DE112017002816T5

DE112017002816T5 - Selektives verändern einer mikrobiota zur immunmodulation

Info

Publication number: DE112017002816T5
Application number: DE112017002816.7T
Authority: DE
Inventors: Jasper Clube; Morten Sommer; Christian Grøndahl; Ruben VAZQUEZ-URIBE; Eric VAN DER HELM
Original assignee: SNIPR Technologies Ltd
Current assignee: SNIPR Technologies Ltd
Priority date: 2016-06-05
Filing date: 2017-06-04
Publication date: 2019-02-14
Also published as: AU2022246439B2; IL263255A; US11471531B2; US20180140698A1; US20190321468A1; US20190240326A1; AU2020257117A1; US20190321469A1; IL279571A; AU2021202550A1; US20190134194A1; AU2017276620B2; WO2017211753A1; JP2019517529A; US20200390886A1; US10195273B2; US20180303934A1; US11351252B2; AU2017276620A1; CN116474121A

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Modulieren von Immunzellen bei einem Patienten durch Veränderung der Mikrobiota des Patienten. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Modulieren von Behandlungen oder Therapien bei einem Probandenorganismus durch Verändern der Mikrobiota des Probanden. Die Erfindung betrifft ferner Zellpopulationen, Systeme, Arrays, Zellen, RNA, Sets und sonstige Mittel zur Entfaltung der vorgenannten Wirkungen. In einem Beispiel wird zur Bewirkung der Veränderung eine vorteilhafte Selektion auf eine bestimmte Art in einer menschlichen Darmflora unter Verwendung einer geführten Nukleinsäuremodifikation durchgeführt.

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Modulieren von Immunzellen bei einem Patienten (endogenen Zellen des Patienten und/oder verabreichten Zellen, z.B. bei einer adoptiven Zelltherapie) durch Verändern einer Mikrobiota des Patienten. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Modulieren von Behandlungen oder Therapien bei einem Probandenorganismus durch Verändern der Mikrobiota des Probanden. Die Erfindung betrifft ferner Zellpopulationen, Systeme, Sets, und sonstige Mittel zur Entfaltung der vorgenannten Wirkungen. In einem Beispiel wird zur Bewirkung der Veränderung selektiv auf eine bestimmte Art bei einer menschlichen Darmflora unter Verwendung einer geführten Nukleinsäuremodifikation gezielt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zu einem Immuntherapieansatz gehört die zellentechnische Modifizierung der Immunzellen des Patienten (bzw. eines Spenders), um CARs (Cell-surface Antigen Receptors) zu exprimieren, die Tumoren erkennen und angreifen. Obwohl diese adoptiver Zelltransfer (ACT) genannter Ansatz bislang auf kleinere klinische Versuche beschränkt ist, haben Behandlungen unter Verwendung dieser modifizierten Immunzellen bei Patienten mit fortgeschrittenen Krebserkrankungen mitunter zu bemerkenswertem Ansprechen geführt.
Der chimäre Antigenrezeptor (CAR) besteht aus einer aus einem Antikörper abgeleiteten Zielungsdomäne, die mit T-Zell-Signalisierungsdomänen, die bei Expression durch eine T-Zelle der T-Zelle eine von der Zielungsdomäne des CAR bestimmten Antigenspezifizität verleiht, fusioniert ist. Potentiell können CARs die Effektorfunktionen einer T-Zell auf ein beliebiges proteinöses und nicht proteinöses Ziel umleiten, das auf der Zelloberfläche exprimiert wird, solange eine antikörperbasierte Zielungsdomäne zur Verfügung steht. Dadurch umgeht diese Strategie die Voraussetzung des Verarbeitens und Präsentierens von Antigenen durch die Zielzelle und findet auf nicht klassische T-Zell-Ziele wie z.B. Kohlenhydrate Anwendung. Diese Umgehung der HLA-Einschränkung heißt, dass der CAR-T-Zell-Ansatz als generisches Werkzeug verwendet werden kann, womit das Anwendungspotenzial der adoptiven T-Zell-Therapie erweitert wird. Vgl. z.B. Methods Mol Biol. 2012;907:645-66. doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_36, „Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy", Cheadle EJ et al.
Das erste CAR-T-Konstrukt wurde 1989 in einer Arbeit von Zelig Eshhar, einem Vorreiter auf dem Gebiet der Immuntherapie, in PNAS beschrieben. Die Struktur des CAR umfasst nunmehr eine Transmembran-Polypeptidkette, die eine Chimäre unterschiedlicher Domänen aus unterschiedlichen Zellproteinen darstellt. Bspw. weist der CAR einen extrazellulären Teil auf, der (häufig über eine Linker- und/oder Hinge-Region) mit einem intrazellulären Teil verbunden ist, wobei ein Transmembran-Anteil des CAR den Rezeptor in der Membran einer Immunzelle - normalerweise einer T-Zelle - einbettet. Der extrazelluläre Anteil umfasst eine Antikörperbindungsstelle (üblicherweise in Form eines scFv, z.B. aus einem Maus-mAb abgeleitet), die ein Zielantigen erkennt, bei dem es sich üblicherweise um ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) auf der Oberfläche von Krebszellen handelt. Auf diese Weise wird bei der Antigenerkennung auf TCRs verzichtet, die eine MHC-restringierte Antigenpräsentation erfordern, und bei denen Bindungsaffinitäten womöglich relativ gering sind. Der intrazelluläre Anteil des CAR umfasst typischerweise eine CD3-zeta-Domäne (CD3ζ) zur intrazellulären Signalisierung, wenn an die extrazelluläre Bindungsstelle ein Antigen gebunden ist. CARs der späteren Generationen umfassen auch eine weitere Domäne, die T-zellvermittelte Reaktionen verstärkt; hierbei handelt es sich häufig um eine intrazelluläre 4-1BB- (CD137) oder CD28-Domäne. Bei Auffinden des verwandten Antigenliganden der CAR-Bindungsstelle kann der CAR die intrazelluläre Signalisierung aktivieren und somit die CAR-T-Zelle aktivieren, um das Abtöten der Tumorzellen zu verstärken.
Die meisten CAR-Ts expandieren in vivo, also gestaltet sich die Dosistitration im herkömmlichen Sinne schwierig, und in vielen Fällen scheinen die modifizierten T-Zellen „ewig“ aktiv zu sein - d.h. die Beobachtung einer andauernden B-Zell-Aplasie, die bei den bisher meisten klinischen Studien zu CD19-CAR-T gemacht worden ist. Für CAR-T-Zell-Ansätze stellt dies ein schwerwiegendes Problem dar. Einige der beobachteten Risiken bespricht Discov Med. 2014 Nov;18(100):265-71, „Challenges to chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy for cancer", Magee MS & Snook AE, in dem erklärt wird, dass das erste schwere unerwünschte Ereignis im Anschluss an eine CAR-T-Zell-Behandlung bei einem Patienten mit Darmkrebs mit Lungen- und Lebermetastasen aufgetreten ist (Morgan et al., 2010). Dieser Patient wurde mit T-Zellen behandelt, die einen CAR der 3. Generation exprimierten, der auf EGF-Rezeptor 2 (ERBB2, HER2) zielte. Der CAR enthielt ein aus dem 4D5-Antikörper (Trastuzumab) abgeleitetes scFv, das von der US-Arzneimittelbehörde FDA für die Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs zugelassen ist (Zhao et al., 2009). Bei dem Patienten entwickelte sich binnen 15 Minuten nach der Einnahme einer Einzeldosis 1010 CAR-T-Zellen eine Atemnot, gefolgt durch mehrere Herzstillstände über 5 Tage und letztendlich durch den Tod. Eine Serumanalyse vier Stunden nach der Behandlung zeigte deutliche Zunahmen der Zytokine IFNγ, GM-CSF, TNFa, IL-6 und IL-10. CAR-T-Zellen wurden in der Lunge sowie in den Bauch- und Mediastinallymphknoten, aber nicht in Tumormetastasen aufgefunden. Die Prüfer führten die Toxizität auf die Erkennung von HER2 im Lungenepithel zurück, was zu einer inflammatorischen Zytokinfreisetzung führte, die Lungentoxizität und Zytokinfreisetzungssyndrom (CRS) hervorrief, was zu Multiorganversagen führte (Morgan et al., 2010). Versuche, bei denen auf HER2 gezielte CARs der 2. Generation, die aus einem anderen Antikörper (FRP5) abgeleitet sind, und bei denen konservative Dosiseskalationsansätzen gefolgt wird, werden derzeit von anderen Forschern für verschiedene HER2+ - Malignome durchgeführt (clinicaltrials.gov, Kennzeichen NCT01109095, NCT00889954 und NCT00902044).
Eine Variation des CAR-T-Zell-Themas sind mit Antikörpern gekoppelte T-Zell-Rezeptor-Therapeutika (ACTR), die CD16A (FCγRIIIA) verwenden, um die Fc-Regionen von tumorspezifischem IgG zu binden (siehe z.B. WO2015/058018 , US2015139943 ). Ziel ist es dabei, eine bessere Steuerung der CAR-T-Zell-Aktivität in vivo durch Titrieren des an die Patienten verabreichten IgG zu ermöglichen. Den CD16-Bindungsstellen der CAR-T-Zellen bleibt indes auch freigestellt, sich auch an endogenes IgG der Patienten zu binden, was die Attraktivität des Ansatzes reduziert. Bei diesem Ansatz muss auch die von Natur aus lange Halbwertzeit des IgG im Organismus (etwa 20 Tage für IgG beim Menschen) berücksichtigt werden, die die Steuerung der Aktivität von CAR-Zellen einschränken kann. Bei den derzeit andauernden Studien wird diese Gefahr womöglich bewertet.
Wünschenswert wäre es, eine alternative Möglichkeit zum Modulieren (Hoch- oder Herunterregulieren) von immunzellbasierten Therapien wie z.B. CAR-T-Zell-Ansätze und sonstige zellbasierte Ansätze bereitzustellen. Es wäre auch wünschenswert, eine Möglichkeit zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen, die durch endogene Immunzellen vermittelt werden, z.B. Autoimmun-, Entzündungs- und Infektionskrankheiten und -zuständen, bereitzustellen.
ANGABEN ZUR ERFINDUNG
Erfindungsgemäß werden geführte Nucleasen, wirtszellmodifizierende (HM)-CRISPR/Cas-Systeme, gRNAs, HM-Arrays, HM-crRNA, HM-Cas, HM-TALENs, HM-Meganucleasen, HM-Zinkfmgerproteine und Verfahren bereitgestellt, die den vorliegenden Patentansprüchen entsprechen.
Zur medizinischen Praxis gehört häufig die Verabreichung von Antibiotika an Patienten. Zu diesen Behandlungen gehört typischerweise die Verabreichung von Breitbandantibiotika oder Antibiotika, die ohne Unterschied auf zahlreiche grampositive Bakterienarten oder gramnegative Bakterienarte zielen. Ebenso gibt der Einsatz von Breitbandantibiotika z.B. in der Landwirtschaft Anlass zu Umweltschutzbedenken, insbesondere was den Eintritt dieser Antibiotika in die Nahrungskette von Menschen und Tieren betrifft, der gesundheitsschädlich sein und die Entwicklung von mikrobieller Resistenz fördern kann. Stattdessen wird erfindungsgemäß selektiv auf eine Mikrobiota einer ersten Art bzw. eines ersten Stammes gezielt. Wie in den vorliegenden bearbeiteten Beispielen gezeigt, ist die selektive Zielung auf eine bestimmte Bakterienart unter Verwendung der geführten Nucleasezielung auf das Genom der ausgewählten Art erreicht worden, wobei phylogenetisch verwandte Arten und Stämme geschont werden. Außerdem nimmt die Erfindung die von den Bakterien und Archaeen der Mikrobiota gespielte Rolle bei der Ausgestaltung der Immunfunktion bei Menschen und Tieren zur Kenntnis, wie nachfolgend näher erörtert wird.
Die Erfindung betrifft also Verfahren zum Modulieren von Immunzellen bei einem Patienten (endogenen Zellen des Patienten und/oder verabreichten Zellen, z.B. durch adoptive Zelltherapie) durch Verändern einer Mikrobiota des Patienten. In einem Beispiel wird zur Bewirkung der Veränderung vorteilhafterweise selektiv auf eine Art bei einer Mikrobiota (z.B. Darmflora) gezielt. Beim selektiven Zielen kann z.B. das Zielen auf verwandte Arten oder Stämme, z.B. auf Stämme des gleichen Phylums oder auf einen anderen Stamm derselben Art, vermieden werden.
Erfindungsgemäß wird z.B. das Modulieren einer immunzellbasierten oder anderen Therapie von Krankheiten oder Zuständen bei Patienten und Probanden durch Verändern von Mikrobiota, sowie Systeme, Sets und sonstige Mittel zu diesem Zweck bereitgestellt.
Erfindungsgemäß wird z.B. die Behandlung oder Reduzierung von Krankheiten und Zuständen bei Patienten durch Veränderung der Mikrobiota bereitgestellt, wobei die Krankheiten oder Zustände solche sind, die durch Immunzellen (z.B. T-Zellen) vermittelt werden oder im Wege der Veränderung der Aktivitäten oder Populationen von Immunzellen bei Patienten behandelt werden. Ausführungsformen hiervon sind Krebserkrankungen, Autoimmunerkrankungen oder -zustände, Entzündungskrankheiten oder -zustände, Virusinfektionen (z.B. HIV-Infektion bei menschlichen Patienten) oder Krankheiten oder Zustände, die durch Virusinfektionen vermittelt oder hervorgerufen werden.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Modulieren von Behandlungen oder Therapien bei einem Probandenorganismus (z.B. Pflanze, Hefe, menschlicher oder tierischer Patient) durch Verändern der Mikrobiota des Probanden. Als Beispiele von Therapien seien genannt: adoptive Zelltherapie, Antikörpertherapie (z.B. Immun-Checkpoint-Hemmung), Strahlungstherapie, Chemotherapie, z.B. zur Behandlung oder Verhütung einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem Patienten.
Bei einer ersten Ausgestaltung wird erfindungsgemäß bereitgestellt:

Ein Verfahren zum Modulieren einer Therapie einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst:
1. a. Durchführen der Therapie beim Patienten und
2. b. Hervorrufen einer Dysbiose der Darmflora beim Patienten, wobei die Dysbiose die Therapie beim Patienten durch Modulieren von Immunzellen beim Patienten moduliert.

Unter einem weiteren Aspekt wird gemäß der ersten Ausgestaltung der Erfindung bereitgestellt: Ein Verfahren zum Modulieren einer Therapie einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem menschlichen oder tierischen Patienten, wobei das Verfahren umfasst:

a. Durchführen der Therapie beim Patienten und
b. Hervorrufen einer Dysbiose der Mikrobiota (z.B. Darmflora) beim Patienten, wobei die Dysbiose die Therapie beim Patienten durch Modulieren von Immunzellen beim Patienten moduliert;

a. Durchführen der Therapie beim Patienten und
b. Hervorrufen einer Dysbiose der Mikrobiota (z.B. Darmflora) beim Patienten, wobei die Dysbiose die Therapie beim Patienten moduliert;

Unter einem weiteren Aspekt wird gemäß der ersten Ausgestaltung der Erfindung bereitgestellt: Verfahren zum Modulieren einer Behandlung bei einem Probanden, wobei das Verfahren umfasst:

a. Durchführen der Therapie beim Probanden und
b. Hervorrufen einer Dysbiose der Mikrobiota beim Probanden, wobei die Dysbiose die Behandlung beim Patienten moduliert.

In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden bzw. Patienten um einen Menschen. In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden bzw. Patienten um ein nicht menschliches Tier. In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden um eine Pflanze, und wahlweise ist die Behandlung eine Behandlung, die das Wachstum von Pflanzen fördert bzw. hemmt, eine Pestizidbehandlung, eine Behandlung zur Förderung der Stickstoffbindung, eine Herbizidbehandlung oder eine Düngemittelbehandlung. In einem Beispiel ist der Proband eine Hefe, und wahlweise ist die Hefe eine Behandlung zur Förderung bzw. Hemmung des Hefewachstums.
In einem Beispiel wird die Behandlung bzw. Therapie des Probanden bzw. Patienten durch die Modulation ergänzt, hochreguliert, herunterreguliert, gehemmt, verstärkt oder potenziert. In einem Beispiel ist die Behandlung bzw. Therapie wirksam beim Probanden bzw. Patienten, wobei die Behandlung bzw. Therapie beim Probanden, Patienten oder einem Kontrollprobanden bzw. -patienten, die keiner Modulations unterzogen worden sind, eine reduzierte oder erhöhte Wirksamkeit aufweist. Die Kontrolle gehört zu derselben Art wie der Proband bzw. Patient, und wahlweise zum gleichen Alter und/oder Geschlecht. In einem Beispiel werden bakterielle oder archaeale Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Verfahren beim Probanden bzw. Patienten abgetötet, oder deren Wachstum gehemmt, wobei die Kontrolle Zellen derselben bakteriellen oder archaealen Art umfasst und die Zellen durch ein erfindungsgemäßes Verfahren nicht abgetötet werden bzw. deren Wachstum nicht gehemmt wird.
In einem Beispiel werden die Schritte (a) und (b) gleichzeitig ausgeführt. In einem Beispiel wird der Schritt (a) vor dem Schritt (b) ausgeführt. In einem Beispiel wird der Schritt (b) vor dem Schritt (a) ausgeführt, und wahlweise wird der Schritt (b) nach (a) noch einmal ausgeführt.
Gemäß einer Ausführungsform wird erfindungsgemäß bereitgestellt:
Verfahren zum Modulieren einer Behandlung bei einer Pflanze oder Hefe, wobei das Verfahren umfasst:

a. Durchführen der Therapie bei der Pflanze bzw. Hefe und
b. Hervorrufen einer Dysbiose der bakteriellen Mikrobiota bei der Pflanze bzw. Hefe, wobei die Dysbiose die Behandlung beim Probanden moduliert;

Das Hervorrufen einer mikrobiellen Dysbiose beim Probanden, Patienten, der Pflanze bzw. Hefe umfasst in einem Beispiel Hervorrufen einer mikrobiellen Dysbiose auf einer Oberfläche des Probanden, Patienten, der Pflanze bzw. Hefe, z.B. auf einer Blattoberfläche (wenn der Proband eine Pflanze ist) oder auf einer Haut-, Lungen-, Augen- oder Schleimhautoberfläche (wenn der Proband bzw. Patient ein Mensch oder Tier ist).
Zusätzlich oder alternativ zur Hervorrufung der bakteriellen Dysbiose umfasst die Erfindung im Schritt (b) das Hervorrufen einer Dysbiose der archaealen Mikrobiota beim Probanden, Patienten, der Pflanze bzw. Hefe.
Die Krankheit bzw. der Zustand ist z.B. eine Autoimmunkrankheit bzw. -zustand (z.B. SLE) und die Therapie ist eine Behandlung dafür, z.B. Verabreichung eines Antagonisten, der zur Überfamilie der TNF-Liganden gehört, z.B. eines Anti-BAFF-Antikörpers wie z.B. BENLYSTATM oder einer generischen Version davon. Bei der Krankheit bzw. dem Zustand handelt es sich z.B. um eine Entzündungskrankheit oder -zustand (z.B. rheumatoide Arthritis, M. Crohn, Colitis oder Psoriasis), und die Therapie ist eine Behandlung dafür, z.B. Verabreichung von Sarilumab, Dupilumab, eines Antagonisten, der zur Überfamilie der TNF-Liganden gehört, z.B. eines Anti- TNF-alpha-Antikörpers oder -Fänger wie z.B. HUMIRA™, REMICADE™, SYMPONI™ oder ENBREL™ oder einer generischen Version davon. Die Krankheit bzw. der Zustand ist z.B. eine Virusinfektion oder wird von einer Virusinfektion vermittelt (z.B. HIV-Infektion) und die Therapie ist eine Behandlung dafür, z.B. Verabreichung eines Antiretroviral-Mittels oder eines Impfstoffs gegen HIV. Die Krankheit bzw. der Zustand ist z.B. eine Krebserkrankung (z.B. Melanom, NSCLC, Brustkrebs oder Bauchspeicheldrüsenkrebs) und die Therapie ist eine Behandlung dafür, z.B. Verabreichung eines Chemotherapeutikums, z.B. eines Checkpoint-Hemmers oder eines Agonistenantikörpers wie z.B. Anti-CTLA4-, PD-1-, PD-L1-, PD-L2-, LAG3-, OX40-, CD28-, BTLA-, CD137-, CD27-, HVEM-, KIR-, TIM-3-, VISTA-, ICOS-, GITR-, TIGIT- oder SIRPa-Antikörper. In einem Beispiel ist der Antikörper ein bispezifischer Antikörper, der erste und zweite Ziele spezifisch bindet, die aus der nachfolgenden Gruppe gewählt sind: CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, OX40, CD28, BTLA, CD137, CD27, HVEM, KIR, TIM-3, VISTA, ICOS, GITR, TIGIT und SIRPa, z.B. wobei das erste Ziel CTLA4 und das zweite Ziel LAG3 oder PD-1 ist. Wahlweise ist der Antikörper ein menschlicher Gamma-1-Antikörper und/oder er kann für ADCC oder CDC verstärkt werden. Die Therapie ist z.B. eine Impfstofftherapie, z.B. eine Impfstofftherapie gegen Krebs oder eine Impfstofftherapie zur Behandlung oder Verhütung einer Infektion oder einer Infektionskrankheit wie z.B. Malaria, HIV-Infektion, Tuberkuloseinfektion, Cholera, Salmonella typhimurium-Infektion, C. dificile-Infektion, Bordetella pertussis-Infektion oder Chlamydia-Infektion.
Gemäß einer Ausführungsform der ersten Ausgestaltung wird bereitgestellt:

Ein Verfahren zum Modulieren einer Zelltherapie einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst:
1. a. Ausführen einer Zelltherapie beim Patienten, umfassend Verabreichen einer Zellpopulation an den Patienten, wobei die Verabreichung der Zellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und
2. b. Hervorrufen einer Dysbiose der bakteriellen Darmflora beim Patienten, wobei die Dysbiose die Zelltherapie beim Patienten moduliert.

In einem Beispiel ist die Zelltherapie eine adoptive Immunzelltherapie wie z.B. CAR-T- oder TILS-Therapie zur Behandlung einer Krebserkrankung.
Bei einer zweiten Ausgestaltung wird erfindungsgemäß bereitgestellt:
Ein Verfahren zur Behandlung oder Reduzierung des Risikos einer Krankheit bzw. eines Zustandes bei einem Patienten, wobei die Krankheit bzw. Zustand beim Patienten durch Immunzellen (z.B. T-Zellen) vermittelt wird, wobei das Verfahren umfasst: Hervorrufen einer Dysbiose der bakteriellen Mikrobiota beim Patienten, wobei die Dysbiose Immunzellen beim Patienten moduliert (z.B. TH17-Zellen), wodurch die Krankheit bzw. Zustand beim Patienten behandelt oder das Risiko der Krankheit bzw. des Zustandes beim Patienten reduziert wird.
Die Krankheit bzw. Zustand ist z.B. eine Autoimmunerkrankung bzw. -zustand (z.B. SLE), eine Entzündungskrankheit oder -zustand (z.B. rheumatoide Arthritis, Reizdarmsyndrom, M. Crohn, Colitis oder Psoriasis) oder eine Virusinfektion ist oder von einer Virusinfektion (z.B. HIV-Infektion) vermittelt wird.
In einem Beispiel wird die Dysbiose der Mikrobiota bewirkt durch Abtöten mindestens einer bakteriellen Zielart bei der Mikrobiota oder Hemmen des Wachstums einer Population der Bakterien in der Mikrobiota. In einem Beispiel wird die Dysbiose der Mikrobiota bewirkt durch Abtöten mindestens einer archaealen Zielart bei der Mikrobiota oder Hemmen des Wachstums einer Population der Archaea in der Mikrobiota.
Bei einer dritten Ausgestaltung wird erfindungsgemäß bereitgestellt:
Ein Verfahren zum Modulieren einer adoptiven Immunzelltherapie einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst:

a. Ausführen einer adoptiven Immunzelltherapie beim Patienten, umfassend Verabreichen einer Immunzellpopulation an den Patienten, wobei die Verabreichung der Immunzellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und
b. Ändern des relativen Anteils einer Teilgesamtheit von Zellen einer ersten bakteriellen Art bzw. eines ersten bakteriellen Stammes oder archaealen Art oder eines archaealen Stammes in einer Mikrobiota (z.B. Darmflora) des Patienten, wodurch eine veränderte Mikrobiota erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert.

Unter einem weiteren Aspekt wird gemäß der dritten Ausgestaltung der Erfindung bereitgestellt:
Ein Verfahren zum Modulieren einer Therapie einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem menschlichen oder tierischen Patienten, wobei das Verfahren umfasst:

a. Durchführen der Therapie beim Patienten und
b. Ändern des relativen Anteils einer Teilgesamtheit von Zellen einer ersten bakteriellen Art bzw. eines ersten bakteriellen Stammes oder archaealen Art oder eines archaealen Stammes in einer Mikrobiota (z.B. Darmflora) des Patienten, wodurch eine veränderte Mikrobiota erzeugt wird, die beim Patienten die Therapie moduliert.

Unter einem weiteren Aspekt wird gemäß der dritten Ausgestaltung der Erfindung bereitgestellt:
Verfahren zum Modulieren einer Behandlung bei einem Probanden, wobei das Verfahren umfasst:

a. Durchführen der Therapie beim Probanden und
b. Verändern des relativen Anteils einer Teilgesamtheit von Zellen einer ersten bakteriellen Art oder eines ersten bakteriellen Stammes oder einer ersten archaealen Art oder eines ersten archaealen Stammes in einer Mikrobiota des Probanden, wobei die Dysbiose die Behandlung beim Probanden moduliert.

a. Durchführen der Therapie bei der Pflanze bzw. Hefe und
b. Verändern des relativen Anteils einer Teilgesamtheit von Zellen einer ersten bakteriellen Art oder eines ersten bakteriellen Stammes oder einer ersten archaealen Art oder eines ersten archaealen Stammes in einer Mikrobiota der Pflanze bzw. Hefe, wobei die Dysbiose die Behandlung bei der Pflanze bzw. Hefe moduliert;

Die Veränderung des relativen Anteils der Teilgesamtheit von Zellen beim Probanden, Patienten, der Pflanze oder Hefe umfasst in einem Beispiel Hervorrufen einer mikrobiellen Dysbiose auf einer Oberfläche des Probanden, Patienten, der Pflanze bzw. Hefe, z.B. auf einer Blattoberfläche (wenn der Proband eine Pflanze ist) oder auf einer Haut-, Lungen-, Augen- oder Schleimhautoberfläche (wenn der Proband bzw. Patient ein Mensch oder Tier ist).
Der Anteil der ersten Teilgesamtheit von Bakterien oder Archaea wird dabei erhöht oder reduziert. In einem Beispiel wird das relative Verhältnis der ersten und zweiten bakteriellen Arten oder Stämme verändert (z.B. erhöht oder reduziert) oder das relative Verhältnis der ersten und zweiten archaealen Arten oder Stämme wird verändert (z.B. erhöht oder reduziert).
In einem Beispiel ist die adoptive Immunzelltherapie eine CAR-T-Therapie zur Behandlung einer Krebserkrankung. In einem Beispiel ist die adoptive Immunzelltherapie eine TILs-Therapie zur Behandlung einer Krebserkrankung.
In einem Beispiel der ersten oder dritten Ausgestaltung sind die Zellen des Schritts (a) Zellen einer ersten Art, die aus der nachfolgenden Gruppe gewählt ist: CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, TH1-Zellen oder TH17-Zellen, und der Schritt (b) reguliert Zellen dieser Art beim Patienten hoch. Dies ist nützlich zur Verstärkung der zellbasierten Therapie. In einem weiteren Beispiel sind die Zellen des Schritts (a) Zellen einer ersten Art, die aus der nachfolgenden Gruppe gewählt ist: CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, TH1-Zellen oder TH17-Zellen, und der Schritt (b) reguliert Zellen dieser Art beim Patienten herunter. Dies ist nützlich zur Dämpfung der zellbasierten Therapie oder einer Nebenwirkung davon (z.B. CRS).
Gemäß einer Ausführungsform wird die Dysbiose oder der Schritt (b) ausgeführt im Wege einer selektiven Zielung auf eine Teilgesamtheit von bakterieller oder archaealer Mikrobiota unter Verwendung der CRISPR/Cas-Zielung auf Bakterien und/oder Archaea der Mikrobiota (z.B. Darmflora). In einem Beispiel umfasst das Verfahren die Verwendung einer geführten Nuclease (z.B. RNA-geführte Nuclease), Zuschneiden einer jeweiligen Zielsequenz bei Wirtszellen, um die Zielsequenzen zu modifizieren, wobei Wirtszellen abgetötet werden oder das Wachstum der Wirtszellopulation reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Mikrobiota reduziert wird. Geeignete Systeme zur Ausführung eines geführten Nuclease-Zuschnitts sind z.B. gentechnisch erzeugte CRISPR/Cas-Systeme, TALENs, Meganucleasen und Zinkfingerproteinsysteme.
Hierzu gehen die Erfinder davon aus, dass ihnen erstmals der Nachweis einer Hemmung des Populationswachstums eines bestimmten Bakterienstammes in einem gemischten Bakterienkonsortium, das normalerweise gemeinsam in der Darmflora auftritt, mit mindestens einem der nachfolgenden Merkmale gelungen ist:
Hemmung des Populationswachstums mit einem gentechnisch erzeugten CRISPR/Cas-System durch

• Zielen auf wilde Zellen;
• Nutzen der Aktivität der wilden endogenen Cas-Nuclease;
• Zielen auf essentielle und Antibiotikaresistenzgene;
• wobei die Ziele wilde Sequenzen sind.

Dies haben die Erfinder bei einer gemischten Population von Bakterien der menschlichen Darmflora mit folgenden Merkmalen nachgewiesen:

• gezielte Hemmung des Bakterienwachstums bei einer gemischten Population von Arten der menschlichen Darmflora;
• wobei die Population drei unterschiedliche Arten umfasst;
• umfassend selektives Abtöten einer dieser Arten und Schonen von Zellen der anderen Arten;
• gezielte Hemmung des Zellwachstums in Gegenwart einer phylogenetisch nahen anderen Art der menschlichen Darmflora, die von dieser Hemmung geschont wird;
• gezielte Hemmung des Zellwachstums in einer gemischten Population aus Bakterien der menschlichen Darmflora, umfassend Firmicutes-Zielarten und Nicht-Firmicutes-Arten;
• gezielte Wachstumshemmung einer bestimmten Firmicutes-Art bei Schonen einer anderen Firmicutes-Art in einer gemischten Population aus Bakterien der menschlichen Darmflora;
• gezielte Wachstumshemmung eines bestimmten grampositiven Bakterienstammes bei Schonen einer anderen grampositiven Bakterienart in einer gemischten Population aus Bakterien der menschlichen Darmflora;
• Zielen auf eine Bakterienart der menschlichen Darmflora bei Schonen einer kommensalen Bakterienart des menschlichen Darms;
• Zielen auf eine Bakterienart der menschlichen Darmflora bei Schonen einer probiotischen Bakterienart des menschlichen Darms;
• gezielte Hemmung des Zellwachstums bei einer gemischten Population von Bakterien der menschlichen Darmflora auf einer Oberfläche;
• Erreichen einer mindestens 10-fachen Hemmung einer bestimmten Bakterianart allein oder bei Mischen mit einer Mehrzahl anderer Bakterienarten in einem Konsortium von bakterien der menschlichen Darmflora und
• Erreichen einer mindestens 10-fachen Wachstumshemmung von zwei unterschiedlichen Stämmen einer bestimmten Bakterienart der menschlichen Darmflora.

Erfindungsgemäß wird bereitgestellt:
Ex-vivo-Immunzellpopulation zur Verwendung bei einem adoptiven Zelltherapieverfahren bei einem Patienten zur Behandlung bzw. Verhütung einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten, wobei das Verfahren umfasst:

a. Ausführen einer adoptiven Immunzelltherapie beim Patienten, umfassend Verabreichen von Zellen der Population an den Patienten, wobei die Verabreichung der Immunzellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und
b. Hervorrufen einer Dysbiose der bakteriellen Darmflora beim Patienten, wobei die Dysbiose die Immunzelltherapie beim Patienten moduliert und die Krankheit bzw. der Zustand behandelt oder verhütet wird.

a. Ausführen einer adoptiven Immunzelltherapie beim Patienten, umfassend Verabreichen von Zellen der Population an den Patienten, wobei die Verabreichung der Immunzellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und
b. Ändern des relativen Anteils einer Teilgesamtheit von Zellen einer ersten bakteriellen Art bzw. eines ersten bakteriellen Stammes oder archaealen Art oder eines archaealen Stammes in der Darmflora des Patienten, wodurch eine veränderte Darmflora erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert. Erfindungsgemäß werden auch CRISPR/Cas-Systeme, Arrays, cRNAs und Sets zur Ausführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die Erfindung betrifft ferner Systeme, Sets, und sonstige Mittel zur Ausführung des Verfahrens.
Die Merkmale einer vorliegenden Ausgestaltung werden in einem Beispiel mit einer anderen Ausgestaltung der Erfindung zur möglichen Aufnahme der Kombination in mindestens einen der vorliegenden Patentansprüche kombiniert.
Figurenliste

