和系统可以用于转染多种不同的细胞类型。例如，可以通过本文提供的方法和系统转染多达108个细胞或更多细胞。本文提供的方法和系统可用于转染EC7细胞、haNK细胞、CHO细胞和T细胞。例如，本文呈现的方法和技术可用于使用0.6ml/min的流速以4x107个细胞/ml的细胞浓度转染EC7细胞。在另一个实例中，本文呈现的方法和技术可用于使用0.36ml/min的流速以3x107个细胞/ml的细胞浓度转染haNK细胞。在又另一个实例中，本文提供的方法和技术可用于使用0.45ml/min的流速以2.5x107个细胞/ml的细胞浓度转染CHO细胞。对于T细胞，本文呈现的方法和技术可用于以0.44ml/min的流速以约2x107个细胞/ml的细胞浓度转染T细胞。可以进一步改变这些条件以获得最佳条件。
图13A-13D示出了使用本文描述的方法和设备针对这些不同细胞系的各种转染效率。图13A示出了对于haNK细胞(用GFP mRNA转染)，在细胞活率大于90％的情况下转染效率大于95％。转染了多达1.27亿个细胞/min。图13B示出了对于CHO细胞(用GFP DNA转染)，在细胞活率大于50％的情况下转染效率大于90％。转染了多达1500万个细胞//min。图13C示出了对于EC7细胞(用GFP腺病毒DNA转染)，在细胞活率大于50％的情况下转染效率大于95％。转染了多达2000万个细胞/min或更高。图13D示出了对于T细胞(用GFP mRNA转染)，在细胞活率大于80％的情况下转染效率大于90％。转染了多达880万个细胞//min。
实施例4.原代T细胞的转染
在其他方面，本文呈现的方法和系统已用于用附接至聚(β-氨基酯)的mRNA电穿孔原代T细胞。已经显示某些聚(β-氨基酯)聚合物可作为有效的RNA转染剂。
包含RNA和聚(β-氨基酯)聚合物的纳米颗粒已经用于将mRNA递送至T细胞(参见，例如，Moffett等人，Nature Communications[自然通讯](2017)8：389)。例如，在一些实施方案中，可以使用基于聚谷氨酸(PGA)的壳来产生纳米颗粒。靶向分子(例如，抗体的结合结构域)可以附接至PGA分子以将纳米颗粒靶向合适的靶。例如，为了将纳米颗粒靶向T细胞，可以将抗CD3/抗CD28结合结构域附接至PGA分子。PGA或任何其他合适的带负电荷的分子可以用于靶向。纳米颗粒的摄取可以通过特异性靶向或通过阳离子膜缔合而发生。
纳米颗粒的内部可以包含mRNA和载体分子，例如聚(β-氨基酯)。一旦纳米颗粒被吸收到细胞中，mRNA就通过纳米颗粒的降解、通过渗透溶胀或其他合适的过程释放到细胞中，并且mRNA被转录成其各自的蛋白质。在一些情况下，合成的mRNA可用于减少mRNA降解。
本文提供的方法可用于通过例如使用mRNA和聚(β-氨基酯)(PbAE)载体或使用包裹mRNA和聚(β-氨基酯)载体的纳米颗粒将mRNA转染到细胞中。图14A-14E示出了用与mRNA(不是游离的mRNA，并且没有电穿孔)复合的PbAE的T细胞转染。图13A示出了适合于与本文提供的技术一起使用的聚(β-氨基酯)的结构。图14B示出了使用PbAE用mRNA转染的T细胞的流式细胞术进行的细胞分选结果。图14C是图，其示出了基于mRNA与载体分子的变化的比率的活细胞归一化结果。图14D和14E示出了在刺激的T细胞(图14D)和未刺激的T细胞(图14E)中在针对GFP-mRNA转染的各种条件下的细胞活率结果。在这些实验中，PbAE∶RNA的比率为60∶1导致高水平的活细胞，同时提供高GFP递送速率。
图15A和15B示出了使用对照细胞(无电穿孔)和经电穿孔的细胞的T细胞GFP mRNA转染。特别地，图15A示出了对照细胞(无电穿孔)，其中主要观察到背景荧光。图15B示出了经电穿孔的细胞，其中在大多数细胞中检测到的GFP-mRNA，如直方图所示。
实施例5.脂肪衍生的间充质干细胞(AD-MSC)的转染