zeigt ein mit Xylose induzierbares System.
zeigt einen ST1-CRISPR-Array.
zeigt einen Spott-Assay der bei der vorliegenden Arbeit verwendeten Stämme auf TH-Agar. Alle Stämme wurden 20 h lang bei 37 °C auf TH-Agar gezüchtet. Serielle Verdünnungen von Übernachtkulturen wurden zweifach für E.coli, L. Lactis und S. mutans durchgeführt, und dreifach für beide Stämme von S. thermophilus, um die einzelnen Kolonien zu zählen.
zeigt selektives Wachstum von S. thermophilus, S. mutans, L. lactis und E. coli unter unterschiedlichen Kulturbedingungen. Tetracyclin kann zur selektiven Züchtung von S. thermophilus LMD-9 nicht verwendet werden. Es stellte sich jedoch heraus, dass 3g/l^-1 PEA S. thermophilus LMD-9 selektiv züchten und dabei das Wachstum von E. coli einschränken konnte.
zeigt die Konstruktion zweier Xylose-Induktionskassetten.
zeigte die Charakterisierung der mit Xylose induzierbaren Kassette bei Streptoccocus thermophilus LMD-9 mit dem Plasmid pBAV1KT5-Xy1R-mCherry-P1dha. Auf Fluoreszenz war ein klares Ansprechen mit zunehmender Xylosemenge feststellbar.
zeigt die Konstruktion eines CRISPR -Arrays in pBAV1KT5-Xy1R-mCherry-Pldha+XylA. Der Array enthält 2 Spacer-Sequenzen, die auf S. thermophilus-Gene unter einem induzierbaren Xylosepromoter zielen und eine tracrRNA unter einem stark konstitutiven Promoter P3A.
zeigt die Umwandlungseffizienz von Streptoccocus thermophilus LMD-9 mit dem Plasmid pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-P1dh+Xy1A sowie mit pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-PXy1A.
ist eine schematische Darstellung der mit Xylose induzierbaren CRISPR-Vorrichtung. Bei der Induktion der Xylose wird der CRISPR-Array, der sowohl auf polIII als auch auf tetA auf dem S. thermophiles LMD-9-Genom zielt, exprimiert. Zusammen mit der konstitutiv exprimierten tracrRNA wird mit Cas9 ein Komplex gebildet. Dieser Komplex führt einen doppelsträngigen Bruch in die tetA- und polIII-Gene im S. thermophilus LMD-9-Genom ein, was zu einer eingeschränkten Zellviabilität führt
zeigt die Wachstumshemmung von Streptoccocus thermophilus DSM 20617(T) mit dem Plasmid pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-PXy1A oder pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-P1dha+Xy1A, nicht induziert und induziert. Bild nach 63 h Inkubation aufgenommen. Koloniezahlen unten links (oberste Zeile: >1000, >1000, unterste Zeile: 336, 113).
zeigt einen ML-Stammbaum von 16S-Sequenzen aus S. thermophilus, L. lactis und E. coli.
zeigt die selektive Wachstumshemmung von S. thermophilus in Kokultur mit E. coli, L. lactis und S. thermophiles, die entweder das pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-Pxy1A- oder das pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-P1dhA+Xy1A-P1asmid enthält. Es wird kein Wachstumsunterschied festgestellt zwischen E. coli, der das pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-Pxy1A- oder das pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-P1dhA+Xy1A-Plasmid enthält. S. thermophiles (selektiv gezüchtet auf TH-Agar, das um 2,5 gl^-1 PEA ergänzt ist) zeigt erwartungsgemäß eine Abnahme der Umwandlungseffizienz zwischen dem pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-Pxy1A- (stark) oder dem pBAV1KT5-Xy1R-CRISPR-P1dhA +XylA-Plasmid (schwach). So gelang uns der Nachweis einer selektiven Wachstumshemmung der Zielteilgesamtheit, S. thermophilus, in der gemischten Zellpopulation. Koloniezahlen unten links (oberste Zeile: >1000, >1000, 68, unterste Zeile: > 1000, > 1000, 32).
zeigt Regulierer, die die Expression von spCas9 und die selbstzielsuchende sgRNA, die auf die ribosomale RNA-Untereinheit 16s zielt, regeln.
zeigt spezifisches Zielen auf den E. coli-Stamm durch ein exogenes CRISPR-Cas-System. Die sgRNA zielt auf das Genom von aus K-12 abgeleiteten E. coli-Stämmen wie z.B. E. coli T0P10, während der andere untersuchte Stamm unberührt blieb.
zeigt einen Spot-Assay mit seriellen Verdünnungen von einzelnen bei dieser Studie verwendeten Bakterienarten sowie Mischkultur in TH-Agar ohne Induktion eines CRISPR-Cas9-Systems.
zeigt einen Spot-Assay der Verdünnung 103 auf unterschiedlichen selektiven Medien. TH mit 2,5 g 1^-1 PEA ist ein selektives Medium ausschließlich für B. subtilis. Um Maltose ergänztes MacConkey-Medium ist ein selektives und differentielles Kulturmedium für Bakterien, das derart konstruiert ist, dass es gramnegative und Darmbazillen selektiv isoliert und diese nach Maltosefermentation differenziert. Deshalb erzeugt TOP10 ΔmalK-Mutant weiße Kolonien auf den Platten, während Nissle rosa Kolonien erzeugt; A ist E.coli ΔmalK, B ist E. coli Nissile, C ist B. subtilis, D ist L. lactis, E ist Mischkultur; die Bilder bei MacConkey-/B und E erscheinen rosa; die Bilder bei MacConkey+/B und E erscheinen rosa.
zeigt selektives Wachstum der bei dieser Studie verwendeten Bakterien auf unterschiedlichen Medien und selektiven Platten.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Im nachfolgend geschilderten ausgeführten Beispiel wurde bei einer gemischten Population von Bakterienarten der menschlichen Darmflora auf die Wachstumshemmung eingewirkt. Eine >10-fache Wachstumshemmung der Population wurde bei einer Art (einer grampositiven Firmicutes-Population), auf die selektiv gezielt wurde, erreicht, wobei kommensale Bakterien des Konsortiums, auf die nicht gezielt wurde, geschont wurden. Die Erfinder haben die nützliche Anwendungsmöglichkeit dieses Befunds zur Veränderung der Mikrobiota, z.B. der Darmflora, in situ bei Patienten erkannt, wodurch eine Immunzellmodulation beim Patienten als Reaktion auf die veränderte Mikrobiota ermöglicht wird. Ferner haben die Erfinder erkannt, dass dies auf die Modulation von Behandlungen bei Probanden wie z.B. Pflanzen und Hefen, die veränderbare Mikrobiota umfassen, Anwendung findet. Ferner haben die Erfinder den Nutzen bei der Modulation von immunzellbasierten Therapien bei Patienten bzw. der Verhütung von immunzellvermittelten Krankheiten bzw. Zuständen bei Patienten, z.B. Autoimmunerkrankungen, Entzündungskrankheiten und Virusinfektionen (z.B. HIV-Infektion beim Menschen) erkannt. Die Erfinder haben den Nutzen des Hervorrufens einer Dysbiose der Darm-, Haut-, Vagina-, Nasen-, Augen-, Magen-Darm-Trakt-, Rektal-, Skrotal-, Haut- oder Haarflora zur Bewirkung dieser Modulation bei einem menschlichen oder tierischen Probanden oder Patienten erkannt.
Im vorliegenden Sinne bezieht sich „Dysbiose“ auf eine Veränderung des bakteriellen und/oder archaealen Gleichgewichts der Mikrobiota, z.B. Darmflora. Die Veränderung ist relativ zum Gleichgewicht vor (z.B. unmittelbar vor oder höchstens einen Tag vor) der Ausführung des Verfahrens. Bei der Veränderung kann es sich um mindestens eine von folgenden Varianten handeln: (i) Erhöhung des Anteils einer ersten Art (bakteriellen oder archealen Art) oder eines ersten Stammes an der Mikrobiota (z.B. Darmflora), (z.B. B. fragalis oder thetaiotaomicron); (ii) eine Erhöhung des relativen Anteils von ersten und zweiten Arten (z.B. B. fragalis gegenüber C. dificile oder S. thermophilus gegenüber E. coli oder L. lactis), ersten und zweiten Stämmen derselben Art oder ersten Phylen, die sich voneinander unterscheiden (z.B. Bacterioidetes gegenüber Firmicutes); (iii) eine Hinzufügung einer Art oder eines Stammes, die vor dem Behandlungsverfahren von der Mikrobiota nicht umfasst war; (iv) eine Reduzierung des Anteils einer ersten Art (bakteriellen oder archaealen Art) oder eines ersten Stammes an der Mikrobiota (z.B. C. dificile oder S. thermophilus); (v) eine Reduzierung des relativen Anteils von ersten und zweiten Arten (z.B. B. fragalis gegenüber C. dificile oder S. thermophilus gegenüber E. coli oder L. lactis), ersten und zweiten Stämmen derselben Art oder ersten Phylen, die sich voneinander unterscheiden (z.B. Bacterioidetes gegenüber Firmicutes); und (vi) eine Entfernung einer Art oder eines Stammes, die vor dem Behandlungsverfahren von der Mikrobiota nicht umfasst war. Die Dysbiose kann bewirkt werden z.B. unter Verwendung mindestens eines selektiven antibakteriellen Wirkstoffs (z.B. auf CRISPR-Basis oder sonstige vorliegend beschriebene geführte Nucleasen) oder durch Verabreichung mindestens eines bakteriellen und/oder archaealen Transplantats an den Patienten zur Änderung des Gleichgewichts der Mikrobiota, z.B. Darmflora.
Die Wirkung des Immunsystems auf die Zusammensetzung der Mikrobiota wird von mehreren Immundefizienzen nahegelegt, die Mikrobengemeinschaften auf Arten und Weisen verändern, die sie für Krankheiten prädisponieren. Garrett et al. untersuchten z.B. Mäuse, denen der Transkriptionsfaktor T-bet (codiert von Tbx21) fehlt, der Entzündungsreaktionen bei Zellen sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems steuert (Cell. 2007 Oct 5;131(1):33-45, „Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system", Garrett WS et al.). Wurden Tbx21-/- -Mäuse mit Rag2-/- -Mäusen gekreuzt, die keine adaptive Immunität haben, entwickelte sich beim Tbx21-/-/Rag2-/- -Nachwuchs Colitis ulcerosa auf mikrobiotaabhängige Art. Bemerkenswert ist dabei, dass dieser Colitis-Phänotyp durch den adoptiven Transfer der Tbx21-/-/Rag2-/- -Mikrobiota auf wilde Mäuse übertragbar war. Hierdurch wurde der Nachweis geführt, dass eine veränderte Mikrobiota ausreichte, um eine Krankheit hervorzurufen. Ein weiteres Beispiel einer vom Immunsystem angetriebenen Dysbiose ist bei Mäusen ohne Expression der Inflammasomkomponente NLPR6 in den Epithelzellen zu sehen. Bei diesen Mäusen entwickelt sich eine veränderte Mikrobiota mit erhöhtem Anteil der Mitglieder des Phylums Bacteroidetes, die mit einer vermehrten Anwerbung von Entzündungszellen im Darm und einer Anfälligkeit für chemisch induzierte Colitis assoziiert waren.
Es ist klar geworden, dass einzelne kommensale Arten die Zusammensetzung von Teilmengen der T-Lymphozyten der Lamina propria mit unterschiedlichen Effektorfunktionen beeinflussen. Die Homöostase wird in der Darmschleimhaut durch ein System der gegenseitigen Kontrolle zwischen potentiell proinflammatorischen Zellen, darunter TH1-Zellen, die Interferon-y erzeugen, TH17-Zellen, die IL-17a, IL-17f und IL-22 erzeugen, verschiedene angeborene lymphoide Zellen mit Zytokin-Effektorfunktionen, die TH2- und TH17-Zellen ähnlich sind, und antiinflammatorischen Foxp3+ Tregs-Zellen aufrechterhalten.
Eine besondere Anwendungsmöglichkeit der Erfindung liegt in der Gestaltung von TH17-Zellpopulationen bei Patienten. Es gibt Anhaltspunkte für eine Beteiligung dieser Zellen an Autoimmun- und Entzündungsstörungen. Beschrieben wurden diese Zellen in: Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al., „Interleukin 17-producing CD41 effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages", Nat Immunol. 2005;6(11): 1123-1132; und Park H, Li Z, Yang XO, et al., „A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17", Nat Immunol. 2005; 6(11):1133-1141. Im Falle der Autoimmunstörungen kann eine übermäßige Aktivation von TH17-Zellen zu einem unangemessenen Ausmaß an Entzündung führen, wie im Falle der multiplen Sklerose, rheumatoiden Arthritis und Psoriasis. TH17-Zellen haben sich auch als erforderlich zur Aufrechterhaltung der Immunität der Mukosa erwiesen. TH17-Zellen tragen möglicherweise infolge von Erhöhungen der Genexpression gegenüber Treg-Zellen zur Entwicklung später asthmatischer Reaktionen bei.
Bei HIV kann der Verlust von TH17-Zellpopulationen zu chronischer Infektion beitragen. Die Erschöpfung der TH17-Zellpopulationen im Darm stört die Darmbarriere, erhöht den Umfang des Austretens von Bakterien aus dem Darm im Wege der mikrobiellen Translokation und trägt zur chronischen HIV-Infektion und Progression hin zu AIDS bei. Die mikrobielle Translokation führt dazu, dass Bakterien aus dem Darmlumen in die Lamina propria, die Lymphknoten und darüber hinaus in die nicht lymphatischen Gewebe eintreten. Sie kann die dauerhafte Immunaktivation verursachen, die in den späten Stadien von HIV im Organismus zu sehen ist. Die Erhöhung der TH17-Zellpopulationen im Darm hat sich sowohl als wirksame Behandlung als auch als mögliche Verhütungsmaßnahme erwiesen. Obwohl HIV eine weitgehende Erschöpfung aller CD4+ T-Zellen im Darm verursacht, ist der Verlust insbesondere von TH17-Zellen mit Symptomen der chronischen, pathogenen HIV- und SIV-Infektion in Verbindung gebracht worden. Die mikrobielle Translokation ist ein wichtiger Faktor, der im Rahmen von HIV zu chronischer Entzündung und Immunaktivation beiträgt. In nicht pathogenen Fällen von SIV wird keine mikrobielle Translokation beobachtet. TH17-Zellen verhüten schwere HIV-Infektionen, indem sie die Darmepithelbarriere während der HIV-Infektion im Darm aufrechterhalten. Aufgrund ihrer hohen Spiegel an CCR5-Expression (Korezeptor für HIV) werden sie bevorzugt infiziert und erschöpft. So erfolgt die mikrobielle Translokation eben im Wege der Erschöpfung der TH17-Zellen. Außerdem führt der Verlust von TH17-Zellen im Darm zu einem Verlust des Gleichgewichts zwischen inflammatorischen TH17-Zellen und ihren antiinflammatorischen Gegenstücken, den Treg-Zellen. Aufgrund ihrer immunsuppressiven Eigenschaften wird vermutet, dass sie die antivirale Antwort auf HIV reduzieren und so zur Pathogenese beitragen. Es gibt mehr Treg-Aktivität als TH17-Aktivität, und die Immunantwort auf das Virus ist weniger aggressiv und weniger wirksam. Die Wiederbelebung der TH17-Zellen reduziert nachweislich die Symptome chronischer Infektionen, darunter auch die verminderte Entzündung, und führt zu verbessertem Ansprechen auf HAART (Highly Active Anti-Retroviral Treatment). Es handelt sich hierbei um einen wichtigen Befund - generell führt die mikrobielle Translokation nämlich zu Unansprechbarkeit gegenüber HAART. Die Patienten weisen weiterhin Symptome auf und zeigen eine Viruslast, die nicht im erwarteten Umfang reduziert wurde. Bei einem SIV-Rhesusmakakenmodell wurde festgestellt, dass die Verabreichung von IL-21, einem Zytokin, das nachweislich die TH17-Differenzierung und -Proliferation fördert, die mikrobielle Translokation veringert, indem des die TH17-Zellpopulationen erhöht.
In einem Beispiel des Verfahrens wird IL-21, IL-15 und/oder IL-2 sequentiell oder gleichzeitig mit der Zellpopulation an den Patienten verabreicht. Dies ist nützlich zur weiteren Modulation der Immunzellpopulationen beim Patienten.
Yang et al. stellten fest, dass das Vorhandensein von TH17-Zellen bei Mäusen die Kolonisation der Mäuse mit Mikrobiota erfordert. Segmentierte Fadenbakterien (SFB) reichten aus, um TH17-Zellen zu induzieren und TH17-abhängige Autoimmunkrankheit bei Tiermodellen zu fördern (Nature, 2014 Jun 5;510(7503):152-6. doi: 10.1038/nature13279. Epub 2014 Apr 13, „Focused specificity of intestinal Th17 cells towards commensal bacterial antigens", Yang Y et al.). Offenbar können SFB die Schleimschicht über den Darmepithelzellen im terminalen Ileum durchdringen, und sie treten in enge Wechselwirkung mit den Epithelzellen und induzieren eine Polymerisation von Actin bei den Wirtszellen am Wechselwirkungsort, wobei sie vermutlich Ereignisse signalisieren, die zu einer Umgebung in der Lamina propria führen, die TH17 polarisiert.
In einem Beispiel gehören die ersten Bakterien zu einer Art oder einem Stamm, die eine 16s rDNA-Sequenz umfassen, die mindestens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % Identität mit einer 16s rDNA-Sequenz eines segmentierten Fadenbakteriums aufweist. Gemäß einer Ausführungsform erhöht das Verfahren den Anteil der ersten Bakterien, wobei TH17-Zellen beim Patienten hochreguliert werden, z.B. wobei die Krankheit eine Krebserkrankung oder eine Virusinfektion (z.B. HIV) ist. Gemäß einer Ausführungsform reduziert das Verfahren den Anteil der ersten Bakterien, wobei TH17-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden, z.B. wobei die Krankheit bzw. der Zustand eine Autoimmun- oder Entzündungskrankheit oder -zustand ist, oder um das Risiko von CRS bei einem Patienten mit Krebs zu reduzieren, der ACT erhält.
In einem Beispiel wird vom Verfahren eine allergische Krankheit bzw. ein allergischer Zustand behandelt, z.B. Asthma. In einem Beispiel wird vom Verfahren eine IgE-vermittelte Krankheit bzw. ein IgE-vermittelter Zustand behandelt, z.B. Asthma.
In einem Beispiel reduziert das Verfahren die von der Zytokinfreisetzung von TH2-Zellen vermittelte Autotoxizität beim Patienten.
López et al. stellten fest, dass die Darmdysbiose, die durch ein reduziertes Firmicutes-Bacteroidetes-Verhältnis charakterisiert ist, auch bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) berichtet worden ist. In ihrer Studie zeigten in vitro-Kulturen, dass aus Stuhlproben von SLE-Patienten isolierte Mikrobiota (SLE-M) die Lymphozytenaktivation und die Differenzierung von TH17 aus naiven CD4+ -Lymphozyten in größerem Umfang fördern als gesunde Kontrollmikrobiota. Die Anreicherung von SLE-M mit Treg induzierenden Bakterien zeigte, dass eine Mischung aus zwei Clostridia-Stämmen das Gleichgewicht zwischen TH17 und TH1 erheblich reduziert, während eine Ergänzung mit Bifidobacterium bifidum eine Überaktivation der CD4+ -Lymphozyten verhindern konnte. Ex vivo-Analysen von Proben aus Patienten zeigten erhöhte TH17- und Foxp3* IL-17+ -Populationen, was eine mögliche Transdifferenzierung von Treg-TH 17 nahelegt. Außerdem zeigten Analyse der fäkalen Mikrobiota eine negative Korrelation zwischen IL-17+ -Populationen und Firmicutes bei gesunden Kontrollen, während bei SLE dieses Phylum unmittelbar mit den Serumspiegeln an IPNγ, einem bei Patienten leicht reduzierten TH1-Zytokin„ korrelierte. (Sci Rep. 2016 Apr 5;6:24072. doi: 10.1038/srep24072, „Th17 responses and natural IgM antibodies are related to gut microbiota composition in systemic lupus erythematosus patients“, López P et al.).
Es hat sich herausgestellt, dass auch andere Bakterien die antiinflammatorischen Zweige des adaptiven Immunsystems verstärken, indem sie die Differenzierung von Tregs lenken oder die IL-10-Expression induzieren. Die Kolonisation gnotobiotischer Mäuse mit einem komplexen Cocktail aus 46 murinen Clostridia-Stämmen, die ursprünglich aus Mausfäkalien isoliert wurden und v.a. zu den Clustern IV und XIVa der Gattung Clostridium gehören, führt z.B. zur Ausbreitung von Tregs in der Lamina propria sowie auch in systemischem Umfang.
Das Bacteroides fragilis- Polysaccharid-A (PSA) wirkt auf die Entwicklung systemischer T-Zell-Antworten ein. Die Kolonisation keimfreier Mäuse mit PSA erzeugendem B. fragilis führt zu höheren Anzahlen zirkulierender CD4+ T-Zellen gegenüber Mäusen, die mit B. fragilis ohne PSA kolonisiert wurden. PSA erzeugender B. fragilis ruft auch höhere TH1-Zellfrequenzen im Kreislauf hervor. Zusammen genommen zeigen diese Befunde, dass kommensale Bakterien eine allgemeine Wirkung auf die Immunität entfalten, die weit über die Schleimhautgewebe hinausreicht.
Die bei Patienten mit Reizdarmsyndrom festgestelte Verringerung von F. prausnitzii ist deshalb interessant, weil dieses Bakterium Butyrate erzeugt und dessen orale Gabe die Schwere der von TNBS induzierten Colitis bei Mäusen reduziert. In einem Beispiel handelt es sich bei der ersten Art um eine Bakterienart, die Butyrate erzeugt (z.B. F. prausnitzii), und der Anteil der ersten Art an der Mikrobiota ist reduziert, wobei das Verfahren T-Effektor- und/oder T-Helferzellen beim Patienten herunterreguliert, wodurch die Krankheit bzw. der Zustand (z.B. eine Autoimmun- oder Entzündungskrankheit oder - zustand oder CRS) behandelt oder verhütet wird.
Traditionell teilt man die Archaea in fünf Phylen ein, und zwar Crenarchaeota, Euryarchaeota, Korarchaeota, Nanoarchaeota und Thaumarchaeota. Aufgrund der zunehmenden Fülle an Daten über das gesamte Genom (v.a. aus Umweltisolaten) ist die Phylogenie der Archaea in letzter Zeit überarbeitet wurden: Die vier Gruppen Korarchaeota, Crenarchaeota, Thaumarchaeota und die neu vorgeschlagene Gruppe Aigarchaeota sind unter Ausschluss von Euryarchaeota und Nanoarchaeota zu einem Überphylum zusammengefasst worden (sog. TACK-Überphylum). Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die erste Art eine beliebige der in diesem Absatz erwähnten Archaea sein.
T-Zellen reifen im Thymus heran, exprimieren TCR (T-Zell-Rezeptor) und können auf ihrer Oberfläche entweder CD8-Glycoprotein exprimeren, und werden dann CD8+-T-Zellen (zytotoxisch) genannt oder aber sie können CD4-Glycoprotein exprimieren, und werden dann CD4-Zellen (T-Helferzellen) genannt. Die CD4+ -Zellen differenzieren sich in verschiedene Teilmengen: TH (T-Helfer)1, TH 2, TH9, TH17, TH22, Treg (regulatorische T-Zellen) und Tfh (follikuläre T-Helferzellen), die durch unterschiedliche Zytokinprofile charakterisiert sind. Diese unterschiedlichen CD4+ - Teilmengen spielen bei den Immun- und Effektorantwortfunktionen der T-Zellen eine kritische Rolle. Alle CD4+ TH-Teilmenge werden von spezifischen Zytokinen aus naiven CD4+ -T-Zellen differenziert: TH 1 durch IL-12 und IFN-γ (proinflammatorisches Zytokin mit mehreren Rollen, z.B. Vermehrung von TLR (Toll-like receptor), Induzierung der Zytokinabsonderung oder Makrophagenaktivation); TH2 durch IL-4; Treg durch IL-2 und TGF-beta. Jede TH-Teilmenge setzt spezifische Zytokine frei, die entweder pro- oder antiinflammatorische Funktionen, Überlebens- oder Schutzfunktionen aufweisen können. Bspw. setzt TH1 IFN-γ und TNF frei; TH2 setzt IL-4 (einen wichtigen Überlebensfaktor für B-Lymphozyten), IL-5 und IL-13 frei; TH9 erzeugt IL-9; Treg sondert IL-10 (ein Zytokin mit immunsuppressiver Funktion, das die Expression des für die suppressive Funktion von Treg auf andere Zellen erforderlichen Transkriptionsfaktors FOXP3 aufrechterhält) und TGF-β ab; TH17 erzeugt IL-17 (ein Zytokin, das eine wichtige Rolle bei der Bakterien- und Pilzabwehr des Wirts spielt).
Eine Ausführungsform der Erfindung findet Anwendung zur Modulation von CAR-T und anderen adoptiven Immunzelltherapien (z.B. adoptive TILs-Therapie). Mehrere Berichte haben die differentiellen Rollen unterschiedlicher Arten von Zytokinen nachgewiesen, die von CD4+ -Teilmengen freigesetzt werden, was eine wichtige Erwägung bei der Bewertung von CAR-T und anderen immunzellbasierten Therapien darstellt. Es wurde gezeigt, dass Zytokinen der CD4+ T-Zell-Teilmengen TH1 und TH2 unterschiedliche Arten von Zytotoxizität antreiben, die von CAR-T, die CD28 der 2. Generation enthält, erzeugt werden. Es wurde eine kurzfristige Toxizität mit hohen TH1-Zytokinspiegeln beobachtet, während hohe Dosiermengen der TH2-Zytokinen eine chronische Autozytotoxizität bei Tieren, die eine für CD19 der 2. Generation spezifische CAR-T erhielten, erzeugten. CAR-T-Zellen, die zur Freisetzung von induzierbarem IL-12 gentechnisch erzeugt wurden, modulierten das Stützgewebe von Tumoren, um Krebs zu vernichten. Die IL-12-Freisetzung durch gentechnisch erzeugte CAR-T-Zellen erhöhten die antitumoröse Aktivität im Wege der Anwerbung von Makrophagen. Das von CAR-T freigesetzte IL-12 induzierte auch eine Reprogrammierung suppressiver Zellen, wobei ihre Hemmungsfunktionen umgekehrt wurden, was eine Bewertung im Rahmen klinischer Versuche nahelegt. Es zeigte sich, dass die Persistenz der CAR-T-Therapie von der Anzahl der CD4+ -Zellen und der Anzahl der zentralen Gedächtniszellen im infundierten Produkt abhängt. CD8+ -Klone, die aus zentralen T-Gedächtniszellen, aber nicht aus CD8+ -Effektorzellen isoliert wurden, blieben beim adoptiven T-ZellTransfer bei einem nicht menschlichen Primatenmodell langfristig bestehen, was die Bedeutung der Funktionen spezifischer T-Zell-Teilmengen für eine wirksame adoptive Immuntherapie aufzeigt. Auch ist gezeigt worden, dass die Kombination der CD8+ -Teilmenge mit der CD4+ -Teilmenge den adoptiven T-Zell-Transfer deutlich verstärkte. Es wurde gezeigt, dass CD4+ -Zellen die Entwicklung der CD8+ - Gedächtnisfunktionen unterstützen, was die Bedeutung beider Teilmengen und Kombinationen für Immuntherapieversuche aufzeigt. Bei mehreren präklinischen Modellen wurde der Vorteil unterschiedlicher T-Zell-Teilmenge für eine wirksame CAR-T-Therapie nachgewiesen: CD8+ CD45RA+ CCR7+ CAR-T -Zellen, die phänotypisch den T-Gedächtnisstammzellen am nächsten lagen, lösten eine höhere antitumoröse Aktivität der CAR-T -Zellen aus; die beiden Teilmengen CD8+ und CD4+ exprimierten synergistische antitumoröse CAR-T-Aktivitäten.
In einem Beispiel handelt es sich bei der verabreichten Zellpopulation um eine Population von CAR-T-Zellen, die eine Kombination aus einer CD8+ CAR-T -Teilmenge und einer CD4+ CAR-T-Teilmenge umfasst.
In einem Beispiel der Erfindung ist die Zelltherapie eine adoptive T-Zell-Therapie, und wahlweise werden Zellen an den Patienten verabreicht, die aus der nachfolgenden Gruppe gewählt sind: CD4+ T-Zellen, CD8+ T-zellen, TH1 -Zellen und TH17 -Zellen. In einem Beispiel wird die Zelltherapie durch das erfindungsgemäße Verfahren verstärkt, z.B. die Immunzell-Zytotoxizität von Krebszellen wird beim Patienten verstärkt, oder die Behandlung der Krankheit bzw. des Zustandes wird verstärkt. In einem Beispiel wird die Zelltherapie durch das erfindungsgemäße Verfahren reduziert, z.B. die Immunzell-Zytotoxizität von Krebszellen wird beim Patienten reduziert, oder das CRS-Risiko wird reduziert (z.B. bei einem Krebspatienten). Gemäß einer Ausführungsform wird vom Verfahren also das Risiko von CRS beim Patienten reduziert oder verhütet. Gemäß einer Ausführungsform wird vom Verfahren das Risiko einer unerwünschten Nebenwirkung der Zelltherapie reduziert oder verhütet (z.B. eine Nebenwirkung einer CAR-T-Therapie bei einem menschlichen Patienten wie z.B. CRS).
In einem Beispiel umfasst die Immunzellpopulation CAR-T-Zellen und/oder T-Zellen, die gentechnisch erzeugte TCRs und/oder TILs exprimieren. WO2013063361 , US9113616 , US20130109053 , US20160081314 und WO2016044745 (deren Offenbarungsgehalt als Bestandteil der vorliegenden Patentschrift gilt) beschreiben geeignete transgene in vivo-Plattformen zur Erzeugung von CARs und TCRs zur Verwendung bei der Erzeugung von Zellen zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung. Die Immunzellpopulation kann gentechnisch erzeugte autologe oder allogene Immunzellen (Transplantat) umfassen, z.B. T-Zellen, NK-Zellen und/oder TILs, z.B. wobei Zellen und Patient menschlich sind. Ein Vorteil der autologen Zellen besteht darin, dass die Modulation des endogenen Systems wahrscheinlich ähnlich einer Modulation der zelltransplantierten autologen Zellen eingestellt ist. Gemäß einer Ausführungsform gehören die verabreichten Zellen und der Patient zu derselben Art bzw. demselben Stamm, z.B. Mensch oder Nagetier (z.B. Maus), z.B. Spendertransplantat und Empfängerpatient sind HLA- oder MHC-kompatibel.
In einem Beispiel sind die T-Zellen CD4+ -T-Zellen oder TH17-Zellen. Die verabreichten CAR-T-Zellen umfassen z.B. einen CAR, der eine intrazelluläre ICOS-Domäne umfasst, und wahlweise sind die Zellen TH17-Zellen. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei den verabreichten T-Zellen um CD8+ CD45RA+ CCR7+ CAR-T -Zellen.
Adoptive Transferversuche bei Mäusen deuten darauf hin, dass TH17-Zellen ein höheres in vivo-Überlebens- und Selbsterneuerungsvermögen aufweisen als TH1-polarisierte Zellen. In einem Beispiel werden also TH17-Zellen beim Patienten moduliert, z.B. hochreguliert, z.B. beim Patienten erweitert, oder herunterreguliert. Es kann sich hierbei um endogene T-Zellen des Patienten und/oder Zellen, die an den Patienten verabreicht wurden, oder um deren Nachwuchs handeln. Gemäß einer Ausführungsform werden RORyt exprimierende TH17 -Zellen beim Patienten hochreguliert, z.B. erweitert. Gemäß einer Ausführungsform wird die Expression von mindestens einem mit TH17 zusammenhängenden Gen erhöht, z.B. mindestens eines von Rorc, I122 und I126. Gemäß einer Ausführungsform wird die Expression mindestens eines mit TH1 zusammenhängenden Gens erhöht, z.B. mindestens eines von Ifng, Tnfa und Tbx21 (T-bet). Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der Krankheit bzw. dem Zustand in diesem Fall um eine Krebserkrankung.
In einem Beispiel werden Treg-Zellen beim Patienten moduliert, z.B. hochreguliert, z.B. beim Patienten erweitert, oder herunterreguliert. Es kann sich hierbei um endogene T-Zellen des Patienten und/oder Zellen, die an den Patienten verabreicht wurden, oder um deren Nachwuchs handeln. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der Krankheit bzw. dem Zustand in diesem Fall um eine Autoimmun-, Entzündungs- oder Infektionskrankheit oder -zustand, wenn die Treg-Zellen hochreguliert werden.
In einem Beispiel werden CD4+-Zellen beim Patienten moduliert, z.B. hochreguliert, z.B. beim Patienten erweitert, oder herunterreguliert. Es kann sich hierbei um endogene Zellen des Patienten und/oder Zellen, die an den Patienten verabreicht wurden, oder um deren Nachwuchs handeln.
In einem Beispiel werden CD8+-Zellen beim Patienten moduliert, z.B. hochreguliert, z.B. beim Patienten erweitert, oder herunterreguliert. Es kann sich hierbei um endogene Zellen des Patienten und/oder Zellen, die an den Patienten verabreicht wurden, oder um deren Nachwuchs handeln.
In einem Beispiel werden TILs (tumour infiltrating lymphocytes) beim Patienten moduliert, z.B. hochreguliert, z.B. beim Patienten erweitert, oder herunterreguliert. Es kann sich hierbei um endogene Zellen des Patienten und/oder Zellen, die an den Patienten verabreicht wurden, oder um deren Nachwuchs handeln.
In einem Beispiel werden Gedächtniszellen, z.B. mindestens eines von TCM-Zellen, TEM-Zellen, TSCM-Zellen und Teff-Zellen, in der Mikrobiota bzw. beim Patienten hochreguliert, wobei die Zellen von der an den Patienten verabreichten Immunzellpopulation umfasst sind und/oder deren Nachwuchs sind. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei den Gedächtniszellen um CD45RO+CD62L+ oder CD25+ CD45RA- CD45RO+ CD127+.
Die Hochregulierung einer Zellpopulation kann z.B. eine Vergrößerung der Population oder eine Erhöhung des Anteils von Zellen der jeweiligen Art (z.B. Art oder Stamm) an der Mikrobiota oder dem Patienten oder dem Probanden und/oder eine Erhöhung der Aktivität (z.B. Zytotoxizität, Effektorfunktion oder Suppressorfunktion) von Zellen der jeweiligen Art in der Mikrobiota bzw. beim Patienten oder Probanden sein. Die Herunterregulierung einer Zellpopulation kann z.B. eine Verkleinerung der Population oder eine Reduzierung des Anteils von Zellen der jeweiligen Art (z.B. Art oder Stamm) an der Mikrobiota oder dem Patienten oder dem Probanden und/oder eine Reduzierung der Aktivität (z.B. Zytotoxizität, Effektorfunktion oder Suppressorfunktion) von Zellen der jeweiligen Art in der Mikrobiota bzw. beim Patienten oder Probanden sein.
In einem Beispiel umfasst die Zelltherapiepopulation CAR-T-Zellen (d.h. jeweils T-Zellen, die zur Oberflächenexpression von CARs gentechnisch erzeugt wurden). Alternative handelt es sich bei den Zellen um CAR-TIL oder CAR-NK-Zellen. Ein CAR umfasst eine extrazelluläre Rezeptordomäne zur Bindung an ein Zielantigen (z.B. ein Tumorzellantigen), einen Transmembrananteil und einen intrazellulären Anteil, der mindestens eine (z.B. erste und zweite) Signalisierungsdomänen zur Signalisierung in der Immunzelle (z.B. T-Zelle) umfasst. Beispiele geeigneter intrazellulärer Domänen sind hinreichend bekannt, z.B. eine Kombination aus einer CD3ζ -Domäne und mindestens einer von einer ICOS-, CD28-, OX40- oder 4-1BB-Signalisierungsdomäne, z.B. eine Kombination aus ICOS und CD28; oder ICOS und 41-BB; CD28- und 41-BB-Signalisierungsdomäne.
Wahlweise ist die Zellpopulation von einem Transplantat umfasst, das an den Patienten verabreicht wird, um eine Krankheit zu behandeln oder zu verhüten (z.B. eine Krebserkrankung, Autoimmunkrankheit, Transplantatabstoßung oder GvHD), oder die Zelle bzw. das Transplantat ist dazu bestimmt.
In einem Beispiel ist der Patient ein Mensch, z.B. eine Frau oder ein Mann.
In einem Beispiel hat sich der Patient bzw. der Mensch vor der Gabe der Immunzelle (z.B. CAR-T-Zelle) einer Lymphodepletion unterzogen.
Techniken zur Erzeugung von CARs und CAR-T-Zellen sind hinreichend bekannt und werden routinemäßig ausgeführt; diese lassen sich allgemein auf die Erzeugung von Zellen zur Verwendung im Rahmen der Erfindung anwenden (vgl. WO2012079000A1 ; US8906682 , US8911993 , US8916381 , US8975071 , US9101584 , US9102760 , US9102761 , US9328156 , US9464140 , US9481728 , US9499629 , US9518123 , US9540445 , US20130287748 , US20130288368 , US20130309258 , US20140106449 , US20140370017 , US20150050729 , US20150093822 , US20150099299 , US20150118202 , US20160130355 , US20160159907 , US20160194404 , US20160208012 ; J Immunother. 2009 Sep; 32(7): 689-702, doi: 10.1097/CJI.0b013e3181ac6138, „Construction and Pre-clinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor", James N. Kochenderfer et al; sowie WO2014012001 und US20150290244 für allgemeine Verfahren, die auf die vorliegende Erfindung anwendbar sind). Die Verwendung von Elektroporation, Retrovirusvektoren oder Lentivirusvektoren - was dem Fachmann an sich bekannt ist - kann z.B. zur Einführung von Nukleotidsequenzen, die Elemente des CAR codieren, in T-Zellen, NK-Zellen, TILs oder sonstige Immunzellen verwendet werden, um die CAR-Zellen zu erzeugen. Zellen, die aus dem Patienten (autologe Zellprobe) oder aus einem anderen Spender derselben Art (allogene Probe) isoliert wurden, können zur Bereitstellung von Vorläuferzellen verwendet werden, die derart gentechnisch erzeugt wurden, dass sie die CAR codierenden Sequenzen enthalten. Dabei können Zellen erweitert werden, was an sich bekannt ist. Nach der gentechnischen Erzeugung von CAR-Zellen kann die Zellpopulation z.B. unter Verwendung von Routinemethoden enorm erweitert werden, um ein Transplantat zu erzeugen, dass an den Patienten verabreicht (z.B. transfundiert) wird. Beim Patienten kann es sich um einen Menschen oder ein nichtmenschliches Tier handeln. Nukleotidsequenzen für eines oder mehrere der CAR-Elemente (z.B. für mindestens eine von drei Signalisierungsdomänen) können unter Verwendung einer dem Patienten oder einem anderen Spender entnommenen Zelle geklont oder sequenziert werden.
Bspw. umfasst der CAR eine erste intrazelluläre Signalisierungsdomäne, die eine menschliche CD3ζ -Domäne ist, und die an den Patienten verabreichten Zellen sind menschliche Zellen, die eine endogene Nukleotidsequenz umfassen, die diese menschliche CD3ζ -Domäne codiert. In einem beispiel umfasst die CD3-zeta-Signalisierungsdomäne die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 24 nach WO2012079000A1 , die zur erfindungsgemäßen Verwendung und womöglich zur Aufnahme in mindestens einen vorliegenden Patentanspruch als Bestandteil der vorliegenden Patentschrift gilt. In einem beispiel wird die CD3-zeta-Signalisierungsdomäne von der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 18 nach WO2012079000A1 codiert, die zur erfindungsgemäßen Verwendung und womöglich zur Aufnahme in mindestens einen vorliegenden Patentanspruch als Bestandteil der vorliegenden Patentschrift gilt.
Bei der ersten Signalisierungsdomäne handelt es sich z.B. um eine menschliche CD28-Domäne, und die erfindungsgemäße Zellpopulation ist eine Population menschlicher Zellen, die jeweils eine endogene Nukleotidsequenz umfassen, die diese menschliche CD28-Domäne codieren.
Bei der ersten Signalisierungsdomäne handelt es sich z.B. um eine menschliche 4-1BB-Domäne, und die erfindungsgemäße Zellpopulation ist eine Population menschlicher Zellen, die jeweils eine endogene Nukleotidsequenz umfassen, die diese menschliche 4-1BB-Domäne codieren.
Bei der ersten Signalisierungsdomäne handelt es sich z.B. um eine menschliche OX40-Domäne, und die erfindungsgemäße Zellpopulation ist eine Population menschlicher Zellen, die jeweils eine endogene Nukleotidsequenz umfassen, die diese menschliche OX40-Domäne codieren.
In einem beispiel ist die erste Signalisierungsdomäne eine CD3ζ -Domäne, und die ersten und zweiten intrazellulären Signalisierungsdomänen kommen in der Natur nicht in einer einzelnen Zelle vor (z.B. eine wilde menschliche Zelle oder eine aus dem Patienten isolierte Zelle), z.B. ist die zweite Domäne eine CD28-, CD27-, OX40- oder 4-1BB-Domäne.
In einem Beispiel ist die erste intrazelluläre Domäne eine CD3ζ -, CD28- oder 4-1BB-Domäne.
In einem Beispiel handelt es sich beim CAR um ein gentechnisch erzeugtes Einzelpolypeptid, das (in Richtung vom N- zum C-Terminus) eine Antigenbindungsstelle (z.B. ein scFv eines Antikörpers, der menschlich sein kann), ein optionales Hinge (z.B. ein menschliches CD8α -Hinge); eine Transmembrandomäne (z.B. eine menschliche CD8a- oder CD28-Transmembrandomäne) und eine menschliche CD3ζ-Domäne umfasst. In einem Beispiel ist der CAR ein Komplex aus zwei oder mehr dieser Polypeptide. Wahlweise umfasst der CAR eine weitere intrazelluläre Signalisierungsdomäne (i) zwischen den Transmembran- und CD3ζ-Domänen. Wahlweise umfasst der CAR eine weitere intrazelluläre Signalisierungsdomäne, wobei die CD3ζ -Domäne zwischen der weiteren Signalisierungsdomäne und der Transmembrandomäne liegt. In einem Beispiel handelt es sich bei der weiteren Signalisierungsdomäne um eine menschliche CD27 -Domäne, CD28 -Domäne, ICOS -Domäne, OX40 -Domäne, CD40 -Domäne, 4-1BB -Domäne, eine FcεRIγ -Domäne, CD64 -Domäne oder CD16 - Domäne. In einer Alternative umfasst der CAR statt eines einzelnen Polypeptids einen gentechnisch erzeugten Komplex aus mindestens 2 Polypeptiden, die diese Domänen umfassen.
Die Immunzellen können entweder allein oder als pharmazeutische Zusammensetzung in Kombination mit Verdünnungsmitteln und/oder anderen Bestandteilen wie z.B. IL-2- oder anderen Zytokinen oder Zellpopulationen verabreicht werden.
Gemäß einer Ausführungsform umfassen die Immunzellen (z.B. CAR-Zellen oder Zellen, die TCRs tragen) Zelloberflächenbindungsstellen (z.B. bereitgestellt vom CAR oder TCR), die eine TAA binden. Tumorantigene (TAA) sind Proteine, die von Tumorzellen erzeugt werden und eine Immunantwort, v.a. T-zellvermittelte Immunantworten, auslösen. Die Auswahl der Bindungsspezifizität des Antigens hängt dabei von der Art der zu behandelnden Krebserkrankung ab. Tumorantigene sind an sich hinreichend bekannt; hierzu gehören im Rahmen einer Ausführungsform der Erfindung z.B. ein gliomassoziiertes Antigen, CEA, β-HCG, Alphafetoprotein (AFP), auf Lectin reagierendes AFP, Thyroglobulin, RAGE-1 , MN-CA IX, Reverse-Transkriptase der menschlichen Telomerase, RU1 , RU2 (AS), intestinale Carboxyesterase, mut hsp70-2, M-CSF, Prostase, PSA, PAP, NY-ESO- 1 , LAGE-la, p53, Prostein, PSMA, Her2/neu, Survivin und Telomerase, PCTA-1, MAGE, ELF2M, Neutrophilelastase, EphrinB2, CD22, IGF-I, IGF-II, IGF-I-Rezeptor und Mesothelin.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das TAA mindestens ein antigens Krebsepitop, das mit einem Malignom assoziiert ist. Malignome exprimieren eine Reihe von Proteinen, die als Zielantigene eines Immunangriffs fungieren können. Zu diesen Molekülen gehören insbesondere gewebespezifische Antigene wie z.B. MART-1, Tyrosinase und GP 100 bei Melanom und PAP und PSA bei Prostatakrebs. Weitere Zielmoleküle gehören zur Gruppe der mit Umwandlungen zusammenhängenden Moleküle wie z.B. das Oncogen HER-2/Neu ErbB-2. Noch eine weitere Gruppe von Zielantigenen sind die onko-fötalen Antigene wie z.B. CEA. Bei B-Zell-Lymphom stellt das Immunglobulin des tumorspezifischen Idiotyps eine wahrhaft tumorspezifisches Ig-Antigen, das dem einzelnen Tumor eindeutig zugeordnet werden kann. B-Zell-Differenzierungsantigene wie z.B. CD19, CD20 und CD37 kommen als Zielantigene bei B-Zell-Lymphom auch infrage. Einige dieser Antigene (CEA, HER-2, CD19, CD20, Idiotyp) sind als Ziele einer passiven Immuntherapie mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) verwendet worden; hierbei hat sich der Erfolg in Grenzen gehalten. Das erste Antigen oder der vierte Bindungsanteil kann ein beliebiges dieser TAAs oder eine antigene Sequenz eines dieser TAAs sein.
Als Beispiele von TAA-Antigenen einer Ausführungsform der Erfindung seien insbesondere gekannt: Differenzierungsantigene wie z.b. MART-1/MelanA (MART-1), g 1 OO (MMel 17), Tyrosinase, TRP-1 , TRP-2 und tumorspezifische multipotente Antigene wie z.B. MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE- 1 , GAGE-2, pi 5; überexprimierte embryonale Antigene wie z.B. CEA; überexprimerte Onkogene und mutierte Tumor-Suppressor-Gene wie z.B. p53, Ras, HER-2/neu; einzigartige Tumorantigene infolge chromosomaler Translokationen wie z.B. BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, 1GH-IGK, MYL-RAR; und Virusantigene wie z.B. die Epstein-Barr-Virus-Antigene EBVA und die humanen Papillomvirus (HPV)-Antigene E6 und E7. Weitere große, auf Proteinen basierende Antigene sind insbesondere TSP- 180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE- 6, RAGE, NY-ESO, pl 85erbB2, p 1 80erbB-3, c-met, nm-23H 1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDK4, Mum-1 , p 15, p 16, 43-9F, 5T4(791Tgp72} Alphafetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\ I, CO-029, FGF-5, G250, Ga733VEpCAM, HTgp- 175, M344, MA-50, MG7- Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1 , SDCCAG16, TA-90\Mac-2-Bindungsprotein, Acyclophilin C-assoziiertes Protein, TAAL6, TAG72, TLP und TPS.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der CAR oder TCR eine Bindungsstelle für menschliches CD19, bei einem CAR kann dies z.B. durch ein Anti-CD19-scFv bereitgestellt werden, wahlweise wobei das Anti-CD19-scFv von der SEQ ID NR: 14 nach WO2012079000A1 codiert wird. Gemäß einigen Ausführungsbeispielen umfasst Anti-CD19-scFv die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 20. Die Sequenzen in diesem Absatz erscheinen in der WO2012079000A1 und werden ausdrücklich zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung und womöglich zur Aufnahme in mindestens einen vorliegenden Patentanspruch bestimmt.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Transmembran-Domäne, die natürlich mit einer der Domänen im CAR assoziiert ist, verwendet. In einigen Fällen kann die Transmembran-Domäne ausgewählt oder mittels Aminosäuresubstitution modifiziert werden, um eine Bindung dieser Domänen an die Transmembran-Domänen derselben oder anderer Oberflächenmembranproteine zu vermeiden, um so Wechselwirkungen mit anderen Mitgliedern des Rezeptorkomplexes zu minimieren.
Die Transmembran-Domäne kann entweder aus einer natürlichen oder einer synthetischen Quelle abgeleitet werden. Ist die Quelle natürlich, so kann die Domäne aus einem beliebigen membrangebundenen oder Transmembran-Protein abgeleitet werden. Transmembran-Regionen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders nützlich sind, können abgeleitet werden aus (d.h. umfassen mindestens die Transmembran-Region(en) von) der Alpha-, Beta- oder Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptors, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137 oder CD 154. Alternativ kann die Transmembran-Domäne synthetisch sind; in diesem Fall umfasst sie v.a. hydrophobe reste wie z.B. Leucin und Valin. Wahlweise befindet sich ein Triplett aus Phenylanalinin, Tryptophan und Valin an jedem Ende einer synthetischen Transmembran-Domäne.
Wahlweise bildet ein kurzer Oligo- oder Polypeptid-Linker, vorzugsweise zwischen 2 und 10 Aminosäuren lang, eine Verbindung zwischen der Transmembran-Domäne und dem intrazellulären Teil des Transmembran-Proteins der Immunzelle, z.B. des CAR. Ein Glycin-Serin-Dublett bietet einen besonders geeigneten Linker (z.B. einen erfindungsgemäen (G4S)n-Linker).
Wahlweise handelt es sich bei der Transmembran-Domäne um die CD8-Transmembran-Domäne, die von der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 16 codiert wird. Gemäß einer Ausführungsform umfasst die CD8-Transmembran-Domäne die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 22. Die Sequenzen in diesem Absatz erscheinen in der WO2012079000A1 und werden ausdrücklich zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung und womöglich zur Aufnahme in mindestens einen vorliegenden Patentanspruch bestimmt.
In einigen Fällen umfasst die Transmembran-Domäne die CD8-Hinge-Domäne, die von der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 15 codiert wird. Gemäß einer Ausführungsform umfasst die CD8-Hinge-Domäne die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 21. Die Sequenzen in diesem Absatz erscheinen in der WO2012079000A1 und werden ausdrücklich zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung und womöglich zur Aufnahme in mindestens einen vorliegenden Patentanspruch bestimmt.
Der intrazelluläre Teil oder sonst die intrazelluläre(n) Signalisierungsdomäne(n) des Transmembran-Proteins, das von Zellen der an den Patienten verabreichten Zellpopulation exprimiert wird, ist verantwortlich für die Aktivation mindestens einer der normalen Effektorfunktionen der Immunzelle, die das Transmembran-Protein exprimiert (z.B. eine T-Zell-Funktion, die z.B. zur Zytotoxizität (z.B. für T-Effektorzellen) oder Suppression (für regulatorische T-Zellen) führt). Der Begriff „Effektorfunktion“ bezieht sich hierbei auf eine spezialisierte Funktion einer Zelle. Die Effektorfunktion einer T-Zelle kann z.B. eine zytolytische Aktivität oder Helferaktivität sein, zu der die Absonderung von Zytokinen gehört. Also bezieht sich der Begriff „intrazelluläre Signalisierungsdomäne“ auf den Teil eines Proteins, der das Signal der Effektorfunktoion überträgt und die Zelle dazu veranlasst, eine spezialisierte Funktion auszuführen. Obgleich dabei die gesamte intrazelluläre Signalisierungsdomäne eingesetzt werden kann, ist die Verwendung der ganzen Kette in vielen Fällen nicht notwendig. Soweit ein gekürzter Teil der intrazellulären Signalisierungsdomäne verwendet wird, kann dieser gekürzte Teil anstelle der intakten Kette verwendet werden, solange er das Signal der Effektorfunktion überträgt. Der Begriff „Signalisierungsdomäne“ soll also einen beliebigen gekürzten Teil der intrazellulären Signalisierungsdomäne umfassen, der zur Übertragung des Signals der Effektorfunktion ausreicht. Als beispiele intrazellulärer Signalisierungsdomänen zur Verwendung im Transmembran-Protein der verabreichten Zellen seien genannt die zytoplasmischen Sequenzen des TCR und Korezeptoren, die zusammenwirken, um nach dem Einschalten des Antigenrezeptors die Signalübertragung einzuleiten, sowie ein beliebiges Derivat oder eine beliebige Variante dieser Sequenzen und eine beliebige synthetische Sequenz mit der gleichen funktionellen Fähigkeit.
Bekannt ist, dass Signale, die durch den TCR erzeugt werden, allein zur vollständigen Aktivation der T-Zelle nicht ausreichen und dass auch ein sekundäres oder kostimulatorisches Signal benötigt wird. So lässt sich sagen, dass die T-Zell-Aktivation durch zwei unterschiedliche Klassen von zytoplasmischen Signalisierungssequenzen vermittelt wird: Solche, die die antigenabhängige primäre Aktivation durch den TCR (primäre zytoplasmische Signalisierungsdomäne) einleiten, und diejenigen, die auf antigenunabhängige Weise wirken, um ein sekundäres oder kostimulatorisches Signal bereitzustellen (sekundäre zytoplasmische Signalisierungsdomäne). Die primären zytoplasmischen Signalisierungssequenzen regeln die primäre Aktivation des TCR-Komplexes entweder stimulatorisch oder hemmend. Primäre zytoplasmische Signalisierungssequenzen, die stimulatorisch wirken können Signalisierungsmotive enthalten, die ITAMs (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs) genannt werden.
In einem Beispiel ist die erste Signalisierungsdomäne eine primäre zytoplasmische Signalisierungsdomäne (z.B. CD3ζ -Domäne). In einem Beispiel ist die erste Signalisierungsdomäne eine sekundäre zytoplasmische Signalisierungsdomäne (z.B. CD28- oder 4-1BB-Domäne).
In einem Beispiel umfasst die erste Signalisierungsdomäne mindestens ein ITAM.
Als Beispiele geeigneter ITAMs, die primäre zytoplasmische Signalisierungsdomänen enthalten, die im Rahmen der Erfindung besonders nützlich sind, seien insbesondere solche genannt, die abgeleitet sind aus TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma , CD3 delta , CD3 epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b, und CD66d. Besonders bevorzugt wird dabei, dass das zytoplasmische Signalisierungsmolekül im erfindungsgemäßen Transmembran-Protein eine zytoplasmische Signalisierungssequenz umfasst, die aus CD3 zeta abgeleitet ist.
Der intrazelluläre Teil umfasst wahlweise (z.B. als erste Signalisierungsdomäne oder weitere intrazelluläre Domäne) eine Domäne eines kostimulatorischen Moleküls. Ein kostimulatorisches Molekül ist ein anderes Zelloberflächemolekül als ein Antigenrezeptor oder Liganden davon, das für eine effiziente Antwort auf ein Antigen seitens der Lymphozyten (z.B. T- oder NK-Zellen) benötigt wird. Als Beispiele dieser Moleküle seien genannt: CD27, CD28, 4- 1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, sowie ein Ligand, der sich spezifisch mit CD83 bindet, u. dgl. Also fallen diese und weitere kostimulatorische Elemente in den Schutzumfang der Erfindung zur Verwendung im intrazellulären Teil des Transmembran-Proteins.
Die intrazellulären Domänen können durch mindestens einen Linker, z.B. einen erfindungsgemäßen (G4S)n-Linker, verbunden werden.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der intrazelluläre Anteil die Signalisierungsdomäne von CD3-zeta und die Signalisierungsdomäne von CD28. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst der intrazelluläre Anteil die Signalisierungsdomäne von CD3-zeta und die Signalisierungsdomäne von 4-1BB. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform umfasst der intrazelluläre Anteil die Signalisierungsdomäne von CD28 und die Signalisierungsdomäne von 4-1BB.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der intrazelluläre Anteil die Signalisierungsdomäne von 4-1BB und die Signalisierungsdomäne von CD3-zeta, wobei die Signalisierungsdomäne von 4-1BB von der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 17 codiert wird und die Signalisierungsdomäne von CD3-zeta von der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 18 codiert wird. Die Sequenzen in diesem Absatz erscheinen in der WO2012079000A1 und werden ausdrücklich zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung und womöglich zur Aufnahme in mindestens einen vorliegenden Patentanspruch bestimmt.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der intrazelluläre Anteil die Signalisierungsdomäne von 4-1BB und die Signalisierungsdomäne von CD3-zeta, wobei die Signalisierungsdomäne von 4-1BB die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 23 umfasst und die Signalisierungsdomäne von CD3-zeta die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 24 umfasst. Die Sequenzen in diesem Absatz erscheinen in der WO2012079000A1 und werden ausdrücklich zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung und womöglich zur Aufnahme in mindestens einen vorliegenden Patentanspruch bestimmt.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der intrazelluläre Anteil die Signalisierungsdomäne von 4-1BB und die Signalisierungsdomäne von CD3-zeta, wobei die Signalisierungsdomäne von 4-1BB die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 23 umfasst und die Signalisierungsdomäne von CD3-zeta die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 24 umfasst. Die Sequenzen in diesem Absatz erscheinen in der WO2012079000A1 und werden ausdrücklich zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung und womöglich zur Aufnahme in mindestens einen vorliegenden Patentanspruch bestimmt.
Quellen von T-Zellen und anderen Immunzellen finden sich in WO2012079000A1 , US8906682 , US8911993 , US8916381 , US8975071 , US9101584 , US9102760 , US9102761 , US9328156 , US9464140 , US9481728 , US9499629 , US9518123 , US9540445 , US20130287748 , US20130288368 , US20130309258 , US20140106449 , US20140370017 , US20150050729 , US20150093822 , US20150099299 , US20150118202 , US20160130355 , US20160159907 , US20160194404 , US20160208012 , sowie Verfahren zu ihrer Erzeugung, Aktivation und Erweiterung. Auf diese Druckschriften wird zwecks evtl. Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwiesen.
KREBSERKRANKUNGEN ZUR BEHANDLUNG ODER VEHÜTUNG MIT DEM VERFAHREN
Zu den Krebserkrankungen, die behandelt werden können, gehören Tumoren, die nicht vaskularisiert sind oder keine erhebliche Vaskularisation aufweisen, sowie vaskularisierte Tumoren. Diese Krebeserkrankungen können nicht solide Tumoren (z.B. hämatologische Tumoren, z.B. Leukämien und Lymphome) umfassen, oder sie können solide Tumoren umfassen. Zu den Krebsarten, die mit der Erfindung behandelbar sind, gehören insbesondere Karzinom, Blastom und Sarkom sowie bestimmte Leukämien und lymphoide Malignome, gut- und bösartige Tumoren und Malognome, z.B. Sarkome, Karzinome und Melanome. Hierzu gehören auch Tumoren/Krebserkrankungen bei Erwachsenen sowie bei Kindern.
Hämatologische Krebserkrankungen sind Krebserkrankungen des Bluts oder des Knochenmarks. Als Beispiele hämatologischer (oder hämatogener) Krebserkrankungen seien insbesondere genannt: Leukämien, insbesondere akute Leukämien (z.B. akute lymphozytische Leukämie, akute myelozytische Leukämie, akute myeloische Leukämie und Myeloblasten, promyelozytische, myelomonozytische, monozytische und Erythroleukämie), chronische Leukämien (z.B. chronische myelozytische (granulozytische) Leukämie, chronische myeloische Leukämie und chronische lymphozytische Leukämie), Polycythemia vera, Lymphom, M. Hodgkin, Nicht-Hodgkin-Lymphom (indolente und hochgradige Formen), multiplee Myelom, M. Waldenström, Schwerkettenkrankheit, myelodysplastisches Syndrom, Haarzell-Leukämie und Myelodysplasie.
Solide Tumoren sind abnorme Gewebemassen, die normalerweise keine Zysten oder flüssigen Bereiche enthalten. Solide Tumoren können gut- oder bösartig sein. Die verschiedenen Arten der soliden Tumoren werden nach den Zellarten genannt, aus denen sie bestehen (z.B. Sarkome, Karzinome und Lymphome). Als Beispiele solider Tumoren wie z.B. Sarkome und Karzinome, seinen insbesondere genannt: Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom und andere Sarkome, Synoviom, Mesotheliom, Ewing-Sarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Kolonkarzinom, lymphoides Malignom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Leberzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, medulläres Schilddrüsenkarzinom, papilläres Schilddrüsenkarzinom, Phäochromozytome, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläre Adenokarzinome, medulläres Karzinom, Bronchialkarzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallengangskarzinom, Choriokarzinom, Wilmstumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumoren, Seminom, Blasenkarzinom, Melanom und ZNS-Tumoren (z.B. Gliom (z.B. Hirnstammgliom und Mischgliome), Glioblastom (auch Glioblastoma multiforme genannt), Astrozytom, ZNS-Lymphom, Germinom, Medulloblastom, Schwannom, Kraniopharyngeom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, Akustikusneurinom, Oligodendrogliom, Meningeom, Neuroblastom, Retinoblastom und Hirnmetastasen).
Gemäß einer Ausführungsform exprimieren die verabreichten Zellen eine erste Antigenbindungsstelle (z.B. umfasst von einem CAR), die zur Behandlung einer bestimmten Krebserkrankung konstruiert ist. Bspw. bindet sie sich spezifisch an CD19 und kann zur Behandlung von Krebserkrankungen und Störungen behandelt werden, z.B. prä-B ALL (pädiatrische Indikation), ALL bei Erwachsenen, Mantellzelllymphom, diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom oder zur Bergung im Anschluss an eine allogene Knochenmarktransplantation. Gemäß einer weiteren Ausführungsformen bindet sich der erste Anteil bzw. die erste Bindungsstelle spezifisch an CD22, um diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom zu behandeln.
Gemäß einer Ausführungsform gehören zu den Krebserkrankungen und Störungen insbesondere prä-B ALL (pädiatrische Indikation), ALL bei Erwachsenen, Mantelzelllymphom, diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom, Bergung im Anschluss an allogene Knochenmarktransplantation u. dgl.; diese können mit einer Kombination aus Überbrückungsmitteln (oder Bindungsanteilen oder -stellen, die von einem einzelnen Wirkstoff umfasst sind), die auf zwei oder mehr der nachfolgenden Ziele zielen: CD19, CD20, CD22 und ROR1 (z.B. CD19 und eines der anderen Ziele).
In einem Beispiel umfassen die Zellen erste und zweite Transmembran-Proteine (z.B. CARs oder einen CAR und einen von einer T-Zelle exprimierten gentechnisch erzeugten TCR), die unterschiedlich sind, die sich z.B. in den Zielantigenen unterscheiden (und wahlweise sonst gleich sind). Ebenso kann im Rahmen der Erfindung eine Mischung aus Immunzellen (z.B. Mischung aus CAR-Zellen) verwendet werden, die z.B. in einem Transplantat umfasst sind, wobei die Mischung Zellen umfasst, die Transmembran-Proteine (z.B. CARs oder einen CAR und einen von einer T-Zelle exprimierten gentechnisch erzeugten TCR), die unterschiedlich sind, die sich z.B. in ihren Zielantigenen unterscheiden (und wahlweise sonst gleich sind). Dies kann nützlich sein, z.B. um die Behandlungsresistenz der Krebserkrankungen zu reduzieren oder um wirksamer auf Zellpopulationen wie z.B. Krebszellen, die auf ihren Oberflächen eine Mehrzahl Zielantigene exprimieren.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an Mesothelin, um Mesotheliom, Bauchspeicheldrüsenkrebs oder Eierstockkrebs zu behandeln oder zu verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an CD33/IL3Ra, um akute myeloische Leukämie zu behandeln oder verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an c-Met, um tripl-negativen Brustkrebs oder nicht kleinzelligen Lungenkrebs zu behandeln oder verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an PSMA, um Prostatakrebs zu behandeln oder verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an Glycolipid F77, um Prostatakrebs zu behandeln oder verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an EGFRvI1I, um Glioblastom zu behandeln oder verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an GD-2, um Neuroblastom oder Melanom zu behandeln oder verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an NY-ESO- 1 TCR, um Myelom, Sarkom oder Melanom zu behandeln oder verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform bindet sich die Antigenbindungsstelle spezifisch an MAGE A3 TCR, um Myelom, Sarkom und Melanom zu behandeln oder verhüten.
Die spezifische Antigenbindung ist eine Bindung mit einem KD-Wert von höchstens 1mM (z.B. höchstens 1 mM, höchstens 100 nM, höchstens 10 nM, höchstens 1 nM, höchstens 100 µM oder höchstens 10 µM) per Oberflächenplasomenenresonanz (SPR) in vitro bei 25 °C oder RT.
In einem Beispiel wird durch die Behandlung unter Verwendung des Verfahrens die Progression der Krankheit bzw. des Zustandes oder eines Symptoms davon reduziert. In einem Beispiel wird durch die Behandlung unter Verwendung des Verfahrens die Häufigkeit der Krankheit bzw. des Zustandes oder eines Symptoms davon über eine Dauer z.B. von mindestens 1, 2, 3, 4 oder 5 Jahren reduziert.
In einem Beispiel erfolgt das Verfahren in vivo bei einem Säuger, z.B. einem Menschen, Mann oder Frau, oder männlichen oder weiblichen Kind, oder einem menschlichen Säugling (z.B. höchstens 1, 2, 3 oder 5 Jahre alt). In ienem Beispiel handelt es sich beim Patienten um einen erwachsenen Menschen oder einen pädiatrischen menschlichen Patienten.
Der CAR oder TCR ist gentechnisch erzeugt, d.h. er enthält eine nicht natürlich vorkommende Kombination aus Anteilen und Domänen. In einem Beispiel zielt die Zelltherapie auf eine Zielzelle, wobei die Zielzelle eine Krebszelle, z.B. eine leukämische Zelle, eine Lymphomzelle, Adenokarzinomzelle oder Krebsstammzelle, ist. Wahlweise bindet sich der CAR bzw. TCR der verabreichten Immunzellen spezifisch an menschliches CD19 (und wahlweise ist die Zielzelle eine leukämische oder Lymphomzelle), EpCAM (und wahlweise ist die Zielzelle eine Lungenkrebszelle, Magen-Darm-Krebszelle, Adenokarzinom, Krebsstammzelle), CD20 (und wahlweise ist die Zielzelle eine leukämische Zelle), MCSP (und wahlweise ist die Zielzelle eine Melanomzelle), CEA, EGFR, EGFRvIII, Sialyl Tn, CD133, CD33 (und wahlweise ist die Zielzelle eine leukämische Zelle, z.B. AML-Zelle), MMSA, WT1, CD22, L1CAM, ROR-1, MUC-16, CD30, CD47, CD52, gpA33, TAG-72, Mucin, CIX, GD2, GD3, GM2, CD123, VEGFR, Integrin, cMET, Her1, Her2, Her3, MAGE1, MAGE A3 TCR, NY-ESO-1, IGF1R, EPHA3, CD66e, EphA2,TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Angiopoetin, Mesothelin, Glycolipid F77 oder Tenascin.
Wahlweise umfasst der CAR die variablen Domänen eines aus der nachfolgenden Gruppe gewählten Antikörpers: CD19 -Bindungsstelle von Blinatumomab oder Antikörper HD37; EpCAM - Bindungsstelle von Catumaxomab; CD19 -Bindungsstelle von AFM11; CD20 -Bindungsstelle von Lymphomun; Her2 -Bindungsstelle von Ertumaxomab; CEA -Bindungsstelle von AMG211 (MEDI-565, MT111); PSMA -Bindungsstelle von Pasotuxizumab; EpCAM -Bindungsstelle von Solitomab; VEGF- oder Angiopoietin 2 -Bindungsstelle von RG7221 oder RG7716; Herl- oder Her3 -Bindungsstelle von RG7597; Her2- oder Her3 -Bindungsstelle von MM111; IGF1R- oder Her3 -Bindungsstelle von MM141; CD123 -Bindungsstelle von MGD006; gpa33 -Bindungsstelle von MGD007; CEA -Bindungsstelle von TF2; CD30 -Bindungsstelle von AFM13; CD19 -Bindungsstelle von AFM11; und Herl- oder cMet - Bindungsstelle von LY3164530.
Wahlweise umfasst der CAR die variablen Domänen einer Antigenbindungsstelle eines aus der nachfolgenden Gruppe gewählten Antikörpers: ReoPro™; Abciximab; Rituxan™; Rituximab; Zenapax™; Daclizumab; Simulect™; Basiliximab; Synagis™; Palivizumab; Remicade™; Infliximab; Herceptin™; Trastuzumab; Mylotarg™; Gemtuzumab; Campath™; Alemtuzumab; Zevalin™; Ibritumomab; Humira™; Adalimumab; Xolair™; Omalizumab; Bexxar™; Tositumomab; Raptiva™; Efalizumab; Erbitux™; Cetuximab; Avastin™; Bevacizumab; Tysabri™; Natalizumab; Actemra™; Tocilizumab; Vectibix™; Panitumumab; Lucentis™; Ranibizumab; Soliris™; Eculizumab; Cimzia™; Certolizumab; Simponi™; Golimumab, Ilaris™; Canakinumab; Stelara™; Ustekinumab; Arzerra™; Ofatumumab; Prolia™; Denosumab; Numax™; Motavizumab; ABThrax™; Raxibacumab; Benlysta™; Belimumab; Yervoy™; Ipilimumab; Adcetris™; Brentuximab; Vedotin™; Perjeta™; Pertuzumab; Kadcyla™; Ado-trastuzumab; Gazyva™ und Obinutuzumab.
In einem Beispiel ist die Zielzelle eine Blutzelle, z.B. eine Stammzelle oder Knochenmarkzelle eines Menschen oder Tiers. Wahlweise ist die Zielzelle eine B- oder T-Zelle.
In einem Beispiel umfasst der CAR bzw. TCR eine Antigenbindungsstelle für eine Autoimmunkrankheitsziel und die Signalisierung reguliert die zytotoxische Aktivität oder die Proliferation der Immunzellen herunter. Im vorliegenden Sinne heißt „Autoimmunkrankheit“ eine Störung, die aus einer Autoimmunantwort resultiert. Eine Autoimmunkrankheit ist das Ergebnis einer unangemessenen und übermäßigen Antwort auf ein Selbstantigen. Als Beispiele von Autoimmunkrankheiten seien insbesondere genannt: M. Addison, Alopecia greata, Spondylitis ankylosans, Autoimmunhepatitis, Autoimmunparotitis, M. Crohn, Diabetes (Typ I), dystrophe Epidermolysis bullosa, Epididymitis, Glomerulonephritis, M. Graves, Guillain-Barr-Syndrom, Hashimoto-Thyreoiditis, hämolytic Anämie, systemisches Lupus erythaematodes, multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Pemphigus vulgaris, Psoriasis, rheumatisches Fieber, rheumatoide Arthritis, Sarkoidose, Sklerodermie, Sjögren-Syndrom, Spondyloarthropathien, Thyreoiditis, Vaskulitis, Weißfleckenkrankheit, Myxödem, perniziöse Anämie, Colitis ulcerosa u.a.
Innerhalb der T-Gedächtniszellpopulation insgesamt sind mehrere unterschiedliche Teilgesamtheiten beschrieben worden, die an der differentiellen Expression des Chemokinrezeptors CCR7 und L-Selectin (CD62L) erkennbar sind. TSCM-Gedächtnisstammzellen, wie naive Zellen, sind CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-Selectin), CD27+, CD28+ and IL-7Rα+, aber sie exprimieren auch große Mengen an CD95, IL-2Rß, CXCR3 und LFA-1, und weisen zahlreiche funktionelle Eigenschaften auf, die für Gedächtniszellen charakteristisch sind. TCM-Zellen exprimieren L-Selectin und CCR7, sie sondern IL-2 ab, aber nicht IFNγ oder IL-4. TEM-Zellen exprimieren jedoch weder L-Selectin noch CCR7, sondern sie erzeugen Effektorzytokine wie z.B. IFNγ und IL-4. T-Gedächtniszellen wie z.B. TSCM können besonders nützlich sein, um eine nachhaltige Population gentechnisch erzeugter Immunzellen beim Menschen zu etablieren.
Eine beliebige Immunzelle, Zielzelle oder Stammzelle kann vorliegend in einem Beispiel eine TSCM-, TCM- oder TEM-Zelle, z.B. eine menschliche TSCM-, TCM- oder TEM-Zelle. In einem Beispiel sind die Immunzellen der Zelltherapie (z.B. CAR-T-Zellen) jeweils Nachwuchs einer Zelle eines Menschen, der unter einer Autoimmunkrankheit, einer Entzündungskrankheit, einer Virusinfektion oder einer Krebserkrankung leidet, z.B. wobei der Mensch unter lymphoblastischer Leukämie, ALL (z.B. T-ALL), CLL (z.B. B-Zell-CLL) oder Nicht-Hodgkin-Lymphom leidet. Der Mensch kann z.B. der Patient oder ein Verwandter von diesem (z.B. Geschwister oder Elternteil) sein.
In einem Beispiel sind die verabreichten Immunzellen zur verstärkten Signalisierung gentechnisch erzeugt worden, wobei die Signalisierung aus CD28-, 4-1BB-, OX40-, ICOS- und CD40-Signalisierung gewählt ist.
Wahlweise werden die Zielzellen (z.B. Tumorzellen) abgetötet. In einem Beispiel ist jede Zielzelle eine Tumorzelle und das Verfahren behandelt oder reduziert das Risiko einer Krebserkrankung oder behandelt oder reduziert das Risiko einer Progression einer Krebserkrankung beim Menschen.
Wahlweise hat der Mensch Krebs. In einem Beispiel ist die Krebserkrankung eine hämatologische Krebserkrankung. In einem Beispiel hat der eine Krebserkrankung B-Zell-Ursprungs. In einem Beispiel hat der eine Krebserkrankung T-Zell-Ursprungs. Bei der Krebserkrankung handelt es sich z.B. um Lungenkrebs, Melanom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Darmkrebs, Nierenzellkarzinom, Eierstockkrebs, Neuroblastom, Rhabdomyosarkom, Leukämie und Lymphom. Bevorzugte krebsartige Ziele zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind B-Zell-Krebserkrankungen, insbesondere ALL, B-Zell-CLL oder B-Zell-Nicht-Hodgkin-Lymphom. In einem Beispiel ist die Krebserkrankung eine T- oder B-Zell-Krebserkrankung, z.B. lymphoblastische Leukämie, ALL (z.B. T-ALL), CLL (z.B. B-Zell-CLL) oder Nicht-Hodgin-Lymphom.
Wahlweise ist jede verabreichte Immunzelle (z.B. CAR-Zellen) Nachwuchs einer Immunzelle des Menschen, z.B. wobei der Mensch unter lymphoblastischer Leukämie, diffusem großzelligem B-Zell-Lymphom (DLBCL), ALL (z.B. T-ALL oder B-ALL), CLL (z.B. B-Zell-CLL) oder Nicht-Hodgkin-Lymphom. Wahlweise ist jede verabreichte Immunzelle (z.B. CAR-Zellen) eine autologe Zelle (z.B. T-Zellen) des Menschen oder Nachwuchs einer derartigen autologen Zelle. Im vorliegenden Sinne bezieht sich der Begriff „autolog“ auf ein beliebiges Material, das aus demselben Individuum abgeleitet ist, in das es später wieder einzuführen ist. „Allogen“ bezieht sich dabei auf ein Transplantat, das aus einem anderen Tier derselben Art abgeleitet ist.
Wahlweise ist jede verabreichte Immunzelle (z.B. CAR-Zellen) aus einer Blut- oder Tumorprobe des Menschen und wird vor dem Schritt (c) in vitro aktiviert und expandiert. Im vorliegenden Sinne bezieht sich „Aktivierung“ auf den Zustand einer T-Zelle oder einer anderen Immunzelle, die ausreichend erregt worden ist, um eine nachweisbare Zellproliferation einzuleiten. Die Aktivation kann auch mit einer induzierten Zytokinproduktion und nachweisbaren Effektorfunktionen einhergehen. Der Begriff „aktivierte T-Zellen“ bezieht sich u.a. auf T-Zellen, die sich einer Zellteilung unterziehen.
Gemäß einer Ausführungsform hat der Mensch eine Autoimmunkrankheit, wobei die verabreichten Immunzellen (z.B. CAR-Zellen) anerg sind oder eine verringerte Proliferation und/oder zytotoxische Aktivität bei Bindung an Zielzellen aufweisen, wobei die Zelltransplantatzellen (und/oder deren Nachwuchs) mit endogenen Immunzellen des Menschen konkurrieren, die die Autoimmunkrankheit hochregulieren.
Die Verabreichung von Immunzellen im Verfahren kann durch Zellinfusion in das Blut eines Patienten erfolgen. Die Immunzellen können expandiert werden, um eine expandierte Immunzellpopulation zu erzeugen, die an den Patienten verabreicht wird. Die Immunzellen können aktiviert werden, um eine aktivierte Immunzellpopulation zu erzeugen, die an den Patienten verabreicht wird. In erfindungsgemäßen Verfahren wird eine wirksame Menge an Immunzellen verabreicht. Eine „wirksame Menge“ heißt im vorliegenden Sinne eine Menge, die einen therapeutischen oder prophylaktischen Vorteil bietet, um die Krankheit bzw. den Zustand zu behandeln oder verhüten.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vom Verfahren das Risiko einer Krebserkrankung beim Patienten (z.B. einem Menschen) behandelt oder reduziert, wobei sich der Patient vor der Verabreichung der Immunzellen an den Patienten einer Lymphodepletion unterzogen hat.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Mensch resistent gegenüber mindestens einem Chemotherapeutikum.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der CLL um refraktäre CD19+ -Leukämie und Lymphom.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Erzeugung einer nachhaltigen Population gentechnisch erzeugter T-Zellen bei einem Menschen, bei dem eine Krebserkrankung festgestellt worden ist, wobei die verabreichten Zellen T-Zellen umfassen und die nachhaltige Population den Nachwuchs davon umfasst. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren Verabreichen einer T-Zell-Population (z.B. einer CAR-T-Zell-Population) an einen Menschen, wobei die nachhaltige Population gentechnisch erzeugter T-Zellen mindestens einen Monat lang nach der Verabreichung beim Menschen bestehen bleibt. Gemäß einer Ausführungsform umfasst die nachhaltige Population gentechnisch erzeugter T-Zellen eine T-Gedächtniszelle. Gemäß einer Ausführungsform bleibt die nachhaltige Population gentechnisch erzeugter T-Zellen mindestens 3 Monate lang nach der Verabreichung beim Menschen bestehen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform bleibt die nachhaltige Population gentechnisch erzeugter T-Zellen mindestens 4 Monate, 5 Monate, 6 Monate, 7 Monate, 8 Monate, 9 Monate, 10 Monate, 11 Monate, 12 Monate, 2 Jahre oder 3 Jahre lang nach der Verabreichung bestehen.
Gemäß einer Ausführungsform wird die CLL behandelt. Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zum Expandieren einer Population der gentechnisch erzeugten T- oder NK-Zellen bei einem Menschen, bei dem eine Krebserkrankung festgestellt worden ist, bereitgestellt, wobei die verabreichten Zellen T- und/oder NK-Zellen umfassen und die expandierte Population deren Nachwuchs umfasst.
Wahlweise wird bei der Behandlung eine autologe Lymphozyteninfusion verwendet. Autologe PBMCs werden z.B. einem behandlungsbedürftigen Patienten entnommen, und CAR-T-Zellen werden derart gentechnisch erzeugt, dass sie das CAR-Transmembran-Protein exprimieren, aktiviert und mit bekannten Verfahren expandiert und dann im Schritt (a) wieder in den Patienten infundiert.
In einem Beispiel sind die verabreichten Zellen pluri- oder multipotent.
Die Stammzelle kann sich nicht zu einem Menschen entwickeln. Gemäß einer Ausführungsform kann sich die Stammzelle nicht zu einem menschlichen Embryo oder einer menschlichen Zygote entwickeln.
In einem Beispiel umfasst die verabreichte Zellpopulation Knochenmark-Stammzellen, z.B. menschliche autologe oder allogene Zellen.
In einem Beispiel umfasst die verabreichte Zellpopulation hämatopoetische Stammzellen, z.B. menschliche autologe oder allogene Zellen.
MODIFIKATION DER MIKROBIOTA
Zur medizinischen Praxis gehört häufig die Verabreichung von Antibiotika an Patienten. Zu diesen Behandlungen gehört typischerweise die Verabreichung von Breitbandantibiotika oder Antibiotika, die ohne Unterschied auf zahlreiche grampositive Bakterienarten oder gramnegative Bakterienarte zielen. Ebenso gibt der Einsatz von Breitbandantibiotika z.B. in der Landwirtschaft Anlass zu Umweltschutzbedenken, insbesondere was den Eintritt dieser Antibiotika in die Nahrungskette von Menschen und Tieren betrifft, der gesundheitsschädlich sein und die Entwicklung von mikrobieller Resistenz fördern kann. Vielmehr umfasst die Erfindung in einem Beispiel das selektive Zielen auf eine erste mikrobielle (z.B. bakterielle oder archaeale) Art oder einen ersten mikrobiellen Stamm der Mikrobiota. Wie in den vorliegenden ausgeführten Beispielen gezeigt, ist das selektive Zielen auf eine bestimmte Bakterienart unter Nutzung der geführten Nucleasezielung auf das Genom der ausgewählten Art erreicht worden, wobei gleichzeitig verwandte Arten und Stämme, sowie Arten, die neben dieser bestehen, geschont werden (in den Beispielen, Arten, die in der menschlichen Darmflora nebeneinander bestehen). In einem Beispiel umfasst also der Schritt des Hervorrufens einer Dysbiose bzw. der Schritt (b) Abtöten erster Zellen einer Teilgesamtheit der Mikrobiota oder Hemmen des Wachstums der Teilgesamtheit unter Verwendung der geführten Nucleasezielung (z.B. RNA-geführte Nuclease) auf das Genom der von einer Teilgesamtheit der Mikrobiota umfassten ersten Zellen. Geeignete Systeme zur Ausführung der geführten Nucleasezielung sind z.B. gentechnisch erzeugte CRISPR/Cas-Systeme, TALENs, Meganucleasen und Zinkfingerproteinsysteme. Die CRPSR-/Cas-vermittelte geführte Zielung auf eine ausgewählte Bakterienart der menschlichen Darmflora in einem Konsortium wird z.B. in den vorliegenden Beispielen aufgezeigt. Die Zielung ergibt ein Zuschneiden der DNA der Zielart bzw. des Zielstammes durch die Nuclease, was z.B. den relativen Anteil der Art an der Mikrobiota reduziert oder das Wachstum der Teilgesamtheit der Art in der Mikrobiota hemmt. Das selektive Zielen auf Arten im Verfahren ist generell vorteilhaft, um eine feinere Steuerung der Änderung der relativen Anteile der bakteriellen und/oder archaealen Arten an der Mikrobiota zu ermöglichen. Auf diese Weise wird erfindingsgemäß die Möglichkeit bereitgestellt, die Mikrobiota zu verändern, um die Hoch- oder Herunterregulierung bestimmter Immunzellpopulationen wie z.B. TH1-, TH17- und/oder Treg-Zellen (gleichgültig, ob es sich hier bei um endogene Zellen des Patienten und/oder solche, die von adoptiven Immunzellpopulationen umfasst sind, die an den Patienten verabreicht werden) oder sonstige Ergebnisse des Modulierens der Mikrobiota zu beeinflussen, wie vorliegend beschrieben.
In einem Beispiel wird das Wachstum der ersten Zellpopulation gegenüber dem Wachstum vor der Dysbiose bzw. dem Schritt (b) um mindestens ein 5-faches reduziert. Das Verfahren kann Hemmen des Wachstums der ersten Zellpopulation auf einer Darmoberfläche umfassen. Das Verfahren kann Hemmen des Wachstums der ersten Zellpopulation auf einer Pflanzenoberfläche (z.B. Blatt und/oder Stiel) umfassen.
In einer Alternative wird die Behandlung nicht auf einen Probanden, sondern auf eine Umgebung bzw. einen Boden angewendet (die Behandlung ist z.B. ein Düngemittel, eine Behandlung zur Förderung bzw. Hemmung des Pflanzenwachstums, Herbizid- oder Pestizidbehandlung), wobei die Behandlung von der erfindung moduliert wird.
Dem Fachmann ist es ohne weiteres bekannt, Veränderungen bei Bakterien und Archaea in einer Darmflora oder einer anderen Mikrobiota zu bestimmen. Dies kann z.B. durch Analysieren einer Stuhlprobe des Patienten vor und nach der Behandlung erfolgen. Man kann die unterschiedlichen Arten oder Stämme in jeder Probe sowie den Anteil der Arten bzw. Stämme vor und nach der Behandlung bestimmen. Mit einer konventionellen Analyse der 16s ribosomale RNA codierenden DNA (16s rDNA) ist es z.B. möglich, Arten zu identifizieren. Zusätzlich oder alternativ können standardmäßige biochemische Tests zur Identifizierung von Stämmen oder Arten verwendet werden, die z.B. auch mindestens eines der nachfolgenden Verfahren umfassen: Färben, Motilitätsuntersuchung, serologische Untersuchung, Phagotypisierung und Kennungsscheibenuntersuchungen (z.B. mit einem Scheibendiffusionsverfahren nach Kirby Baur). Zu den biochemischen Untersuchungen kann mindestens eines der nachfolgenden Verfahren gehören: (a) Katalasetest, (b) Koagulasetest, (c) Oxidasetest, (d) Zuckerfermentationstest, (i) Indoltest, (f) Citrattest und (g) Ureasetest. Die relativen Anteile können durch Züchten von Kolonien auf Agarplatten (wie in den vorliegenden Beispielen) aus jeder Probe und Zählen der Koloniezahlen bestimmt werden.
In einem Beispiel erhöht die Dysbiose bzw. der Schritt (b) den Anteil von Bacteroides (z.B. B. fragalis und/oder B. thetaiotaomicron) an der Mikrobiota.
In einem Beispiel reduziert die Dysbiose bzw. der Schritt (b) den Anteil von Bacteroides (z.B. B. fragalis und/oder B. thetaiotaomicron) an der Mikrobiota. In einem Beispiel erhöht die Dysbiose bzw. der Schritt (b) das Verhältnis von Bacteroides zu Vermicutes in der Mikrobiota, z.B. Darmflora. In einem Beispiel reduziert die Dysbiose bzw. der Schritt (b) das Verhältnis von Bacteroides zu Vermicutes in der Mikrobiota, z.B. Darmflora.
Zunehmende Beweise sprechen dafür, dass kommensale Stämme von Bifidobacterium und Clostridium spp. zu den Clustern IV und XIVa bei der Induktion von Treg-Zellen gehören. Vgl. López et al. In einem Beispiel reduziert die Dysbiose bzw. der Schritt (b) den Anteil mindestens einer Clostridium-Art oder mindestens eines Clostridium-Stammes an der Darmflora reduziert (in einem Beispiel ist jede Art eine Cluster IV- oder -XIVa-Clostridiumart). In einem Beispiel erhöht die Dysbiose bzw. der Schritt (b) den Anteil mindestens einer Clostridium-Art oder mindestens eines Clostridium-Stammes an der Darmflora reduziert (in einem Beispiel ist jede Art eine Cluster IV- oder -XIVa-Clostridiumart).
In einem Beispiel reduziert die Dysbiose bzw. der Schritt (b) den Anteil von Bifidobacterium (z.B. B. bifidum) an der Darmflora. In einem Beispiel erhöht die Dysbiose bzw. der Schritt (b) den Anteil von Bifidobacterium (z.B. B. bifidum) an der Darmflora.
Bspw. durch selektives Verändern der menschlichen Darmflora wird erfindungsgemäß die Hochregulierung einer CAR-T- oder einer anderen ACT-Behandlung bereitgestellt (z.B. wobei die veränderte Mikrobiota Treg-Zellen beim Patienten herunterreguliert, an den die CAR-T oder ACT verabreicht wurde und/oder TH1- und/oder TH17-Zellen bei dem Patienten hochreguliert, wobei die Zellen z.B. vom CAR-T- oder ACT-Transplantat umfasst sind). Das Herunterregulieren von Treg-Zellen kann die Suppression von T-Effektoren und/oder T-Helfern beim Patienten reduzieren, wodurch die Zytotoxizität der CAR-T oder ACT oder eine andere wünschenswerte Aktivität gegen Krebs oder sonstige krankheitsvermittelnde Zellen verstärkt wird. Die Hochregulierung von TH1- und/oder TH17-Zellen kann die T-Effektor-Aktivität erhöhen, wodurch die Zytotoxizität der CAR-T oder ACT oder eine andere wünschenswerte Aktivität gen Krebs oder sonstige krankheitsvermittelnde Zellen verstärkt wird.
In einem weiteren Beispiel kann die selektive Veränderung der menschlichen Darmflora als Schalter verwendet werden, um eine CAR-T- oder eine andere ACT-Behandlung abzudämpfen (z.B. wobei die veränderte Mikrobiota Treg-Zellen beim Patienten hochreguliert, an den die CAR-T oder ACT verabreicht wurde und/oder TH1- und/oder TH17-Zellen bei dem Patienten herunterreguliert, wobei die Zellen z.B. vom CAR-T- oder ACT-Transplantat umfasst sind). Die Hochregulierung von Treg-Zellen kann die Suppression von T-Effektoren und/oder T-Helfern beim Patienten erhöhen, wodurch die Fähigkeit der CAR-T oder ACT zur Förderung der Zytokinfreisetzung oder eine andere unerwünschte Aktivität reduziert wird. Die Herunterregulierung von TH1- und/oder TH17-Zellen kann die T-Effektor-Aktivität reduzieren, wodurch die Fähigkeit der CAR-T oder ACT zur Förderung der Zytokinfreisetzung oder eine andere unerwünschte Aktivität reduziert wird. Dies kann nützlich sein, um das Risiko von CRS beim Patienten zu begrenzen. Eine anschließende weitere Modifikation der Darmflora des Patienten mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann durchgeführt werden, um die CAR-T- oder ACT-Behandlung hochzuregulieren, wenn gewünscht wird, dies noch einmal zu benutzen, um auf die Krankheit bzw. den Zustand einzuwirken (z.B. eine Krebserkrankung, z.B. eine hämatologische Krebserkrankung). In diesem Fall können die CAR-T- oder ACT-Populationen von T-Gedächtniszellen aus der früheren Behandlung beim Patienten vorhanden sein, und die Hochregulierung unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Mikrobiotaveränderung kann die T-Gedächtniszellen hochregulieren, sodass sie sich in Effektor- und/oder Helferzellen differenzieren, um auf die Krankheit bzw. den Zustand einzuwirken. In einem Beispiel umfasst die erfindungsgemäße Zelltherapie also Verabreichen einer Immunzellpopulation, umfassend Immungedächtniszellen (z.B. T-Gedächtniszellen wie z.B. TCM und/oder TSCM), und/oder die verabreichte Population umfasst Zellen, die im Anschluss an die anfängliche Mikrobiotaveränderung diese Gedächtniszellen hervorbringen.
Während ein Aspekt der Erfindung einen Nutzen zur Modulation einer zellbasierten Therapie bei einem Patienten erkennt, erkennt ein weiterer Aspekt einen Nutzen zur Modulation (d.h. Behandeln oder Verhüten) zellvermittelter Krankheiten und Zustände bei Patienten, wie z.B. Autoimmun- und Entzündungskrankheiten und -zustände, die z.B. durch T-Zellen oder sonstige Immunzellen des Patienten vermittelt werden. Unter einem weiteren Aspekt erkennt die Erfindung einen Nutzen als Mittel zum Modulieren (z.B. Verstärken) einer anderen Therapie einer Krankheit oder eines Zustandes, z.B. zur Verstärkung oder Bewirkung einer Therapie mit einem Antikörper oder antiviralen Arzneimittel, um die Krankheit bzw. den Zustand zu behandeln oder verhüten. Das Arzneimittel kann z.B. ein Immun-Checkpoint-Antagonist oder -Agonist sein (z.B. zur Behandlung oder Verhütung einer Krebserkrankung wie z.B. Melanom oder NSCLC). Unter „Bewirken einer Therapie“ ist zu verstehen, dass der Patient auf das Arzneimittel nicht oder ungenügend Anspricht und die erfindungsgemäße Mikrobiotaveränderung (z.B. unter Verwendung einer erfindungsgemäßen selektiven geführten Nucleasezielung auf eine bakterielle oder archaeale Art) bewirkt ein Ansprechen (oder verbessertes Ansprechen) des Patienten auf das Arzneimittel. Das erfindungsgemäße Verfahren reguliert z.B. TH17-Zellen bei einem Patienten hoch, der unter einer HIV-Infektion leidet. Unter einem Aspekt wird hierdurch eine antiretrovirale Therapie oder HIV-Impfstofftherapie des Patienten verstärkt. Die TH17-Zellen können endogene Zellen des Patienten oder Zellen, die durch eine ACT des Patienten bereitgestellt wurden, sein. In einem weiteren Beispiel reguliert das erfindungsgemäße Verfahren TH17-Zellen bei einem Patienten hoch, der unter einer Krebserkrankung leidet (z.B. Melanom oder Lungenkrebs, wie z.B. NSCLC). Unter einem Aspekt wird hierdurch eine Immun-Checkpoint-Antagonismus- oder -Agonismustherapie des Patienten verstärkt. Die TH17-Zellen können endogene Zellen des Patienten oder Zellen, die durch eine ACT des Patienten bereitgestellt wurden, sein. Bei der Therapie handelt es sich z.B. um eine Antikörpertherapie unter Verwendung eines Antikörpers, der aus der nachfolgenden Gruppe gewählt ist: Ipilimumab (oder YERVOY™), Tremelimumab, Nivolumab (oder OPDIVO™), Pembrolizumab (oder KEYTRUDA™), Pidilizumab, BMS-936559, Durvalumab und Atezolizumab.
Die Erfindung betrifft geführte Nucleasesysteme (z.B. gentechnisch erzeugte CRISPR/Cas-Systeme, TALENs, Meganucleasen und Zinkfingerproteinssteme), Arrays (z.B. CRISPR-Arrays), cRNAs, gRNAs und Vektoren (z.B. Phage, das Bestandteile eines o.g. Systems umfasst) zur Verwendung bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Zielen auf die ersten Zellen oder zum Hervorufen der Dysbiose durch Hemmen des Wachstums einer bakteriellen oder archaealen Zellpopulation oder Ändern des relativen Anteils mindestens einer Teilgesamtheit an einer Mikrobiota einer Pflanze, Hefe, Umwelt, eines Bodens, eines Menschen oder eines Tiers, z.B. um den Anteil von Bacteroidetes (z.B. Bacteroides), Firmicutes und/oder grampositiven oder -negativen Bakterien an der Darmflora eines Menschen zu ändern. Zur Erfindung gehört z.B. Modifizieren (z.B. Schneiden und/oder Mutieren) mindestens einer genomischen oder episomalen Zielnukleotidsequenz einer bakteriellen Wirtszelle, z.B. einer Bacteroidetes- oder Firmicutes-Zelle oder einer archaealen Zelle des Wirts. In einem Beispiel sind die ersten Bakterien pathogene Darmbakterien.
Es hat eine Reihe von Studien gegeben, die aufzeigen, dass die jeweiligen Spiegel der beiden wichtisten Darmphylen, Bacteroidetes und Firmicutes, sowohl bei Menschen als auch bei keimfreien Mäusen mit Adipositas in Verbindung stehen. Die Autoren der Studien schließen daraus, dass der Kohlehydratstoffwechsel der wichtigste Faktor sei. Sie stellen fest, dass die Mikrobiota adipöser Individuen stärker angereichert sind mit Bakterien des Phylums Firmicutes und weniger mit Bacteroidetes, und sie vermuten, dass diese bakterielle Mischung aus einer bestimmten Diät effizienter Energie extrahieren können als die Mikrobiota schlanker Individuen (bei denen die Anteile umgekehrt sind). In einigen Studien stellten sie fest, dass die relative Häufigkeit von Bacteroidetes mit der Abnahme des Körpergewichts adipöser Individuen zunimmt, und ferner, dass, wenn die Mikrobiota adipöser Mäuse an keimfreie Mäuse übertragen werden, diese Mäuse mehr an Fett zunehmen als eine Kontrollgruppe, die Mikrobiota aus schlanken Mäusen erhielt. Siehe z.B. Turnbaugh, P. J., R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon. 2006, „An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest", Nature 444:1027-1131. Unter einem weiteren Aspekt erkennt die Erfindung einen Nutzen als Mittel zur Verstärkung einer Adipositas-Therapie eines Patienten, z.B. durch Erhöhen des Verhältnisses von Bacteroidetes zu Firmicutes in der Mikrobiota.
Wahlweise befinden sich die ersten Zellen in Gegenwart von Zellen eines anderen Stammes oder einer anderen Art, wobei die anderen Zellen Enterobacteriaceae oder Bakterien sind, die probiotisch, kommensal oder symbiotisch mit Menschen sind (z.B. im menschlichen Darm). In einem Beispiel ist jede erste Zelle eine Firmicutes-Zelle, z.B. Streptococcus.
In einem Beispiel kann die Erfindung die Zielmikroben in der Mikrobiota selektiv töten oder herunterregulieren, ohne dabei auf einen zweiten verwandten Stamm derselben Art oder einer anderen Art, die dennoch phylogenetisch verwandt ist (wie es an der 16s rDNA erkennbar ist), zu zielen. Die Mikrobiota umfasst z.B. Zellen einer zweiten bakteriellen Art bzw. eines zweiten bakteriellen Stammes oder einer zweiten archealen Art oder eines zweiten archealen Stammes umfasst, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine 16s ribosomale RNA codierende DNA-Sequenz aufweist, die mindestens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99% Identität mit einer 16s ribosomalen RNA codierenden DNA-Sequenz der ersten Zellenart bzw. des ersten Zellstammes aufweist, wobei das Wachstum der zweiten Zellen in der Mikrobiota durch das HM-System nicht gehemmt wird. Gemäß einer Ausführungsform wird das Wachstum des zweiten Stammes bzw. der zweiten Art nicht gehemmt; oder aber das Wachstum der ersten Zellen wird um mindestens ein 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 50-, 100- oder 1000-faches der Wachstumshemmung der zweiten Zellen gehemmt.
Unter einem Aspekt des Verfahrens umfasst das Hervorrufen der Dysbiose bzw. der Schritt (b) Ändern des Anteils einer Teilgesamtheit von ersten Zellen (Wirtszellen) an der Mikrobiota, z.B. Darmflora, des patienten, wodurch eine veränderte Darmflora erzeugt wird, die die Immunzelltherapie beim Patienten moduliert, wobei die Teilgesamtheit Wirtszellen der ersten Art bzw. des ersten Stammes umfasst, wobei das Verfahren umfasst: geführtes Nuclease-Zuschneiden (z.B. RNA-geführte Nuclease) einer jeweiligen Zielsequenz in Wirtszellen, um die Zielsequenzen zu modifizieren, wobei die Wirtszellen getötet oder das Wachstum der Wirtszellpopulation reduziert werden, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Mikrobiota reduziert wird. Geeignete Systeme zur Ausführung eines geführten Nuclease-Zuschnitts sind z.B. gentechnisch erzeugte CRISPR/Cas-Systeme, TALENs, Meganucleasen und Zinkfingerproteinsysteme. Das CRPSR-/Cas-vermittelte geführte Zuschneiden einer ausgewählten Bakterienart der menschlichen Darmflora in einem Konsortium wird z.B. in den vorliegenden Beispielen aufgezeigt.
In einem Beispiel wird die Modifikation der Zielsequenz durchgeführt durch:

a. Kombinieren der Mikrobiota mit mehreren Kopien gentechnisch erzeugter Nukleinsäuresequenzen, die wirtmodifizierende (HM) crRNAs codieren, und
b. Exprimieren von HM-crRNAs bei Wirtszellen,

(i) Spacer- und Repeat-Sequenzen, die eine HM-crRNA codieren;
(ii) wobei die HM-crRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Zielsequenz einer Wirtszelle hybridisieren kann, um die Cas-Nuclease zur Zielsequenz in der Wirtszelle zu führen; und

In einer Alternative sindHM-crRNA und tracrRNA in einer einzelnen gRNA umfasst. In einem Beispiel ist jede gentechnisch erzeugte Nukleinsäuresequenz von einem jeweiligen Vektor umfasst, wobei jeder Vektor wahlweise ein Plasmid (z.B. konjugatives Plasmid, das in eine Wirtszelle übertragbar ist), Phage, Phagemid oder Prophage ist. Der Phage ist in der Lage, eine o.g. Wirtszelle zu infizieren.
In einem Beispiel wird zur Modifikation von Zielnukleotidsequenzen die endogene Cas-Nuclease der Wirtszellen verwendet. Gemäß einer Ausführungsform fehlt also jedem Vektor eine Sequenz, die Cas (z.B. Cas9)-Nuclease codiert. Durch die Ausnutzung der endogenen Cas-Nuclease verwenden Ausführungsformen der Erfindung die Aktivität der endogenen Cas-Nuclease (z.B. ohne, dass vorher eine genetische Modifikation der Wirtszelle erforderlich ist, um die Aktivität der Nuklease zu aktivieren oder verstärken). In einem Beispiel wird also die Cas-Nuclease durch ein wildes Gen der Wirtszelle codiert. In einem Beispiel ist die Nuclease aktiv zur Erreichung der Zelltötung oder Wachstumsreduzierung, ohne dass ein endogener Cas-Nuclease (oder Cas-Nuclease-Gen)-Repressor in der Wirtszelle gehemmt wird. Die Erfindung kann also auf wilde Bakterienpopulationen einwirken, ohne dass vorher eine Manipulation erfolgen muss, um eine wirksame Cas-vermittelte Zelltötung oder Wachstumsreduzierung herbeizuführen. Die Population kann also der cRNA ausgesetzt werden, wenn sich die Population in ihrer wilden Umgebung (bestehend z.B. aus dem Mikrobiom einer Pflanze, Hefe, Umwelt, eines Bodens, eines Menschen oder eines Tiers) befindet.
In einem Beispiel ist die cRNA bzw. gRNA für die Verabreichung an einen menschlichen Patienten oder ein nicht menschliches Tier durch mukosale, intestinale, orale, intranasale, intrarektale oder bukkale Verabreichung bestimmt (oder wird an diese verabreicht).
Wahlweise wird die Cas-Nuclease durch ein endogens Typ II-CRISPR/Cas-System jeder ersten Zelle bereitgestellt. Wahlweise ist die tracrRNA-Sequenz oder die DNA-Sequenz, die eine tracrRNA-Sequenz exprimiert, jeder Wirtszelle endogen. Wahlweise ist jede Zielsequenz von einem Antibiotikaresistenzgen, Virulenzgen oder einem essentiellen Gen der jeweiligen Wirtszelle umfasst; z.B. sind die Zielsequenzen zwischen den Wirtszellen identisch. Wahlweise sind die gentechnisch erzeugten Nukleinsäuresequenzen umfasst von einer Antibiotikazusammensetzung, wobei die Sequenzen mit einem Antibiotikum (erstem Antibiotikum) kombiniert werden, und in einem Beispiel sind die Zielsequenzen von einem Antibiotikaresistenzgen umfasst, wobei es sich beim Antibiotikum um das erste Antibiotikum handelt. Die Antibiotikazusammensetzung wird an den Patienten bzw. Probanden verabreicht, um die Dysbiose zu bewirken bzw. den Schritt (b) auszuführen.
Wahlweise umfasst jede Wirtszelle einen Desoxyribonukleinsäurestrang mit einem freien Ende (HM-DNA), der eine interessierende HM-Sequenz codiert und/oder wobei das Verfahren Einführen einer deratigen Sequenz, die die HM-DNA codiert, in die Wirtszellen umfasst, wobei die HM-DNA mindestens eine Sequenz umfasst, die jeweils mindestens einer Sequenz in der Zielsequenz oder einer die Zielsequenz flankierenden Sequenz homolog ist, um die HM-DNA in das Genom des Wirts (z.B. in eine chromosomale oder episomale Stelle) einzufügen.
Erfindungsgemäß werden auch Vektoren zur Einführung in erste Zellen (Wirtszellen) bereitgestellt, um das erfindungsgemäße Behandlungs- oder Verhütungsverfahren auszuführen, wobei jeder Vektor ist:

ein gentechnisch erzeugter Nukleinsäurevektor zur Modifizierung einer bakteriellen oder archaealen Wirtszelle, die ein endogenes CRISPR/Cas-System umfasst, wobei der Vektor Nukleinsäuresequenzen zur Expression einer Mehrzahl unterschiedlicher crRNAs (z.B. gRNAs) zur Verwendung beim Hervorrufen der Dysbiose bzw. zur Verwendung beim Schritt (b) des Verfahrens umfasst, und wobei ihm wahlweise eine Nukleinsäuresequenz fehlt, die eine Cas-Nuclease codiert;
wobei eine erste der crRNAs sich mit einer ersten Nukleinsäuresequenz in der Wirtszelle hybridisieren kann und eine zweite der crRNAs sich mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz in der Wirtszelle hybridisieren kann, wobei die zweite Sequenz eine andere ist als die erste Sequenz und
1. a. die erste Sequenz von einem Antibiotikaresistenzgen (oder RNA davon) umfasst ist und die zweite Sequenz von einem Antibiotikaresistenzgen (oder RNA davon) umfasst ist; wahlweise wobei die Gene unterschiedlich sind;
2. b. die erste Sequenz von einem Antibiotikaresistenzgen (oder RNA davon) umfasst ist und die zweite Sequenz von einem essentiellen oder Virulenzgen (oder RNA davon) umfasst ist;
3. c. die erste Sequenz von einem essentiellen Gen (oder RNA davon) umfasst ist und die zweite Sequenz von einem essentiellen oder Virulenzgen (oder RNA davon) umfasst ist; oder
4. d. die erste Sequenz von einem Virulenzgen (oder RNA davon) umfasst ist und die zweite Sequenz von einem essentiellen oder Virulenzgen (oder RNA davon) umfasst ist.

Jeder Vektor kann der obigen Beschreibung entsprechen, z.B. ein Phage, der eine Wirtszelle infizieren kann, oder ein konjugatives Plasmid, das in eine Wirtszelle eingeführt werden kann. In einem Beispiel werden die Vektoren mit einem Antibiotikum (z.B. einem Beta-Laktam-Antibiotikum) kombiniert.
Jede erste Zelle (Wirtszelle) kann eine Staphylococcus-, Streptococcus-, Pseudomonas-, Salmonella-, Listeria-, E. coli-, Desulfovibrio- oder Clostridium-Wirtszelle sein. In einem Beispiel ist jede erste Zelle (Wirtszelle) eine Firmicutes-Zelle, z.B. eine Staphylococcus-, Streptococcus-, Listeria- oder Clostridium-Zelle.
In einem Beispiel umfasst jede gentechnisch erzeugte Nukleinsäuresequenz eine Sequenz R1-S1-R1' zur Expression und Erzeugung der jeweiligen crRNA (z.B. umfasst von einer einzelnen gRNA) in der Wirtszelle, (i) wobei R1 ein erstes CRISPR-Repeat ist, R1' ein zweites CRISPR-Repeat ist und R1 oder R1' optional ist; und (ii) S1 ein erster CRISPR-Spacer ist, der eine Nukleotidsequenz, die mindestens zu 95 % identisch ist mit der Zielsequenz, umfasst oder aus dieser besteht.
In einem Beispiel weisen R1 und R1' mindestens 95 % Identität mit den ersten bzw. zweiten Repeat-Sequenzen eines CRISPR-Arrays der Wirtszellarten auf. In einem Beispiel weisen R1 und R1' mindestens 95% (z.B. 96, 97, 98, 99 oder 100%) Identität mit den ersten (5' am nächsten) und zweiten (das Repeat, das unmittelbar 3' zum ersten Repeat angeordnet ist) Repeat-Sequenzen eines CRISPR-Arrays der Art auf, z.B. einer Wirtszelle der Art. In einem Beispiel sind R1 und R1' funktionell mit einer Typ II-Cas9-Nuclease (z.B. eine Cas9 von S. thermophilus, S. pyogenes oder S. aureus) oder einer Typ I-Cas3, um das Ziel in einer Wirtszelle zu modifizieren.
Unter einem Aspekt umfasst das Verfahren folgende Verwendung, wie vom ausgeführten Versuchsbeispiel gezeigt:
Die Verwendung der wilden endogenen Cas-Nucleaseaktivität der ersten Zellpopulation (Wirtszelle), um das Wachstum der Population zu hemmen, wobei jede Wirtszelle ein endogenes CRISPR/Cas-System mit wilder Cas-Nucleaseaktivität umfasst, wobei die Verwendung Umwandeln von Wirtszellen der Population umfasst, wobei jede umgewandelte Wirtszelle mit einer gentechnisch erzeugten Nukleotidsequenz umgewandelt wird, um eine HM-cRNA oder gRNA in der Wirtszelle bereitzustellen, wobei die HM-cRNA oder gRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Ziel-Protospacer-Sequenz einer Wirtszelle hybridisieren kann, um eine endogene Cas zum Ziel zu führen, wobei die cRNA oder gRNA mit einer endogenen Cas-Nuclease der Wirtszelle verwandt ist, die diese wilde Nucleaseaktivität aufweist und das Wachstum der Population nach der Umwandlung der Wirtszellen gehemmt wird.
Unter „verwandt“ ist zu verstehen, dass die endogene Cas mit einer crRNA- oder gRNA-Sequenz zusammenwirken kann, um sich zum Ziel in der Wirtszelle führen zu lassen. Der Fachmann versteht dabei, dass diese Cas-Führung generell ein Merkmal der CRISPR/Cas-Aktivität bei bakteriellen und archaealen Zellen ist, z.B. wilde CRISPR/Cas-Aktivität bei bakteriellen oder archaealen Zellen mit endogenen aktiven wilden CRISPR/Cas-Systemen.
Unter einer „wilden“ Cas-Aktivität ist zu verstehen, dass die endogene Cas keine gentechnisch erzeugte Cas ist oder dass die Zelle nicht derart gentechnisch erzeugt worden ist, dass sie die Repression der endogenen Cas-Aktivität rückgängig macht, was dem Fachmann klar ist. Dies im Gegensatz zu bestimmten Bakterien, bei denen die Cas-Nucleaseaktivität natürlich reprimiert wird (d.h. es gibt keine wilde Cas-Nucleaseaktivität oder keine, die für die vorliegende Erfindung nützlich ist, was im Gegenteil anwendbar ist, um auf wilde Wirtszellen in situ einzuwirken, wenn z.B. die endogene Cas-Aktivität ausgenutzt werden kann, um eine Hemmung des Wachstums der Zellpopulation zu bewirken).
In den nachfolgenden ausgeführten Beispielen wurde bei einer bakteriellen Population (einer grampositiven Firmicutes) auf einer festen Oberfläche auf die Hemmung eingewirkt. Dabei wurde eine >10-fache Hemmung des Wachstums der Wirtszellpopulation erreicht. Dabei wurde auf ein Antibiotikaresistenzgen und ein essentielles Gen gezielt. Der Nachweis der Fähigkeit der Erfindung, das Wachstum der Wirtszellen auf einer Oberfläche zu hemmen, ist wichtig und wünschenswert bei Ausführungsformen, bei denen die Erfindung zu Behandlung oder Verhütung von Krankheiten bzw. Zuständen bestimmt ist, die von Mikrobiota bei einem menschlichen oder tierischen Probanden vermittelt oder hervorgerufen werden, wie vorliegend beschrieben. Diese Mikrobiota befinden sich typischerweise im Kontakt mit einem Gewebe des Probanden (z.B. Bauch, Gewebe), und deshalb vermuten wir, dass der Nachweis der Fähigkeit, das Wachstum einer Bakterienart einer Mikrobiota auf einer Oberfläche (am Beispiel von Streptococcus) für diesen Nutzen spricht. Das Zielen auf Mikrobiota auf Pflanzenoberflächen ist ebenfalls eine wünschenswerte Anwendungsmöglichkeit.
In einem Beispiel wird das Wachstum der ersten Zellpopulation (Wirtszellen) um mindestens ein 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- oder 10-faches mehr gehemmt als das Wachstum von Zellen derselben Art bzw. desselben Stammes, die der gentechnisch erzeugten Nukleotidsequenz nicht ausgesetzt wurden. Angedeutet wird die Wachstumshemmung z.B. durch eine niedrigere bakterielle Koloniezahl einer ersten Wirtszellprobe (allein oder in einer gemischten Bakterienpopulation, z.B. eine Mikrobiota- oder Stuhlprobe eines Patienten nach der Behandlung) um mindestens ein 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- oder 10-faches mehr als die Koloniezahl einer zweiten Probe der Wirtszellen (allein oder in einer gemischten Bakterienpopulation, z.B. eine Mikrobiota- oder Stuhlprobe eines Patienten vor der Behandlung), wobei die ersten Zellen von der gentechnisch erzeugten Nukleotidsequenz umgewandelt worden sind, aber die zweite Probe ist der gentechnisch erzeugten Nukleotidsequenz nicht ausgesetzt worden. Gemäß einer Ausführungsform wird die Koloniezahl 12, 24, 36 oder 48 h vor der Aussetzung der ersten probe an die gentechnisch erzeugte Sequenz ermittelt. Gemäß einer Ausführungsform werden die Kolonien auf festem Agar in vitro gezüchtet (z.B. in einer Petrischale). Es versteht sich also, dass die Wachstumshemmung von einer Reduzierung (<100 % Wachstum gegenüber keiner Behandlung, d.h. Wachstum der Kontrollprobe) beim Wachstum der ersten Zellen (Wirtszellen) oder Populationen angedeutet wird, oder es kann sich dabei um eine vollständige Eliminierung des Wachstums handeln. In einem Beispiel wird das Wachstum der Wirtszellpopulation um mindestens 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 95 % reduziert, d.h. über einen vorgegebenen Zeitraum (z.B. 24 oder 48 h nach der Kombination mit der cRNA oder gRNA, TALEN, Meganuclease, Zinkfingerprotein usw. in den Wirtszellen), d.h. das Wachstum der Wirtszellpopulation ist um mindestens diesen Prozentanteil geringer als das Wachstum einer Kontrollpopulation von Wirtszellen, die der cRNA oder gRNA usw. nicht ausgesetzt wurde, aber ansonsten über den vorgegebenen Zeitraum unter denselben Bedingungen gehalten worden ist. In einem Beispiel wird die prozentuale Reduzierung des Wachstums durch einen Vergleich der Koloniezahl bei einer Probe aus jeder Population am Ende des Zeitraums bestimmt (z.B. zu einem Zeitpunkt einer mittelexponentiellen Wachstumsphase der Kontrollprobe). Nachdem z.B. die Prüfpopulation zum Nullzeitpunkt der crRNA oder gRNA usw. Ausgesetzt wird, wird eine Probe der Prüf- und Kontrollpopulationen entnommen und jede Probe wird auf eine Agarplatte gelegt und über den vorgegebenen Zeitraum unter identischen Bedingungen inkubiert. Zum Abschluss des Zeitraums wird die Koloniezahl jeder Probe gezählt und der prozentuale Unterschied (sic) (d.h. Prüfkoloniezahl, geteilt durch Kontrollkoloniezahl, mal 100, und dann wird das Ergebnis von 100 abgezogen, um die prozentuale Wachstumsreduzierung zu ergeben). Der -fache Unterschied wird berechnet durch Teilen der Kontrollkoloniezahl durch die Prüfkoloniezahl.
Die Hemmung des Populationswachstums kann also von einer Reduzierung der Proliferation der ersten Zellzahl (Wirtszellen) der Bevölkerung angedeutet werden. Dies kann auf Zelltötung durch die Nuclease und/oder durch Herunterregulierung der Proliferation der Wirtszellen (Teilung und/oder Zellwachstum) durch die Einwirkung der Nuclease auf die Ziel-Protospacer-Sequenz zurückzuführen sein. Gemäß einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Behandlung bzw. Verhütung wird die Wirtszelllast des menschlichen oder tierischen Probanden reduziert, wobei die Krankheit bzw. der Zustand behandelt wird (z.B. reduziert oder behoben) oder verhütet wird (d.h. das Risiko der Entwicklung der Krankheit bzw. des Zustandes beim Probanden wird reduziert oder ausgeschlossen).
In einem Beispiel wird die wilde endogene Cas9- oder cfp1-Aktivität der Wirtszelle verwendet. In einem Beispiel wird die wilde endogene Cas3- oder CASCADE-Aktivität der Wirtszelle verwendet. Es ist möglich, dass die gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz mit einer exogenen Sequenz, die Cas-Nuclease codiert, nicht kombiniert ist. Wahlweise ist die Cas-Nuclease eine Nickase.
In einem Beispiel wird die Bildung von Bakterienkolonien der Wirtszellen nach der Dysbiose bzw. dem Schritt (b) gehemmt. In einem Beispiel wird die Proliferation der Wirtszellen nach der Dysbiose bzw. dem Schritt (b) gehemmt. In einem Beispiel werden die Wirtszellen nach der Dysbiose bzw. dem Schritt (b) getötet.
Unter einem Aspekt umfasst das Verfahren Erzeugen eines Arzneimittels ex vivo zur Verabreichung an den Patienten zur Hervorrufung der Dysbiose bzw. zur Ausführung des Schritts (b), um die Krankheit bzw. den Zustand zu behandeln oder verhüten, wobei das Arzneimittel eine modifizierte gemischte Bakterienpopulation (z.B. entnommen aus Fäkalien oder Darmflora mindestens eines menschlichen Spenders bzw. des Patienten), wobei die modifizierte Population an den Patienten verabreicht wird, um die Dysbiose hervorzurufen bzw. den Schritt (b) auszuführen, um das Arten- oder Stämmegleichgewicht in der Darmflora des Patienten zu ändern, wodurch der Anteil der ersten Zellen in der Darmflora geändert wird. Die modifizierte gemischte Population kann ex vivo unter Verwendung erfindungsgemäßer geführter Nuclease-Modifikationstechniken erzeugt werden. So kann das Verfahren z.B. zur Reduzierung des Anteils einer bestimmten Firmicutes-Teilgesamtheit unter Schonung von Bacteroidetes in der gemischten Population verwendet werden, z.B. um ein Arzneimittel zur Behandlung oder Verhütung eines vorliegend offenbarten Stoffwechsel- oder Magen-Darm-Zustandes bzw. - Krankheit zu erzeugen. Auf diese Weise kann die Erfindung hierzu ein modifiziertes bakterielles Transplantat-Arzneimittel (z.B. ein modifiziertes Fäkaltransplantat) oder zur Behandlung bzw. Verhütung bei einem Menschen oder Tier verwenden. So z.B. kann das Verfahren zur Modifizierung mindestens einer Mikrobiota in vitro verwendet werden, um eine modifizierte Bakteriensammlung zur Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier zum medizinischen Gebrauch zu erzeugen (z.B. Behandlung oder Verhütung eines Stoffwechselzustandes (z.B. Adipositas oder Diabetes) oder eines Zustandes des Magen-Darm-Traktes (z.B. eines beliebigen vorliegend aufgeführten Zustandes) oder einer Krebserkrankung (z.B. einer Krebserkrankung des Magen-Darm-Traktes)). In einem Beispiel erfolgt die Umwandlung bakterieller Zellen mit Phagen- oder Plasmidvektoren, die erfindungsgemäße gentechnisch erzeugte Nukleinsäuresequenzen umfassen, in vitro, oder die gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz ist von einer Nukleinsäure umfasst, die in die Wirtszellen elektroporiert wird. In einem Beispiel handelt es sich bei der Nukleinsäure um RNA (z.B. Kopien der gRNA). In einem weiteren Beispiel handelt es sich bei der Nukleinsäure um DNA, die die crRNA oder gRNA zu deren Expression bei Wirtszellen codiert.
In einem Beispiel wird erfindungsgemäß also eine gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz zur Bereitstellung einer HM-cRNA oder gRNA (guide RNA) bei einer Population von wilden bakteriellen Wirtszellen, die von einer Mikrobiota einer Pflanze, Hefe, Umwelt, eines Bodens, eines menschlichen oder tierischen Probanden zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt, wobei die cRNA oder gRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Ziel-Protospacer-Sequenz einer Wirtszelle hybridisieren kann, um Cas zum Ziel zu führen, wobei die cRNA oder gRNA mit einer endogenen Cas-Nuclease einer Wirtszellen mit wilder Nukleaseaktivität verwandt ist wobei die anschließende Umwandlung des Wachstums der Wirtszellen der Population gehemmt wird und die Krankheit bzw. der Zustand behandelt bzw. verhütet wird oder die Therapie bzw. Behandlung moduliert wird.
In einem Beispiel umfasst die gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz einen HM-CRISPR-Array. In einem Beispiel codiert die gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz eine einzelne gRNA. In einem Beispiel ist die gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz eine gRNA (z.B. eine einzelne gRNA) oder crRNA. In einem Beispiel ist die gentechnisch erzeugte Sequenz von einem Bakteriophagen umfasst, der die Wirtszellen infizieren kann, wobei die Umwandlung die Übertragung der Wirtszellen durch den Bakteriophagen umfasst. Beim Bakteriophagen kann es sich um einen vorliegend beschriebenen Phagen handeln. In einem Beispiel ist die gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz von einem Plasmid (z.B. einem konjugativen Plasmid) umfasst, das Wirtszellen umwandeln kann. Beim Plasmid kann es sich um ein vorliegend beschriebenes Plasmid handeln. In einem Beispiel ist die gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz von einem Transposon umfasst, das zur Übertragung in und/oder zwischen Wirtszellen in der Lage ist. Beim Transposon kann es sich um ein vorliegend beschriebene Transposon handeln.
Ein beliebiges erfindungsgemäßes Verfahren kann das Umwandeln von Wirtszellen mit Nukleinsäurevektoren zur Erzeugung von cRNA oder gRNA in den Zellen umfassen. Die Vektoren bzw. Nukleinsäuren, die die gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz umfassen, werden z.B. oral, intravenös, topisch, okular, intranasal, per inhalationem, rektal oder über einen beliebigen anderen erfindungsgemäßen Darreichungsweg oder einen sonstigen Weg an den Patienten verabreicht, wobei die Verabreichung die ersten Zellen (Wirtszellen) mit den Vektoren bzw. den Nukleinsäuren umwandelt.
In einem Beispiel werden erste Bakterien mit zweiten Bakterien in der Mikrobiota des Patienten bzw. Probanden gemischt. Wahlweise handelt es sich bei der zweiten Bakterienart um E. coli, L. lactis oder S. thermophilus, wie im nachfolgenden ausgeführten Beispiel gezeigt; es handelt sich dabei um Stämme, die in der Darmflora von Menschen und Tieren symbiotisch nebeneinander bestehen. Das Beispiel betrifft auf das Zielen bei einer gemischten grampositiven und -negativen Bakterienpopulation. Außerdem betrifft das Beispiel eine Firmicutes-Population (S. thermophilus) und eine Enterobacteriaceae-Population (E. coli), die beide in der menschlichen Mikrobiota zu finden sind. Als weitere Beispiele von Enterobacteriaceae seien genannt: Salmonella, Yersinia pestis, Klebsiella, Shigella, Proteus, Enterobacter, Serratia und Citrobacter.
In einem Beispiel ist der Zustand bzw. die Krankheit eine Stoffwechsel- oder Magen-Darm-Krankheit oder Zustand, z.B. Adipositas, Reizdarmsyndrom, enzündliche Darmerkrankung, M. Crohn oder Colitis ulcerosa. In einem Beispiel handelt es sich beim Zustand bzw. der Krankheit um eine Krebserkrankung, z.B. einen soliden Tumor oder eine Magen-Darm-Krebserkrankung (z.B. Magenkrebs), Leberkrebs oder Bauchspeicheldrüsenkrebs. In einem Beispiel handelt es sich beim Zustand oder Resistenz gegenüber oder verringertes Ansprechen auf ein Antibiotikum (z.B. ein beliebiges vorliegend beschriebenes Antibiotikum).
In einem Beispiel umfasst jede erste Zelle (Wirtszelle) eine endogene RNase III, die mit der gentechnisch erzeugten Sequenz bei der Erzeugung der HM-cRNA in der Zelle zusammenwirken kann. In einer Alternative umfasst mindestens einer der Vektoren eine Nukleotidsequenz, die eine derartige RNase III zur Expression der RNase III in der Wirtszelle codiert.
In einem Beispiel codiert das essentielle Gen (umfassend das Ziel) eine DNA-Polymerase der Zelle. Ein Beispiel hiervon wird nachfolgend geschildert.
In einem Beispiel umfasst die cRNA bzw. gRNA eine Sequenz, die sich mit einer Ziel-Protospacer-Sequenz einer Wirtszelle hybridisieren kann, die an ein NGG-, NAG-, NGA-, NGC-, NGGNG-, NNGRRT- oder NNAGAAW-PAM angrenzt, z.B. ein AAAGAAA- oder TAAGAAA-PAM (diese Sequenzen werden von 5' nach 3' geschrieben). Gemäß einer Ausführungsform grenzt das PAM unmittelbar an das 3'-Ende der Protospacer-Sequenz an. In einem Beispiel ist die Cas eine Cas von S. aureus, S. thermophilus oder S. pyogenes. In einem Beispiel ist die Cas Cpf1 und/oder das PAM ist TTN oder CTA.
In einem Beispiel umfasst jede gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz bzw. jeder gentechnisch erzeugter Vektor einen o.g. CRISPR-Array oder eine Sequenz, die eine o.g. crRNA oder gRNA codiert, und umfasst ferner ein Antibiotikaresistenzgen (z.B. Kanamycinresistenz), wobei die HM-crRNA oder gRNA auf das Antibiotikaresistenzgen nicht zielt. In einem Beispiel ist die Zielsequenz von einem Antibiotikaresistenzgen der Wirtszelle umfasst, wobei das Antibiotikum ein anderes ist als das erste Antibiotikum (z.B. Kanamycin). Auf diese Weise kann die gentechnisch erzeugte Sequenz bzw. der gentechnisch erzeugte Vektor auf den Wirt zielen, ohne dabei auf sich selber zu zielen. Indem die Wirtszellen dem ersten Antibiotikum ausgesetzt werden (z.B. durch orale oder intravenöse Verabreichung an den Patienten) kann das Einbehalten der gentechnisch erzeugten Sequenz bzw. des gentechnisch erzeugten Vektors darin durch positiven Selektionsdruck fördern, da Zellen, die das erste Antibiotikaresistenzgen enthalten, einen Überlebensvorteil in Gegenwart des ersten Antibiotikums haben werden (wenn Wirtszellen, die von der gentechnisch erzeugten Sequenz oder Vektoren nicht umgewandelt werden, dem ersten Antibiotikum gegenüber nicht resistent sind). In einem Beispiel ist also Folgendes vorgesehen: Das erfindungsgemäße Verfahren, umfassend, Aussetzen der ersten Zellpopulation (Wirtszellen) an das Antibiotikum (z.B. Kanamycin) und die gentechnisch erzeugte Sequenz bzw. den mindestens einen gentechnisch erzeugten Vektor, um die Aufrechterhaltung von Sequenzen, die cRNA oder gRNA codieren, in Wirtszellen; oder die erfindungsgemäße gentechnisch erzeugte Sequenz, Array oder Vektor befindet sich in Kombination mit dem Antibiotikum.
In einem Beispiel unterliegt die Sequenz, die die cRNA oder gRNA codiert, einem konstitutiven Promoter (z.B. einem starken Promoter), der bei der Art der Wirtszellen wirken kann, oder einem induzierbaren Promoter.
In einem Beispiel ist die bzw. jede erste Zelle (Wirtszelle) eine grampositive Zelle. In einem weiteren Beispiel ist die bzw. jede erste Zelle (Wirtszelle) eine grampositive Zelle.
Erfindungsgemäß wird ferner bereitgestellt: Eine gemischte ex vivo-Population von Mikrobiota-Bakterien, die im Verfahren erhältlich ist durch Isolieren einer Darmfloraprobe aus dem Patienten nach dem Ausführen des Verfahrens, oder durch Isolieren einer Stuhlprobe des Patienten nach dem Ausführen des Verfahrens. In einem Beispiel befindet sich die gemischte Population in einem Behältnis zum medizinischen Gebrauch oder zu Ernährungszwecken. Beim Behältnis handelt es sich z.B. um ein sterilisiertes Behältnis, z.B. einen Inhalator, ein intranasales Abgabegerät, oder das Behältnis ist an eine Spritze oder IV-Nadel angeschlossen. In einem Beispiel ist die gemischte Population nützlich zur Verabreichung an einen Menschen ode rein Tier, um ein Mikrobiom davon zu bevölkern, um eine Krankheit bzw. einen Zustand (z.B. eine vorliegend beschriebene Krankheit bzw. einen vorliegend beschriebenen Zustand) zu behandeln.
In einem vorliegenden Beispiel handelt es sich beim Bacteroides um eine Art, die ausgewählt ist aus: Caccae, Capillosus, Cellulosilyticus, Coprocola, Coprophilus, Coprosuis, Distasonis, Dorei, Eggerthii, Faecis, Finegoldii,Fluxus, Fragalis, Intestinalis, Melaninogenicus, Nordii, Oleiciplenus, Oralis, Ovatus, Pectinophilus, Plebeius, Stercoris, Thetaiotaomicron, Uniformis, Vulgatus und Xylanisolvens. Beim Bacteroides handelt es sich z.B. um Thetaiotaomicron. In einem Beispiel umfassen die erste (Wirtszell-) Population oder die zweiten Bakterien eine Mehrzahl unterschiedlicher Bacteroidetes-Arten oder eine Mehrzahl Bacteroides-Arten (z.B. umfassend B. thetaiotaomicron und B. fragalis) oder Bacteroides- und Prevotella-Arten. In einem vorliegenden Beispiel handelt es sich beim Prevotella um eine Art, die ausgewählt ist aus Bergensis, Bivia, Buccae, Buccalis, Copri, Melaninogenica, Oris, Ruminicola, Tannerae, Timonensis und Veroralis. In einer Alternative sind die ersten Zellen (Wirtszellen) oder die zweiten Bakterien Firmicutes-Zellen, die z.B. mindestens eine Firmicutes-Art umfassen oder aus mindestens einer Firmicutes-Art bestehen, die gewählt ist aus: Anaerotruncus, Acetanaerobacterium, Acetitomaculum, Acetivibrio, Anaerococcus, Anaerofilum, Anaerosinus, Anaerostipes, Anaerovorax, Butyrivibrio, Clostridium, Capracoccus, Dehalobacter, Dialister, Dorea, Enterococcus, Ethanoligenens, Faecalibacterium, Fusobacterium, Gracilibacter, Guggenheimella, Hespellia, Lachnobacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Leuconostoc, Megamonas, Moryella, Mitsuokella, Oribacterium, Oxobacter, Papillibacter, Proprionispira,Pseudobutyrivibrio, Pseudoramibacter, Roseburia, Ruminococcus, Sarcina, Seinonella, Shuttleworthia, Sporobacter, Sporobacterium, Streptococcus, Subdoligranulum, Syntrophococcus, Thermobacillus, Turibacter und Weisella. In einem Beispiel umfassen die ersten Zellen (Wirtszellen) oder die zweiten Bakterien Clostridium-Zellen (z.B. dificile) oder bestehen daraus (und wahlweise besteht die andere Teilgesamtheit aus Bacteroides-Zellen (z.B. thetaiotaomicron). In einem Beispiel umfassen die ersten Zellen (Wirtszellen) oder die zweiten Bakterien Enterococcus-Zellen oder bestehen daraus (und wahlweise bestehen die anderen Zellen aus Bacteroides-Zellen (z.B. thetaiotaomicron). In einem Beispiel umfassen die ersten Zellen (Wirtszellen) oder die zweiten Bakterien Ruminococcus-Zellen oder bestehen daraus (und wahlweise bestehen die anderen Zellen aus Bacteroides-Zellen (z.B. thetaiotaomicron). In einem Beispiel umfassen die ersten Zellen (Wirtszellen) oder die zweiten Bakterien Streptococcus-Zellen oder bestehen daraus (und wahlweise bestehen die anderen Zellen aus Bacteroides-Zellen (z.B. thetaiotaomicron). In einem Beispiel umfassen die ersten Zellen (Wirtszellen) oder die zweiten Bakterien Faecalibacterium-Zellen oder bestehen daraus (und wahlweise bestehen die anderen Zellen aus Bacteroides-Zellen (z.B. thetaiotaomicron). Beim Faecalibacterium handelt es sich z.B. um Faecalibacterium prausnitzii (z.B. A2-165, L2-6, M21/2 oder SL3/3).
In einem Beispiel bestehen die ersten Zellen (Wirtszellen) oder die zweiten Bakterien aus Streptococcus-Zellen (wahlweise S. thermophilus- und/oder pyogenes-Zellen) und die zweiten Bakterien bestehen aus Bacteroides- (z.B. thetaiotaomicron) und/oder Enterobacteriaceae-Zellen (z.B. E. coli).
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Infektionskrankheitserreger beim Menschen, einem Tier (z.B. einem nicht menschlichen Tier) oder einer Pflanze.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) gewählt aus einer Art von: Escherichia (z.B. E.coli O157:H7 oder O104: H4), Shigella (z.B. dysenteriae), Salmonella (z.B. typhi oder enterica, z.B. Serotyp typhimurium, z.B. DT 104), Erwinia, Yersinia (z.B. pestis), Bacillus, Vibrio, Legionella (z.B. pneumophilia), Pseudomonas (z.B. aeruginosa), Neisseria (z.B. gonnorrhoea oder meningitidis), Bordetella (z.B. pertussus), Helicobacter (z.B. pylori), Listeria (z.B. monocytogenes), Agrobacterium, Staphylococcus (z.B. aureus, z.B. MRSA), Streptococcus (z.B. pyogenes oder thermophilus), Enterococcus, Clostridium (z.B. dificile oder botulinum), Corynebacterium (z.B. amycolatum), Mycobacterium (z.B. tuberculosis), Treponema, Borrelia (z.B. burgdorferi), Francisella, Brucella, Campylobacter (z.B. jejuni), Klebsiella (z.B. pneumoniae), Frankia, Bartonella, Rickettsia, Shewanella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Providencia, Brochothrix, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Vibrio (z.B. cholera, z.B. O139, oder vulnificus), Haemophilus (z.B. influenzae), Brucella (z.B. abortus), Franciscella, Xanthomonas, Erlichia (z.B. chaffeensis), Chlamydia (z.B. pneumoniae), Parachlamydia, Enterococcus (z.B. faecalis oder faceim, z.B. linezolidresistent), Oenococcus und Acinetoebacter (z.B. baumannii, z.B. multiresistent).
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Staphylococcus aureus-Zellen, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Methicillin, vancomycinresistent und Teicoplanin gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Pseudomonas aeuroginosa-Zellen, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Cephalosporinen (z.B. Ceftazidim), Carbapenemen (z.B. Imipenem oder Meropenem), Fluorchinolonen, Aminoglycosiden (z.B. Gentamicin oder Tobramycin) und Colistin gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Klebsiella-Zellen (z.B. pneumoniae), z.B. resistent gegenüber Carbapenem.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Streptoccocus-Zellen (z.B. pneumoniae oder pyogenes), z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Erythromycin, Clindamycin, Beta-laktam, Makrolid, Amoxicillin, Azithromycin und Penicillin gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Salmonella-Zellen (z.B. Serotyp Typhi), z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Ceftriaxon, Azithromycin und Ciprofloxacin gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Shigella-Zellen, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Ciprofloxacin und Azithromycin gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Mycobacterium tuberculosis-Zellen, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das gewählt ist aus: Resistenz gegenüber Isoniazid (INH), Rifampicin (RMP), Fluorchinolon, Amikacin, Kanamycin und Capreomycin.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Enterococcus-Zellen, z.B. resistent gegenüber Vancomycin.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei alle Wirtszellen Enterobacteriaceae-Zellen sind, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus einem Cephalosporin und Carbapenem gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) E. coli-Zellen, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Trimethoprim, Itrofurantoin, Cefalexin und Amoxicillin gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Clostridium-Zellen (z.B. dificile), z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus einem Fluorchinolon-Antibiotikum und Carbapenem gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Neisseria gonorrhoea-Zellen, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Cefixim (z.B. einem oralen Cephalosporin), Ceftriaxon (einem injizierbaren Cephalosporin), Azithromycin und Tetracyclin gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Acinetoebacter baumannii-Zellen, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Beta-laktam, Meropenem und einem Carbapenem gewählt ist.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen (Wirtszellen) Campylobacter-Zellen, z.B. resistent gegenüber einem Antibiotikum, das aus Ciprofloxacin und Azithromycin gewählt ist.
In einem Beispiel ist die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine kommensale Art bzw. ein kommensaler Stamm des menschlichen Darms und/oder eine probiotische Art bzw. ein probiotischer Stamm des menschlichen Darms.
In einem Beispiel ist die zweite Art bzw. der zweite Stamm ein Bacteroidetes (z.B. Bacteroides) ist und die Wirtszellen sind wahlweise grampositive bakterielle Zellen.
In einem Beispiel sind die ersten Zellen Firmicutes-Zellen.
In einem Beispiel wird das Hervorrufen der Dysbiose bzw. der Schritt (b) ausgeführt durch Zielen auf die Teilgesamtheit der ersten Zellen, indem an sie ein antibakterieller bzw. antiarchaealer Wirkstoff gleichzeitig oder sequentiell mit der Immunzellpopulation verabreicht wird, wobei erste Zellen getötet werden oder das Wachstum der Teilgesamtheit reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Mikrobiota des Patienten reduziert wird.
In einem Beispiel reduziert das Verfahren das Wachstum der ersten Zellpopulation (Wirtszellen) um mindestens ein 5-, 10-, 20-, 50- oder 100-faches gegenüber dem Wachstum einer Kontrollpopulation von Wirtszellen, die diese geführte Nuclease-Modifikation (z.B. Cas) nicht erhalten haben.
In einem Beispiel hemmt das Verfahren das Wachstum der Wirtszellpopulation auf einer Darmoberfläche.
In einem Beispiel umfasst das System für jede Wirtszelle Bestandteile nach (i) - (iv):

(i) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die eine Cas-Nuclease codiert;
(ii) ein gentechnisch erzeugter HM-CRISPR-Array, umfassend eine Spacer-Sequenz und Repeats, die eine HM-crRNA codieren, wobei die HM-crRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Zielsequenz einer Wirtszelle hybridisiert, um das Cas zum Ziel in der Wirtszelle zu führen, um so die Zielsequenz zu modifizieren;
(iii) eine optionale tracrRNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die eine tracrRNA-Sequenz exprimiert;
(iv) wobei die Bestandteile des Systems aufgeteilt sind zwischen der Wirtszelle und mindestens einem Nukleinsäurevektor, der die Wirtszelle umwandelt, wobei die HM-crRNA Cas zum Ziel führt, um die Zielsequenz des Wirts in der Wirtszelle zu modifizieren, und