脂肪衍生的间充质干细胞(AD-MSC)分离并以每毫升约1x10^5百万的密度收获。用PBS和电穿孔缓冲液洗涤细胞，并以每毫升330万个细胞的密度悬浮在电穿孔缓冲液中。每种条件均以0.1毫升的最终细胞密度和30μg的DNA电穿孔。电穿孔条件是：脉冲宽度＝100us，脉冲周期＝340ms，电场强度从0.9到1.6kV/cm变化，如下表4中所示
表4.电穿孔场强条件
编号 kv/cm
1 1.6
2 1.5
3 1.4
4 1.3
5 1.2
6 1.1
7 1.0
8 0.9
电穿孔后，将细胞以每平方厘米30x10^3个细胞的密度接种。在电穿孔后24小时，用流式细胞术验证了GFP的表达效率。结果显示在图16A-16D中。表16A-15C的每一个中的x轴值1-8对应于表4中所示的场强，并且“CTL”对应于没有电穿孔的对照。图16A示出了电穿孔后24小时的细胞活率。电场强度越低，细胞越有活力。图16B示出了在电穿孔后24小时通过流式细胞术的GFP(绿色荧光蛋白)表达读数，用于细胞转染效率测量。电场越强，活细胞表达GFP的百分比越高。图16C示出了GFP荧光的中值，其表示GFP在流式细胞术测量中的亮度程度。电场越强，测得的GFP越亮。结果表明，在1.1到1.3kv/cm之间的电场强度可在活率和效率之间提供最佳性能。请注意，此处的活率包括附着的细胞和上清液，以反映真实的总体活率。图16D是MSC转染结果的照片。左手的照片示出了MSC的形态，并且右手的图像是同一光场的荧光图像，表明大多数细胞表达绿色荧光蛋白(绿色)。
实施例6.EC-7细胞、CHO-S细胞、原代CD4/CD8 T细胞、haNK细胞、原代NK细胞、活化的NK细胞、树突状细胞、AD-MSC细胞的转染。
将EC-7细胞、CHO-S细胞、原代CD4/CD8 T细胞、haNK细胞、原代NK细胞、活化的NK细胞、树突状细胞、AD-MSC细胞在与图2A中所描绘的器具类似的器具中电穿孔，其中电穿孔参数在下表5中显示。
表5.电穿孔
n参数
表5中使用的电穿孔介质(“电培养基”)1和2的组成在下表6和7中显示。
表6.电穿孔介质1组成
表7.电穿孔介质1组成
在下表8中提供了根据给定参数对表5中的细胞进行电穿孔的结果。
表8.电穿孔结果
图17示出了根据本披露的另一个示例性实施方案的示例性电穿孔系统1700。如图17所示，系统1700包括用于泵1701的安装座和位于两个I/O盒1703之间的芯片组件1720(其可以称为电穿孔室)。例如，芯片组件1720可以经由管道和无菌连接器1704之一连接到两个I/O盒1703之一的输出。在各种实施方式中，常闭连接器可用于连接管道。如图17所示，每个I/O盒1703可以连接至通风口1702以允许过量空气逸出I/O盒1703。
泵1701可以经由管道和无菌连接器1704中的另一个连接至I/O盒1703中的一个的输入。一个或多个泵1701可用于产生通过芯片组件1720的流体流。芯片组件1720可以选择性地耦合到系统1700和从系统1700解耦合，以允许在系统1700中使用不同的芯片组件，如下文进一步描述的。例如，系统1700可以包括可拆卸地安装不同芯片组件的芯片保持器结构，并且任选的芯片传感器位于邻近芯片保持器结构。
系统1700可以包括扫描仪、用户界面等，其可以被编程以识别或验证放置在系统1700中的芯片组件1720，以选择要使用芯片组件1720执行的一个或多个操作，等等。在各种实施方式中，芯片组件1720可以是伽马辐射兼容的。系统1700可以允许使用要与芯片组件1720一起使用的各种消耗品、缓冲液等。在一个实施方案中，用于每个芯片组件1720的系统1700是一次性使用的封闭系统设计，其具有连接至输入和输出器皿的常闭鲁尔连接器，以用于细胞样品的简单且无菌的连接和断开。在各种实施方式中，例如，如果连接在罩外，则可以使用比如CPC AseptiQuick等无菌连接器来提供无菌连接。
图18示出了用于在具有货物的情况下对细胞进行电穿孔的示例性装置，其包括电穿孔室1820(其可以被称为芯片或芯片组件)。电穿孔室1820包括第一电极1840和第二电极1842，其中三个流体通道层1825、1826和1827位于电极1840和1842之间。每个流体通道层1825、1826和1827可以包括流体通道1835(其可以被称为路径)。例如，含有细胞(和任选的货物)的流体可以经由流体通道1835横向流过电穿孔室1820，而流体通道1835的形状限定流体行进的特定路径。