In einem Beispiel ist der Bestandteil (i) jeder Wirtszelle endogen.
In einem Beispiel ist jeder Vektor ein Virus oder ein Phage.
In einem Beispiel grenzt jede Zielsequenz an ein NNAGAAW- oder NGGNG-PAM (protospacer adj acent motif) an.
In einem Beispiel sind HM-crRNA und tracrRNA alternativ von einer einzelnen gRNA umfasst, wobei das Verfahren umfasst: Einführen der gRNA in Wirtszellen oder Exprimieren der gRNA in Wirtszellen.
In einem Beispiel umfasst die Mikrobiota eine zweite bakterielle oder archaeale Art, wobei die ersten und zweiten Arten jeweils eine jeweilige Art desselben Phylums sind (z.B. beide Firmicutes-Arten) und das Wachstum der zweiten Bakterien nicht gehemmt wird durch das HM-System; oder wobei die Mikrobiota einen zweiten bakteriellen oder archaealen Stamm umfasst, wobei die ersten und zweiten Bakterien oder Archaea jeweils ein jeweiliger Stamm derselben Art ist und das Wachstum der zweiten Bakterien oder Archaea vom HM-System nicht gehemmt wird.
In einem Beispiel umfasst die Mikrobiota eine zweite Bakterienart, wobei die ersten und zweiten Arten jeweils grampositive Arten sind und das Wachstum der zweiten Bakterien vom HM-System nicht gehemmt wird.
In einem Beispiel ist jede Zielsequenz von einem Antibiotikaresistenzgen, Virulenzgen oder einem essentiellen Gen der Wirtszelle umfasst.
In einem Beispiel ist jede erste Zelle eine Staphylococcus-, Streptococcus-, Pseudomonas-, Salmonella-, Listeria-, E.coli-, Desulfovibrio-, Vibrio- oder Clostridium-Zelle.
In einem Beispiel umfasst die Dysbiose bzw. der Schritt (b): Stimulieren von Paneth-Zellen des Patienten durch Bacteroides des Darms (z.B. B. thetaiotamicron), wobei die von der Dysbiose bzw. dem Schritt (b) erzeugte geänderte Mikrobiota einen erhöhten Anteil der ersten Bacteroides-Bakterien gegenüber der Mikrobiota vor der Dysbiose bzw. dem Schritt (b) umfasst, wobei Paneth-Cellen stimuliert werden und die Zelltherapie moduliert wird.
Bacteroides kann die Expression von Paneth-Zellproteinen beeinflussen. Kleine Darmkrypten enthalten Stammzellen, die die Epithelzellen, die absterben und den Zotten verlorengehen, ständig regenerieren. Paneth-Zellen (Immunsystemzellen, die ähnlich den Neutrophilen sind), die an diese Stammzellen angrenzen, schützen sie vor Mikroben, indem sie verschiedene antimikrobielle Moleküle (Defensine) ins Lumen der Krypta absondern, und es ist möglich, dass sich ihre Schutzwirkung sogar auf die gereiften Zellen erstreckt, die auf die Zotten gewandert sind. Bei Tiermodellen kann B. thetaiotaomicron die Erzeugung eines antibiotischen Paneth-Zellproteins (Ang4) stimulieren, dass bestimmte pathogene Organismen töten kann (z.B. Listeria monocytogenes). Listeria monocytogenes ist ein starker Induktor von TH1-Zellen, also kann dies im Wege der Stimulation von Paneth-Zellen unter bestimmten Aspekten der Erfindung nützlich sein, um die Immunität von TH1 auf andere Zelltypen, wie z.B. TH17, zu lenken. Dies kann nützlich sein, um die erfindungsgemäße Immunzelltherapie zu erhöhen oder verstärken. Dies kann z.B. dann nützlich sein, wenn die Erfindung die Verabreichung einer auf TH17 basierenden Zelltherapie (z.B. CAR- TH17-Zellen) an den Patienten umfasst.
In einem Beispiel umfasst die Dysbiose bzw. der Schritt (b): Entwickeln einer Immunantwort beim Patienten auf Bacteroides des Darms (z.B. B. thetaiotamicron), wobei die von der Dysbiose bzw. dem Schritt (b) erzeugte geänderte Mikrobiota einen erhöhten Anteil der ersten Bacteroides-Bakterien gegenüber der Mikrobiota vor der Dysbiose bzw. dem Schritt (b) umfasst, wobei die Zelltherapie moduliert wird.
In einem Beispiel umfasst die Dysbiose bzw. Schritt (b): Ändern des relativen Anteils einer bzw. der Teilgesamtheit der ersten Zellen in der Darmflora des Patienten, wodurch eine veränderte Darmflora erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert, wobei die Dysbiose bzw. der Schritt (b) Abtöten erster Zellen der Teilgesamtheit bzw. Hemmen des Wachstums der Teilgesamtheit unter Verwendung einer geführten Nucleasezielung auf das Genom der von der Teilgesamtheit umfassten ersten Zellen umfasst.
Erfindungsgemäß wird ferner bereitgestellt: Ein bakterielles oder archaeales Transplantat zur Verabreichung an einen Patienten zur Therapie einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wahlweise umfasst das Transplantat Zellen der ersten Art. Wahlweise umfasst das Transplantat Zellen der zweiten Art (und umfasst z.B. keine Zellen der ersten Art).
Erfindungsgemäß wird ferner bereitgestellt: Ein bakterielles oder archaeales Transplantat zur Verabreichung an einen Probanden (z.B. Pflanze oder Hefe) oder einen Boden oder eine Umwelt zum Modulieren einer Behandlung davon unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wahlweise umfasst das Transplantat Zellen der ersten Art. Wahlweise umfasst das Transplantat Zellen der zweiten Art (und umfasst z.B. keine Zellen der ersten Art).
In einem Beispiel umfasst die Hefe eine Hefezellpopulation derselben Art bzw. desselben Stammes. Die Hefe ist z.B. von der Mikrobiota umfasst, z.B. die Hefe umfasst eine Teilgesamtheit von Zellen der Mikrobiota, z.B. wenn die Zielzellen Bakterien- oder Archaeazellen sind, die ebenfalls von der Mikrobiota umfasst sind. Gemäß einer Ausführungsform tötet das Verfahren die Zielzellen (z.B. Bakterien) oder reduziert das Wachstum der von der Mikrobiota umfassten Teilgesamtheit der Zielzellen, wobei die Freisetzung (bzw. die Konzentration) von einem oder mehreren Chemikalien oder Botenstoffen durch Zielzellen in der Mikrobiota reduziert wird. Bspw. werden die ein oder mehreren Chemikalien oder Botenstoffe reduziert, die das Quorum-Sensing bei Mikroben (z.B. Bakterien) der Mikrobiota vermitteln. Dies kann nützlich sein, um das Wachstum der Zielzell- und/oder anderer mikrobieller Zellpopulationen in der Mikrobiota zu gestalten. In einem Beispiel hemmen die ein oder mehreren Chemikalien oder Botenstoffe das Wachstum der Hefe bzw. töten die Hefe, also ist eine Reduzierung der Freisetzung bzw. Konzentration der Chemikalien bzw. Botenstoffe in der Mikrobiota vorteilhaft, um Wachstum und/oder Aufrechterhaltung der Hefe in der Mikrobiota zu fördern. Gemäß einer Ausführungsform dieser Beispiele ist die Behandlung eine Ernährung der Hefe bzw. Behandlung der Hefe mit einem Wachstumsförderer (z.B. wobei die Hefe zur Nahrungs- oder Getränkeproduktion oder zur Erzeugung eines biotechnologischen oder medizinischen Erzeugnises wie z.B. eines Antikörpers, bestimmt ist, z.B. wobei die Hefe Saccharomyces ist). In einem weiteren Beispiel fördern die Chemikalien bzw. Botenstoffe das Wachstum der Hefe, wobei die Behandlung der Hefe eine Behandlung mit einem Mittel zur Tötung der Hefe (z.B. Fungizid) ist. Dies ist nützlich, um die Wirksamkeit der Tötungsbehandlung zu fördern, wenn die Hefen unerwünscht sind (z.B. unerwünschter Schimmel). Wenn der Proband eine Pflanze ist, hemmen die ein oder mehreren Chemikalien oder Botenstoffe in einem Beispiel das Wachstum der Pflanze bzw. töten die Pflanze, also ist eine Reduzierung der Freisetzung bzw. Konzentration der Chemikalien bzw. Botenstoffe in der Mikrobiota vorteilhaft, um Wachstum der Pflanze zu fördern und/oder das Töten der Pflanze zu hemmen. Gemäß einer Ausführungsform dieser Beispiele ist die Behandlung eine Ernährung der Pflanze bzw. eine Behandlung der Hefe mit einem Düngemittel oder einem Stickstoffbindemittel. Gemäß einer Ausführungsform ist die Behandlung eine Pestizidbehandlung der Pflanze, z.B. eine Behandlung, die in Gegenwart der Zielzellen der Mikrobiota gehemmt oder reduziert wird.
In einem Beispiel ist die Pflanze eine Kulturpflanze (z.B. Weizen, Gerste, Getreide oder Viehfutterpflanze), Obstpflanze (z.B. Apfel-, Orangen-, Zitrus-, Limonen-, Zitronen-, Himbeer-, Erdbeer-, Beer- oder Bananenpflanze), Hülsenfruchtpflanze, Zuckerrohrpflanze, Gewürzpflanze, Gartenpflanze, Gemüsepflanze, Gras, Baum oder Blütenpflanze. Bei der Pflanze handelt es sich z.B. um eine Knollenpflanze, z.B. eine Kartoffel oder Süßkartoffel (z.B. sind die ersten, Wirts- bzw. Zielbakterien Pectobacterium atrosepticum-Zellen, wahlweise wobei die Behandlung Lagerung (z.B. Kaltlagerung), Waschen, Pestizid- oder Herbizidbehandlung, Düngen oder Hydrieren der Pflanze oder eines Ernteguts davon (z.B. Kartoffelernte)) . Bei der Pflanze handelt es sich z.B. um eine Tabakpflanze (z.B. sind die ersten, Wirts- bzw. Zielbakterien Ralstonia solanacearum-Zellen, wahlweise wobei die Behandlung Lagerung (z.B. Kaltlagerung), Waschen, Pestizid- oder Herbizidbehandlung, Düngen oder Hydrieren der Pflanze oder eines Ernteguts davon (z.B. Tabakernte)).
In einem Beispiel ist der Proband ein Protozoon. In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden bzw. Patienten um einen Fisch. In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden bzw. Patienten um einen Vogel. In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden bzw. Patienten um ein Reptil. In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden bzw. Patienten um ein Spinnentier. In einem Beispiel ist der Proband eine Hefezelle (z.B. Saccharomyces-Zelle). In einem Beispiel ist der Proband bzw. Patient ein Tier (z.B. Nager, Maus oder Ratte). In einem Beispiel ist der Proband bzw. Patient ein Mensch (z.B. Embryo oder kein Embryo). In einem Beispiel ist der Proband bzw. Patient ein Haustier (z.B. Vogel, Pferd, Hund, Katze oder Kaninchen). In einem Beispiel ist der Proband bzw. Patient ein Insekt (ein Insekt in einem beliebigen Stadium seines Lebenszyklus, z.B. Ei, Larve, Puppe, z.B. Fliege oder kriechendes Insekt oder Käfer). In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden bzw. Patienten um einen Kopffüßer oder Nematoden. In einem Beispiel handelt es sich beim Probanden bzw. Patienten um einen pflanzlichen oder tierischen Schädling. In einem Beispiel kann die Behandlung eines Tiers oder Menschen eine Ernährungsbehandlung, Therapie einer Krankheit bzw. eines Zustandes, Prophylaxe einer Krankheit bzw. eines Zustandes, Augenbehandlung, Pestizidbehandlung, Zahnbehandlung, topische Behandlung oder Verdauungsbehandlung sein. In einem Beispiel verstärkt das Verfahren die Immunität des Probanden bzw. Patienten gegenüber einem Krankheitserreger (z.B. pathogenen Parasiten, Protozoen, Viren oder Bakterien). In einem Beispiel ist die Behandlung bzw. Therapie eine Kombinationsbehandlung oder -therapie, die am Menschen bzw. Tier durchgeführt wird, wobei ein erstes Arzneimittel in Kombination mit einem zweiten Arzneimittel bzw. Strahlung an den Menschen bzw. das Tier verabreicht wird. Das erste und/oder zweite Arzneimittel kann eine Antikörpertherapie oder eine Immunzelltransplantationstherapie (z.B. CAR-T- oder TILs-Transplantation) sein (und der Immunmodulationsaspekt der Erfindung kann bei der Modulation dieser Therapien nützlich sein). In einem Beispiel ist jedes Arzneimittel bzw. jede Behandlung aus der Tabelle 2 gewählt.
In einem Beispiel ist die Krankheit bzw. der Zustand Diabetes (z.B. Typ I- oder -II-Diabetes, insulinresistenter Diabetes (z.B. insulinresistenter Typ II-Diabetes), Eintritt von Insulinresistenz bei einem diabetischen oder prädiabetischen Patienten oder Reduzierung des Ansprechens eines diabetischen oder prädiabetischen Patienten auf Insulin. In diesem Beispiel handelt es sich zusätzlich wahlweise bei den ersten bzw. Wirtszellen, auf die gezielt wird, um Prevotella copri- oder Bacteroides vulgatus-Zellen. Gemäß einer Ausführungsform wird beim Patienten sowohl auf Prevotella copri- als auch auf Bacteroides vulgatus-Zellen gezielt (z.B. getötet oder Populationswachstum reduziert, oder reduziert in der Mikrobiota nach der Verabreichung eines vorliegend beschriebenen Transplantats), wobei die Krankheit bzw. der Zustand behandelt oder verhütet wird.
Erfindungsgemäß wird ferner bereitgestellt: das HM-CRISPR/Cas-System, HM-Array oder HM-crRNA zur Verabreichung an einen Patienten zur Therapie einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Erfindungsgemäß wird ferner bereitgestellt: ein Set, umfassend eine ex vivo-Immunzellpopulation zur adoptiven Zelltherapie bei einem Patienten, wobei das Set ferner ein Transplantat, einen Array oder eine crRNA umfasst, wahlweise wobei die Immunzellen gewählt sind aus CAR-T-Zellen, TCRs, TILs und NK-Zellen.
MOBILE GENETISCHE ELEMENTE (MGEs)
In einem Beispiel ist jeder Vektor ein Nukleinsäurevektor, umfassend oder bestehend aus einem mobilen genetischen Element (MGE), wobei das MGE einen Transferursprung (oriT) und einen CRISPR-Array zum Modifizieren einer Zielsequenz des Genoms einer Wirtszelle oder des Genoms eines Virus (z.B. Prophage) bei einer Wirtszelle umfasst. Als Beispiele von MGEs seien genannt: ICEs, Transposons, Plasmide und Bakteriophagen. Ein Transferursprung (oriT) ist eine kurze Sequenz (z.B. bis zu 500 bp), die zum Transfer der sie enthaltenden DNA aus einem bakteriellen Wirt an einen Empfänger bei der Konjugation erforderlich ist. Der oriT ist cis-wirkend - er befindet sich auf derselben DNA, die übertragen wird, und wird zusammen mit der DNA übertragen. Ein typischer oriT umfasst drei funktionell definierte Domänen: Eine Nicking-Domäne, eine Transfer-Domäne und eine Terminierungsdomäne.
Hierzu wird auf die ICEberg-Datenbank verwiesen (http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/), die Beispiele für die Erfindung geeigneter ICEs sowie Quellen geeigneter oriTs bietet. In einem Beispiel ist das ICE ein Mitglied einer ICE-Familie, die ein aus der Gruppe 1-28 gewähltes ICE umfasst, oder der oriT ist ein oriT eines Mitglieds einer derartigen Familie. 1=SXT/R391; 2=Tn916; 3=Tn4371; 4=CTnDOT/ERL; 5=ICEc1c; 6=ICEBs1; 7=ICEHin1056; 8=PAPI-1; 9=ICEM1Sym(R7A); 10=ICESt1; 11=SPI-7; 12=ICE6013; 13=ICEKp1; 14=TnGBS1; 15=Tn5253; 16=ICESa2603; 17=ICEYe1; 18=10270-RD.2; 19=Tn1207.3; 20=Tn1806; 21=ICEA5632; 22=ICEF-I/II; 23=ICEAPG2; 24=ICEM; 25=10270-RD.1, 26=Tn5801; 27=PPI-1; 28=ICEF-III. Familienbeschreibungen finden sich in der ICEberg-Datenbank. Die Familie Tn916 wurde z.B. von Roberts et al (2009) definiert (Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251-8. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; „A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements", Roberts A, Mullany P). Elemente, die zur Familie Tn916 gehören, werden nach folgenden Kriterien definiert: Sie müssen die allgemeine Organisation nach Roberts et al. aufweisen, und sie müssen eine Kernregion (Konjugations- und Regulierungsmodul) aufweisen, die in Sequenz und Struktur dem ursprünglichen Tn916 auf DNA-Ebene ähnlich ist. Ausnahmen hiervon sind einige konjugative Transposons wie z.B. Tn1549, die früher in dieser Familie klassifiziert wurden, sowie solche mit einem hohen Grad an Proteinähnlichkeit, wie in den entsprechenden Referenzen beschrieben. Wahlweise ist das ICE ein Transposon, z.B. ein konjugatives Transposon. In einem Beispiel ist das MGE ein mobilisierbares Transposon, das in Gegenwart eines funktionellen Helferelements mobilisierbar ist, wahlweise wobei das Transposon mit einem o.g. Helferelement kombiniert ist.
Wahlweise ist der Vektor ein Plasmid, wahlweise wobei das MGE ein vom Plasmid umfasstes Transposon ist. Das Transposon ist z.B. ein konjugatives Transposon. In einem Beispiel ist das Transposon ein mobilisierbares Transposon (z.B. mobilisierbar unter Verwendung mindestens eines vom Plasmid codierten Faktors, z.B. durch Gene außerhalb der Transposon-Sequenz des Plasmids). Wahlweise ist das Transposon ein Typ I-Transposon. Wahlweise ist das Transposon ein Typ II-Transposon. Wahlweise ist der oriT des Vektors ein oriT eines Bacteroidetes (z.B. Bacteroidales oder Bacteroides) oder Prevotella-Transposons. Dies ist nützlich, wenn die ersten Zellen (Wirtszellen) Bacteroidetes (z.B. Bacteroidales oder Bacteroides) bzw. Prevotella sind. Wahlweise ist der oriT des Vektors ein TransposonoriT der Familien CTnDot, CTnERL SXT/R391, Tn916 oder Tn4371.
Wahlweise umfasst das Verfahren Aussetzen der Mikrobiota des Patienten an einen Vektor oder ein MGE (z.B. wie sie oben beschrieben wurden), umfassend ein Toxin-Antitoxin-Modul, das ein Antitoxingen umfasst, das bei den zweiten Bakterien wirken kann, bei den ersten Zellen (Wirtszellen) aber nicht oder nur in reduziertem Umfang wirkt. So werden die ersten Zellen getötet und die zweiten Bakterien geschont, wodurch der Anteil der ersten Zellen an der Mikrobiota des Patienten geändert wird.
GESPALTENES CRISPR/CAS-SYSTEM
Unter einem Aspekt wird die endogene Cas der ersten Zellen (Wirtszellen) ausgenutzt und sie wirkt mit den gentechnisch erzeugten Sequenzen zusammen, die von Vektoren (z.B. Phagen) umfasst sind, die in Wirtszellen eingeführt werden. Dieser Aspekt ist vorteilhaft, um in Vektoren Platz freizumachen, z.B. Viren oder Phagen mit eingeschränkter Fähigkeit zum Tragen exogener Sequenzen. Indem Platz freigemacht wird, können mehr Zielungs-Spacers oder -Arrays aufgenommen werden, was nützlich ist, um die Resistenz des Wirts umgehen zu können. Vorteilhaft ist es, z.B. die endogene Cas-Endonuclease auszunutzen, statt sie im Vektor zu codieren, v.a. bei sperrigen Cas-Sequenzen wie z.B. sp oder saCas9. Außerdem gibt es dann keine Möglichkeit einer schlechteren Kompatibilität, wie sie etwa bei einigen exogenen Cas aus anderen Quellen als dem Wirt zu sehen ist. Die Fähigkeit, die Genome von Viren, z.B. Phagen, zu verkleinern, kann auch vorteilhaft sein, um die Aufnahme der Wirtszellen zu steigern (Infektion und/oder Aufrechterhaltung des Virus bei den Wirtszellen). In einigen Beispielen besteht ein Vorteil darin, dass das Eindringen in den Wirt durch den Vektor (z.B. Phage) die CRISPR/Cas-Aktivität des Wirts hochregulieren kann, insbesondere erhöhte Expression von Cas-Nucleasen des Wirts, in einem Versuch des Wirts, die eindringende Nukleinsäure zu bekämpfen. Dies ist aber auch nützlich, um endogene Cas zur Verwendung im Rahmen der Erfindung bereitzustellen, wenn es sich hierbei um cRNA oder gRNA handelt, die von der Cas des Wirts erkannt werden. Umfasst die Erfindung das Zielen auf einen CRISPR-Array des Wirts mit cRNA oder gRNA, so fördert dies die Deaktivation des CRISPR-Arrays des Wirts selbst, ähnlich einer „suizidalen“ Wirtszelle, die dann die eigene Cas-Nuclease verwendet, um die eigenen CRISPR-Systeme zu deaktivieren.
Also können den Vektoren eine Codierungssequenz für Cas-Nuclease (z.B. aCas9) fehlen.
Wahlweise ist das endogene erste Zellsystem (Wirtszellen) ein CRISPR/Cas9-System. Wahlweise ist die Nuclease eine Typ I-Cas-Nuclease. Wahlweise ist die Nuclease eine Typ II-Cas-Nuclease (z.B. Cas9). Wahlweise ist die Nuclease eine Typ III-Cas-Nuclease.
Um noch mehr Platz zu sparen, wird wahlweise keine tracrRNA-Sequenz von den Vektoren bereitgestellt, sondern es handelt sich um eine tracrRNA-Sequenz eines endogenen CRISPR/Cas-Systems der Wirtszelle, wobei die tracrRNA sich mit der HM-crRNA in der Wirtszelle zur späteren Verarbeitung zu reifer crRNA hybridisieren kann, um Cas zum Ziel in der Wirtszelle zu führen.
ALLGEMEIN ANWENDBARE MERKMALE
Folgende Merkmale finden auf eine beliebige Ausgestaltung der Erfindung (z.B. beliebige Aspekte, Ausführungsformen, Konzepte, Absätze oder Beispiele) Anwendung:
In einem Beispiel ist die Zielsequenz eine chromosomale Sequenz, eine endogene Wirtszellsequenz, eine wilde Wirtszellsequenz, eine nicht virale chromosomale Wirtszellsequenz und/oder eine Nicht-Phagen-Sequenz (d.h. eines oder mehrere, oder alle, von diesen), z.B. die Sequenz ist eine wilde chromosomale Zellsequenz des Wirts wie z.B. Antibiotikaresistenz- oder essentielle Gensequenz, die von einem Chromosom einer Wirtszelle umfasst ist. In einem Beispiel ist die Sequenz eine Plasmidsequenz einer Wirtszelle, z.B. eine Antibiotikaresistenzgensequenz.
In einem Beispiel werden mindestens zwei Zielsequenzen von Cas modifiziert, z.B. ein Antibiotikaresistenzgen und ein essentielles Gen. Diese mehrfache Zielung kann nützlich sein, um die Evolution von Escape-Mutanten unter den Wirtszellen zu reduzieren.
In einem Beispiel ist die Ca seine wilde endogene Cas-Nuclease der Wirtszellen. In einem Beispiel weist jede Wirtszelle eine constitutive Cas-Nucleaseaktivität auf, z.B. konstitutive wilde Cas-Nucleaseaktivität. In einem Beispiel ist die Wirtszelle eine bakterielle Zelle; in einem weiteren Beispiel ist die Wirtszelle eine archeale Zelle. Die Verwendung einer endogenen Cas ist vorteilhaft, da hierdurch Platz in cRNA oder gRNA von Vektoren freigemacht werden kann. Eine Typ II-Cas9-Nukleotidsequenz ist z.B. groß, und die Verwendung einer endogenen Cas der Wirtszelle stattdessen ist in diesem Fall vorteilhaft, wenn ein Typ II-CRISPR/Cas-System im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Modifikation der Wirtszelle verwendet wird. Die am häufigsten eingesetzt Cas9, die 4,2 kb groß ist, stammt aus S. pyogenes. Obwohl sie eine effiziente Nuclease ist, stößt die Länge des Moleküls an die Grenzen des von einem Vektor aufnehmbaren genetischen Materials, wodurch eine Barriere für den Einsatz von CRISPR in den Geweben lebender Tiere und anderen vorliegend beschriebenen Umgebungen entsteht (siehe F.A. Ran et al., „In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9," Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015). Also ist der erfindungsgemäße Vektor gemäß einer Ausführungsform ein AAV-Vektor oder weist eine Fähigkeit zum Einfügen exogener DNA auf, die nicht größer ist als die eines AAV-Vektors, und die Cas ist eine endogene Cas der Wirtszelle, wobei die Zelle eine bakterielle oder archaeale Zelle ist. Die Nukleotidsequenz von S. thermophilus Cas9 (UniProtKB - G3ECR1 (CAS9_STRTR)) ist 1,4 kb groß.
In einem Beispiel ist der Vektor ein Virusvektor. Virusvektoren haben eine besonders beschränkte Fähigkeit zur Einfügung exogener DNA auf, also muss die Verpackungskapazität des Virus berücksichtigt werden. Es muss Platz für Sequenzen, die Vitalfunktionen des Virus codieren, z.B. zum Exprimieren von Hüllenproteinen und Polymerase, übrig bleiben. In einem Beispiel ist der Vektor ein Phagenvektor oder ein AAV- oder Lentivirusvektor. Phagenvektoren sind nützlich, wenn der Wirt eine bakterielle Zelle ist.
Dem Fachmann ist ohne weiteres klar, dass unter dem Begriff „gentechnisch erzeugt“ zu verstehen ist, dass der Array, die Sequenz, der Vektor, die cRNA, gRNA, das MGE oder eine beliebige andere Ausgestaltung, Konzept, Aspekt, Ausführungsform, Absatz oder Beispiel usw. der Erfindung nicht natürlich vorkommt. Bspw. umfasst das MGE, der Vektor, die Sequenz oder der Array mindestens eine Sequenz oder einen Bestandteil, der in der Natur nicht zusammen mit anderen Sequenzen oder Bestandteilen des MGE, des Vektors, der Sequenz oder des Arrays zu finden ist. Der Array oder die Sequenz ist z.B. rekombinant, künstlich, synthetisch oder der bzw. jeder Wirtszelle exogen (d.h. nicht endogen oder nicht wild).
In einem Beispiel ist der erfindungsgemäße Array bzw. die erfindungsgemäße Sequenz eine gentechnisch erzeugte Version eines isolierten Arrays oder einer isolierten Sequenz, z.B. isoliert aus einer Wirtszelle. In einem Beispiel liegt der gentechnisch erzeugte Array bzw. die gentechnisch erzeugte Sequenz nicht in Kombination mit einer Cas-Endonuclease codierenden Sequenz vor, die in einer Zelle natürlich vorkommt.
Studien lassen vermuten, dass Bacteroides bei der Verhütung von Clostridium difficile-Infektionen eine Rolle spielen. Die Entwicklung der Immunantwort, die Eintritt und Proliferation möglicher Krankheitserreger einschränkt, hängt stark von B. fragilis ab. Ferner können Paneth-Zellproteine antibakterielle Peptide als Reaktion auf eine Erregung durch B. thetaiotaomicron erzeugen, und diese Moleküle können verhindern, dass Krankheitserreger den Darm kolonisieren. Außerdem kann B. thetaiotaomicron Paneth-Zellen dazu veranlassen, ein bakterizides Lectin, RegIII, zu erzeugen, das eine antimikrobielle Wirkung durch Binden an das Peptidoglykan grampositiver Organismen entfaltet. Die Verwendung der Erfindung gemäß einer beliebigen ihrer Ausgestaltungen zur Erhöhung des Bacteroides-Anteils (z.B. thetaiotaomicron und/oder fragilis) an der Mikrobiota des Patienten ist also nützlich, um eine pathogene bakterielle Kolonisation der Population oder eines Darms des Menschen oder nicht menschlichen Tiers einzuschränken.
Hooper et al. führten den Nachweis, dass B. thetaiotaomicron die intestinale Fucosylierung in einer komplexen Wechselwirkung modifizieren kann, die von einem Fucose-Repressorgen und einem Signalisierungssystem vermittelt wird. Mit einer Transkriptionsanalyse wurde nachgewiesen, dass B. thetaiotaomicron die Expression verschiedener Wirtsgene modulieren kann, darunter auch derjenigen, die an der Nährstoffaufnahme, der Verstärkung der Schleimhautbarrier und der Erzeugung angiogener Faktoren beteiligt sind.
Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein gramnegatives Bakterium (z.B. Spirilla oder Vibrio). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein grampositives Bakterium. Wahlweise handelt es sich beim Wirt (oder dem ersten und/oder zweiten Bakterium) um Mykoplasmen, Chlamydien, Spirochäten oder Mykobakterien. Wahlweise handelt es sich beim Wirt (oder dem ersten und/oder zweiten Bakterium) um einen Streptococcus-Wirt (z.B. pyogenes oder thermophilus). Wahlweise handelt es sich beim Wirt (oder dem ersten und/oder zweiten Bakterium) um einen Staphylococcus-Wirt (z.B. aureus, z.B. MRSA). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein E. coli-Wirt (z.B. O157:H7), z.B. wobei die Cas vom Vektor codiert wird oder die Repression einer endogenen Cas-Nucleaseaktivität des Wirts rückgängig gemacht wird. Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Pseudomonas-Wirt (z.B. aeruginosa). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Vibro-Wirt (z.B. cholerae (z.B. O139) oder vulnificus). Wahlweise handelt es sich beim Wirt (oder dem ersten und/oder zweiten Bakterium) um einen Neisseria-Wirt (z.B. gonorrhoeae oder meningitidis). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Bordetella-Wirt (z.B. pertussis). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Haemophilus-Wirt (z.B. influenzae). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Shigella-Wirt (z.B. dysenteriae). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Brucella-Wirt (z.B. abortus). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Francisella-Wirt. Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Xanthomonas-Wirt. Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Agrobacterium-Wirt. Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Erwinia-Wirt. Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Legionella-Wirt (z.B. pneumophila). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Listeria-Wirt (z.B. monocytogenes). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Campylobacter-Wirt (z.B. jejuni). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Yersinia-Wirt (z.B. pestis). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Borelia-Wirt (z.B. burgdorferi). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Helicobacter-Wirt (z.B. pylori). Wahlweise handelt es sich beim Wirt (oder dem ersten und/oder zweiten Bakterium) um einen Clostridium-Wirt (z.B. difficile oder botulinum). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Erlichia-Wirt (z.B. chaffeensis). Wahlweise handelt es sich beim Wirt (oder dem ersten und/oder zweiten Bakterium) um einen Salmonella-Wirt (z.B. typhi oder enterica, z.B. Serotyp typhimurium, z.B. DT 104) Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Chlamydia-Wirt (z.B. pneumoniae). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Parachlamydia-Wirt. Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Corynebacterium-Wirt (z.B. amycolatum). Wahlweise ist der Wirt (oder das erste und/oder zweite Bakterium) ein Klebsiella-Wirt (z.B. pneumoniae). Wahlweise handelt es sich beim Wirt (oder dem ersten und/oder zweiten Bakterium) um einen Enterococcus-Wirt (z.B. faecalis oder facim, z.B. linezolidresistent) Wahlweise handelt es sich beim Wirt (oder dem ersten und/oder zweiten Bakterium) um einen Acinetobacter-Wirt (z.B. baumannii, z.B. multiresistent).
Eine tracrRNA-Sequenz kann aus einem erfindungsgemäßen Array oder Vektor weggelassen werden, z.B. für Cas-Systeme eines Typs, bei dem keine tracrRNA verwendet wird.
In einem Beispiel ist die zum Ziel geführte Ca seine Exonuclease. Wahlweise ist eine erfindungsgemäße Nickase eine doppelte Nickase. Ein Beispiel einer Nickase ist eine Cas9-Nickase, d.h. eine Cas9, bei der eine der beiden Nucleasedomänen deaktiviert ist, und zwar entweder die RuvC- und/oder HNH-Domäne.
Sofern vorliegend von der Verwendung von Vektor-DNA die Rede ist, kann dies gemäß einer alternativen Ausführungsform auf Vektor-RNA entsprechende Anwendung finden, sofern dies der Zusammenhang zulässt. So z.B. wenn der Vektor ein RNA-Vektor ist. Alle Merkmale der Erfindung werden somit alternativ als „RNA“ statt „DNA“ offenbart und entsprechend zu verstehen, sofern vorliegend auf Vektor-DNA Bezug genommen wird, wenn es der zusammenhang zulässt. In einem Beispiel codiert der bzw. jeder Vektor auch eine Reverse-Transkriptase.
In einem Beispiel wird der bzw. jeder Array bzw. der bzw. jede gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz bereitgestellt durch einen Nanopartikel-Vektor oder in Liposomen.
In einem Beispiel ist die Cas eine Cas-Nuclease zum Schneiden, tote Cas (dCas) zum Unterbrechen oder eine mit einem Transkriptions-Aktivator konjugierte dCas zum Aktivieren des Ziels.
In einem Beispiel umfasst der bzw. jeder Array bzw. der bzw. jede gentechnisch erzeugte Nukleotidsequenz einen exogenen Promoter, der zur Transkription der cRNA oder gRNA beim Wirt funktionell ist.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Aray bzw. die gentechnisch erzeugte Sequenz in einem Virophagen-Vektor enthalten, und der Wirt ist alternativ ein Virus, das eine Zelle infizieren kann. Der Wirt ist z.B. ein großes Virus, das eine Amöbenzelle infiziert haben kann. Beim Wirt handelt es sich z.B. um ein Sputnik-Virus, Pithovirus, Mimivirus, Mamavirus, Megavirus oder Pandoravirus, z.B. wobei sich das Wirtsvirus in Wasser befindet. In einem Beispiel dieser Ausführungsform ist die Erfindung für die Wasser- oder Abwasseraufbereitung bestimmt (z.B. Reinigung, z.B. Behandlung von Wasserstraßen, Flüssen, Seen oder Teichen).
Gemäß einer Ausführungsform ist der bzw. jeder Vektor bzw. die bzw. jede gentechnisch erzeugte Sequenz ein ΦNM1-Page oder davon umfasst, wobei die mindestens eine Wirtszelle eine S. aureus-Zelle (z.B. MRSA) ist.
Bspw. wird das Verfahren an einem säugerartigen Probanden, z.B. einem Menschen, Nager, Maus oder Ratte, ausgeführt. Bspw. wird das Verfahren an einem Wirbeltier, Reptil, Vogel oder Fisch ausgeführt.
Die Zellpopulation kann in einer oder mehreren Dosen an den Patienten verabreicht werden. Das Verfahren umfasst z.B. Verabreichen eines antibakteriellen Wirkstoffs zur Hervorrufung der Dysbiose oder Verabreichen eines bakteriellen Transplantats an den Patienten, um die Dysbiose hervorzurufen.
Wobei das Verfahren die Zelltherapie reduziert, die Therapie herunterreguliert, abgedämpft oder abgeschaltet werden kann, z.B. um eine unerwünschte Nebenwirkung der Zelltherapie (z.B. eine nebenwirkung einer CAR-T-Therapie bei einem menschlichen Patienten wie z.B. CRS) zu reduzieren oder verhüten. Wobei das Verfahren die Zelltherapie verstärkt, die Therapie hochreguliert, verstärkt oder eingeschaltet werden kann, z.B. um die Zytotoxizität gegen mindestens eine Zielzelle zu erhöhen.
Das Verfahren behandelt oder verhütet (d.h. reduziert das Risiko von) die Krankheit bzw. den Zustand. Es kann sich hierbei um eine vollständige oder teilweise Behandlung oder Verhütung handeln, d.h. eine Reduzierung, aber keine vollständige Reduzierung, der Krankheit/des Zustandes oder der Symptome davon; oder eine Reduzierung des Risikos, aber keine vollständige Verhütung der Krankheit/des Zustandes oder eines Symptoms davon. Ebenso behandelt oder verhütet (d.h. reduziert das Risiko von) das Verfahren ein unerwünschtes Symptom der Krankheit bzw. des Zustandes oder der Therapie (z.B. CRS).
KONZEPTE:

1. Ein Verfahren zum Modulieren einer adoptiven Immunzelltherapie einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst:
1. a. Ausführen einer adoptiven Immunzelltherapie beim Patienten, umfassend Verabreichen einer Immunzellpopulation an den Patienten, wobei die Verabreichung der Immunzellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und
2. b. Hervorrufen einer Dysbiose der bakteriellen Mikrobiota (z.B. Darmflora) beim Patienten, wobei die Dysbiose die Zelltherapie beim Patienten moduliert.
2. Ein Verfahren zum Modulieren einer adoptiven Immunzelltherapie einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst:
1. a. Ausführen einer adoptiven Immunzelltherapie beim Patienten, umfassend Verabreichen einer Immunzellpopulation an den Patienten, wobei die Verabreichung der Immunzellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und
2. b. Ändern des relativen Anteils einer Teilgesamtheit von Zellen einer ersten bakteriellen Art bzw. eines ersten bakteriellen Stammes oder archaealen Art oder eines archaealen Stammes in einer Mikrobiota (z.B. Darmflora) des Patienten, wodurch eine veränderte Mikrobiota erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert.
3. Verfahren nach Konzept 2, wobei der Schritt (b) ausgeführt wird durch Zielen auf die Teilgesamtheit der ersten Zellen, indem an sie ein antibakterieller bzw. antiarchaealer Wirkstoff gleichzeitig oder sequentiell mit der Immunzellpopulation verabreicht wird, wobei erste Zellen getötet werden oder das Wachstum der Teilgesamtheit reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Mikrobiota des Patienten reduziert wird.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei die Zelltherapie eine adoptive T-Zell-Therapie ist.
5. Verfahren nach Konzept 4, wobei Zellen, die aus der Gruppe von CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, TH1 -Zellen und TH17 -Zellen an den Patienten im Schritt (a) verabreicht werden.
6. Verfahren nach Konzept 4 oder 5, wobei beim Patienten TH17-Zellen moduliert werden.
7. Verfahren nach Konzept 4, 5 oder 6, wobei beim Patienten Treg-Zellen moduliert werden.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei die Zelltherapie verstärkt ist.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei TH17-Zellen beim Patienten hochreguliert und/oder Treg-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei CD4+ -T-Zellen beim Patienten hochreguliert werden.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei CD8+ -T-Zellen beim Patienten hochreguliert werden.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei mindestens eines von TCM-Zellen, TEM-Zellen, TSCM-Zellen und Teff-Zellen beim Patienten hochreguliert werden, wobei die Zellen von der im Schritt (a) verabreichten Immunzellpopulation umfasst sind und/oder deren Nachwuchs sind.
13. Verfahren nach einem der Konzepte 1 -7, wobei die Zelltherapie reduziert wird.
14. Verfahren nach Konzept 13, wobei das Verfahren das Risiko von CRS beim Patienten reduziert oder verhütet.
15. Verfahren nach einem der Konzepte 1 - 7, 13 und 14, wobei TH17-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden und/oder Treg-Zellen beim Patienten hochreguliert werden.
16. Verfahren nach einem der Konzepte 1 - 7 und 13 - 15, wobei CD4+ -T-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden.
17. Verfahren nach einem der Konzepte 1 - 7 und 13 - 16, wobei CD8+ -T-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden.
18. Verfahren nach einem der Konzepte 1 - 7 und 13 - 17, wobei mindestens eines von TCM-Zellen (central memory T-cells), TEM-Zellen (effector memory T-cells), TSCM-Zellen (stem cell memory T-cells) und Teff-Zellen (effector T-cells) beim Patienten herunterreguliert werden, wobei die Zellen von der im Schritt (a) verabreichten Immunzellpopulation umfasst sind und/oder deren Nachwuchs sind.
19. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei die Immunzellpopulation CAR-T-Zellen und/oder T-Zellen, die gentechnisch erzeugte TCRs (T-cell receptors) und/oder TILs (tumour infiltrating lymphocytes) exprimieren, umfasst.
20. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei die Immunzellpopulation gentechnisch erzeugte autologe oder allogene Immunzellen, z.B. T-Zellen, NK-Zellen und/oder TILs, umfasst.
21. Verfahren nach Konzept 19 oder 20, wobei die T-Zellen CD4+ -T-Zellen oder TH17-Zellen sind.
22. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei der Schritt (b) den Anteil von Bacteroides (z.B. B. fragalis und/oder B. thetaiotaomicron) an der Mikrobiota erhöht.
23. Verfahren nach einem der Konzepte 1 - 12, wobei der Schritt (b) den Anteil von Bacteroides (z.B. B. fragalis und/oder B. thetaiotaomicron) an der Mikrobiota reduziert.
24. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei der Schritt (b) das Verhältnis von Bacteroidetes zu Firmicutes in der Mikrobiota erhöht.
25. Verfahren nach einem der Konzepte 1 - 23, wobei der Schritt (b) das Verhältnis von Bacteroidetes zu Firmicutes in der Mikrobiota reduziert.
26. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei der Schritt (b) den Anteil mindestens einer Clostridium-Art oder mindestens eines Clostridium-Stammes an der Mikrobiota reduziert (z.B. wobei jede Art eine Cluster IV- oder -XIVa-Clostridiumart ist).
27. Verfahren nach einem der Konzepte 1 - 25, wobei der Schritt (b) den Anteil mindestens einer Clostridium-Art oder mindestens eines Clostridium-Stammes an der Mikrobiota erhöht (z.B. wobei jede Art eine Cluster IV- oder -XIVa-Clostridiumart ist).
28. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei der Schritt (b) den Anteil von Bifidobacterium (z.B. B. bifidum) an der Mikrobiota erhöht.
29. Verfahren nach einem der Konzepte 1 - 27, wobei der Schritt (b) den Anteil von Bifidobacterium (z.B. B. bifidum) an der Mikrobiota erhöht.
30. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei der Schritt (b) umfasst: Ändern des relativen Anteils einer bzw. der Teilgesamtheit der ersten Zellen in der Mikrobiota des Patienten, wodurch eine geänderte Mikrobiota erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert, wobei die Teilgesamtheit Wirtszellen der ersten Art bzw. des ersten Stammes umfasst, wobei das Verfahren umfasst:
1. a. Kombinieren der Mikrobiota mit mehreren Kopien gentechnisch erzeugter Nukleinsäuresequenzen, die wirtmodifizierende (HM) crRNAs codieren, und
2. b. Exprimieren von HM-crRNAs bei Wirtszellen,
wobei jede gentechnisch erzeugte Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, mit einer Cas-Nuclease in einer jeweiligen Wirtszelle ein HM-CRISPR/Cas-System zu bilden, und die gentechnisch erzeugte Sequenz umfasst:
- (iii) Spacer- und Repeat-Sequenzen, die eine HM-crRNA codieren;
- (iv) wobei die HM-crRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Zielsequenz einer Wirtszelle hybridisieren kann, um die Cas-Nuclease zur Zielsequenz in der Wirtszelle zu führen; und
das HM-System wahlweise eine tracrRNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die eine tracrRNA-Sequenz exprimiert, umfasst, wobei HM-crRNAs die Cas-Modifizierung der Zielsequenzen des Wirts in den Wirtszellen führen, wobei Wirtszellen getötet werden oder das Wachstum der Wirtszellpopulation reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Mikrobiota reduziert wird.
31. Verfahren nach Konzept 30, umfassend Verwenden einer endogenen Cas-Nuclease der Wirtszellen zum Modifizieren der Zielnukleotidsequenzen.
32. Verfahren nach Konzept 30 oder 31, umfassend Reduzieren des Wachstums der Wirtszellpopulation um mindestens ein 5-faches gegenüber dem Wachstum einer Kontrollpopulation von Wirtszellen, die die Cas-Modifikation nicht erhalten haben.
33. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 32, umfassend Hemmen des Wachstums der Wirtszellpopulation auf einer Darmoberfläche.
34. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 33, wobei die Mikrobiota Zellen einer zweiten bakteriellen Art bzw. eines zweiten bakteriellen Stammes oder einer zweiten archealen Art oder eines zweiten archealen Stammes umfasst, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine 16s ribosomale RNA codierende DNA-Sequenz aufweist, die mindestens 80 % Identität mit einer 16s ribosomalen RNA codierenden DNA-Sequenz der Wirtszellenart bzw. des Wirtszellenstammes aufweist, wobei das Wachstum der zweiten Zellen in der Mikrobiota durch das HM-System nicht gehemmt wird.
35. Verfahren nach Konzept 34, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine kommensale Art bzw. ein kommensaler Stamm des menschlichen Darms und/oder eine probiotische Art bzw. ein probiotischer Stamm des menschlichen Darms ist.
36. Verfahren nach Konzept 34 oder 35, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm ein Bacteroidetes (z.B. Bacteroides) ist und die Wirtszellen wahlweise grampositive bakterielle Zellen sind.
37. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 36, wobei die ersten Zellen Firmicutes-Zellen sind.
38. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 37, wobei für jede Wirtszelle das System Bestandteile nach (i) - (iv) umfasst:
1. (i) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die eine Cas-Nuclease codiert;
2. (ii) ein gentechnisch erzeugter HM-CRISPR-Array, umfassend eine Spacer-Sequenz und Repeats, die eine HM-crRNA codieren, wobei die HM-crRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Zielsequenz einer Wirtszelle hybridisiert, um das Cas zum Ziel in der Wirtszelle zu führen, um so die Zielsequenz zu modifizieren;
3. (iii) eine optionale tracrRNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die eine tracrRNA-Sequenz exprimiert;
4. (iv) wobei die Bestandteile des Systems aufgeteilt sind zwischen der Wirtszelle und mindestens einem Nukleinsäurevektor, der die Wirtszelle umwandelt, wobei die HM-crRNA Cas zum Ziel führt, um die Zielsequenz des Wirts in der Wirtszelle zu modifizieren, und
wobei die Zielsequenz durch das Cas modifiziert wird, wobei die Wirtszelle getötet wird oder das Wachstum der Wirtszelle reduziert wird; wobei das Verfahren umfasst: Einführen der Vektoren nach (iv) in Wirtszellen und Exprimieren der HM-crRNA in den Wirtszellen, Ermöglichen, dass HM-crRNA sich mit Zielsequenzen der Wirtszelle hybridisiert, um Cas zu den Zielen in den Wirtszellen zu führen, um so die Zielsequenzen zu modifizieren, wobei Wirtszellen getötet werden oder das Wachstum der Wirtszellen reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Mikrobiota geändert wird.
39. Verfahren nach Konzept 38, wobei der Bestandteil (i) jeder Wirtszelle endogen ist.
40. Verfahren nach Konzept 38 oder 39, wobei jeder Vektor ein Virus oder eine Phage ist.
41. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 40, wobei jede Zielsequenz an ein NNAGAAW- oder NGGNG-PAM (protospacer adjacent motif) grenzt.
42. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 41, wobei HM-crRNA und tracrRNA alternativ von einer einzelnen gRNA (guide RNA) umfasst sind, wobei das Verfahren umfasst: Einführen der gRNA in Wirtszellen oder Exprimieren der gRNA in Wirtszellen.
43. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 35 und 37 - 42, wobei die Mikrobiota eine zweite bakterielle oder archaeale Art umfasst, wobei die ersten und zweiten Arten jeweils eine jeweilige Art desselben Phylums sind (z.B. beide Firmicutes-Arten) und das Wachstum der zweiten Bakterien nicht gehemmt wird durch das HM-System; oder wobei die Mikrobiota einen zweiten bakteriellen oder archaealen Stamm umfasst, wobei die ersten und zweiten Bakterien oder Archaea jeweils ein jeweiliger Stamm derselben Art ist und das Wachstum der zweiten Bakterien oder Archaea vom HM-System nicht gehemmt wird.
44. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 43, wobei die Mikrobiota eine zweite Bakterienart umfasst, wobei die ersten und zweiten Arten jeweils grampositive Arten sind und das Wachstum der zweiten Bakterien vom HM-System nicht gehemmt wird.
45. Verfahren nach einem der Konzepte 30 - 44, wobei jede Zielsequenz von einem Antibiotikaresistenzgen, Virulenzgen oder essentiellen Gen der Wirtszelle umfasst ist.
46. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei jede erste Zelle eine Staphylococcus-, Streptococcus-, Pseudomonas-, Salmonella-, Listeria-, E.coli-, Desulfovibrio-, Vibrio- oder Clostridium-Zelle ist.
47. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei der Schritt (b) umfasst: Stimulieren von Paneth-Zellen des Patienten durch Bacteroides des Darms (z.B. B. thetaiotaomicron), wobei die im Schritt (b) erzeugte geänderte Mikrobiota einen erhöhten Anteil der ersten Bacteroides-Bakterien gegenüber der Mikrobiota vor dem Schritt (b) umfasst, wobei Paneth-Cellen stimuliert werden und die Zelltherapie moduliert wird.
48. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei der Schritt (b) umfasst: Entwickeln einer Immunantwort auf Bacteroides (z.B. B. thetaiotaomicron) im Bauch beim Patienten, wobei die vom Schritt (b) erzeugte veränderte Mikrobiota einen erhöhten Anteil der ersten Bacteroides-Bakterien gegenüber der Mikrobiota vor dem Schritt (b) umfasst, wodurch die Zelltherapie moduliert wird.
49. Verfahren nach einem der vorstehenden Konzepte, wobei der Schritt (b) umfasst: Ändern des relativen Anteils einer bzw. der Teilgesamtheit der ersten Zellen in der Mikrobiota des Patienten, wodurch eine veränderte Mikrobiota erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert, wobei der Schritt (b) Abtöten erster Zellen der Teilgesamtheit bzw. Hemmen des Wachstums der Teilgesamtheit unter Verwendung einer geführten Nucleasezielung auf das Genom der von der Teilgesamtheit umfassten ersten Zellen umfasst.
50. Bakterielles oder archaeales Transplantat zur Verabreichung an einen Patienten zur Therapie einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten unter Verwendung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Konzepte, wahlweise wobei das Transplantat Zellen der ersten Art umfasst.
51. HM-CRISPR/Cas-System, HM-Array oder HM-crRNA nach einem der Konzepte 30 - 45 zur Verabreichung an einen Patienten zur Therapie einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten unter Verwendung des Verfahrens nach einem der Konzepte 1 - 49.
52. Set, umfassend eine ex vivo-Immunzellpopulation zur adoptiven Zelltherapie bei einem Patienten, wobei das Set ferner ein Transplantat, einen Array oder eine crRNA nach Konzept 50 oder 51 umfasst, wahlweise wobei die Immunzellen gewählt sind aus CAR-T-Zellen, TCRs (T-cell receptors), TILs (tumour infiltrating lymphocytes) und NK-Zellen.

ASPEKTE:

1. Ex-vivo-Immunzellpopulation zur Verwendung bei einem adoptiven Zelltherapieverfahren bei einem Patienten zur Behandlung bzw. Verhütung einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten, wobei das Verfahren umfasst:
1. a. Ausführen einer adoptiven Immunzelltherapie beim Patienten, umfassend Verabreichen von Zellen der Population an den Patienten, wobei die Verabreichung der Immunzellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und
2. b. Hervorrufen einer Dysbiose der bakteriellen Darmflora beim Patienten, wobei die Dysbiose die Immunzelltherapie beim Patienten moduliert und die Krankheit bzw. der Zustand behandelt oder verhütet wird.
2. Ex-vivo-Immunzellpopulation zur Verwendung bei einem adoptiven Zelltherapieverfahren bei einem Patienten zur Behandlung bzw. Verhütung einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten, wobei das Verfahren umfasst:
1. a. Ausführen einer adoptiven Immunzelltherapie beim Patienten, umfassend Verabreichen von Zellen der Population an den Patienten, wobei die Verabreichung der Immunzellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und
2. b. Ändern des relativen Anteils einer Teilgesamtheit von Zellen einer ersten bakteriellen Art bzw. eines ersten bakteriellen Stammes oder archaealen Art oder eines archaealen Stammes in der Darmflora des Patienten, wodurch eine veränderte Darmflora erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert.
3. Immunzellpopulation nach Aspekt 2, wobei der Schritt (b) ausgeführt wird durch Zielen auf die Teilgesamtheit der ersten Zellen, indem an sie ein antibakterieller bzw. antiarchaealer Wirkstoff (z.B. eine geführte Nuclease) gleichzeitig oder sequentiell mit der Immunzellpopulation verabreicht wird, wobei erste Zellen getötet werden oder das Wachstum der Teilgesamtheit reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Darmflora des Patienten reduziert wird.
4. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei die Zelltherapie eine adoptive T-Zell-Therapie ist.
5. Immunzellpopulation nach Aspekt 4, wobei Zellen, die aus der Gruppe von CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, TH1 -Zellen und TH17 -Zellen an den Patienten im Schritt (a) verabreicht werden.
6. Immunzellpopulation nach Aspekt 4 oder 5, wobei beim Patienten TH17-Zellen moduliert werden.
7. Immunzellpopulation nach Aspekt 4, 5 oder 6, wobei beim Patienten Treg-Zellen moduliert werden.
8. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei die Zelltherapie verstärkt ist.
9. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei TH17-Zellen beim Patienten hochreguliert und/oder Treg-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden.
10. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei CD4+ -T-Zellen beim Patienten hochreguliert werden.
11. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei CD8+ -T-Zellen beim Patienten hochreguliert werden.
12. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei mindestens eines von TCM-Zellen, TEM-Zellen, TSCM-Zellen und Teff-Zellen beim Patienten hochreguliert werden, wobei die Zellen von der im Schritt (a) verabreichten Immunzellpopulation umfasst sind und/oder deren Nachwuchs sind.
13. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 7, wobei die Zelltherapie reduziert wird.
14. Immunzellpopulation nach Aspekt 13, wobei das Verfahren das Risiko von CRS (cytokine release syndrome) beim Patienten reduziert oder verhütet.
15. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 7, 13 und 14, wobei TH17-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden und/oder Treg-Zellen beim Patienten hochreguliert werden.
16. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 7 und 13 - 15, wobei CD4+ -T-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden.
17. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 7 und 13 - 16, wobei CD8+ -T-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden.
18. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 7 und 13 - 17, wobei mindestens eines von TCM-Zellen, TEM-Zellen, TSCM-Zellen und Teff-Zellen beim Patienten herunterreguliert werden, wobei die Zellen von der im Schritt (a) verabreichten Immunzellpopulation umfasst sind und/oder deren Nachwuchs sind.
19. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei die Immunzellpopulation CAR-T-Zellen und/oder T-Zellen, die gentechnisch erzeugte TCRs und/oder TILs exprimieren, umfasst.
20. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei die Immunzellpopulation gentechnisch erzeugte autologe oder allogene Immunzellen, z.B. T-Zellen, NK-Zellen und/oder TILs umfasst oder daraus besteht.
21. Immunzellpopulation nach Aspekt 19 oder 20, wobei die T-Zellen CD4+ -T-Zellen oder TH17-Zellen sind.
22. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Schritt (b) den Anteil von Bacteroides (z.B. B. fragalis und/oder B. thetaiotaomicron) an der Mikrobiota erhöht.
23. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 12, wobei der Schritt (b) den Anteil von Bacteroides (z.B. B. fragalis und/oder B. thetaiotaomicron) an der Mikrobiota reduziert.
24. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Schritt (b) das Verhältnis von Bacteroidetes zu Firmicutes in der Darmflora erhöht.
25. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 23, wobei der Schritt (b) das Verhältnis von Bacteroidetes zu Firmicutes in der Darmflora reduziert.
26. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Schritt (b) den Anteil mindestens einer Clostridium-Art oder mindestens eines Clostridium-Stammes an der Darmflora reduziert (z.B. wobei jede Art eine Cluster IV- oder -XIVa-Clostridiumart ist).
27. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 25, wobei der Schritt (b) den Anteil mindestens einer Clostridium-Art oder mindestens eines Clostridium-Stammes an der Darmflora erhöht (z.B. wobei jede Art eine Cluster IV- oder -XIVa-Clostridiumart ist).
28. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Schritt (b) den Anteil von Bifidobacterium (z.B. B. bifidum) an der Darmflora reduziert.
29. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 27, wobei der Schritt (b) den Anteil von Bifidobacterium (z.B. B. bifidum) an der Darmflora erhöht.
30. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Schritt (b) umfasst: Ändern des relativen Anteils einer bzw. der Teilgesamtheit der ersten Zellen in der Darmflora des Patienten, wodurch eine geänderte Darmflora erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert, wobei die Teilgesamtheit Wirtszellen der ersten Art bzw. des ersten Stammes umfasst, wobei das Verfahren umfasst:
1. a. Kombinieren der Mikrobiota mit mehreren Kopien gentechnisch erzeugter Nukleinsäuresequenzen, die wirtmodifizierende (HM) crRNAs codieren, und
2. b. Exprimieren von HM-crRNAs bei Wirtszellen,
wobei jede gentechnisch erzeugte Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, mit einer Cas-Nuclease in einer jeweiligen Wirtszelle ein HM-CRISPR/Cas-System zu bilden, und die gentechnisch erzeugte Sequenz umfasst:
1. (i) Spacer- und Repeat-Sequenzen, die eine HM-crRNA codieren;
2. (ii) wobei die HM-crRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Zielsequenz einer Wirtszelle hybridisieren kann, um die Cas-Nuclease zur Zielsequenz in der Wirtszelle zu führen; und
das HM-System wahlweise eine tracrRNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die eine tracrRNA-Sequenz exprimiert, umfasst, wobei HM-crRNAs die Cas-Modifizierung der Zielsequenzen des Wirts in den Wirtszellen führen, wobei Wirtszellen getötet werden oder das Wachstum der Wirtszellpopulation reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Mikrobiota reduziert wird.
31. Immunzellpopulation nach Aspekt 30, umfassend Verwenden einer endogenen Cas-Nuclease der Wirtszellen zum Modifizieren der Zielnukleotidsequenzen.
32. Immunzellpopulation nach Aspekt 30 oder 31, umfassend Reduzieren des Wachstums der Wirtszellpopulation um mindestens ein 5-faches gegenüber dem Wachstum einer Kontrollpopulation von Wirtszellen, die die Cas-Modifikation nicht erhalten haben.
33. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 32, umfassend Hemmen des Wachstums der Wirtszellpopulation auf einer Darmoberfläche.
34. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 33, wobei die Mikrobiota Zellen einer zweiten bakteriellen Art bzw. eines zweiten bakteriellen Stammes oder einer zweiten archealen Art oder eines zweiten archealen Stammes umfasst, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine 16s ribosomale RNA codierende DNA-Sequenz aufweist, die mindestens 80 % Identität mit einer 16s ribosomalen RNA codierenden DNA-Sequenz der Wirtszellenart bzw. des Wirtszellenstammes aufweist, wobei das Wachstum der zweiten Zellen in der Mikrobiota durch das HM-System nicht gehemmt wird.
35. Immunzellpopulation nach Aspekt 34, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine kommensale Art bzw. ein kommensaler Stamm des menschlichen Darms und/oder eine probiotische Art bzw. ein probiotischer Stamm des menschlichen Darms ist.
36. Immunzellpopulation nach Aspekt 34 oder 35, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm ein Bacteroidetes (z.B. Bacteroides) ist und die Wirtszellen wahlweise grampositive bakterielle Zellen sind.
37. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 36, wobei die ersten Zellen Firmicutes-Zellen sind.
38. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 37, wobei für jede Wirtszelle das System Bestandteile nach (i) - (iv) umfasst:
1. (i) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die eine Cas-Nuclease codiert;
2. (ii) ein gentechnisch erzeugter HM-CRISPR-Array, umfassend eine Spacer-Sequenz und Repeats, die eine HM-crRNA codieren, wobei die HM-crRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Zielsequenz einer Wirtszelle hybridisiert, um das Cas zum Ziel in der Wirtszelle zu führen, um so die Zielsequenz zu modifizieren;
3. (iii) eine optionale tracrRNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die eine tracrRNA-Sequenz exprimiert;
4. (iv) wobei die Bestandteile des Systems aufgeteilt sind zwischen der Wirtszelle und mindestens einem Nukleinsäurevektor, der die Wirtszelle umwandelt, wobei die HM-crRNA Cas zum Ziel führt, um die Zielsequenz des Wirts in der Wirtszelle zu modifizieren, und
wobei die Zielsequenz durch das Cas modifiziert wird, wobei die Wirtszelle getötet wird oder das Wachstum der Wirtszelle reduziert wird; wobei das Verfahren umfasst: Einführen der Vektoren nach (iv) in Wirtszellen und Exprimieren der HM-crRNA in den Wirtszellen, Ermöglichen, dass HM-crRNA sich mit Zielsequenzen der Wirtszelle hybridisiert, um Cas zu den Zielen in den Wirtszellen zu führen, um so die Zielsequenzen zu modifizieren, wobei Wirtszellen getötet werden oder das Wachstum der Wirtszellen reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit an der Mikrobiota geändert wird.
39. Immunzellpopulation nach Aspekt 38, wobei der Bestandteil (i) jeder Wirtszelle endogen ist.
40. Immunzellpopulation nach Aspekt 38 oder 39, wobei jeder Vektor ein Virus oder Phage ist.
41. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 40, wobei jede Zielsequenz an ein NNAGAAW- oder NGGNG-PAM (protospacer adj acent motif) grenzt.
42. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 41, wobei HM-crRNA und tracrRNA alternativ von einer einzelnen gRNA umfasst sind, wobei das Verfahren umfasst: Einführen der gRNA in Wirtszellen oder Exprimieren der gRNA in Wirtszellen.
43. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 35 und 37 - 42, wobei die Mikrobiota eine zweite bakterielle oder archaeale Art umfasst, wobei die ersten und zweiten Arten jeweils eine jeweilige Art desselben Phylums sind (z.B. beide Firmicutes-Arten) und das Wachstum der zweiten Bakterien nicht gehemmt wird durch das HM-System; oder wobei die Mikrobiota einen zweiten bakteriellen oder archaealen Stamm umfasst, wobei die ersten und zweiten Bakterien oder Archaea jeweils ein jeweiliger Stamm derselben Art ist und das Wachstum der zweiten Bakterien oder Archaea vom HM-System nicht gehemmt wird.
44. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 43, wobei die Mikrobiota eine zweite Bakterienart umfasst, wobei die ersten und zweiten Arten jeweils grampositive Arten sind und das Wachstum der zweiten Bakterien vom HM-System nicht gehemmt wird.
45. Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 30 - 44, wobei jede Zielsequenz von einem Antibiotikaresistenzgen, Virulenzgen oder essentiellen Gen der Wirtszelle umfasst ist.
46. Verfahren nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei jede erste Zelle eine Staphylococcus-, Streptococcus-, Pseudomonas-, Salmonella-, Listeria-, E.coli-, Desulfovibrio-, Vibrio- oder Clostridium-Zelle ist.
47. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Schritt (b) umfasst: Stimulieren von Paneth-Zellen des Patienten durch Bacteroides des Darms (z.B. B. thetaiotaomicron), wobei die im Schritt (b) erzeugte geänderte Mikrobiota einen erhöhten Anteil der ersten Bacteroides-Bakterien gegenüber der Mikrobiota vor dem Schritt (b) umfasst, wobei Paneth-Cellen stimuliert werden und die Zelltherapie moduliert wird.
48. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Schritt (b) umfasst:
- Entwickeln einer Immunantwort auf Bacteroides (z.B. B. thetaiotaomicron) im Bauch beim Patienten, wobei die vom Schritt (b) erzeugte veränderte Mikrobiota einen erhöhten Anteil der ersten Bacteroides-Bakterien gegenüber der Mikrobiota vor dem Schritt (b) umfasst, wodurch die Zelltherapie moduliert wird.
49. Immunzellpopulation nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der Schritt (b) umfasst: Ändern des relativen Anteils einer bzw. der Teilgesamtheit der ersten Zellen in der Darmflora des Patienten, wodurch eine veränderte Darmflora erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert, wobei der Schritt (b) Abtöten erster Zellen der Teilgesamtheit bzw. Hemmen des Wachstums der Teilgesamtheit unter Verwendung einer geführten Nucleasezielung auf das Genom der von der Teilgesamtheit umfassten ersten Zellen umfasst.
50. Bakterielles oder archaeales Transplantat zur Verabreichung an einen Patienten zur Therapie einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten unter Verwendung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Aspekte, wahlweise wobei das Transplantat Zellen der ersten Art umfasst.
51. HM-CRISPR/Cas-System, HM-Array oder HM-crRNA nach einem der Aspekte 30 - 45 zur Verabreichung an einen Patienten zur Therapie einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten unter Verwendung des Verfahrens nach einem der Aspekte 1 - 49.
52. Set, umfassend eine ex vivo-Immunzellpopulation nach einem der Aspekte 1 - 49 zur adoptiven Zelltherapie zur Behandlung der Krankheit bzw. des Zustandes bei einem Patienten, wobei das Set ferner ein Transplantat, einen Array oder eine crRNA nach Aspekt 50 oder 51 umfasst, wahlweise wobei die Immunzellen gewählt sind aus CAR-T-Zellen, TCRs, TILs und NK-Zellen.