如图18所示，流体通道层1825、1826和1827可以彼此对准，因此每一层1825、1826和1827的流体通道1835也对准。电极1840和1842可以彼此对准并且与层1825、1826和1827对准，以形成夹层布置，其中每个电极1840和1842的周界以及每个通道层1825、1826和1827的周界基本上是相同。在各种实施方式中，通道层1825、1826和1827中的一者或多者的长度和/或宽度可以大于电极1840和1842的长度和/或宽度，以抑制电极1840和1842无意地接触另一个造成短路。
电穿孔室1820可以包括第一支撑层1815和第二支撑层1816。如图18所示，电极1840和1842以及通道层1825、1826和1827可以位于支撑层1815和1816之间。电穿孔室1820还包括第一板1817和第二板1818(其可称为外壳板或盖板)。板1817和1818可以布置为电穿孔室1820的最外层，如图18所示。
支撑层1815和1816以及板1817和1818可以向电极1840和1842以及通道层1825、1826和1827提供结构支撑。支撑层1815和1816可以与电极1840和1842以及通道层1825、1826和1827对准，使得每层的周界在电穿孔室1820中具有大致相同的覆盖区。在各种实施方式中，支撑层1815和1816可以具有比电极1840和1842更大的长度和/或宽度，以抑制电极1840和1842接触另一导电表面而产生短路。
板1817和1818可以与支撑层1815和1816、电极1840和1842以及通道层1825、1826和1827对准，使得每层的周界在电穿孔室1820中具有大致相同的覆盖区。在各种实施方式中，板1817和1818可具有比其他层更大的长度和/或宽度(例如，如图18所示)，以抑制电极1840和1842或其他层接触外部元件。电穿孔室的其他实施方案可以具有更多或更少的图18所示的层。例如，可以有更多或更少的流体通道层、更多或更少(或没有)支撑层等。
如图18所示，电穿孔室包括输入1810和输出1830。输入1810可以允许细胞和货物进入电穿孔室1820，而输出1830允许来自电穿孔室1820的电穿孔细胞通过。输入1810和输出1830可以分开一定的偏移距离，以有助于细胞横向流动通过电穿孔室1820，例如通过通道层1825、1826和1827的流体通道1835的路径。
例如，输入1810和输出1830可以限定板1818(当电穿孔室接收在电穿孔器具中时，其可以被认为是顶板)中的开口。如图18所示，支撑层1816和电极1842还包括与输入1810和输出1830对准的开口。因此，细胞和货物可以通过输入1810流入电穿孔室1820，继续通过支撑层1816和电极1842中的相应开口，并到达流体通道1835。然后，含有细胞和货物的流体在经历电穿孔时穿过流体通道1835，并经由电极1842和支撑层1816中的对应孔通过输出1830离开。
图18中所示且未标记的其他开口或孔可表示用于例如经由螺钉、塞子等连接电穿孔室的各个部件的开口。在一个实施方案中，板1817和1818可以包括用于香蕉插头的四个孔和用于连接鲁尔插座的两个螺纹孔(例如，通过管道向电穿孔室1820供应流体和从电穿孔室1820供应流体)。
通道层1825、1826和1827可以包括用于允许流体在流体通道1835中流动的任何合适的材料。例如，通道层1825、1826和1827可以包括聚对苯二甲酸乙二酯(PET)材料、压敏粘合剂(PSA)材料、硅树脂垫圈材料等。在各种实施方式中，中间通道层1825可包括PET材料，而外通道层1826和1827包括PSA材料，以将通道层1825、1826和1827粘附在一起。
例如，外通道层1826和1827可以是厚度为约100微米的双面PSA材料，其中通道层1825是厚度为约100微米的PET膜，使得全通道结构具有厚度为约300微米并提供电极1840和1842之间的密封。在各种实施方式中，流体通道1835的高度(即，通道层1825、1826和1827的厚度)在流体通道1835的整个长度上(例如，从入口到出口)可以是均匀的，以便确定电穿孔过程中施加到细胞上的电场。在其他实施方案中，可以使用任何合适的流体通道高度，例如约100微米、200微米、400微米、500微米、一毫米等。
电极1840和1842可包括固体电极(例如固体板状电极)，或者是具有孔隙度的网状电极(例如微网电极)。在一个实施方案中，电极1840和1842均为固体电极，例如固体板电极。在各种实施方式中，电极1840和1842可以包括固体金属板(类似于图2C中所示的板)的阵列。每个固体金属板可以被配置为施加独立的电场以形成特定的电场图案。
可以形成电极1840和1842的合适材料包括但不限于不锈钢、聚酰亚胺、硅、贵金属、第4族金属、导电材料及其组合。合适的贵金属的实例包括但不限于钌(Ru)、铑(Rh)、钯(Pd)、银(Ag)、锇(Os)、铱(Ir)、铂(Pt)和金(Au)。第4族金属的实例包括钛(Ti)、锆(Zr)、铪(Hf)和鈩(Rf)。合适的导电材料的实例包括但不限于氧化铟锡(ITO)，碳纳米管(CNT)和导电聚合物，例如聚(3，4-亚乙基二氧基噻吩)聚苯乙烯磺酸盐(PEDOT:PSS)。在一个实施方案中，电极1840和1842均由316不锈钢垫片原料制成，具有约0.004英寸的厚度。
支撑层1815和1816以及板1817和1818可以包括任何合适的材料，用于例如为电极1840和1842提供结构支撑，包含流体(该流体包括流体通道层1825、1826和1827中的细胞)等。实例可包括但不限于无孔材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)丙烯酸、聚乙烯、聚丙烯、金属板、压敏粘合剂(PSA)、PET材料、丙烯酸玻璃、注射模制塑料等。在一个实施方案中，支撑层1815和1816中的每一个都包括双面PSA材料以将板1817和1818与电极1840和1842粘合在一起，并且板1817和1818各自都是四分之一英寸厚的丙烯酸板。
图19示出了组装形式的电穿孔室1820(或芯片组件)，其中各层被压缩在一起。如图19所示，板1817和1818形成组件的外侧，并且其他层夹在板1817和1818之间。板1818包括用于将含有细胞的流体供应至电穿孔室1820(例如，经由管道或另一合适的流体递送系统)的输入1810，以及用于将电穿孔的细胞供应出电穿孔室1820(例如，经由管道或其他合适的流体递送系统)的输出1830。
图19所示的芯片组件可以用在电穿孔器具内，例如图17的系统1700。例如，多个芯片组件可以选择性地插入系统中以用于各种细胞的电穿孔。在每次电穿孔过程之后，或者当需要新的细胞类型进行电穿孔时等，可以将图19的芯片组件从电穿孔系统中移除并用另一芯片组件替换。
如下文进一步描述的，不同的芯片组件可以具有不同体积的流体通道1835、流体通道1835的不同形状的流动路径等。各种芯片组件可以具有相同的尺寸或覆盖区，使得不同的体积或流动路径芯片组件可以在电穿孔系统中互换。在一个示例实施方式中，具有三种不同体积的流体通道的芯片组件可以选择性地插入到电穿孔系统中，其中具有大体积芯片组件(例如，其中流体通道1835的体积为约500微升)、中等体积芯片组件(例如，其中流体通道1835的体积为约250微升)，以及小体积芯片组件(例如，其中流体通道1835的体积为约50微升)。在其他实施方式中，更多或更少的芯片组件设计可以与电穿孔系统一起使用，每个芯片组件可以具有比上面提供的那些更大或更小的流体通道体积，等等。
图20示出了示例性通道层2025，其可以是电穿孔室(例如图18的电穿孔室1820)的一部分。通道层2025包括具有多个弯曲部分和多个直线路径部分(其可以被称为S形路径)的流体通道2035。图20示出了具有八个弯曲部分和九个直线部分(其中七个全长和两个半长位于流体通道2035的每一端)的流体通道2035。流体通道2035可以被认为是单个S曲线图案的四个完整周期的一半。