Wahlweise ist die mindestens eine Wirtszelle, erste Zelle, zweite Zelle oder gemischte Bakterienpopulation umfasst von einem menschlichen Probanden oder einem nicht menschlichen Tierprobanden, z.B. die Population ist umfasst von einer Darmflora, Hautflora, Mundhöhlenflora, Kehlenflora, Haarflora, Achselhöhlenflora, Vaginaflora, Rektalflora, Augenflora, Nasenflora, Zungenflora, Lungenflora, Leberflora, Nierenflora, Gentalflora, Penisflora, Skrotalflora, Brustdrüsenflora, Ohrenflora, Urethralflora, Labialflora, Organflora oder Zahnflora. Wahlweise ist die gemischte Bakterienpopulation von einer Pflanze (z.B. Tabak, Kulturpflanze, Obstpflanze, Gemüsepflanze oder Tabak, z.B. auf der Oberfläche einer Pflanze oder in einer Pflanze enthalten) oder einer Umwelt (z.B. Boden oder Wasser oder Wasserstraße oder wässrige Flüssigkeit) umfasst.
Wahlweise ist die Krankheit bzw. der Zustand eines menschlichen oder tierischen Probanden bzw. Patienten gewählt aus:

(a) Einer neurodegenerativen Krankheit bzw. einem neurodegenerativen Zustand;
(b) Einer Krankheit bzw. einem Zustand des Hirns;
(c) Einer Krankheit bzw. einem Zustand des ZNS;
(d) Gedächtnisverlust oder -störung;
(e) Herz- oder Kreislaufkrankheit oder -zustand, z.B. Herzinfarkt, Schlaganfall oder Vorhoffflimmern;
(f) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Leber;
(g) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Nieren, z.B. chronische Nierenerkrankung (CKD);
(h) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Bauchspeicheldrüse;
(i) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Lungen, z.B. Mukoviszidose oder COPD;
(j) Einer Krankheit bzw. einem Zustand des Magen-Darm-Traktes;
(k) Einer Krankheit bzw. einem Zustand des Halses bzw. der Mundhöhle;
(l) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Augen;
(m) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Genitalien, z.B. Vagina, Schamlippen, Penis oder Skrotum;
(n) Einer sexuell übertragbaren Krankheit bzw. einem sexuell übertragbaren Zustand, z.B. Gonorrhö, HIV-Infektion, Syphilis- oder Chlamydia-Infektion;
(o) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Ohren;
(p) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Haut;
(q) Einer Krankheit bzw. einem Zustand des Herzens;
(r) Einer Krankheit bzw. einem Zustand der Nase;
(s) Einer hämatologischen Krankheit bzw. einem hämatologischen Zustand, z.B. Anämie, z.B. Anämie bei chronischer Erkrankung oder Krebs;
(t) Einer Virusinfektion;
(u) Einer pathogenen Bakterieninfektion;
(v) Einer Krebserkrankung;
(w) Einer Autoimmunkrankheit bzw. einem Autoimmunzustand, z.B. SLE;
(x) Einer Entzündungskrankheit bzw. einem Entzündungszustand, z.B. rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Ekzem, Asthma, Colitis ulcerosa, Colitis, M. Crohn oder IBD;
(y) Autismus;
(z) ADHS;
(aa) Bipolarer Störung
(bb) ALS [Amyotrophe laterale Sklerose];
(cc) Osteoarthritis;
(dd) Einem Geburts- oder Entwicklungsfehler oder -zustand;
(ee) Fehlgeburt;
(ff) Einem Blutgerinnungszustand;
(gg) Bronchitis;
(hh) Trockener oder nasser AMD;
(ii) Neovaskularisation (z.B. eines Tumors oder im Auge);
(jj) Erkältung;
(kk) Epilepsie;
(ll) Fibrose, z.B. Leber- oder Lungenfibrose;
(mm) Einer Pilzkrankheit bzw. einem Pilzzustand, z.B. Soor;
(nn) Einer Stoffwechselkrankheit bzw. einem Stoffwechselzustand, z.b. Adipositas, Magersucht, Diabetes, Typ I- oder Typ II-Diabetes;
(oo) Ulcus, z.B. Magen- oder Hautgeschwüre;
(pp) Trockener Haut;
(qq) Sjögren-Syndrom;
(rr) Zytokin-Sturm;
(ss) Gehörlosigkeit, Gehörverlust oder -störung;
(tt) Langsamem oder schnellem Stoffwechsel (d.h. überdurchschnittlich schnell bezogen auf Körpergewicht, Geschlecht und Alter des Probanden);
(uu) Empfängnisstörung, z.B. Unfruchtbarkeit oder geringe Fruchtbarkeit;
(vv) Ikterus;
(ww) Hautausschlag;
(xx) Kawasaki-Syndrom;
(yy) Borreliose;
(zz) Einer Allergie, z.B. Nuss-, Gras-, Pollen-, Staubmilben-, Katzen- oder Hundehaar- oder - Hautschuppenallergie;
(aaa) Malaria, Typhus, Tuberkulose oder Cholera;
(bbb) Depression;
(ccc) Geistige Behinderung;
(ddd) Mikrozephalie;
(eee) Mangelernährung;
(fff) Bindehautentzündung;
(ggg) Pneumonie;
(hhh) Lungenembolie;
(iii) Lungenhochdruck;
(jjj) Einer Knochenstörung;
(kkk) Sepsis oder septischem Schock;
(lll) Sinusitis;
(mmm) Streß (z.B. beruflich);
(nnn) Thalassämie, Anämie, Willebrand-Jürgens-Syndrom oder Hämophilie;
(ooo) Gürtelrose oder Herpesbläschen;
(ppp) Menstruation;
(qqq) Geringe Spermienzahl.

NEURODEGENERATIVE ODER ZNS-KRANKHEITEN ODER -ZUSTÄNDE ZUR BEHANDLUNG ODER VERHÜTUNG DURCH DAS VERFAHREN
In einem Beispiel ist die neurodegenerative bzw. ZNS-Krankheit oder -zustand aus der nachfolgenden Gruppe gewählt: M. Alzheimer, Geriopsychose, Down-Syndrom, M. Parkinson, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, diabetische Neuropathie, Parkinson-Syndrom, Huntington-Krankheit, Machado-Joseph-Krankheit, amyotrophe laterale Sklerose, diabetische Neuropathie und Creutzfeldt-Jakob-Krankheit. Die Krankheit ist z.B. M. Alzheimer. Die Krankheit ist z.B. Parkinson-Syndrom.
In einem Beispiel, wobei das erfindungsgemäße Verfahren an einem menschlichen oder tierischen Probanden zur Behandlung einer neurodegenerativen oder ZNS-Krankheit bzw. eines neurodegenerativen oder ZNS-Zustandes ausgeführt wird, verursacht das Verfahren die Herunterregulierung von Treg-Zellen beim Probanden, wodurch der Eintritt von von systemischen Monozyten abstammenden Makrophagen und/oder Treg-zellen über den Plexus choroideus in das Hirn des Probanden gefördert wird, wodurch die Krankheit bzw. der Zustand (z.B. M. Alzheimer) behandelt, verhütet oder deren Progression reduziert wird. Gemäß einer Ausführungsform verursacht das Verfahren einen Anstieg des IFN-gamma-Spiegels im ZNS (z.B. in Hirn und/oder ZSF) des Probanden. In einem Beispiel stellt das Verfahren Nervenfasern wieder her und/oder es reduziert die Progression von Nervenfaserschäden. In einem Beispiel stellt das Verfahren das Myelin der Nerven wieder her und/oder es reduziert die Progression von Nervenmyelinschäden. In einem Beispiel behandelt bzw. verhütet das erfindungsgemäße Verfahren eine Krankheit bzw. einen Zustand nach WO2015136541 und/oder das Verfahren kann zusammen mit einem beliebigen Verfahren nach WO2015136541 verwendet werden (der Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift gilt vollumfänglich als Bestandteil der vorliegenden Patentschrift, z.B. als Offenbarungsquelle für diese Verfahren, Krankheiten, Zustände und potentiellen Therapeutika, die an den Probanden verabreicht werden kann, um Behandlung und/oder Verhütung von neurodegenerativen und ZNS-Krankheiten und Zuständen zu bewirken, z.B. Wirkstoffe wie Immun-Checkpoint-Hemmer, z.B. anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-TIM3 oder sonstige dort offenbarte Antikörper).
KREBSERKRANKUNGEN ZUR BEHANDLUNG ODER VEHÜTUNG MIT DEM VERFAHREN
Zu den Krebserkrankungen, die behandelt werden können, gehören Tumoren, die nicht vaskularisiert sind oder keine erhebliche Vaskularisation aufweisen, sowie vaskularisierte Tumoren. Diese Krebeserkrankungen können nicht solide Tumoren (z.B. hämatologische Tumoren, z.B. Leukämien und Lymphome) umfassen, oder sie können solide Tumoren umfassen. Zu den Krebsarten, die mit der Erfindung behandelbar sind, gehören insbesondere Karzinom, Blastom und Sarkom sowie bestimmte Leukämien und lymphoide Malignome, gut- und bösartige Tumoren und Malognome, z.B. Sarkome, Karzinome und Melanome. Hierzu gehören auch Tumoren/Krebserkrankungen bei Erwachsenen sowie bei Kindern.
Hämatologische Krebserkrankungen sind Krebserkrankungen des Bluts oder des Knochenmarks. Als Beispiele hämatologischer (oder hämatogener) Krebserkrankungen seien insbesondere genannt: Leukämien, insbesondere akute Leukämien (z.B. akute lymphozytische Leukämie, akute myelozytische Leukämie, akute myeloische Leukämie und Myeloblasten, promyelozytische, myelomonozytische, monozytische und Erythroleukämie), chronische Leukämien (z.B. chronische myelozytische (granulozytische) Leukämie, chronische myeloische Leukämie und chronische lymphozytische Leukämie), Polycythemia vera, Lymphom, M. Hodgkin, Nicht-Hodgkin-Lymphom (indolente und hochgradige Formen), multiplee Myelom, M. Waldenström, Schwerkettenkrankheit, myelodysplastisches Syndrom, Haarzell-Leukämie und Myelodysplasie.
Solide Tumoren sind abnorme Gewebemassen, die normalerweise keine Zysten oder flüssigen Bereiche enthalten. Solide Tumoren können gut- oder bösartig sein. Die verschiedenen Arten der soliden Tumoren werden nach den Zellarten genannt, aus denen sie bestehen (z.B. Sarkome, Karzinome und Lymphome). Als Beispiele solider Tumoren wie z.B. Sarkome und Karzinome, seinen insbesondere genannt: Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom und andere Sarkome, Synoviom, Mesotheliom, Ewing-Sarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Kolonkarzinom, lymphoides Malignom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Leberzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, medulläres Schilddrüsenkarzinom, papilläres Schilddrüsenkarzinom, Phäochromozytome, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläre Adenokarzinome, medulläres Karzinom, Bronchialkarzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallengangskarzinom, Choriokarzinom, Wilmstumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumoren, Seminom, Blasenkarzinom, Melanom und ZNS-Tumoren (z.B. Gliom (z.B. Hirnstammgliom und Mischgliome), Glioblastom (auch Glioblastoma multiforme genannt), Astrozytom, ZNS-Lymphom, Germinom, Medulloblastom, Schwannom, Kraniopharyngeom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, Akustikusneurinom, Oligodendrogliom, Meningeom, Neuroblastom, Retinoblastom und Hirnmetastasen).
AUTOIMMUNKRANKHEITEN ZUR BEHANDLUNG ODER VEHÜTUNG MIT DEM VERFAHREN

• Akute disseminierte Enzephalomyelitis (ADEM)
• Akute nekrotisierende hämorrhagische Leukoenzephalitis
• M. Addison
• Agammaglobulinämie
• Alopecia areata
• Amyloidose
• Spondylitis ankylosans
• Anti-GBM/Anti-TBM-Nephritis
• Antiphospholipid-Syndrom (APS)
• Autoimmunes Angioödem
• Autoimmune aplastische Anämie
• Autoimmune Dysautonomie
• Autoimmune Hepatitis
• Autoimmune Hyperlipidämie
• Autoimmune Immundefizienz
• Autoimmune Innenohrkrankheit (AIED)
• Autoimmune Myokarditis
• Autoimmune Eierstockentzündung
• Autoimmune Pankreatitis
• Autoimmune Retinopathie
• Autoimmune thrombozytopenische Purpura (ATP)
• Autoimmune Schilddrüsenkrankheit
• Autoimmune Urtikaria
• Axonale & neuronale Neuropathien
• Balo-Krankheit
• M. Behҫet
• Bullöses Pemphigoid
• Kardiomyopathie
• Castleman-Syndrom
• Zöliakie
• Chagas-Krankheit
• Chronisches Müdigkeitssyndrom
• Chronic inflammatorisch demyelinisierende Polyneuropathie (CIDP)
• Chronisch rezidivierende multifokale Osteomyelitis (CRMO)
• Churg-Strauss-Syndrom
• Narbenpemphigoid/gutartiges Schleimhaut pemphigoid
• M. Crohn
• Cogan-Syndrom
• Kälteagglutininkrankheit
• Angeborener herzblock
• Coxsackie-Myokarditis
• CREST-Syndrom
• Essentielle gemischte Kryoglobulinämie
• Demyelinisierende Neuropathien
• Dermatitis herpetiformis
• Dermatomyositis
• Devic-Syndrom (Neuromyelitis optica)
• Diskoider Lupus
• Dressler-Syndrom;
• Endometriose
• Eosinophile Ösophagitis
• Eosinophile Fasziitis
• Erythema nodosum
• Experimentelle allergische Enzephalomyelitis
• Evans-Syndrom
• Fibromyalgie
• Alveolitis fibrosans
• Riesenzellarteritis (Temporalisarteritis)
• Riesenzellmyokarditis
• Glomerulonephritis
• Goodpasture-Syndrom
• Granulomatose mit Polyangiitis (GPA) (ehem. Wegener-Granulomatose)
• Morbus Basedow
• Guillain-Barre-Syndrom
• Hashimoto-Enzephalitis
• Hashimoto-Thyreoiditis
• Hämolytische Anämie
• Purpura Schönlein-Henoch
• Herpes gestationis
• Hypogammaglobulinämie
• Idiopathische thrombozytopenische Purpura (ITP)
• IgA-Nephropathie
• IgG4-Sklerosierungskrankheit
• Immunregulatorische Lipoproteine
• Einschlusskörpermyositis
• Interstitielle Zystitis
• Juvenile Arthritis
• Juveniler Diabetes (Type 1 -Diabetes)
• Juvenile Myositis
• Kawasaki-Syndrom
• Lambert-Eaton-Syndrom
• Leukozytoklastische Vaskulitis
• Lichen rubber planus
• Lichen sclerosus
• Conjunctivitis ligneosa
• Lineare IgA-Krankheit (LAD)
• Lupus (SLE)
• Borreliose, chronisch
• M. Meniere
• Mikroskopische Polyangiitis
• Sharp-Syndrom (MCTD)
• Ulcus Mooren
• Mucha-Habermann-Krankheit
• multiple Sklerose
• Myasthenia gravis
• Myositis
• Narkolepsie
• Neuromyelitis optica (Devic)
• Neutropenie
• Okulares Narbenpemphigoid
• Neuritis optica
• Palindromischer Rheumatismus
• PANDAS (Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus)
• Paraneoplastische zerebelläre Degeneration
• Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH)
• Parry Romberg-Syndrom
• Parsonnage-Turner-Syndrom
• Pars planitis (periphere Uveitis)
• Pemphigus
• Periphere Neuropathie
• Perivenöse Enzephalomyelitis
• Perniziöse Anämie
• POEMS-Syndrom
• Polyarthritis nodosa
• Typ I, II, & III polyglanduläre Autoimmunsyndromes
• Polymyalgia rheumatica
• Polymyositis
• Post-Myokardinfarkt-Syndrom
• Post-Perikardiotomie-Syndrom
• Progesteron-Dermatitis
• Primär biliäre Zirrhose
• Primär sklerosierende Cholangitis
• Psoriasis
• Psoriasisarthritis
• Idiopathische Lungenfibrose
• Pyoderma gangrenosum
• Erworbene isolierte aplastische Anämie
• Raynaud-Phänomen
• Reaktive Arthritis
• Algoneurodystrophie
• Reiter-Syndrom;
• Rezidivierende Polychondritis
• Restless-Legs-Syndrom
• Retroperitonealfibrose
• Rheumatisches Fieber
• Rheumatoide Arthritis
• Sarkoidose
• Schmidt-Syndrom
• Skleritis
• Sklerodermie
• Sjögren-Syndrom
• Spermien- & Hoden-Autoimmunität
• Stiff-Man-Syndrom
• Subakute bakterielle Endokarditis (SBE)
• Susac-Syndrom
• Sympathische Ophthalmie
• Takayasu-Arteritis
• Temporalisarteritis/Riesenzellarteritis
• Thrombozytopenische Purpura (TTP)
• Tolosa-Hunt-Syndrom
• Transverse Myelitis
• Typ-1-Diabetes
• Colitis ulcerosa
• Undifferenzierte Bindegewebserkrankung (UCTD)
• Uveitis
• Vaskulitis
• Vesikulobullöse Dermatose
• Weißfleckenkrankheit
• Wegener-Granulomatose (nunmehr Granulomatose mit Polyangiitis (GPA).

ENTZÜNDUNGSKRANKHEITEN ZUR BEHANDLUNG ODER VEHÜTUNG MIT DEM VERFAHREN

• M. Alzheimer
• Spondylitis ankylosans
• Arthritis (Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis (RA), Psoriasisarthritis)
• Asthma
• Atherosklerose
• M. Crohn
• Colitis
• Dermatitis
• Divertikulitis
• Fibromyalgie
• Hepatitis
• Reizdarmsyndrom (IBS)
• systemisher Lupus erythematodes (SLE)
• Nephritis
• M. Parkinson
• Colitis ulcerosa.

In einem Beispiel (z.B. beim erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem es um eine gemischte Bakterienpopulation geht) wird die Gattung oder Art der Wirtszelle aus den in der Tabelle 1 aufgeführten Gattungen und Arten gewählt. In Ausführungen der vorliegenden Erfindung ist die Cas (z.B. Cas-Nuclease wie z.B. Typ I-, II- oder III-Cas, z.B. Cas3 oder 9) eine Cas, die von Bakterien einer aus den Gattungen und Arten der Tabelle 1 gewählten Gattung oder Art umfasst ist, und wahlweise gehört auch die Wirtszelle (oder erste oder zweite Zelle) zu derselben Gattung bzw. Art. In einem Beispiel hiervon ist die Cas der Wirtszelle (oder der ersten oder zweiten Zelle) endogen, was bei vorliegenden Ausführungsformen, bei denen eine endogen Cas zur Modifikation einer Zielsequenz verwendet wird, nützlich ist. In diesem Fall kann der HM-Array mindestens eine Repeat-Nukleotidsequenz (z.B. DNA oder RNA) umfassen, die mindestens 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % Identität (oder 100 % Identität) mit einer Repeat-Sequenz der Zelle, Gattung oder Art aufweist, wobei die Cas mit der vom HM-Array codierten cRNA zusammenwirken kann, um mindestens eine Zielsequenz in der Zelle zu modifizieren. In einem Beispiel ist die Cas eine Typ I-Cas3 und wird mit einer Typ I-CASCADE verwendet, wobei Cas3 und CASCADE dem Wirt oder den ersten Zellen endogen sind oder vektorübertragen sind (d.h. dem Wirt oder den ersten Zellen exogen).
In einem Beispiel tötet das Verfahren selektiv erste Zellen in der Mikrobiota, ohne dabei auf zweite Zellen zu zielen, z.B. wobei die zweiten Zellen (a) zu einem mit dem Stamm der ersten Art verwandten Stamm gehören oder (b) zu einer Art gehören, die sich von der ersten Art unterscheidet und mit der ersten Art phylogenetisch verwandt ist, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine 16s ribosomale RNA codierende DNA-Sequenz aufweist, die mit einer 16s ribosomale RNA codierenden DNA-Sequenz der ersten Zellart bzw. des ersten Zellstammes zu mindestens 80 % identisch ist. Gemäß einer Ausführungsform gehören die ersten Zellen zu einer ersten Art, die aus der Tabelle 1 gewählt ist, und die zweiten Zellen gehören zu einer anderen Art, die aus der Tabelle 1 gewählt ist. In einem Beispiel gehören die Arten zu derselben Gattung oder unterschiedlichen Gattungen.
Es versteht sich, dass bestimmte vorliegend beschriebene Ausführungsformen ausschließlich zur Veranschaulichung dargestellt sind und nicht als Einschränkungen der Erfindung zu verstehen sind. Die Hauptmerkmale der Erfindung können bei verschiedenen Ausführungsformen eingesetzt werden, ohne über den Schutzumfang der Erfindung hinauszugehen. Der Fachmann erkennt zahlreiche Äquivalenten der vorliegend beschriebenen Verfahren, oder kann solche durch bloß routinemäßiges Recherchieren auffinden. Diese Äquivalenten gehören zum Schutzumfang der Erfindung und sind von den Patentansprüchen abgedeckt. Alle vorliegend erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen lassen den Kenntnisstand des Fachmannes auf dem erfindungserheblichen Gebiet erkennen. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sowie alle gleichwertigen US-Patentanmeldungen und - Patentschriften gelten auch ohne ausdrücklichen Einbeziehung als Bestandteile der vorliegenden Patentschrift. In Verbindung mit dem Begriff „umfassen“ in den Patentansprüchen und oder der Beschreibung kann die verwendung des unbestimmten Artikels „eins“ heißen, er ist aber auch mit der Bedeutung „mindestens eins“ o.ä. vereinbar. Die Verwendung des Begriffs „oder“ in den Patentansprüchen soll „und/oder“ heißen, sofern nicht ausdrücklich angegeben wird, dass er nur im alternativen Sinne gemeint ist oder die jeweiligen Alternativen einander gegenseitig ausschließen, obwohl der Offenbarungsgehalt Anhaltspunkte für eine Definition liefert, die sich nur auf Alternativen und „und/oder“ bezieht. Vorliegend ist unter „etwa“ ein Wert zu verstehen, der die inhärente Fehlabweichung des zur Ermittlung des Werts verwendeten Geräts oder Verfahrens oder die unter den Probanden vorhandene Variation umfasst.
Im vorliegenden Sinne sind die Begriffe „umfassen“ (in jeder Form, z.B. „umfasst“ und „umfassend“), „aufweisen“ (in jeder Form, z.B: „weist auf“ und „aufweisend“), „enthalten“ (in jeder Form, z.B. „enthält“ und „enthaltend“) offen und inklusiv zu verstehen; sie schließen nicht aufgezählten zusätzlichen Elemente oder Verfahrensschritte nicht aus.
Der Begriff „oder Kombinationen davon“ o.ä. bezieht sich im vorliegenden Sinne auf alle Permutationen und Kombinationen der vor dem Begriff aufgezählten Gegenstände. Bspw. soll „A, B, C oder Kombinationen davon“ mindestens eines von: A, B, C, AB, AC, BC oder ABC mit einschließen, und sofern in einem bestimmten Zusammenhang die Reihenfolge von Beduetung ist, auch BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC oder CAB. Ausdrücklich eingeschlossen sind in diesem Beispiel ferner Kombinationen, die Wiederholungen mindestens eines der Gegenstände oder Begriffe enthalten, so z.B. BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB usw. Der Fachmann versteht, dass die Anzahl der Gegenstände bzw. Begriffe in einer beliebigen Kombination typischerweise keiner Grenze unterliegt, sofern sich nicht etwas anderes aus dem Zusammenhang ergibt.
Ein beliebiger Teil der vorliegenden Erfindung lässt sich in Verbindung mit einem beliebigen anderen Teil der Erfindung lessen, sofern sich nicht aus dem Zusammenhang etwa anderes ergibt.
Alle vorliegend offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und/oder Verfahren können anhand des vorliegenden Offenbarungsgehalts ohne unzumutbares Experimentieren hergestellt und ausgeführt werden. Obgleich die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden sind, ist dem Fachmann klar, dass die Zusammensetzungen und/oder Verfahren und die Schritte und Schrittfolgen des erfindungsgemäßen Verfahrens variiert werden können, ohne das Konzept oder den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen. Alle ähnlichen Ersatzmöglichkeiten und Modifikationen, die für den Fachmann erkennbar sind, gelten von dem Schutzumfang und Konzept der Erfindung, wie sie in den beiliegenden Patentansprüchen definiert ist, als mit umfasst.
Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden nicht einschränkenden Beispielen näher beschrieben.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Spezifische Wachstumshemmung einer Bakterienpopulation einer Mikrobiota unter Ausnutzung von wilder endogener Cas
Materialien und Methoden
Stämme
In diesem Beispiel sowie den Beispielen 2 und 3 wurden folgende Stämme verwendet: E. coli MG1655, E.coli TOP10, Streptococcus thermophilus LMD-9 (ATCC BAA-491, Manassas, Virginia, USA), Streptococcus thermophilus DSM 20617(T) (DSMZ, Braunschweig, Deutschland), Lactococcus lactis MG1363 and Streptococcus mutans Clarke 1924 DSM 20523 (DSMZ, Braunschweig, Deutschland).
Während der Auswahl der Medien und der Prüfung der genetischen Konstrukte wurden verschiedene Streptococci-Stämme verwendet. Streptococcus thermophilus LMD-9 (ATCC BAA-491) and Escherichia coli TOP10 wurden aufgrund ihrer kompatiblen Wachstumsbedingungen in Betracht gezogen. Alle Stämme wurden in Todd-Hewitt-Brühe (TH) (T1438 Sigma-Aldrich) unter aeroben Bedingungen und bei 37 °C kultiviert, sofern nicht etwas anderes angegeben wird. Die Stämme wurden bei -80 °C in 25 % Glyzerin gelagert.
Differentielle Wachstumsmedien
Alle Stämme wurden 20 h lang bei 37 °C auf TH-Medien gezüchtet. Das selektive Medium für S. thermophilus war dabei TH-Medium, ergänzt um 3 g 1^-1 2-Phenylethanol (PEA). Den Medien wurde PEA hinzugegeben und sie wurden 15 min lang bei 15 psi und 121 °C autoklaviert. Agarplatten wurden unter Zugabe von 1,5 % (Gew./Vol.) Agar zu den entsprechenden Medien präpariert. Sofern dies zur Auswahl oder zur Aufrechterhaltung der Plasmide erforderlich war, wurde 30 µg ml^-1 Kanamycin für beide S. thermophilus-Stämme sowie E.coli verwendet, sowie 500 µg ml^-1 für S. mutans.
In einigen Fällen ist je nach Stamm und Plasmid eine längere Inkubation von bis zu 48 h erforderlich, um Wachstum auf mit PEA ergänzten Medien zu sehen. Zur Kontrolle der Viabilität der eingesetzten Organismen muss ein Kontroll-TH-Agar parallel bearbeitet werden.
Klonen
Bei allen Subklonierungsverfahren wurde E. coli (One Shot® ThermoFischer TOP10 Chemically Competent cells) verwendet. PCR wurde mit Phusion-Polymerase durchgeführt. Alle PCR-Produkte wurden nach dem Protokoll des Herstellers mit Nucleospin Gel und PCR Clean-up von Macherey-Nagel gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden mit dem Restriktionsenzym DpnI in 1X FD-Puffer mit 1 µl Enzym in einem Gesamtvolumen von 34 µl verdaut. Die verdaute Reaktion wurde noch einmal nach dem Protokoll des Herstellers mit Nucleospin Gel und PCR Clean-up von Macherey-Nagel gereinigt. Gibson-Assembly wurde an 10 µl Reaktionen nach dem Protokoll des Herstellers (NewEngland Biolab) durchgeführt.
Plasmid-DNA wurde mit Qiagen-Sets nach der Gebrauchsanweisung des Herstellers präpariert. Zu den Modifikationen für die grampositiven Stämme gehörte das Züchten von Bakterien in einem um 0,5 % Glycin und Lysozym ergänzten Medium, um die Zelllyse zu unterstützen.
Umwandlung
Elektrokompetente E. coli-Zellen und Umwandlung
Handelsübliche elektrokompetente Zellen wurden beim Klonen und den Versuchen verwendet (One Shot® ThermoFischer TOP10 Chemically Competent E. coli). Die Elektroporation wurde mit den Standardeinstellungen durchgeführt: 1800 V, 25 µF und 200 Ω mit einem Electro Cell Manipulator (BTX Harvard Apparatus ECM630). Nach dem Impuls wurde 1 ml LB-SOC-Medium hinzugegeben und die Zellen wurden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die umgewandelten Zellen wurden in LB-Agar mit 50 µg ml^-1 Kanamycin plattiert.
Präparation der elektrokompetenten S. thermophilus-Zellen
Gefolgt wurde einer modifizierten Version des Elektroporationsprotokolls nach Somkuti & Steinberg, 1988. Eine Übernachtkultur von Streptococcus thermophilus in TH-Brühe, ergänzt um 40 mM DL-Threonin (T8375 Sigma-Aldrich), wurde 100-fach in 5 ml desselben Mediums verdünnt und auf eine OD600 zwischen 0,3 - 0,5 (etwa 2,5 h nach der Impfung) gezüchtet. Die Zellen wurden durch 10 min Zentrifugation bei 10.000 x g bei 4°C gesammelt und dreimal mit 5 ml eiskaltem Waschpuffer (0,5 M Saccharose + 10 % Glyzerin) gewaschen. Nach dem Waschen der Zellen wurden sie auf eine OD600 von 15 - 30 in Elektroporationspuffer suspendiert (0,5 M Saccharose, 10 % Glyzerin und 1 mM MgCl₂). Die Zellen im Elektroporationspuffer können bis zum Gebrauch (binnen 1 h) bei 4 °C gehalten werden, oder mit einer Aliquote von 50 µl in Eppendorf-Röhrchen in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zum späteren Gebrauch bei -80 °C gelagert werden.
Elektroporation S. thermophilus-Zellen
1 µl gereinigte Plasmid-DNA wurde zu 50 µl der Zellsuspension hinzugegeben und eine Elektroporation wurde in vorgekühlten Elektroporationsküvetten mit Spalten von 2 mm durchgeführt. Die Elektroporationseinstellungen waren 2.500 V, 25 µF und 200 Ω mit einem Electro Cell Manipulator (BTX Harvard Apparatus ECM630). Unmittelbar nach dem elektrischen Impuls wurde den Zellen 1 ml TH-Brühe hinzugegeben, und die Suspension wurde 10 min lang auf Eis gehalten, danach wurden die Zellen 3 h lang bei 37 °C inkubiert. Nachdem zur Expression des Resistenzgens Zeit gelassen wurde, wurden die Zellen auf TH-Agarplatten plattiert, die 30 µg ml^-1 Kanamycin enthielten. Je nach Konstrukt waren Kolonien zwischen 12 und 48 h Inkubation bei 37 °C sichtbar.
Konstruktion des XylS-Plasmids
Alle bei der vorliegenden Arbeit verwendeten Plasmide basierten auf pBAV1K-T5, einem Expressionsvektor mit breitem Wirtsspektrum, der vom kryptischen Plasmid pWV01 aus Streptococcus cremoris abstammt (Bryksin & Matsumura, 2010); das Rückgrat wurde mit verstärkt, die Überhänge zum Zusammenbau mit den anderen Fragmenten im Verfahren nach Gibson enthalten.
Das mit Xylose induzierbare System wurde durch Klonen des Promoters gyrA vor dem Xy1R-Repressor konstruiert ( ). Der XylR-Repressor wurde aus dem Bacillus Subtilis-Stamm SCK6 (Zhang et al. 2011) mit einem Rückwärtsprimer, der einen Überhang zwecks Gibson-Assembly enthält, und einem Vorwärtsprimer, der ein zur Einführung des gyrA-Promoters (Xie et al. 2013) und des entsprechenden Überhangs zum Zusammenbau mit dem pBAV1KT5-Rückgrat verwendetes Ultramer ist, verstärkt. Das resultierende Fragment wurde von einem aus pCL002 (unveröffentlichte Arbeit) verstärkten mCherry mit einem Ultramer flankiert, das den hybriden Promoter Pldha+PxylA umfasst (Xie et al. 2013). Die drei resultierenden PCR-Produkte wurden in einem Gibson Master Mix® (NewEngland Biolab) nach der Gebrauchsanweisung des Herstellers zusammengebaut. Schließlich wurde das Produkt in E. coli TOP10 elektrokompetenten Zellen umgewandelt. Siehe .
Auslegung und Konstruktion des CRISPR-Array-Plasmids
Streptococcus thermophilus weist 4 unterschiedliche CRISPR-Systeme auf (Sapranauskas, et al. 2011); für die vorliegende Arbeit wurde das Typ II-CRISPR1-System (ST1-CRISPR) ausgewählt. Die Auslegung der Zielsequenz basierte dabei auf der verfügbaren Genomsequenz von LMD-9 (GenBank: CP000419.1). Der ST1-CRISPR-Array wurde derart ausgelegt, dass er nur die Repeats und Spacer des CRISPR-Arrays unter einem mit Xylose induzierbaren Promoter enthielt (Xie et al. 2013), gefolgt durch die entsprechende tracrRNA unter einem starken konstitutiven Promoter für Streptococci spp. (Sorg et al. 2014) ( , SEQ ID Nr:).
Die tracrRNA spielt eine Rolle bei der Heranreifung der crRNA, und sie wird von der endogenen RNase III von S. thermophilus verarbeitet, wobei sie einen Komplex mit crRNA eingeht. Dieser Komplex wirkt als Führung Endonuclease ST1-Cas9 (Horvath & Barrangou, 2010). Nach der Transkription des synthetischen Arrays aus dem mit Xylose induzierbaren Promoter wird er von den endogenen Cas9 und RNAsen zu einer funktionellen gRNA verarbeiten. Der gRNA/Cas9-Komplex wird einen doppelsträngigen Bruch am Zielort hervorrufen.
Die Auslegung des Arrays benutze 2 spezifische Zielsequenzen mit hohem GC-Gehalt und einen reduzierten tracrRNA-Anteil (d.h. weniger al seine komplette tracrRNA-Sequenz); man hat nahegelegt, dass dies für die korrekte Heranreifung der crRNA nicht erforderlich ist (Horvath & Barrangou, 2010).
Die 2 Ziele ware nein essentielles Gen (DNA-Polymerase III Untereinheit alpha) und ein Antibiotikaresistenzgen (tetA-ähnliches Gen) (SEQ ID NR:).
Zur Verstärkung des pBAV1KT5-XylR-PldhA-Rückgrats wurden Primer verwendet. Der CRISPR-Array gBlock und das Rückgrat mit Überhängen wurden in einem Gibson Master Mix ® nach der Gebrauchsanweisung des Herstellers (NewEngland Biolabs) zusammengebaut. Schließlich wurde das Produkt in E. coli TOP10 elektrokompetenten Zellen umgewandelt.
Charakterisierung des mit Xylose induzierbaren Systems in Streptoccocus thermophilus LMD-9
Stationärphasen-Übernachtkulturen wurden 1 100 in Th-Brühe mit entsprechenden Antibiotikum verdünnt. Mid-log-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an D-(+)-Xylose induziert (0, 0,001, 0,01, 0,1, 0,5 und 1 % Gew./Vol.) und die Zellkulturen wurden entweder unmittelbar im Medium vermessen, um das Ausmaß der Autofluoreszenz des Mediums zu bewerten, auf der Zellsuspension oder dem Suspensionspuffer vermessen (PBS-Puffer). 20µl Proben der Zellkulturen wurden 1/10 auf PBS-Puffer auf 96-muldigen Platten mit flachem Boden verdünnt. Die Fluoreszenz der Zellsuspensionen bzw. Medien wurde auf einem Plattenlesegerät abgelesen. Die Fluoreszenz von mCherry wurde mit einer Anregungswellenlänge von 558 nm und Emission bei 612 nm gemessen. Die Absorption der resuspendierten zellen wurde bei OD 600 nm gemessen. Mindestens drei unabhängige biologische Replikate wurden für jeden Versuch erstellt.
Aktivation eines CRISPR-Arrays in S. thermophilus
S. thermophilus LMD-9 und E. coli TOP10, beide mit dem Plasmid, das den CRISPR-Array enthält, der auf DNA-Polymerase III und tetA von S. thermophilus zielt, wurden über Nacht in 3 ml Kulturen gezüchtet, die zur Aufrechterhaltung der Plasmide um 30 µg ml^-1 Kanamycin ergänzt waren. Am nächsten Tag wurden 96-muldige Tiefmuldenplatten mit 500 µl 1/100 Übernachtkultur in frischem TH-Medium geimpft, das um 30 µg ml^-1 Kanamycin ergänzt war. Mid-log-Zellkulturen wurden mit 1 % Xylose induziert. Die Tötungswirkung wurde auf S. thermophilus und E. coli allein getestet. Für jeden geprüften Stamm und Zustand wurde eine negative Kontrolle ohne Xylose gehalten. Die zellen wurden bis ~OD 0,5 gezüchtet und dann 10-fach seriell in TH-Medien verdünnt; unter Verwendung eines 96-muldigen Replikators (Mettler Toledo Liquidator™ 96) wurden Tropfen von 5 µL Volumen auf Platten mit TH-Agar und TH-Agar, ergänzt um g 1^-1 PEA, getropft. Die Platten wurden 24 h lang bei 37 °C inkubiert und die keimbildenden Einheiten (KBE) wurden aus dreifachen Messungen berechnet.
Ergebnisse
Wachstumsbedingungen und selektive Medien
Zunächst versuchten wir, die bakteriellen Stämme und das Züchtungsprotokoll festzulegen, die für alle Stämme, die wir bei den Kokultivierungsversuchen zu verwenden gedachten, das Wachstum unterstützen würden. Hierbei verwendeten wir den S. thermophilus-Stamm LMD-9, der ähnliches Wachstum wie E. coli in TH-Brühe bei 37°C ( ) unterstützen konnte.
Es ist wichtig, die unterschiedlichen Bakterien einer Mischkultur zu unterscheiden, um eine Zellzahl der jeweiligen Arten zu ermitteln. Mit MacConkey-Agar ist es möglich, E. coli selektiv zu züchten, es gibt jedoch kein spezifisches Medium für die selektive Züchtung von S. thermophilus. PEA-Agar ist ein selektives Medium, das zur Isolation von grampositiven Stämmen (S. thermophilus) von gramnegativen Stämmen (E. coli) verwendet wird. Außerdem stellten wir fest, dass unterschiedliche PEA-Konzentrationen das Wachstum der anderen grampositiven Stämme teilweise hemmen, was eine Auswahl zwischen den anderen bei der vorliegenden Arbeit verwendeten grampositiven Bakterien ermöglicht ( ). Es stellte sich heraus, dass 3g/l^-1 PEA S. thermophilus LMD-9 selektiv züchten und dabei das Wachstum von E. coli einschränken konnte.
Auslegung und Validierung des induzierbaren Systems
Ein Induktionssystem für Streptococcus spp. wurde vorher aufgrund des Xylose-Operons von Bacillus megaterium ( ) entwickelt, indem eine heterologe Xylose-Induktionskassette (Xyl-S) geschaffen wurde. Die xylR- und xylA-Promoter wurden durch die konstutitv exprimierten Promoter gyrA bzw. ldh von S. mutans ersetzt. Diese Expressionskassette für Streptococcus spp. zeigte Unterschiede hinsichtlich Empfindlichkeit und Expressionsgrade zwischen den unterschiedlichen Arten, das System wurde bei S. thermophilus jedoch nicht getestet (Xie et al. 2013). Deshalb versuchten wir zunächst, die Xylose-Induktionskassette by S. thermophilus zu validieren.
Eine alternative Version der Induktionskassette wurde konstruiert, wobei nur der xylR-Promoter durch den gyrA-Promoter von S. mutans ersetzt wurde und der endogene Promoter xylA von B. megaterium xylA promoter unberührt blieb. Bei der Auslegung des mit Xylose induzierbaren zogen wir beide Versionen des induzierbaren Promoters in Betracht, und zwar den natürlichen PXylA-Promoter, der bei B. megaterium zu finden ist, und einen hybriden Promoter des hochgradig konservierten Promoters Pldha, der mit den Repressor-Bindungsstellen des PxylA-Promoters fusioniert war ( ). Berichten zufolge können nur wenige Streptococcus spp. Xylose verstoffechseln, also ist mit dem Vorhandensein einer regulatorischen Maschinerie zur Erkennung des xylA-Promoters bei den anderen Streptococcus spp. eher nicht zu rechnen. Deshalb konstruierten wir beide Xylose-Induktionssysteme, testeten aber nur die Induzierbarkeit von mCherry mit dem Pldha+XylA-System.
Zur Bestimmung der mit mCherry induzierbaren Expression durch Xylose wurden mid-logzellkuluren mit dem Plasmid (pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA) mit unterschiedlichen Xylosekonzentrationen induziert. Sechs stunden nach der Induktion maßen wir die mCherry-Fluoreszenz der Kulturen, wobei wir bei den Zellen, die das Plasmid trugen, erheblich höhere Expressionsgrade beobachteten ( ). Hierbei ist anzumerken, dass das System selbst bei den Kulturen, denen keine Xylose hinzugegeben wurde, einen erheblichen basalen Expressionsgrad zeigte. Das heißt, dass das System „undicht“ ist, und im Zusammenhang mit dem Tötungsarray kann dies schon vor der Induktion des Systems mit Xylose zum Zelltod führen. Im weiteren Verlauf dieser Studie verwendeten wir jedoch beide Versionen des Plasmids (pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA und pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA).
Auslegung des CRISPR/CAS9-Arrays
Um zu ermitteln, ob die genomischen Zielungs-Spacer in einem CRISPR-Array bei S. thermophilus LMD-9 den Zelltod verursachen können, fügten wir den von uns ausgelegten CRISPR-Array in die beiden bereits konstruierten, mit Xylose induzierbaren Systeme ein (pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA und pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA). Bei diesen Plasmiden ersetzten wir mCherry durch den gBlock, der den CRISPR-Array enthielt ( ). Es wurde erwartet, dass die Variante mit dem Pldha+XylA-Promoter starker ware und eine höhere basale Aktivität aufweisen würde als der PxylA (Xie et al. 2013).
Hemmung des bakteriellen Populationswachstums mit endogener Cas9
Nach der Konstruktion der Plasmide in E. coli wandelten wir die Plasmide in S. thermophilus um. Hierdurch konnten wir ermitteln, ob wir bei einer konkreten Bakterienart den Zelltod verursachen konnten. Interessant war, dass die bakterielle Populationsgröße beim Wirt (angedeutet durch Züchten von Bakterien und Zählen der Koloniezahlen auf Agarplatten) bei S. thermophilus, das dem Plasmid ausgesetzt wurde, das den starken hybriden Pldh+XylA-Promoter enthielt, um ein 10-faches kleiner war als im Falle von S. thermophilus, der dem Plasmid ausgesetzt wurde, das den normalen schwachen PxylA-Promoter enthielt ( ; Kolonien mit starker Array-Expression gegenüber 556 Kolonien mit schwacher Array-Expression, 10,7-facher Unterschied), wobei die 2 Stämme parallel unter Verwendung derselben Charge von elektrokompetenten S. thermophilus-Zellen umgewandelt worden waren. Aus unserer sicht lässt dies schließen, dass das Plasmid, das den auf S. thermophilus-Gene zielenden CRISPR-Array trägt, mit der endogenen Cas-Nuclease und RNase III die Zellen töten kann, wodurch das Populationswachstum um ein 10-faches gehemmt wird.
Wir erwarten, dass eine schwache Array-Expression bei Wirtszellen, die durch das den PxylA-Promoter umfassende Plasmid umgewandelt wurden, zu einem bestimmten Ausmaß an Zelltötung führte, wenngleich überaus weniger als im Falle des Plasmids mit dem starken Promoter. Wir erwarten, dass eine Hemmung des Populationswachstums, die umfangreicher ist als die beobachtete 10-fache Hemmung, festzustellen wäre, wenn ein Vergleich der Aktivität der starken Array-Expression mit S. thermophilus angestellt würde, das keinem Array codierenden Plasmid ausgesetzt worden ist (z.B. Bakterien, die unmittelbar aus Darmflora isoliert wurden). Wir glauben also, dass die Expression von Arrays (oder einzelner gRNA) bei Wirtszellen zur Ausnutzung der endogenen Cas-Nuclease nützlich ist, um eine wirksame Wachstumshemmung bei Zielwirtszellen n den vorliegend beschriebenen Umwelt-, medizinischen und sonstigen Zusammenhängen zu gewährleisten. Eine gemeinsame Antibiotikagabe könnte auch nützlich sein, um die Wachstumshemmung zu verstärken, und zwar v.a. dann, wenn auf mindestens ein Antibiotikaresistenzgen gezielt wird.
Diskussion und Ausblick
Bei dieser Studie versuchten wir, einen CRISPR-Array auszulegen, um S. thermophilus mit dem endogenen Cas9-System spezifisch zu töten. Um das Tötungssignal steuern zu können, versuchten wir, ein induzierbares System anzuwenden, das auf S. thermophilus anwendbar ist. Das mit Xylose induzierbare XylR-System aus B. megaterium wurde bereits auf S. mutans (Xie, 2013) aber nicht auf S. thermophilus angewendet. In dieser Studie konnten wir die Funktionsfähigkeit des xylR-Induktionssystems unter Verwendung des ausgelegten XylR-mCherry-Pldha-Kreislaufs bei S. thermophilus nachweisen. Wir haben dabei festgetstellt, dass 0,1 % Gew./Vol. ausreicht, um das XylR-System bei S. thermophilus voll zu induzieren ( ).
Um bei der Kokultivierung von S. thermophilus und E. coli die Mengen beobachten zu können, stellten wir fest, dass die Ergänzung der Kulturmedium um 3 g 1^-1 PEA selektives Wachstum von S. thermophilus ermöglicht und dabei das Wachstum von E. coli einschränkt ( ).
Ein ST1-CRISPR-Array, der auf die DNA-Polymerase III-Untereinheit alpha und ein tetA-ähnliches Gen im Genom von S. thermophilus LMD-9 zielt, wurde dem mit Xylose induzierbaren Promoter unterstellt (Xie et al., 2013). Das Zielen auf diese Regionen sollte zu einem doppelsträngigen Bruch führen und so die Viabilität von S. thermophilus beschränken ( ). Da der gentechnisch erzeugte Array darauf ausgelegt war, auf das S. thermophilus-Genom unter Verwendung der endogenen CRISPR/Cas-Maschinerie zur Verarbeitung des codierten CRISPR-Arrays zu zielen, wird davon ausgeganten, dass der Array keinen Einfluss auf das Wachstum nicht verwandter Stämme wie z.B. E. coli ausübt; es konnten sogar ähnliche Ziele auf dessen Genom gefunden werden. Dies wurde bei einer gemischten Bakterienpopulation (die Aspekte einer menschlichen Mikrobiota simulierte) erfolgreich getestet, wie im Beispiel 3 erläutert.
Der Nachweis der Fähigkeit, das Wachstum der Wirtszellen auf einer Oberfläche zu hemmen, ist wichtig und wünschenswert bei Ausführungsformen, bei denen die Erfindung zu Behandlung oder Verhütung von Krankheiten bzw. Zuständen bestimmt ist, die von Mikrobiota bei einem menschlichen oder tierischen Probanden vermittelt oder hervorgerufen werden, wie vorliegend beschrieben. Diese Mikrobiota befinden sich typischerweise im Kontakt mit einem Gewebe des Probanden (z.B. Bauch, Gewebe), und deshalb vermuten wir, dass der Nachweis der Fähigkeit, das Wachstum einer Bakterienart einer Mikrobiota auf einer Oberfläche (am Beispiel von Streptococcus) für diesen Nutzen spricht.
BEISPIEL 2: Hemmung des bakteriellen Populationswachstums konkreter Mikrobiota bei unterschiedlichen Stämmen
Im Beispiel 1 wurde die spezifische Wachstumshemmung von Streptococcus thermophilus LMD-9 nachgewiesen. Hier wird nachgewiesen, dass eine Wachstumshemmung auch bei einem zweiten Stamm erreichbar ist: Streptococcus thermophilus DSM 20617. Die im Beispiel 1 verwendeten Methoden wurden deshalb auf letzteren Stamm angewendet (wobei aber das selektive Medium für S. thermophilus DSM 20617 ein TH-Medium war, das um 2,5 g 1^-1 2-Phenylethanol (PEA) ergänzt war).
Streptococcus thermophilus DSM 20617, der mit den Plasmiden des CRISPR-Arrays umgewandelt wurden, wurden zur Rückgewinnung in flüssigen Medien 3 h lang bei 37 °C inkubiert, was die Expression einer Kanamycinresistenz ermöglichen sollte. Nach einer Erholungszeit wurden die Zellen in unterschiedlichen Auswahlmedien in Gegenwart von 1 % Xylose plattiert, um den Zelltod zu induzieren, sowie ohne Xylose als Kontrolle ( ). Klar ist, dass: (1) durch die Induktion mit Xylose das Wachstum von S. thermophilus gehemmt werden kann (rund 10-fach beim „starken“ Promoter-Plasmid gegenüber Kontrolle), (2) das „starke“ System (pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA) zu mehr Wachstumsreduzierung führt als das „schwache“ System (pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA).
BEISPIEL 3: Selektive Hemmung des bakteriellen Populationswachstums bei einem gemischten Konsortium aus unterschiedlichen Mikrobiota-Arten
Als nächstes führten wir den Nachweis einer selektiven Wachstumshemmung einer konkreten bakteriellen Art bei einer gemischten Population aus drei Arten. Dazu wählten wir Arten aus, die in der Darmflora von Menschen und Tieren zu finden sind (S thermophilus DSM 20617(T), Lactobacillus lactis und E. coli). Wir nahmen zwei grampositive Arten auf (S. thermophilus und L. lactis), um zu sehen, ob dies die Fähigkeit zum selektiven Töten der ersteren Art beeinflussen würde; ferner wurde zur Erhöhung der Schwierigkeit (und zur besseren Simulation von Situaitonen in Mikrobiota) L. lactis ausgewählt, da es sich hierbei um eine mit S. thermophilus phylogenetisch verwandte Art handelt (was an der hohen 16s rRNA-Sequenzidentität zwischen den beiden Arten zu erkennen ist). S. thermophilus und L. lactis sind beide Firmicutes. Um eine Mikrobiota zu simulieren, wurde außerdem eine menschliche kommensale Darmart (E. coli) aufgenommen.
Materialien & Methoden
Verwendet wurden die im Beispiel aufgeführten Methoden (wobei aber das selektive Medium TH-Medium war, das um 2,5g 1^-1 2-Phenylethanol (PEA) ergänzt war).
Präparation der elektrokompetenten L. Lactis-Zellen
Übernachtkulturen von L. lactis in TH-Medium, das um 0,5 M Saccharose und 1% Glycin ergänzt war, wurden 100-fach in 5 ml desselben Mediums verdünnt und bei 30 °C auf eine OD600 zwischen 0,2 - 0,7 gezüchtet (etwa 2 h nach der Impfung). Die Zellen wurden 5 min lang bei 7000 x g bei 4°C gesammelt und dreimal mit 5 ml eiskaltem Waschpuffer (0,5 M Saccharose + 10% Glyzerin) gewaschen. Nach dem Waschen der Zellen wurden sie auf eine OD600 von 15 - 30 in Elektroporationspuffer suspendiert (0,5 M Saccharose, 10 % Glyzerin und 1 mM MgCl₂). Die Zellen im Elektroporationspuffer wurden bis zum Gebrauch (binnen 1 h) bei 4 °C gehalten, oder mit einer Aliquote von 50 µl in Eppendorf-Röhrchen in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zum späteren Gebrauch bei -80 °C gelagert.
Die Elektroporationsbedingungen für alle Arten entsprechen der Beschreibung im Beispiel 1.
Aktivation des CRISPR-Arrays: Konsortiumsversuche
S. thermophilus DSM 20617, L. lactis MG1363 und E. coli TOP10 wurden mit dem Plasmid genetisch umgewandelt, das den CRISPR-Array enthielt, der auf die DNA-Polymerase III und tetA von S. thermophilus zielte. Nach der Umwandlung wurden alle Zellen allein und in Kokultur 3 h lang bei 37 °C gezüchtet, wobei man sie erholen ließ, um die im Plasmid codierte Antibiotikaresistenz entwickeln zu können. Wir entschieden uns, die Transformationseffizienz als Ablesung der von CRISPR codierten Wachstumshemmung zu verwenden. Also wurden die Kulturen nach der Erholung der Zellen plattiert in TH-Medium, TH, ergänzt um PEA, und MacConkey-Agar, die alle um Kanamycin ergänzt waren, und mittels 1 % Xylose induziert.
Ergebnisse
Phylogenetische Distanz zwischen L. lactis, E. coli und S. thermophilus
Die berechnete Sequenzähnlichkeit der 16s rRNA codierenden DNA-Sequenz von S. thermophilus und L. lactis wurde als 83,3 % ermittelt. Die nachfolgenden 16s-Sequenzen wurden dabei verwendet: E. coli: AB030918.1, S. thermophilus: AY188354.1, L. lactis: AB030918. Die Sequenzen wurden mit einer Nadel (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html) mit folgenden Parametern ausgerichtet: -gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair - snucleotide1 -snucleotide2. zeigt den ML-Stammbaum von 16S-Sequenzen aus S. thermophilus, L. lactis und E. coli.
Wachstumsbedingungen und selektive Medien
S. thermophilus und L. lactis werden häufig in Kombination mit zahlreichen fermentierten Nahrungsmitteln und Joghurt benutzt. Wir wählten diese Stämme aus, da allgemein bekannt ist, dass sie Darmmikroben sind, die eine enge Assoziation mit dem Wirt binden, und frühere Charakterisierungen der 16s rRNA-Region von S. thermophilus und L. lactis haben gezeigt, dass diese Organismen phylogenetisch nah verwandt sind (Ludwig et al., 1995). Parallel dazu bewerteten wir auch das Wachstum von E. coli für unsere Kokulturversuche mit gemischten Populationen, da dieser Organismus ebenfalls in Darmmikrobengemeinschaften häufig anzutreffen ist. Zunächst versuchten wir, die bakteriellen Stämme und das Züchtungsprotokoll festzulegen, die für alle Stämme, die wir bei den Kokultivierungsversuchen zu verwenden gedachten, das Wachstum unterstützen würden. Dabei stellten wir fest, dass alle Stämme das Wachstum in TH-Brühe bei 37 °C unterstützen konnten ( ).
Es ist wichtig, die unterschiedlichen Bakterien einer Mischkultur zu unterscheiden, um eine Zellzahl der jeweiligen Arten zu ermitteln. Mit MacConkey-Agar ist es möglich, E. coli selektiv zu züchten, es gibt jedoch kein spezifisches Medium für die selektive Züchtung von S. thermophilus. PEA-Agar ist ein selektives Medium, das zur Isolation von grampositiven Stämmen (S. thermophilus) von gramnegativen Stämmen (E. coli) verwendet wird. Außerdem können unterschiedliche PEA-Konzentrationen das Wachstum der unterschiedlichen grampositiven Arten und Stämme teilweise hemmen, was eine Auswahl zwischen den anderen bei dieser Arbeit verwendeten grampositiven Bakterien ermöglicht. Es stellte sich heraus, dass 2,5 g/l^-1 PEA S. thermophilus selektiv züchten und dabei das Wachstum von L. lactis und E. coli einschränken konnte.
Alle Stämme wurden mit einem Plasmid umgewandelt, das das Vektor-Rückgrat von pBAV1KT5 verwendete, das einen Kanamycin-Selektionsmarker aufweist; dabei stellten wir fest, dass die Verwendung von Medien, die mit 30 µg ml^-1 Kanamycin ergänzt waren, ausreichte, um die Zellen zu züchten und dabei das Plasmid zu erhalten.
Umwandlung & selektive Wachstumshemmung bei einer gemischten Population
Wir wandelten S. thermophilus, L. lactis und E. coli mit einem Plasmid um, das den CRISPR-Array enthielt, und kultivierten sie in einem Konsortium aus allen in gleichen Anteilen kombinierten Bakterienarten, was es uns ermöglichen sollte zu ermitteln, ob wir gerade bei S. thermophilus den Zelltod verursachen konnten. Wir wandelten dabei alle Arten entweder mit dem pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA- oder pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA-Plasmid um.
zeigt die selektive Wachstumshemmung von S. thermophilus in Kokultur mit E. coli, L. lactis und S. thermophilus, die entweder das pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA- oder das pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA-Plasmid enthält. Es wird kein Wachstumsunterschied festgestellt zwischen E. coli, der das pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA- oder das pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA-Plasmid enthält (mittlere Spalte). S. thermophilus (selektiv gezüchtet auf TH-Agar, das um 2,5 gl^-1 PEA ergänzt ist, letzte Spalte) zeigt jedoch erwartungsgemäß eine Abnahme der Umwandlungseffizienz zwischen dem pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA- (stark) oder dem pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA +XylA-Plasmid (schwach). So gelang uns der Nachweis einer selektiven Wachstumshemmung der Zielteilgesamtheit, S. thermophilus, in der gemischten Zellpopulation.
Literaturhinweise

1. Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Patrick Boyaval, Moineau, S., ... Horvath, P. (2007). CRISPRProvides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes. Science, 315(March), 1709-1712.
2. Bryksin, A. V, & Matsumura, I. (2010). Rational design of a plasmid origin that replicates efficiently in both gram-positive and gram-negative bacteria. PloS One, 5(10), e13244.
3.Chan CTY, Lee JW, Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ: „Deadman" and „Passcode" microbial kill switches for bacterial containment. Nat Chem Biol 2015, 12(December): 1-7.
4. Horvath, P., Romero, D. A., Coûté-Monvoisin, A.-C., Richards, M., Deveau, H., Moineau, S., . Barrangou, R. (2008). Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology, 190(4), 1401-12.
5. Ludwig, E. S., Klipper, R., Magrum L., Wose C., & Stackebrandt, E. (1985). The phylogenetic position of Streptococcus and Enterococcus. Journul of Gencwl Microhiologj., 131, 543-55 1.
6. Mercenier, A. (1990). Molecular genetics of Streptococcus thermophilus. FEMS Microbiology Letters, 87(1-2), 61-77.
7. Samaržija, D., Antunac, N., & Havranek, J. (2001). Taxonomy, physiology and growth of Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo, 51(1), 35-48.
8. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acids Research, 39(21), 9275-9282.
9. Somkuti, G. A., & Steinberg, D. H. (1988). Genetic transformation of Streptococcus thermophilus by electroporation. Biochimie, 70(4), 579-585.
10. Sorg, R. A., Kuipers, O. P., & Veening, J.-W. (2014). Gene expression platform for synthetic biology in the human pathogen Streptococcus pneumoniae. ACS Synthetic Biology, 4(3), 228-239.
11. Suvorov, a. (1988). Transformation of group A streptococci by electroporation. FEMS Microbiology Letters, 56(1), 95-99.
12. Xie, Z., Qi, F., & Merritt, J. (2013). Development of a tunable wide-range gene induction system useful for the study of streptococcal toxin-antitoxin systems. Applied and Environmental Microbiology, 79(20), 6375-84.
13. Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microbial Biotechnology, 4(1), 98-105.

BEISPIEL 4: Ändern des Verhältnisses von Clostridium difficile bei einer gemischten Darmflora-Population
Die Änderung des Verhältnisses von Bakterien wird dem vorliegenden Beispiel entsprechend ausgeführt, das unter Bezugnahme auf das Niederschlagen von Clostridium difficile-Bakterien bei einer gemischten Darmfloraprobe beschrieben wird. Die Probe enthält dabei Bacteroides und Teilgesamtheiten des metronidazol- (MTZ)-resistenten C dificile Stammes 630. Ex vivo wird die gemischte Population mit einer Population von Trägerbakterien kombiniert (Lactobacillus acidophilus La-14 und/oder La-5), die derart gentechnisch erzeugt wurden, dass sie CRISPR-Arrays enthalten.
Jeder CRISPR-Array ist auf einem Plasmid umfasst, das mit dem Trägerbakterium und C. difficile-Zellen kompatibel ist. Der Array ist umfasst von einem Bacteroides thetaiotaomicron CTnDot-Transposon, das ebenfalls oriT, eine intDOT -Sequenz, ein tetQ-rteA-rteB-Operon, rteC und das Operon xis2c-xis2d-orf3-exc umfasst. In einem Versuch werden mob- und tra-Operons ausgeschlossen (stattdessen hat man sich auf diejenigen verlassen, die von Bacteroides-Zellen bereitgestellt werden, auf die die Transposons in der mit den Trägerbakterien kombinierten Mischung übertragen werden). In einem weiteren Versuch wurden die mob- und tra-Operons in den Transposons eingeschlossen.
Die Proteintranslokation über die zytoplasmische Membran stellt bei allen Bakterien einen wesentlichen Prozess dar. Das See-System, das im Kern eine ATPase, SecA, und einen Membrankanal, SecYEG, umfasst, ist für die Mehrheit dieses Proteintransports verwantwortlich. Ein zweites, paralleles See-System ist bei verschiedenen grampositiven Arten beschrieben worden. Dieses akzessorische Sec-System ist charakterisiert durch das Vorhandensein einer zweiten Kopie der energiespenden ATPase, SecA2; dort, wo es erforscht worden ist, ist SecA2 für die Translokation einer Teilmenge von Sec-Substraten veranwortlich. Gemeinsam mit zahlreichen pathogenen grampositiven Arten besitzt Clostridium difficile zwei Kopien von SecA. Der Export der SLPs (S-Layer Proteins) und eines zusätzlichen Zellwandproteins (CwpV) hängt von SecA2 ab. Die Ansammlung des zytoplasmischen Vorläufers der SLPs, SlpA, und anderer Zellwandproteine wird bei Zellen beobachtet, die dominantnegative secA1- oder secA2-Allele exprimieren, was mit einer Abnahme der Mengen an reifen SLPs in der Zellwand einhergeht. Außerdem wird das Wachstum durch die Expression jedwedes dominantnegativen Allels oder die Herunterregulierung von SecA1 oder SecA2 durch Antisense-RNA dramatisch beeinträchtigt, was andeutet, dass beide See-Systeme bei C. difficile wesentlich sind.
Der C. difficile-Stamm 630 (epidemischer Typ X) weist ein einzelnes kreisförmiges Chromosom mit 4 290 252 bp (G+C-Gehalt = 29,06 %) und ein kreisförmiges Plasmid mit 7881 bp (G+C-Gehalt = 27,9 %) auf. Das ganze Genom ist sequenziert worden; dabei stellte sich heraus, dass 11 % des Genoms aus MGEs wie z.B. konjugativen Transposons besteht. Diese Elemente stellen C. difficile die Gene zur Verfügung, die für dessen antimikrobielle Resistenz, Virulenz, Wechselwirkungen mit dem Wirt und die Erzeugung von Oberflächenstrukturen verantwortlich sind. Das cdeA-Gen von C. difficile erzeugt z.B. eine Multidrug-Efflux-Pumpe, die nachweislich homolog ist mit bekannten Efflux-Transportern der MATE-Familie (Multidrug And Toxic compound Extrusion). Dieses Protein unterstützt den energieabhängigen und natriumgekoppelten Ausfluss von Wirkstoffen aus Zellen. Außerdem ist aufgezeigt worden, dass das cme-Gen bei C. difficile bei anderen Bakterien eine Multiresistenz verleiht.
Der Array umfasst eine R1-S1-R1' CRISPR-Einheit (Spacer flankiert durch zwei CRISPR-Repeats) zum Zielen auf eine Sequenz in einem essentiellen Gen (SecA2) von C. difficile-Zellen. In einem weiteren Versuch wird auf das cdeA-Gen in Gegenwart von MTZ und wahlweise mindestens einem anderen Antibiotikum gegen C. difficile gezielt. Jeder Spacer (S) umfasst eine 20-mer Nukleotidsequenz des SecA- oder cdeA-Gens, wobei die Sequenz ein Pam eines C. difficile-Stamm-630-CRISPR/Cas-Systems umfasst, das mit den Repeat-Sequenzen verwandt ist. Jedes Repeat ist identisch mit einem Repeat des C. difficile-Stammes 630.
Die Repeats wirken in der gemischten Population mit der Cas zusammen, die den C. difficile-Zellen endogen ist. Die gemischte Bakterienpopulation wird als ex vivo-Probe einer Stuhlprobe eines menschlichen Patienten entnommen, der unter einer C. difficile-Infektion leidet. Die gemischte Population wird in vitro mit den Trägerbakterien gemischt und bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen in Gegenwart von Tetracyclin inkubiert, um Darmbedingungen zu simulieren. Es wird davon ausgegangen, dass Transposons, die die CRISPR-Arrays enthalten, auf Bacteroides- und C. difficile-Zellen in der Mischung übertragen werden. Ferner wird erwartet, dass die Zielorte in letzteren Zellen durch die Wirkung einer Cas-Nuclease geschnitten werden, wodurch der C. difficile-Anteil an der gemischten Population reduziert wird (und das Verhältnis von Bacteroides zu C. difficile erhöht wird).
In einem Folgeversuch wird ein die Trägerbakterien umfassendes Getränk erzeugt, und dieses wird ein- oder zweimal über mehrere aufeinanderfolgende Tage mit oder ohne Antazid vom menschlichen Patienten eingenommen. Während der Behandlungsdauer wird auch Tetracyclin an den Patienten verabreicht. Es wird erwartet, dass eine Stuhlanalyse zeigen wird, dass der C. difficile-Anteil an den Stuhlproben zurückgehen wird (und das Verhältnis von Bacteroides zu C. difficile zunimmt).
BEISPIEL 5: Vektorcodiertes System zur selektiven Wachstumshemmung von Arten und Stämmen bei einem gemischten Bakterienkonsortium
Im Beispiel 3 stellten wir überraschenderweise fest, dass es möglich ist, die endogene Cas-Nucleaseaktivität bei Wirtsbakterien zur selektiven Wachstumshemmung von Populationen in einem gemischten Konsortium aus unterschiedlichen Arten auszunutzen. Als nächstes erforschten wir die Möglichkeit, stattdessen eine vektorcodierte Cas-Aktivität zur selektiven Hemmung des Populationswachstum bei einem gemischten Konsortium aus unterschiedlichen Arten zu verwenden. Wir konnten eine selektive Wachstumshemmung einer bestimmten Bakterienart bei einer gemischten Population aus drei unterschiedlichen Arten nachweisen, die ferner einen Stamm enthielt, der einen Alternative zu den Zielbakterien darstellte. Überraschenderweise konnten wir eine selektive Wachstumshemmung nur des Zielstammes der vorgegebenen Zielart zeigen. Außerdem wurde vom vektorcodierten CRISPR/Cas-System nicht auf den alternativen Stamm gezielt, was wünschenswert war, um die feine Spezifizität dieser vektorübertragenen Systeme bei einem gemischten bakteriellen Konsortium nachzuweisen, das Elementen der menschlichen oder tierischen Darmflora nachahmte.
Dazu wählten wir Arten aus, die in der Darmflora von Menschen und Tieren zu finden sind (Bacillus subtilis, Lactobacillus lactis und E. coli). Wir schlossen zwei Stämme der menschlichen kommensalen Darmart E. coli ein. Uns erschien es interessant zu sehen, ob wir zwischen nah verwandten Stämmen unterscheiden konnten, die dennoch Sequenzunterschiede aufwiesen, die wir benutzen konnten, um beim Töten auf einen Stamm, aber nicht den anderen, zielen zu können. Dies war interessant, da einige Stämme von E. coli in Mikrobiota wünschenswert sind, während andere u.U. unerwünscht sind (z.B. pathogen für Menschen und Tiere) und so Ziele einer Cas-Modifikation zur Herunterregulierung des Stammes darstellen könnten.
Materialien und Methoden
Plasmide und Stämme
Siehe Tabellen 7 und 8. Alle Stämme wurden in Todd-Hewitt-Brühe (TH) (T1438 Sigma-Aldrich) unter aeroben Bedingungen und bei 37 °C kultiviert, sofern nicht etwas anderes angegeben wird. Die Stämme wurden bei -80 °C in 25 % Glyzerin gelagert.
Der selbstzielende sgRNA-Cas9-Komplex wurde von einem Theophyllin-Riboswitch bzw. dem AraC/PBAD-Expressionssystem eng reguliert. Eine enge Regulierung von Cas9 ist wünschenswert, damit diese stabil in E. coli getragen werden kann. Das Plasmid enthielt die exogene Cas9 aus Streptococcus pyogenes mit einer sgRNA, die auf die K-12-Stämme von E. coli zielte. Deshalb war der von K-12 abstammende Stamm TOP10 bei Aktivieren des Systems anfällig für die doppelsträngige Selbstspaltung und anschließenden Tod. E. coli-Stämme wie Nissle haben dieselbe Zielsequenz nicht, also blieben sie von der sgRNA-Cas9-Aktivität unberührt. Siehe die nachfolgenden Tabellen 9 - 11, die die im Beispiel 9 verwendeten Sequenzen zeigen. Wir wählten eine zielsequenz (rRNA codierende Sequenz) aus, die bei den Zielzellen konserviert ist und in mehreren Kopien (7 Kopien) vorhanden ist, was die Wahrscheinlichkeit des Schneidens von Genomen der Wirtszelle an mehreren Stellen erhöhte, um das Töten mit einer sgRNA-Konstruktion zu fördern.
zeigt Regulierer, die die Expression von spCas9 und die selbstzielsuchende sgRNA, die auf die ribosomale RNA-Untereinheit 16s zielt, regeln.
Differentielle Wachstumsmedien
Alle Stämme wurden 20 h lang bei 37 °C auf TH-Medien gezüchtet. Das selektive Medium für B. subtilis war dabei TH-Medium, ergänzt um 2,5 g 1^-1 2-Phenylethanol (PEA). Den Medien wurde PEA hinzugegeben und sie wurden 15 min lang bei 15 psi und 121 °C autoklaviert. Agarplatten wurden unter Zugabe von 1,5 % (Gew./Vol.) Agar zu den entsprechenden Medien präpariert.
Klonen
Bei allen Subklonierungsverfahren wurde E. coli (One Shot® ThermoFischer TOP10 Chemically Competent cells) verwendet. PCR wurde mit Phusion ™-Polymerase durchgeführt. Alle PCR-Produkte wurden nach dem Protokoll des Herstellers mit Nucleospin ™ Gel und PCR Clean-up von Macherey-Nagel™ gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden mit dem Restriktionsenzym DpnI in 1X FD-Puffer mit 1 µl Enzym in einem Gesamtvolumen von 34 µl verdaut. Die verdaute Reaktion wurde noch einmal nach dem Protokoll des Herstellers mit Nucleospin Gel und PCR Clean-up von Macherey-Nagel gereinigt. Gibson-Assembly wurde an 10 µl Reaktionen nach dem Protokoll des Herstellers (NewEngland Biolab) durchgeführt.
Plasmid-DNA wurde mit Qiagen-Sets nach der Gebrauchsanweisung des Herstellers präpariert. Zu den Modifikationen für die grampositiven Stämme gehörte das Züchten von Bakterien in einem um 0,5 % Glycin und Lysozym ergänzten Medium, um die Zelllyse zu unterstützen.
Umwandlung
Elektrokompetente E. coli-Zellen und Umwandlung
Handelsübliche elektrokompetente Zellen wurden beim Klonen und den Versuchen verwendet (One Shot® ThermoFischer TOP10 electrompetent E. coli). Die Elektroporation wurde mit den Standardeinstellungen durchgeführt: 1800 V, 25 µF und 200 Ω mit einem Electro Cell Manipulator (BTX Harvard Apparatus ECM630). Nach dem Impuls wurde 1 ml LB-SOC-Medium hinzugegeben und die Zellen wurden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die umgewandelten Zellen wurden in LB-Agar plattiert, das die entsprechenden Antibiotika enthielt.
Activation von sgRNA-Cas9 bei E. coli und Konsortionsversuchen
E.coli TOP10 und Nissle, beide mit dem Plasmid, das die sgRNA enthält, die auf die rRNA codierende Sequenz der von K-12 abstammenden Stämme und andere Bakterien zielte, wurden über Nacht in 3 ml TH-Brühe gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die Zellen auf∼OD 0,5 und danach 10-fach seriell in TH-Medium verdünnt; mit einem 96-muldigen Replikator (Mettler Toledo Liquidator™ 96) wurden Tropfen mit 4 µL Volumen auf TH-Agar, TH-Agar mit Induktoren (1 % Arabinose und 2 mM Theophyllin), TH-Agar, ergänzt um 2,5 g 1^-1 PEA, und MacConkey-Agar, ergänzt um 1 % Maltose, getropft. Die Platten wurden 20 h lang bei 37 °C inkubiert und die keimbildenden Einheiten (KBE) wurden aus dreifachen Messungen berechnet.
Ergebnisse
Spezifisches Zielen auf E. coli-Stämme mit einem exogenen CRISPR-Cas9-System
Zunächst untersuchten wir, ob das System zwischen zwei E. coli-Stämmen unterscheiden konnte, indem wir das Tötungssystem sowohl in E. coli TOP10 als auch in Nissle einführten.
Zielen auf E. coli mit einem exogenen CRISPR-Cas9-Sytem in Mischkultur
Serielle Verdünnungen von Übernachtkulturen wurden zweifach für beide E. coli-Stämme, B. subtilis, L. lactis und dreifach für die Mischkulturen vorgenommen. Alle Stämme wurden 20 h lang bei 37°C in selektiven Platten mit und ohne Induktoren gezüchtet. Die Induktion des Systems aktiviert die sgRNA-Cas9, die auf die von K-12 abstammenden Stämme zielt und schont dabei die anderen Bakterien.
Es ist wichtig, die unterschiedlichen Bakterien einer Mischkultur zu unterscheiden, um eine Zellzahl der jeweiligen Arten sowie die spezifische Entfernung einer Art zu ermitteln. MacConkey-Agar züchtet selektiv E. coli. PEA-Agar ist ein selektives Medium, das zur Isolation von grampositiven Stämmen (B. subtilis) von gramnegativen Stämmen (E. coli) verwendet wird. Außerdem stellten wir fest, dass unterschiedliche PEA-Konzentrationen das Wachstum der anderen grampositiven Stämme teilweise hemmen. Es stellte sich heraus, dass 2,5 g 1^-1 PEA selektiv B. subtilis züchtet und dabei das Wachstum von E. coli und L. lactis hemmt.
zeigt spezifisches Zielen auf den E. coli-Stamm durch das induzierbare, exogene, vektorübertragene CRISPR-Cas-System. Die sgRNA zielt auf das Genom vom aus K-12 abgeleiteten E. coli-Stamm TOP10, während der andere untersuchte E. coli-Stamm unberührt blieb.
zeigt einen Spot-Assay mit seriellen Verdünnungen von einzelnen bei dieser Studie verwendeten Bakterienarten sowie Mischkultur in TH-Agar ohne Induktion eines CRISPR-Cas9-Systems.
zeigt einen Spot-Assay der Verdünnung 10³ auf unterschiedlichen selektiven Medien. TH mit 2,5 g 1^-1 PEA ist ein selektives Medium ausschließlich für B. subtilis. Um Maltose ergänztes MacConkey-Medium ist ein selektives und differentielles Kulturmedium für Bakterien, das derart konstruiert ist, dass es gramnegative und Darmbazillen selektiv isoliert und diese nach Maltosefermentation differenziert. Deshalb erzeugt TOP10 ΔmalK-Mutant weiße Kolonien auf den Platten, während Nissle rosa Kolonien erzeugt; A ist E.coli ΔmalK, B ist E. coli Nissile, C ist B. subtilis, D ist L. lactis, E ist Mischkultur; die Bilder bei MacConkey-/B und E erscheinen rosa; die Bilder bei MacConkey+/B und E erscheinen rosa. zeigt selektives Wachstum der bei dieser Studie verwendeten Bakterien auf unterschiedlichen Medien und selektiven Platten. Erkennbar ist, dass wir eindeutig und selektiv den E. coli-Zielstamm („E. coli“ auf X-Achse in ) in der gemischten Population töteten, während der andere, verwandte Stamm („E. coli-Nissle“) nicht auf ähnliche Weise getötet wurde. In diesem Versuch wurde ein 1000-faches Töten des Zielstammes in der gemischten Population festgestellt.
Literaturhinweise

1. Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microbial Biotechnology, 4(1), 98-105. http://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x
2. Wegmann, U., O'Connell-Motherway, M., Zomer, A., Buist, G., Shearman, C., Canchaya, C., . Kok, J. (2007). Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Journal of Bacteriology, 189(8), 3256-70. http://doi.org/10.1128/JB.01768-06

Abiotrophia			Acidocella	Actinomyces	Alkalilimnicola	Aquaspirillum
Abiotrophia defectiva			Acidocella aminolytica	Actinomyces bovis	Alkalilimnicola ehrlichii	Aquaspirillum polymorphum
			Acidocella facilis	Actinomyces denticolens
Acaricomes				Actinomyces europaeus	Alkaliphilus	Aquaspirillum putridiconchylium
Acaricomes phytoseiuli			Acidomonas	Actinomyces georgiae	Alkaliphilus oremlandii
			Acidomonas methanolica	Actinomyces gerencseriae	Alkaliphilus transvaalensis	Aquaspirillum serpens
Acetitomaculum				Actinomyces hordeovulneris
Acetitomaculum ruminis			Acidothermus		Allochromatium	Aquimarina
			Acidothermus cellulolyticus	Actinomyces howellii	Allochromatium vinosum	Aquimarina latercula
Acetivibrio				Actinomyces hyovaginalis
Acetivibrio cellulolyticus			Acidovorax	Actinomyces israelii	Alloiococcus	Arcanobacterium
Acetivibrio ethanolgignens			Acidovorax anthurii	Actinomyces johnsonii	Alloiococcus otitis	Arcanobacterium haemolyticum
Acetivibrio multivorans			Acidovorax caeni	Actinomyces meyeri
			Acidovorax cattleyae	Actinomyces naeslundii	Allokutzneria	Arcanobacterium pyogenes
Acetoanaerobium			Acidovorax citrulli	Actinomyces neuii	Allokutzneria albata
Acetoanaerobium noterae			Acidovorax defluvii	Actinomyces odontolyticus		Archangium
			Acidovorax delafieldii	Actinomyces oris	Altererythrobacter	Archangium gephyra
Acetobacter			Acidovorax facilis	Actinomyces radingae	Altererythrobacter
Acetobacter aceti			Acidovorax konjaci	Actinomyces slackii	ishigakiensis	Arcobacter
Acetobacter cerevisiae			Acidovorax temperans	Actinomyces turicensis		Arcobacter butzleri
Acetobacter cibinongensis			Acidovorax valerianellae	Actinomyces viscosus	Altermonas	Arcobacter cryaerophilus
Acetobacter estunensis					Altermonas haloplanktis	Arcobacter halophilus
Acetobacter fabarum			Acinetobacter	Actinoplanes	Altermonas macleodii	Arcobacter nitrofigilis
Acetobacter ghanensis			Acinetobacter baumannii	Actinoplanes auranticolor		Arcobacter skirrowii
Acetobacter indonesiensis			Acinetobacter baylyi	Actinoplanes brasiliensis	Alysiella
Acetobacter lovaniensis			Acinetobacter bouvetii	Actinoplanes consettensis	Alysiella crassa	Arhodomonas
Acetobacter malorum			Acinetobacter	Actinoplanes deccanensis	Alysiella filiformis	Arhodomonas aquaeolei
Acetobacter nitrogenifigens			calcoaceticus	Actinoplanes derwentensis
Acetobacter oeni			Acinetobacter gerneri	Actinoplanes digitatis	Aminobacter	Arsenophonus
Acetobacter orientalis			Acinetobacter haemolyticus	Actinoplanes durhamensis	Aminobacter aganoensis	Arsenophonus nasoniae
Acetobacter orleanensis			Acinetobacter johnsonii	Actinoplanes ferrugineus	Aminobacter aminovorans
Acetobacter pasteurianus			Acinetobacter junii	Actinoplanes globisporus	Aminobacter niigataensis
Acetobacter pornorurn			Acinetobacter lwoffi	Actinoplanes humidus
				Actinoplanes italicus
Acetobacter senegalensis		Acinetobacter parvus		Actinoplanes liguriensis	Aminobacterium	Arthrobacter
Acetobacter xylinus		Acinetobacter radioresistens		Actinoplanes lobatus	Aminobacterium mobile	Arthrobacter agilis
				Actinoplanes missouriensis		Arthrobacter albus
Acetobacterium		Acinetobacter schindleri		Actinoplanes palleronii	Aminomonas	Arthrobacter aurescens
Acetobacterium bakii		Acinetobacter soli		Actinoplanes philippinensis	Aminomonas paucivorans	Arthrobacter chlorophenolicus
Acetobacterium carbinolicum		Acinetobacter tandoii		Actinoplanes rectilineatus
		Acinetobacter tjernbergiae		Actinoplanes regularis	Ammoniphilus	Arthrobacter citreus
Acetobacterium dehalogenans		Acinetobacter towneri		Actinoplanes teichomyceticus	Ammoniphilus oxalaticus	Arthrobacter crystallopoietes
		Acinetobacter ursingii			Ammoniphilus oxalivorans
Acetobacterium fimetarium		Acinetobacter venetianus		Actinoplanes utahensis		Arthrobacter cumminsii
Acetobacterium malicum					Amphibacillus	Arthrobacter globiformis
Acetobacterium paludosum		Acrocarpospora		Actinopolyspora	Amphibacillus xylanus	Arthrobacter histidinolovorans
Acetobacterium tundrae		Acrocarpospora corrugata		Actinopolyspora halophila
Acetobacterium wieringae		Acrocarpospora macrocephala		Actinopolyspora mortivallis	Amphritea	Arthrobacter ilicis
Acetobacterium woodii					Amphritea balenae	Arthrobacter luteus
		Acrocarpospora pleiomorpha			Amphritea japonica	Arthrobacter methylotrophus
Acetofilamentum				Actinosynnema
Acetofilamentum rigidum				Actinosynnema mirum	Amycolatopsis	Arthrobacter mysorens
		Actibacter			Amycolatopsis alba	Arthrobacter nicotianae
Acetohalobium		Actibacter sediminis		Actinotalea	Amycolatopsis albidoflavus	Arthrobacter nicotinovorans
Acetohalobium arabaticum				Actinotalea fermentans	Amycolatopsis azurea
		Actinoalloteichus			Amycolatopsis coloradensis	Arthrobacter oxydans
Acetomicrobium		Actinoalloteichus cyanogriseus		Aerococcus		Arthrobacter pascens
Acetomicrobium faecale				Aerococcus sanguinicola	Amycolatopsis lurida	Arthrobacter phenanthrenivorans
Acetomicrobium flavidum		Actinoalloteichus hymeniacidonis		Aerococcus urinae	Amycolatopsis mediterranei	Arthrobacter polychromogenes
				Aerococcus urinaeequi
Acetonema		Actinoalloteichus spitiensis		Aerococcus urinaehominis	Amycolatopsis rifamycinica
Acetonema longum				Aerococcus viridans	Amycolatopsis rubida	Atrhrobacter protophormiae
		Actinobaccillus			Amycolatopsis sulphurea	Arthrobacter psychrolactophilus
Acetothermus		Actinobacillus capsulatus		Aeromicrobium	Amycolatopsis tolypomycina	Arthrobacter ramosus
Acetothermus paucivorans		Actinobacillus delphinicola		Aeromicrobium erythreum
		Actinobacillus hominis				Arthrobacter sulfonivorans
Acholeplasma		Actinobacillus indolicus		Aeromonas	Anabaena	Arthrobacter sulfureus
Acholeplasma axanthum		Actinobacillus lignieresii		Aeromonas allosaccharophila	Anabaena cylindrica	Arthrobacter uratoxydans
Acholeplasma brassicae		Actinobacillus minor			Anabaena flos-aquae	Arthrobacter ureafaciens
Acholeplasma cavigenitalium		Actinobacillus muris		Aeromonas bestiarum	Anabaena variabilis	Arthrobacter viscosus
		Actinobacillus pleuropneumoniae		Aeromonas caviae		Arthrobacter woluwensis
Acholeplasma equifetale				Aeromonas encheleia	Anaeroarcus
Acholeplasma granularum		Actinobacillus porcinus		Aeromonas enteropelogenes	Anaeroarcus burkinensis	Asaia
Acholeplasma hippikon		Actinobacillus rossii				Asaia bogorensis
Acholeplasma laidlawii		Actinobacillus scotiae		Aeromonas eucrenophila	Anaerobaculum
Acholeplasma modicum		Actinobacillus seminis		Aeromonas ichthiosmia	Anaerobaculum mobile	Asanoa
Acholeplasma morum		Actinobacillus succinogenes		Aeromonas jandaei		Asanoa ferruginea
Acholeplasma multilocale				Aeromonas media	Anaerobiospirillum
Acholeplasma oculi		Actinobaccillus suis		Aeromonas popoffii	Anaerobiospirillum succiniciproducens	Asticcacaulis
Acholeplasma palmae		Actinobacillus ureae		Aeromonas sobria		Asticcacaulis biprosthecium
Acholeplasma parvum				Aeromonas veronii	Anaerobiospirillum thomasii
Acholeplasma pleciae		Actinobaculum				Asticcacaulis excentricus
Acholeplasma vituli		Actinobaculum massiliense		Agrobacterium
		Actinobaculum schaalii		Agrobacterium gelatinovorum	Anaerococcus	Atopobacter
Achromobacter		Actinobaculum suis			Anaerococcus hydrogenalis	Atopobacter phocae
Achromobacter denitrificans		Actinomyces urinale			Anaerococcus lactolyticus
				Agrococcus	Anaerococcus prevotii	Atopobium
Achromobacter insolitus		Actinocatenispora		Agrococcus citreus	Anaerococcus tetradius	Atopobium fossor
Achromobacter piechaudii		Actinocatenispora rupis		Agrococcus jenensis	Anaerococcus vaginalis	Atopobium minutum
Achromobacter ruhlandii		Actinocatenispora thailandica				Atopobium parvulum
Achromobacter spanius				Agromonas	Anaerofustis	Atopobium rimae
		Actinocatenispora sera		Agromonas oligotrophica	Anaerofustis stercorihominis	Atopobium vaginae
Acidaminobacter
Acidaminobacter hydrogenoformans		Actinocorallia		Agromyces		Aureobacterium
		Actinocorallia aurantiaca		Agromyces fucosus	Anaeromusa	Aureobacterium barkeri
		Actinocorallia aurea		Agromyces hippuratus	Anaeromusa acidaminophila
Acidaminococcus		Actinocorallia cavernae		Agromyces luteolus		Aurobacterium
Acidaminococcus fermentans		Actinocorallia glomerata		Agromyces mediolanus		Aurobacterium liquefaciens
		Actinocorallia herbida		Agromyces ramosus
Acidaminococcus intestini		Actinocorallia libanotica		Agromyces rhizospherae	Anaeromyxobacter
		Actinocorallia longicatena			Anaeromyxobacter dehalogenans	Avibacterium
Acidicaldus				Akkermansia		Avibacterium avium
Acidicaldus organivorans		Actinomadura		Akkermansia muciniphila	Anaerorhabdus	Avibacterium gallinarum
		Actinomadura alba				Avibacterium paragallinarum
Acidimicrobium		Actinomadura atramentaria		Albidiferax	Anaerorhabdus furcosa	Avibacterium volantium
Acidimicrobium ferrooxidans				Albidiferax ferrireducens
		Actinomadura bangladeshensis			Anaerosinus	Azoarcus
				Albidovulum	Anaerosinus glycerini	Azoarcus indigens
Acidiphilium		Actinomadura catellatispora		Albidovulum inexpectatum		Azoarcus tolulyticus
Acidiphilium acidophilum					Anaerovirgula	Azoarcus toluvorans
Acidiphilium angustum		Actinomadura chibensis		Alcaligenes	Anaerovirgula multivorans
Acidiphilium cryptum		Actinomadura chokoriensis		Alcaligenes denitrificans		Azohydromonas
Acidiphilium multivorum		Actinomadura citrea		Alcaligenes faecalis	Ancalomicrobium	Azohydromonas australica
Acidiphilium organovorum		Actinomadura coerulea			Ancalomicrobium adetum	Azohydromonas lata
Acidiphilium rubrum		Actinomadura echinospora		Alcanivorax
		Actinomadura fibrosa		Alcanivorax borkumensis	Ancylobacter	Azomonas
Acidisoma		Actinomadura formosensis		Alcanivorax jadensis	Ancylobacter aquaticus	Azomonas agilis
Acidisoma sibiricum		Actinomadura hibisca				Azomonas insignis
Acidisoma tundrae		Actinomadura kijaniata		Algicola	Aneurinibacillus	Azomonas macrocytogenes
		Actinomadura latina		Algicola bacteriolytica	Aneurinibacillus aneurinilyticus
Acidisphaera		Actinomadura livida				Azorhizobium
Acidisphaera rubrifaciens		Actinomadura luteofluorescens		Alicyclobacillus	Aneurinibacillus migulanus	Azorhizobium caulinodans