当通道层2025被接收在电穿孔系统中时，包括细胞的流体可以被馈送到流体通道2035的一个入口端，行进穿过流体通道2035的S曲线以进行电穿孔，并且经由流体通道的另一出口端离开。流体通道2035的体积可以确定通道中流体的体积流速，并且可以与电穿孔过程的电脉冲同步。在一些实施方式中，流体通道2035可以具有大约500微升的体积(其能够在指定的时间段内处理例如多达二十亿个或更多的细胞)。在其他实施方式中，流体通道2035可以包括更大或更小的流体体积(例如，约25微升、50微升、100微升、200微升、250微升、300微升、400微升、750微升、1毫升等)、更多或更少的弯曲部分、更厚或更窄的通道宽度、更长或更短的通道部分长度、其他合适的路径形状等。
图21示出了示例性通道层2125，其可以是电穿孔室(例如图18的电穿孔室1820)的一部分。通道层2125包括具有多个弯曲部分和多个直线路径部分(其可以被称为S形路径)的流体通道2135。类似于图20的流体通道2035，图21示出了具有八个弯曲部分和九个直线部分(其中七个全长和两个半长位于流体通道2135的每一端)的流体通道2135。
与图20的流体通道2035相比，图21的流体通道2135具有相对于弯曲部分更短的长度部分。因此，流体通道2135可具有比图20的流体通道2135更小的流体体积。例如，流体通道2135可具有约250微升的流体体积(其能够在指定时间段内处理例如约5亿个细胞)。在其他实施方式中，流体通道2135可包括更大或更小的流体体积、更多或更少的弯曲部分、更厚或更窄的通道宽度、更长或更短的通道部分长度、其他合适的路径形状等。
图22示出了示例性通道层2225，其可以是电穿孔室(例如图18的电穿孔室1820)的一部分。通道层2225包括具有单个直线部分的流体通道2235(与图20和图21的流体通道2035和2135的具有多个弯曲部分的S形曲线相反)。因此，图22的流体通道2235可具有比图20和21的流体通道2035和2135更小的流体体积。
当通道层2225被接收在电穿孔系统中时，包括细胞的流体可以被馈送到流体通道2235的一端，行进穿过流体通道2235的直线以进行电穿孔，并且经由流体通道的另一端离开。在一些实施方式中，流体通道2235可以具有大约50微升的体积(其能够在指定的时间段内处理例如约5000万个细胞)。在其他实施方式中，流体通道2235可以包括更大或更小的流体体积、更厚或更窄的通道宽度、更长或更短的通道长度、其他合适的路径形状等。
图23示出了另一个示例通道层2325，包括流体通道2335。图23中提供的示例尺寸仅用于说明目的。例如，流体通道2335具有三毫米的宽度。通道宽度可以在具有不同体积的不同芯片组件间变化，但是在一个通道层2325的单个流体通道2335内，通道宽度可以从通道的入口到出口保持恒定。这可以有助于维持流体通道2335内恒定的细胞流速。基于图23所示的流体通道2335的直线部分和弯曲部分的尺寸，流体通道2335可具有大约500微升的总流体体积。在其他实施方式中，通道层2325和流体通道2335可以具有任何其他合适的尺寸。例如，在各种实施方式中，流体通道2335的宽度可以是约一毫米、两毫米、四毫米、五毫米、十毫米等。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护某些实施方案的表达成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实施方案中，本书面说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据通过具体实施方案试图获得的所需特性而变化。在一些实施方案中，数值参数应当按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术来解释。虽然阐述一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可行地精确地报告。在一些实施方案中提供的数值可以含有必然由其各自测试测量中所发现的标准偏差引起的某些误差。
如本文的说明书和随后的整个权利要求中所用，除非上下文清楚地另外指明，否则“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该(the)”的含义包括复数参照物。而且，如本文的说明书中所用，除非上下文清楚地另外指明，否则“在......中”的含义包括“在......中”和“在......上”。除非上下文指示相反，否则本文所列出的所有范围应被解释为包括其端点，并且开放式范围应被解释为包括商业实用值。类似地，除非上下文指示相反，否则应当将值的所有列表视为包括中间值。
对于本领域技术人员也应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了本文已经描述的那些之外的更多修改是可能的。此外，在解释本说明书和权利要求时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，表明所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或利用、或组合。在本说明书的权利要求提及选自由A、B、C......和N组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要组中的一种要素，而不是A加N或B加N等。

Claims (20)

1.一种用于在有货物情况下电穿孔细胞的芯片组件，该芯片组件包括：
第一电极；
第二电极；
位于该第一电极和该第二电极之间的流体通道层，该流体通道层限定流体通道以允许包含这些细胞和该货物的流体在电穿孔过程期间流动；
第一外壳板，该第一外壳板限定输入开口，用于接收包含这些细胞和该货物的流体并将接收的流体供应到该流体通道层的流体通道，并且该第一外壳板限定输出开口，用于有助于经电穿孔的细胞从该流体通道流出该芯片组件；
第二外壳板；
位于该第一外壳板和该第一电极之间的第一支撑层，该第一支撑层和该第一电极各自限定对应于该第一外壳板的输入开口的第一开口和对应于该第一外壳板的输出开口的第二开口；和
位于该第二电极和该第二外壳板之间的第二支撑层。
2.如权利要求1所述的芯片组件，其中该流体通道层是第一流体通道层，该芯片组件进一步包括：
位于该第一流体通道层和该第一电极之间的第二流体通道层，其中该第二流体通道层限定与该第一流体通道层的流体通道具有相同形状的流体通道；和
位于该第一流体通道层和该第二电极之间的第三流体通道层，其中该第二流体通道层限定与该第一流体通道层的流体通道具有相同形状的流体通道，并且其中该第一流体通道层、该第二流体通道层和该第三流体通道层的流体通道彼此对准。
3.如权利要求2所述的芯片组件，其中：
该第二流体通道层和该第三流体通道层各自包含压敏粘合剂；并且
该第一流体通道层包含聚对苯二甲酸乙二酯(PET)材料。
4.如权利要求2所述的芯片组件，其中该第一流体通道层、该第二流体通道层和该第三流体通道层的对准的流体通道的高度从这些对准的流体通道的入口到这些对准的流体通道的出口是均匀的，以在该电穿孔过程中向这些对准的流体通道中的流体施加均匀的电场。
5.如权利要求4所述的芯片组件，其中该第一流体通道层、该第二流体通道层和该第三流体通道层的这些对准的流体通道的高度是300微米。
6.如权利要求1所述的芯片组件，其中所限定的流体通道的宽度从该流体通道的入口到该流体通道的出口是均匀的，以有助于通过该流体通道的细胞流速恒定。
7.如权利要求6所述的芯片组件，其中所限定的流体通道的宽度是三毫米。
8.如权利要求1所述的芯片组件，其中所限定的流体通道在该通道的入口和该通道的出口之间具有S形曲线布置，并且该S形曲线布置包括八个弯曲部分。
9.如权利要求1所述的芯片组件，其中所限定的流体通道的体积是500微升。
10.如权利要求1所述的芯片组件，其中所限定的流体通道的体积是250微升。
11.如权利要求1所述的芯片组件，其中所限定的流体通道是从该通道的入口到该通道的出口的直线路径。
12.如权利要求1所述的芯片组件，其中所限定的流体通道的体积是50微升。
13.如权利要求1所述的芯片组件，其中：
该第一电极和该第二电极各自包含不锈钢；
该第一支撑层与该第二支撑层各自包含压敏粘合剂(PSA)材料；并且
该第一外壳板和该第二外壳板各自包括丙烯酸材料。
14.如权利要求1所述的芯片组件，其中该第一外壳板的输入开口和输出开口适于接收鲁尔连接器用于连接管道以有助于流体流入和流出所限定的流体通道。
15.一种在有货物情况下电穿孔细胞的方法，该方法包括：
使这些细胞与该货物一起流入电穿孔室，其中该电穿孔室包含：
第一电极；
第二电极；
位于该第一电极和该第二电极之间的流体通道层，该流体通道层限定流体通道以允许包含这些细胞和该货物的电穿孔介质在电穿孔过程期间流动；
第一外壳板，该第一外壳板限定输入开口，用于接收包含这些细胞和该货物的电穿孔介质并将接收的电穿孔介质供应到该流体通道层的流体通道，并且该第一外壳板限定输出开口，用于有助于经电穿孔的细胞从该流体通道流出该电穿孔室；
第二外壳板；
位于该第一外壳板和该第一电极之间的第一支撑层，该第一支撑层和该第一电极各自限定对应于该第一外壳板的输入开口的第一开口和对应于该第一外壳板的输出开口的第二开口；和
位于该第二电极和该第二外壳板之间的第二支撑层，
其中这些细胞悬浮于电穿孔介质中并且具有约1x106个细胞/ml至约500x106个细胞/ml的细胞密度；并且
向该电穿孔室内的这些细胞施加多个电脉冲，
其中：
(i)每个电脉冲具有指数放电波形或方波形的形式；
(ii)以约0.3kV/cm至约3kV/cm的场强施加该多个电脉冲；
(iii)以约15V至约100V的电压施加该场强；
(iv)每个电脉冲之间的持续时间是约0.1秒至约10秒；并且
(v)每个电脉冲具有约10μs至约10,000μs的脉冲宽度。
16.如权利要求15所述的方法，其中该流动以步进方式进行，其中在指定的时间间隔下将大于或等于该电穿孔室总体积的约一半的流体体积泵入该电穿孔室中，并且这些细胞和该货物的流速是约0.1ml/min至约15ml/min。
17.如权利要求15所述的方法，其中这些细胞暴露于该电穿孔室内的均匀或基本均匀的电场。
18.如权利要求15所述的方法，其中该多个电脉冲是2个脉冲至10个脉冲。
19.如权利要求15所述的方法，其中该货物是核酸。
20.如权利要求15所述的方法，其中：
该流体通道层是第一流体通道层；
第二流体通道层位于该第一流体通道层和该第一电极之间，并且该第二流体通道层限定与该第一流体通道层的流体通道具有相同形状的流体通道；并且
第三流体通道层位于该第一流体通道层和该第二电极之间，该第二流体通道层限定与该第一流体通道层的流体通道具有相同形状的流体通道，并且该第一流体通道层、该第二流体通道层和该第三流体通道层的流体通道彼此对准。
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WO2019083447A1 (en) * 2017-10-23 2019-05-02 National University Of Singapore PLANAR MODULAR MICROFLUIDIC SYSTEM
AU2019301062A1 (en) * 2018-07-09 2021-02-04 NanoCav, LLC Micro flow-through electroporation devices and methods of cell transfection
GB2599531A (en) * 2019-06-27 2022-04-06 Emulate Inc Compound distribution in microfluidic devices
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