Acidithiobacillus		Actinomadura macra		Alicyclobacillus disulfidooxidans	Aneurinibacillust hermoaerophilus	Azorhizophilus
Acidithiobacillus albertensis		Actinomadura madurae		Alicyclobacillus sendaiensis		Azorhizophilus paspali
		Actinomadura oligospora			Angiococcus
Acidithiobacillus caldus		Actinomadura pelletieri		Alicyclobacillus vulcanalis	Angiococcus disciformis	Azospirillum
Acidithiobacillus ferrooxidans		Actinomadura rubrobrunea				Azospirillum brasilense
		Actinomadura rugatobispora		Alishewanella	Angulomicrobium	Azospirillum halopraeferens
Acidithiobacillus thiooxidans				Alishewanella fetalis	Angulomicrobium tetraedrale
		Actinomadura umbrina				Azospirillum irakense
		Actinomadurave verrucosospora		Alkalibacillus
Acidobacterium		Actinomadura vinacea		Alkalibacillus haloalkaliphilus	Anoxybacillus	Azotobacter
Acidobacterium capsulatum		Actinomadura viridilutea			Anoxybacillus pushchinoensis	Azotobacter beijerinckii
		Actinomadura viridis				Azotobacter chroococcum
		Actinomadura yumaensis				Azotobacter nigricans
					Aquabacterium	Azotobacter salinestris
					Aquabacterium commune	Azotobacter vinelandii
					Aquabacterium parvum
Bacillus			Bacteroides	Bibersteinia	Borrelia	Brevinema
[siehe unten]			Bacteroides caccae	Bibersteinia trehalosi	Borrelia afzelii	Brevinema andersonii
			Bacteroides coagulans		Borrelia americana
			Bacteroides eggerthii	Bifidobacterium	Borrelia burgdorferi	Brevundimonas
			Bacteroides fragilis	Bifidobacterium adolescentis	Borrelia carolinensis	Brevundimonas alba
Bacteriovorax			Bacteroides galacturonicus		Borrelia coriaceae	Brevundimonas aurantiaca
Bacteriovorax stolpii			Bacteroides helcogenes	Bifidobacterium angulatum	Borrelia garinii	Brevundimonas diminuta
			Bacteroides ovatus	Bifidobacterium animalis	Borrelia japonica	Brevundimonas intermedia
			Bacteroides pectinophilus	Bifidobacterium asteroides		Brevundimonas subvibrioides
			Bacteroides pyogenes	Bifidobacterium bifidum	Bosea
			Bacteroides salyersiae	Bifidobacterium boum	Bosea minatitlanensis	Brevundimonas vancanneytii
			Bacteroides stercoris	Bifidobacterium breve	Bosea thiooxidans
			Bacteroides suis	Bifidobacterium catenulatum		Brevundimonas variabilis
			Bacteroides tectus		Brachybacterium	Brevundimonas vesicularis
			Bacteroides thetaiotaomicron	Bifidobacterium choerinum	Brachybacterium alimentarium
				Bifidobacterium coryneforme		Brochothrix
			Bacteroides uniformis		Brachybacterium faecium	Brochothrix campestris
			Bacteroides ureolyticus	Bifidobacterium cuniculi	Brachybacterium paraconglomeratum	Brochothrix thermosphacta
			Bacteroides vulgatus	Bifidobacterium dentium
				Bifidobacterium gallicum	Brachybacterium rhamnosum	Brucella
			Balnearium	Bifidobacterium gallinarum		Brucella canis
			Balnearium lithotrophicum		Brachybacterium tyrofermentans	Brucella neotomae
				Bifidobacterium indicum
			Balneatrix	Bifidobacterium longum		Bryobacter
			Balneatrix alpica	Bifidobacterium	Brachyspira	Bryobacter aggregatus
				magnum Bifidobacterium	Brachyspira alvinipulli
			Balneola	merycicum	Brachyspira hyodysenteriae	Burkholderia
			Balneola vulgaris	Bifidobacterium minimum		Burkholderia ambifaria
				Bifidobacterium pseudocatenulatum	Brachyspira innocens	Burkholderia andropogonis
			Barnesiella		Brachyspira murdochii	Burkholderia anthina
			Bamesiella viscericola	Bifidobacterium pseudolongum	Brachyspira pilosicoli	Burkholderia caledonica
						Burkholderia caryophylli
			Bartonella	Bifidobacterium pullorum		Burkholderia cenocepacia
				Bifidobacterium
Bartonella alsatica				ruminantium		Burkholderia cepacia
Bartonella bacilliformis				Bifidobacterium saeculare		Burkholderia cocovenenans
Bartonella clarridgeiae				Bifidobacterium subtile	Bradyrhizobium
Bartonella doshiae				Bifidobacterium thermophilum	Bradyrhizobium canariense	Burkholderia dolosa
Bartonella elizabethae					Bradyrhizobium elkanii	Burkholderia fungorum
Bartonella grahamii					Bradyrhizobium japonicum	Burkholderia glathei
Bartonella henselae				Bilophila	Bradyrhizobium liaoningense	Burkholderia glumae
Bartonella rochalimae				Bilophila wadsworthia		Burkholderia graminis
Bartonella vinsonii						Burkholderia kururiensis
				Biostraticola	Brenneria	Burkholderia multivorans
Bavariicoccus				Biostraticola tofi	Brenneria alni	Burkholderia phenazinium
Bavariicoccus seileri					Brenneria nigrifluens	Burkholderia plantarii
				Bizionia	Brenneria quercina	Burkholderia pyrrocinia
Bdellovibrio				Bizionia argentinensis	Brenneria quercina	Burkholderia silvatlantica
Bdellovibrio bacteriovorus					Brenneria salicis	Burkholderia stabilis
Bdellovibrio exovorus				Blastobacter		Burkholderia thailandensis
				Blastobacter capsulatus	Brevibacillus	Burkholderia tropica
Beggiatoa				Blastobacter denitrificans	Brevibacillus agri	Burkholderia unamae
Beggiatoa alba					Brevibacillus borstelensis	Burkholderia vietnamiensis
				Blastococcus	Brevibacillus brevis
Beijerinckia				Blastococcus aggregatus	Brevibacillus centrosporus	Buttiauxella
Beijerinckia derxii				Blastococcus saxobsidens	Brevibacillus choshinensis	Buttiauxella agrestis
Beijerinckia fluminensis					Brevibacillus invocatus	Buttiauxella brennerae
Beijerinckia indica				Blastochloris	Brevibacillus laterosporus	Buttiauxella ferragutiae
Beijerinckia mobilis				Blastochloris viridis	Brevibacillus parabrevis	Buttiauxella gaviniae
					Brevibacillus reuszeri	Buttiauxella izardii
Belliella				Blastomonas		Buttiauxella noackiae
Belliella baltica				Blastomonas natatoria	Brevibacterium	Buttiauxella warmboldiae
					Brevibacterium abidum
Bellilinea				Blastopirellula	Brevibacterium album	Butyrivibrio
Bellilinea caldifistulae				Blastopirellula marina	Brevibacterium aurantiacum	Butyrivibrio fibrisolvens
						Butyrivibrio hungatei
Belnapia				Blautia	Brevibacterium celere	Butyrivibrio proteoclasticus
Belnapia moabensis				Blautia coccoides	Brevibacterium epidermidis
				Blautia hansenii
			Bergeriella	Blautia producta	Brevibacterium frigoritolerans
			Bergeriella denitrificans	Blautia wexlerae
					Brevibacterium halotolerans
			Beutenbergia	Bogoriella
			Beutenbergia cavernae	Bogoriella caseilytica	Brevibacterium iodinum
					Brevibacterium linens
				Bordetella	Brevibacterium lyticum
				Bordetella avium	Brevibacterium mcbrellneri
				Bordetella bronchiseptica	Brevibacterium otitidis
				Bordetella hinzii	Brevibacterium oxydans
				Bordetella holmesii	Brevibacterium paucivorans
				Bordetella parapertussis
				Bordetella pertussis	Brevibacterium stationis
				Bordetella petrii
				Bordetella trematum


Bacillus

B. acidiceler			B. aminovorans	B. glucanolyticus	B. taeanensis	B. lautus
B. acidicola			B. amylolyticus	B. gordonae	B. tequilensis	B. lehensis
B. acidiproducens			B. andreesenii	B. gottheilii	B. thermantarcticus	B. lentimorbus
B. acidocaldarius			B. aneurinilyticus	B. graminis	B. thermoaerophilus	B. lentus
B. acidoterrestris			B. anthracis	B. halmapalus	B. thermoamylovorans	B. licheniformis
B. aeolius			B. aquimaris	B. haloalkaliphilus	B. thermocatenulatus	B. ligniniphilus
B. aerius			B. arenosi	B. halochares	B. thermocloacae	B. litoralis
B. aerophilus			B. arseniciselenatis	B. halodenitrificans	B. thermocopriae	B. locisalis
B. agaradhaerens			B. arsenicus	B. halodurans	B. thermodenitrificans	B. luciferensis
B. agri			B. aurantiacus	B. halophilus	B. thermoglucosidasius	B. luteolus
B. aidingensis			B. arvi	B. halosaccharovorans	B. thermolactis	B. luteus
B. akibai			B. aryabhattai	B. hemicellulosilyticus	B. thermoleovorans	B. macauensis
B. alcalophilus			B. asahii	B. hemicentroti	B. thermophilus	B. macerans
B. algicola			B. atrophaeus	B. herbersteinensis	B. thermoruber	B. macquariensis
B. alginolyticus			B. axarquiensis	B. horikoshii	B. thermosphaericus	B. macyae
B. alkalidiazotrophicus			B. azotofixans	B. horneckiae	B. thiaminolyticus	B. malacitensis
B. alkalinitrilicus			B. azotoformans	B. horti	B. thioparans	B. mannanilyticus
B. alkalisediminis			B. badius	B. huizhouensis	B. thuringiensis	B. marisflavi
B. alkalitelluris			B. barbaricus	B. humi	B. tianshenii	B. marismortui
B. altitudinis			B. bataviensis	B. hwajinpoensis	B. trypoxylicola	B. marmarensis
B. alveayuensis			B. beijingensis	B. idriensis	B. tusciae	B. massiliensis
B. alvei			B. benzoevorans	B. indicus	B. validus	B. megaterium
B. amyloliquefaciens			B. beringensis	B. infantis	B. vallismortis	B. mesonae
			B. berkeleyi	B. infernus	B. vedderi	B. methanolicus
	•	B.	B. beveridgei	B. insolitus	B. velezensis	B. methylotrophicus
		a. subsp. amyloliquefa ciens	B. bogoriensis	B. invictae	B. vietnamensis	B. migulanus
			B. boroniphilus	B. iranensis	B. vireti	B. mojavensis
	•	B. a. subsp. plantarum	B. borstelensis	B. isabeliae	B. vulcani	B. mucilaginosus
			B. brevis Migula	B. isronensis	B. wakoensis	B. muralis
			B. butanolivorans	B. jeotgali	B. weihenstephanensis	B. murimartini
B. dipsosauri			B. canaveralius	B. kaustophilus	B. xiamenensis	B. mycoides
B. drentensis			B. carboniphilus	B. kobensis	B. xiaoxiensis	B. naganoensis
B. edaphicus			B. cecembensis	B. kochii	B. zhanjiangensis	B. nanhaiensis
B. ehimensis			B. cellulosilyticus	B. kokeshiiformis	B. peoriae	B. nanhaiisediminis
B. eiseniae			B. centrosporus	B. koreensis	B. persepolensis	B. nealsonii
B. enclensis			B. cereus	B. korlensis	B. persicus	B. neidei
B. endophyticus			B. chagannorensis	B. kribbensis	B. pervagus	B. neizhouensis
B. endoradicis			B. chitinolyticus	B. krulwichiae	B. plakortidis	B. niabensis
B. farraginis			B. chondroitinus	B. laevolacticus	B. pocheonensis	B. niacini
B. fastidiosus			B. choshinensis	B. larvae	B. polygoni	B. novalis
B. fengqiuensis			B. chungangensis	B. laterosporus	B. polymyxa	B. oceanisediminis
B. firmus			B. cibi	B. salexigens	B. popilliae	B. odysseyi
B. flexus			B. circulans	B. saliphilus	B. pseudalcalophilus	B. okhensis
B. foraminis			B. clarkii	B. schlegelii	B. pseudofirmus	B. okuhidensis
B. fordii			B. clausii	B. sediminis	B. pseudomycoides	B. oleronius
B. formosus			B. coagulans	B. selenatarsenatis	B. psychrodurans	B. oryzaecorticis
B. fortis			B. coahuilensis	B. selenitireducens	B. psychrophilus	B. oshimensis
B. fumarioli			B. cohnii	B. seohaeanensis	B.	B. pabuli
B. funiculus			B. composti	B. shacheensis	psychrosaccharolyticus	B. pakistanensis
B. fusiformis			B. curdlanolyticus	B. shackletonii	B. psychrotolerans	B. pallidus
B. galactophilus			B. cycloheptanicus	B. siamensis	B. pulvifaciens	B. pallidus
B. galactosidilyticus			B. cytotoxicus	B. silvestris	B. pumilus	B. panacisoli
B. galliciensis			B. daliensis	B. simplex	B. purgationiresistens	B. panaciterrae
B. gelatini			B. decisifrondis	B. siralis	B. pycnus	B. pantothenticus
B. gibsonii			B. decolorationis	B. smithii	B. qingdaonensis	B. parabrevis
B. ginsengi			B. deserti	B. soli	B. qingshengii	B. paraflexus
B. ginsengihumi				B. solimangrovi	B. reuszeri	B. pasteurii
B. ginsengisoli				B. solisalsi	B. rhizosphaerae	B. patagoniensis
B. globisporus (z.B. B. g. subsp. Globisporus; oder B. g. subsp. Marinus)				B. songklensis	B. rigui
				B. sonorensis	B. ruris
				B. sphaericus	B. safensis
				B. sporothermodurans	B. salarius
				B. stearothermophilus
				B. stratosphericus
				B. subterraneus
				B. subtilis (z.B. B. s. subsp. Inaquosorum; oder B. s. subsp. Spizizeni; oder B. s. subsp. Subtilis)




Caenimonas			Campylobacter	Cardiobacterium	Catenuloplanes	Curtobacterium
Caenimonas koreensis			Campylobacter coli	Cardiobacterium hominis	Catenuloplanes atrovinosus	Curtobacterium albidum
			Campylobacter concisus			Curtobacterium citreus
Caldalkalibacillus			Campylobacter curvus	Carnimonas	Catenuloplanes castaneus
Caldalkalibacillus uzonensis			Campylobacter fetus	Carnimonas nigrificans	Catenuloplanes crispus
			Campylobacter gracilis		Catenuloplanes indicus
Caldanaerobacter			Campylobacter helveticus	Carnobacterium	Catenuloplanes japonicus
Caldanaerobacter subterraneus			Campylobacter hominis	Carnobacterium alterfunditum	Catenuloplanes nepalensis
			Campylobacter hyointestinalis
				Carnobacterium divergens	Catenuloplanes niger
Caldanaerobius			Campylobacter jejuni
Caldanaerobius fijiensis			Campylobacter lari	Carnobacterium funditum	Chryseobacterium
Caldanaerobius polysaccharolyticus			Campylobacter mucosalis		Chryseobacterium balustinum
			Campylobacter rectus	Carnobacterium gallinarum
Caldanaerobius zeae			Campylobacter showae
			Campylobacter sputorum	Carnobacterium maltaromaticum	Citrobacter
Caldanaerovirga			Campylobacter		C. amalonaticus
Caldanaerovirga acetigignens				upsaliensis	Camobacterium mobile	C. braakii
					Camobacterium viridans	C. diversus
Caldicellulosiruptor				Capnocytophaga		C. farmeri
Caldicellulosiruptor bescii				Capnocytophaga canimorsus	Caryophanon	C. freundii
Caldicellulosiruptor kristjanssonii					Caryophanon latum	C. gillenii
				Capnocytophaga cynodegmi	Caryophanon tenue	C. koseri
Caldicellulosiruptor owensensis						C. murliniae
				Capnocytophaga gingivalis	Catellatospora	C. pasteurii^[1]
					Catellatospora citrea	C. rodentium
				Capnocytophaga granulosa	Catellatospora methionotrophica	C. sedlakii
						C. werkmanii
				Capnocytophaga haemolytica		C. youngae
					Catenococcus
				Capnocytophaga ochracea	Catenococcus thiocycli	Clostridium
						(siehe unten)
				Capnocytophaga sputigena
						Coccochloris
						Coccochloris elabens

						Corynebacterium
						Corynebacterium flavescens
						Corynebacterium variabile
Clostridium
Clostridium absonum, Clostridium aceticum, Clostridium acetireducens, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acidisoli, Clostridium aciditolerans, Clostridium acidurici, Clostridium aerotolerans, Clostridium aestuarii, Clostridium akagii, Clostridium aldenense, Clostridium aldrichii, Clostridium algidicarni, Clostridium algidixylanolyticum, Clostridium algifaecis, Clostridium algoriphilum, Clostridium alkalicellulosi, Clostridium aminophilum, Clostridium aminovalericum, Clostridium amygdalinum, Clostridium amylolyticum, Clostridium arbusti, Clostridium arcticum, Clostridium argentinense, Clostridium asparagiforme, Clostridium aurantibutyricum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium baratii, Clostridium barkeri, Clostridium bartlettii, Clostridium beijerinckii, Clostridium bifermentans, Clostridium bolteae, Clostridium bornimense, Clostridium botulinum, Clostridium bowmanii, Clostridium bryantii, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium caenicola, Clostridium caminithermale, Clostridium carboxidivorans, Clostridium carnis, Clostridium cavendishii, Clostridium celatum,
Clostridium celerecrescens, Clostridium cellobioparum, Clostridium cellulofermentans, Clostridium cellulolyticum, Clostridium cellulosi, Clostridium cellulovorans, Clostridium chartatabidum, Clostridium chauvoei, Clostridium chromiireducens, Clostridium citroniae, Clostridium clariflavum, Clostridium clostridioforme, Clostridium coccoides, Clostridium cochlearium, Clostridium colletant, Clostridium colicanis, Clostridium colinum, Clostridium collagenovorans, Clostridium cylindrosporum, Clostridium difficile, Clostridium diolis, Clostridium disporicum, Clostridium drakei, Clostridium durum, Clostridium estertheticum, Clostridium estertheticum estertheticum, Clostridium estertheticum laramiense, Clostridium fallax, Clostridium felsineum, Clostridium fervidum, Clostridium fimetarium, Clostridium formicaceticum, Clostridium frigidicarnis, Clostridium frigoris, Clostridium ganghwense, Clostridium gasigenes, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium glycyrrhizinilyticum, Clostridium grantii, Clostridium haemolyticum, Clostridium halophilum, Clostridium hastiforme, Clostridium hathewayi, Clostridium herbivorans, Clostridium hiranonis, Clostridium histolyticum, Clostridium homopropionicum, Clostridium huakuii, Clostridium hungatei, Clostridium hydrogeniformans, Clostridium hydroxybenzoicum, Clostridium hylemonae, Clostridium jejuense, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium intestinale, Clostridium irregulare, Clostridium isatidis, Clostridium josui, Clostridium kluyveri, Clostridium lactatifermentans, Clostridium lacusfryxellense, Clostridium laramiense, Clostridium lavalense, Clostridium lentocellum, Clostridium lentoputrescens, Clostridium leptum, Clostridium limosum, Clostridium litorale, Clostridium lituseburense, Clostridium ljungdahlii, Clostridium lortetii, Clostridium lundense, Clostridium magnum, Clostridium malenominatum, Clostridium mangenotii, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium methylpentosum, Clostridium neopropionicum, Clostridium nexile, Clostridium nitrophenolicum, Clostridium novyi, Clostridium oceanicum, Clostridium orbiscindens, Clostridium oroticum, Clostridium oxalicum, Clostridium papyrosolvens, Clostridium paradoxum, Clostridium paraperfringens (Alias: C. welchii), Clostridium paraputrificum, Clostridium pascui, Clostridium pasteurianum, Clostridium peptidivorans, Clostridium perenne, Clostridium perfringens, Clostridium pfennigii, Clostridium phytofermentans, Clostridium piliforme, Clostridium polysaccharolyticum, Clostridium populeti, Clostridium propionicum, Clostridium proteoclasticum, Clostridium proteolyticum, Clostridium psychrophilum, Clostridium puniceum, Clostridium purinilyticum, Clostridium putrefaciens, Clostridium putrificum, Clostridium quercicolum, Clostridium quinii, Clostridium ramosum, Clostridium rectum, Clostridium roseum, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharogumia, Clostridium saccharolyticum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium sardiniense, Clostridium sartagoforme, Clostridium scatologenes, Clostridium schirmacherense, Clostridium scindens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium sphenoides, Clostridium spiroforme, Clostridium sporogenes, Clostridium sporosphaeroides, Clostridium stercorarium, Clostridium stercorarium leptospartum, Clostridium stercorarium stercorarium, Clostridium stercorarium thermolacticum, Clostridium sticklandii, Clostridium straminisolvens, Clostridium subterminale, Clostridium sufflavum, Clostridium sulfidigenes, Clostridium symbiosum, Clostridium tagluense, Clostridium tepidiprofundi, Clostridium termitidis, Clostridium tertium, Clostridium tetani, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermaceticum, Clostridium thermautotrophicum, Clostridium thermoalcaliphilum, Clostridium thermobutyricum, Clostridium thermocellum, Clostridium thermocopriae, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermolacticum, Clostridium thermopalmarium, Clostridium thermopapyrolyticum, Clostridium thermosaccharolyticum, Clostridium thermosuccinogenes, Clostridium thermosulfurigenes, Clostridium thiosulfatireducens, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium uliginosum, Clostridium ultunense, Clostridium villosum, Clostridium vincentii,

Clostridium viride, Clostridium xylanolyticum, Clostridium xylanovorans

Dactylosporangium		Deinococcus	Delftia	Echinicola
Dactylosporangium aurantiacum		Deinococcus aerius	Delftia acidovorans	Echinicola pacifica
Dactylosporangium aurantiacum		Deinococcus apachensis		Echinicola vietnamensis
Dactylosporangium fulvum		Deinococcus aquaticus	Desulfovibrio
Dactylosporangium matsuzakiense		Deinococcus aquatilis	Desulfovibrio desulfuricans
Dactylosporangium matsuzakiense		Deinococcus caeni	Desulfovibrio desulfuricans
Dactylosporangium roseum		Deinococcus radiodurans
Dactylosporangium thailandense		Deinococcus radiophilus	Diplococcus
Dactylosporangium thailandense			Diplococcus pneumoniae
Dactylosporangium vinaceum


Enterobacter		Enterobacter kobei	Faecalibacterium	Flavobacterium
E. aerogenes		E. ludwigii	Faecalibacterium prausnitzii	Flavobacterium antarcticum
E. amnigenus		E. mori	Faecalibacterium prausnitzii	Flavobacterium antarcticum
E. agglomerans		E. nimipressuralis		Flavobacterium aquatile
E. arachidis		E. oryzae	Fangia	Flavobacterium aquidurense
E. arachidis		E. oryzae	Fangia hongkongensis	Flavobacterium aquidurense
E. asburiae		E. pulveris		Flavobacterium balustinum
E. cancerogenous		E. pyrinus	Fastidiosipila	Flavobacterium balustinum
E. cloacae		E. radicincitans	Fastidiosipila sanguinis	Flavobacterium croceum
E. cowanii		E. taylorae		Flavobacterium cucumis
E. dissolvens		E. turicensis	Fusobacterium	Flavobacterium daejeonense
E. gergoviae		E. sakazakii Enterobacter soli	Fusobacterium nucleatum	Flavobacterium defluvii
E. helveticus		E. sakazakii Enterobacter soli	Fusobacterium nucleatum	Flavobacterium degerlachei
E. hormaechei				Flavobacterium degerlachei
E. intermedius		Enterococcus		Flavobacterium denitrificans
		Enterococcus durans		Flavobacterium denitrificans
		Enterococcus faecalis		Flavobacterium filum
				Flavobacterium flevense
				Flavobacterium
		Enterococcus faecium		frigidarium
				Flavobacterium mizutaii
		Erwinia		Flavobacterium okeanokoites
		Erwinia hapontici		Flavobacterium okeanokoites

		Escherichia
		Escherichia coli


Gaetbulibacter		Haemophilus	Ideonella	Janibacter
Gaetbulibacter saemankumensis		Haemophilus aegyptius	Ideonella azotifigens	Janibacter anophelis
Gaetbulibacter saemankumensis		Haemophilus aphrophilus		Janibacter corallicola
		Haemophilus felis	Idiomarina	Janibacter limosus
Gallibacterium		Haemophilus gallinarum	Idiomarina abyssalis	Janibacter melonis
Gallibacterium anatis		Haemophilus haemolyticus	Idiomarina baltica	Janibacter terrae
		Haemophilus haemolyticus	Idiomarina fontislapidosi
Gallicola		Haemophilus influenzae	Idiomarina loihiensis	Jannaschia
Gallicola barnesae		Haemophilus paracuniculus	Idiomarina ramblicola	Jannaschia cystaugens
		Haemophilus paracuniculus	Idiomarina seosinensis	Jannaschia helgolandensis
Garciella		Haemophilus parahaemolyticus	Idiomarina zobellii	Jannaschia helgolandensis
Garciella nitratireducens		Haemophilus parahaemolyticus		Jannaschia pohangensis
		Haemophilus parainfluenzae	Ignatzschineria	Jannaschia rubra
Geobacillus		Haemophilus parainfluenzae	Ignatzschineria larvae
Geobacillus thermoglucosidasius		Haemophilus paraphrohaemolyticus
Geobacillus thermoglucosidasius		Haemophilus paraphrohaemolyticus
Geobacillus stearothermophilus		Haemophilus parasuis		Janthinobacterium
Geobacillus stearothermophilus		Haemophilus pittmaniae	Ignavigranum	Janthinobacterium agaricidamnosum
			Ignavigranum ruoffiae	Janthinobacterium agaricidamnosum
Geobacter		Hafnia		Janthinobacterium lividum
Geobacter bemidjiensis		Hafnia alvei	Ilumatobacter	Janthinobacterium lividum
Geobacter bremensis			Ilumatobacter fluminis
Geobacter chapellei		Hahella		Jejuia
Geobacter grbiciae		Hahella ganghwensis	Ilyobacter	Jejuia pallidilutea
Geobacter hydrogenophilus			Ilyobacter delafieldii
		Halalkalibacillus
Geobacter lovleyi	Halalkalibacillus halophilus	Ilyobacter insuetus	Jeotgalibacillus
Geobacter metallireducens	Halalkalibacillus halophilus	Ilyobacter polytropus	Jeotgalibacillus alimentarius
Geobacter pelophilus		Ilyobacter tartaricus	Jeotgalibacillus alimentarius
Geobacter pickeringii	Helicobacter
Geobacter sulfurreducens	Helicobacter pylori		Jeotgalicoccus
			Jeotgalicoccus halotolerans
Geodermatophilus			Jeotgalicoccus halotolerans
Geodermatophilus obscurus

Gluconacetobacter
Gluconacetobacter xylinus

Gordonia
Gordonia rubripertincta


Kaistia	Labedella	Listeria ivanovii	Micrococcus	Nesterenkonia
Kaistia adipata	Labedella gwalgkijensis	L. marthii	Micrococcus luteus	Nesterenkonia holobia
Kaistia soli		L. monocytogenes	Micrococcus lylae
	Labrenzia	L. newyorkensis		Nocardia
Kangiella	Labrenzia aggregata	L. riparia	Moraxella	Nocardia argentinensis
Kangiella aquimarina	Labrenzia alba	L. rocourtiae	Moraxella bovis	Nocardia corallina
Kangiella koreensis	Labrenzia alexandrii	L. seeligeri	Moraxella nonliquefaciens	Nocardia otitidiscaviarum
	Labrenzia marina	L. weihenstephanensis	Moraxella nonliquefaciens
	Labrys	L. welshimeri	Moraxella osloensis
Kerstersia	Labrys methylaminiphilus	Listonella	Nakamurella
Kerstersia gyiorum	Labrys miyagiensis	Listonella anguillarum	Nakamurella multipartita
	Labrys monachus
Kiloniella	Labrys okinawensis	Macrococcus	Nannocystis
Kiloniella laminariae	Labrys portucalensis	Macrococcus bovicus	Nannocystis pusilla

Klebsiella		Marinobacter	Natranaerobius
K. granulomatis		Marinobacter algicola	Natranaerobius
K. oxytoca	Lactobacillus	Marinobacter bryozoorum	thermophilus
K. pneumoniae		Marinobacter bryozoorum	Natranaerobius trueperi
K. terrigena	[siehe unten]	Marinobacter flavimaris
K. variicola			Naxibacter
	Laceyella	Meiothermus	Naxibacter alkalitolerans
Kluyvera	Laceyella putida	Meiothermus ruber
Kluyvera ascorbata			Neisseria
	Lechevalieria	Methylophilus	Neisseria cinerea
Kocuria	Lechevalieria aerocolonigenes	Methylophilus methylotrophus	Neisseria denitrificans
Kocuria roasea	Lechevalieria aerocolonigenes	Methylophilus methylotrophus	Neisseria gonorrhoeae
Kocuria varians			Neisseria lactamica
	Legionella	Microbacterium	Neisseria mucosa
Kurthia		Microbacterium ammoniaphilum	Neisseria sicca
Kurthia zopfii	[siehe unten]	Microbacterium ammoniaphilum	Neisseria subflava
		Microbacterium arborescens
	Listeria	Microbacterium arborescens	Neptunomonas
	L. aquatica	Microbacterium liquefaciens	Neptunomonas japonica
	L. booriae	Microbacterium liquefaciens
	L. cornellensis	Microbacterium oxydans
	L. fleischmannii
	L. floridensis
	L. grandensis
	L. grayi
	L. innocua


Lactobacillus
L. acetotolerans	L. catenaformis	L. mali	L. parakefiri	L. sakei
L. acidifarinae	L. ceti	L. manihotivorans	L. paralimentarius	L. salivarius
L. acidipiscis	L. coleohominis	L. mindensis	L. paraplantarum	L. sanfranciscensis
L. acidophilus	L. collinoides	L. mucosae	L. pentosus	L. satsumensis
Lactobacillus agilis	L. composti	L. murinus	L. perolens	L. secaliphilus
L. algidus	L. concavus	L. nagelii	L. plantarum	L. sharpeae
L. alimentarius	L. coryniformis	L. namurensis	L. pontis	L. siliginis
L. amylolyticus	L. crispatus	L. nantensis	L. protectus	L. spicheri
L. amylophilus	L. crustorum	L. oligofermentans	L. psittaci	L. suebicus
L. amylotrophicus	L. curvatus	L. oris	L. rennini	L. thailandensis
L. amylovorus	L. delbrueckii subsp. bulgaricus	L. panis	L. reuteri	L. ultunensis
L. animalis	L. delbrueckii subsp. bulgaricus	L. pantheris	L. rhamnosus	L. vaccinostercus
L. antri	L. delbrueckii subsp. delbrueckii	L. parabrevis	L. rimae	L. vaginalis
L. apodemi	L. delbrueckii subsp. delbrueckii	L. parabuchneri	L. rogosae	L. versmoldensis
L. aviarius	L. delbrueckii subsp. lactis	L. paracasei	L. rossiae	L. vini
L. bifermentans	L. delbrueckii subsp. lactis	L. paracollinoides	L. ruminis	L. vitulinus
L. brevis	L. dextrinicus	L. parafarraginis	L. saerimneri	L. zeae
L. buchneri	L. diolivorans	L. homohiochii	L. jensenii	L. zymae
L. camelliae	L. equi	L. iners	L. johnsonii	L. gastricus
L. casei	L. equigenerosi	L. ingluviei	L. kalixensis	L. ghanensis
L. kitasatonis	L. farraginis	L. intestinalis	L. kefiranofaciens	L. graminis
L. kunkeei	L. farciminis	L. fuchuensis	L. kefiri	L. hammesii
L. leichmannii	L. fermentum	L. gallinarum	L. kimchii	L. hamsteri
L. lindneri	L. fornicalis	L. gasseri	L. helveticus	L. harbinensis
L. malefermentans	L. fructivorans		L. hilgardii	L. hayakitensis
	L. frumenti

Legionella
Legionella adelaidensis	Legionella drancourtii	Candidatus Legionella jeonii	Legionella quinlivanii
Legionella anisa	Legionella dresdenensis	Candidatus Legionella jeonii	Legionella rowbothamii
Legionella beliardensis	Legionella drozanskii	Legionella jordanis	Legionella rubrilucens
Legionella birminghamensis	Legionella dumoffii	Legionella lansingensis	Legionella sainthelensi
Legionella bozemanae	Legionella erythra	Legionella londiniensis	Legionella santicrucis
Legionella brunensis	Legionella fairfieldensis	Legionella longbeachae	Legionella shakespearei
Legionella busanensis	Legionella fallonii	Legionella lytica	Legionella spiritensis
Legionella cardiaca	Legionella feeleii	Legionella maceachernii	Legionella steelei
Legionella cherrii	Legionella geestiana	Legionella massiliensis	Legionella steigerwaltii
Legionella cincinnatiensis	Legionella genomospecies	Legionella micdadei	Legionella taurinensis
Legionella clemsonensis	Legionella gormanii	Legionella monrovica	Legionella tucsonensis
Legionella donaldsonii	Legionella gratiana	Legionella moravica	Legionella tunisiensis
	Legionella gresilensis	Legionella nagasakiensis	Legionella wadsworthii
	Legionella hackeliae	Legionella nautarum	Legionella waltersii
	Legionella impletisoli	Legionella norrlandica	Legionella worsleiensis
	Legionella israelensis	Legionella oakridgensis	Legionella yabuuchiae
		Legionella jamestowniensis	Legionella parisiensis
		Legionella jamestowniensis	Legionella pittsburghensis
			Legionella pittsburghensis
			Legionella pneumophila
			Legionella quateirensis

Oceanibulbus		Paenibacillus	Prevotella	Quadrisphaera
Oceanibulbus indolifex		Paenibacillus thiaminolyticus	Prevotella albensis	Quadrisphaera granulorum
		Paenibacillus thiaminolyticus	Prevotella amnii	Quadrisphaera granulorum
Oceanicaulis			Prevotella bergensis
Oceanicaulis alexandrii		Pantoea	Prevotella bivia	Quatrionicoccus
		Pantoea agglomerans	Prevotella brevis	Quatrionicoccus australiensis
Oceanicola				Quatrionicoccus australiensis
Oceanicola batsensis			Prevotella bryantii
Oceanicola granulosus			Prevotella buccae
Oceanicola nanhaiensis		Paracoccus	Prevotella buccalis
		Paracoccus alcaliphilus	Prevotella copri	Quinella
Oceanimonas			Prevotella dentalis	Quinella ovalis
Oceanimonas baumannii		Paucimonas	Prevotella denticola
		Paucimonas lemoignei	Prevotella disiens
Oceaniserpentilla			Prevotella histicola
Oceaniserpentilla haliotis		Pectobacterium	Prevotella intermedia	Ralstonia
		Pectobacterium aroidearum		Ralstonia eutropha
Oceanisphaera		Pectobacterium aroidearum	Prevotella maculosa
Oceanisphaera donghaensis		Pectobacterium atrosepticum	Prevotella marshii	Ralstonia insidiosa
Oceanisphaera litoralis		Pectobacterium atrosepticum	Prevotella melaninogenica	Ralstonia mannitolilytica
		Pectobacterium betavasculorum	Prevotella melaninogenica	Ralstonia pickettii
Oceanithermus		Pectobacterium betavasculorum	Prevotella micans	Ralstonia pseudosolanacearum
Oceanithermus desulfurans		Pectobacterium cacticida	Prevotella multiformis	Ralstonia pseudosolanacearum
Oceanithermus profundus		Pectobacterium carnegieana	Prevotella nigrescens	Ralstonia syzygii
		Pectobacterium carnegieana	Prevotella oralis	Ralstonia solanacearum
Oceanobacillus		Pectobacterium carotovorum
Oceanobacillus caeni		Pectobacterium carotovorum	Prevotella oris	Ramlibacter
		Pectobacterium chrysanthemi	Prevotella oulorum	Ramlibacter henchirensis
Oceanospirillum	Pectobacterium cypripedii	Prevotella pallens	Ramlibacter tataouinensis
Oceanospirillum linum	Pectobacterium rhapontici	Prevotella salivae
	Pectobacterium rhapontici	Prevotella stercorea
	Pectobacterium wasabiae	Prevotella tannerae
		Prevotella timonensis
	Planococcus	Prevotella veroralis	Raoultella
	Planococcus citreus		Raoultella ornithinolytica
			Raoultella planticola
			Raoultella terrigena
	Planomicrobium	Providencia
	Planomicrobium okeanokoites	Providencia stuartii	Rathayibacter
	Planomicrobium okeanokoites		Rathayibacter caricis
		Pseudomonas	Rathayibacter festucae
	Plesiomonas	Pseudomonas aeruginosa	Rathayibacter iranicus
	Plesiomonas shigelloides	Pseudomonas alcaligenes	Rathayibacter rathayi
		Pseudomonas anguillispetica	Rathayibacter toxicus
	Proteus	Pseudomonas anguillispetica	Rathayibacter tritici
	Proteus vulgaris	Pseudomonas fluorescens
		Pseudoalteromonas haloplanktis	Rhodobacter
		Pseudoalteromonas haloplanktis	Rhodobacter sphaeroides
		Pseudomonas mendocina
		Pseudomonas pseudoalcaligenes	Ruegeria
		Pseudomonas pseudoalcaligenes	Ruegeria gelatinovorans
		Pseudomonas putida
		Pseudomonas tutzeri
		Pseudomonas syringae

		Psychrobacter
		Psychrobacter faecalis
		Psychrobacter phenylpyruvicus




Saccharococcus	Sagittula	Sanguibacter	Stenotrophomonas	Tatlockia
Saccharococcus thermophilus	Sagittula stellata	Sanguibacter keddieii	Stenotrophomonas maltophilia	Tatlockia maceachemii
		Sanguibacter suarezii	Stenotrophomonas maltophilia	Tatlockia micdadei
Saccharomonospora	Salegentibacter
Saccharomonospora azurea	Salegentibacter salegens	Saprospira	Streptococcus	Tenacibaculum
Saccharomonospora cyanea		Saprospira grandis		Tenacibaculum amylolyticum
Saccharomonospora viridis	Salimicrobium		[siehe unten]	Tenacibaculum amylolyticum
	Salimicrobium album	Sarcina		Tenacibaculum discolor
Saccharophagus		Sarcina maxima	Streptomyces	Tenacibaculum gallaicum
Saccharophagus degradans	Salinibacter	Sarcina ventriculi	Streptomyces achromogenes	Tenacibaculum lutimaris
	Salinibacter ruber		Streptomyces achromogenes	Tenacibaculum mesophilum
Saccharopolyspora		Sebaldella	Streptomyces cesalbus	Tenacibaculum skagerrakense
Saccharopolyspora erythraea	Salinicoccus	Sebaldella termitidis	Streptomyces cescaepitosus	Tenacibaculum skagerrakense
Saccharopolyspora gregorii	Salinicoccus alkaliphilus		Streptomyces cescaepitosus
Saccharopolyspora hirsuta	Salinicoccus hispanicus		Streptomyces cesdiastaticus	Tepidanaerobacter
Saccharopolyspora hordei	Salinicoccus roseus		Streptomyces cesdiastaticus	Tepidanaerobacter syntrophicus
Saccharopolyspora rectivirgula		Serratia	Streptomyces cesexfoliatus	Tepidanaerobacter syntrophicus
Saccharopolyspora spinosa	Salinispora	Serratia fonticola	Streptomyces cesexfoliatus
Saccharopolyspora taberi	Salinispora arenicola	Serratia marcescens	Streptomyces fimbriatus	Tepidibacter
	Salinispora tropica		Streptomyces fradiae	Tepidibacter formicigenes
Saccharothrix		Sphaerotilus	Streptomyces fulvissimus	Tepidibacter thalassicus
Saccharothrix australiensis	Salinivibrio	Sphaerotilus natans	Streptomyces griseoruber
Saccharothrix coeruleofusca	Salinivibrio costicola		Streptomyces griseus	Thermus
Saccharothrix espanaensis		Sphingobacterium	Streptomyces lavendulae	Thermus aquaticus
Saccharothrix longispora	Salmonella	Sphingobacterium multivorum	Streptomyces phaeochromogenes	Thermus filiformis
Saccharothrix mutabilis	Salmonella bongori	Sphingobacterium multivorum	Streptomyces phaeochromogenes	Thermus thermophilus
Saccharothrix syringae	Salmonella enterica		Streptomyces thermodiastaticus
Saccharothrix tangerinus	Salmonella subterranea		Streptomyces thermodiastaticus
Saccharothrix texasensis		Staphylococcus	Streptomyces tubercidicus
	Salmonella typhi	[siehe unten]	Streptomyces tubercidicus



Staphylococcus

S. arlettae	S. equorum	S. microti	S. schleiferi
S. agnetis	S. felis	S. muscae	S. sciuri
S. aureus	S. fleurettii	S. nepalensis	S. simiae
S. auricularis	S. gallinarum	S. pasteuri	S. simulans
S. capitis	S. haemolyticus	S. petrasii	S. stepanovicii
S. caprae	S. hominis	S. pettenkoferi	S. succinus
S. carnosus	S. hyicus	S. piscifermentans	S. vitulinus
S. caseolyticus	S. intermedius	S. pseudintermedius	S. warneri
S. chromogenes	S. kloosii	S. pseudolugdunensis	S. xylosus
S. cohnii	S. leei	S. pulvereri
S. condimenti	S. lentus	S. rostri
S. delphini	S. lugdunensis	S. saccharolyticus
S. devriesei	S. lutrae	S. saprophyticus
S. epidermidis	S. lyticans
	S. massiliensis

Streptococcus
Streptococcus agalactiae	Streptococcus infantarius	Streptococcus orisratti	Streptococcus thermophilus
Streptococcus anginosus	Streptococcus iniae	Streptococcus parasanguinis	Streptococcus thermophilus
Streptococcus bovis	Streptococcus intermedius	Streptococcus parasanguinis	Streptococcus sanguinis
Streptococcus canis	Streptococcus lactarius	Streptococcus peroris	Streptococcus sobrinus
Streptococcus constellatus	Streptococcus milleri	Streptococcus pneumoniae	Streptococcus suis
Streptococcus downei	Streptococcus mitis	Streptococcus pneumoniae	Streptococcus uberis
Streptococcus dysgalactiae	Streptococcus mutans	Streptococcus pseudopneumoniae	Streptococcus vestibularis
Streptococcus equines	Streptococcus oralis	Streptococcus pseudopneumoniae	Streptococcus vestibularis
Streptococcus faecalis	Streptococcus tigurinus	Streptococcus pyogenes	Streptococcus viridans
Streptococcus ferus		Streptococcus ratti	Streptococcus zooepidemicus
		Streptococcus salivariu	Streptococcus zooepidemicus



Uliginosibacterium	Vagococcus	Vibrio	Virgibacillus	Xanthobacter
	Vagococcus camiphilus	Vibrio aerogenes	Virgibacillus halodenitrificans	Xanthobacter agilis
Uliginosibacterium gangwonense	Vagococcus elongatus	Vibrio aestuarianus	Virgibacillus halodenitrificans	Xanthobacter aminoxidans
Uliginosibacterium gangwonense	Vagococcus fessus	Vibrio albensis	Virgibacillus pantothenticus	Xanthobacter autotrophicus
	Vagococcus fluvialis	Vibrio alginolyticus	Virgibacillus pantothenticus	Xanthobacter flavus
Ulvibacter	Vagococcus lutrae	Vibrio campbellii		Xanthobacter tagetidis
Ulvibacter litoralis	Vagococcus salmoninarum	Vibrio cholerae	Weissella	Xanthobacter viscosus
	Vagococcus salmoninarum	Vibrio cincinnatiensis	Weissella cibaria
Umezawaea		Vibrio coralliilyticus	Weissella confusa	Xanthomonas
Umezawaea tangerina	Variovorax	Vibrio cyclitrophicus	Weissella halotolerans	Xanthomonas albilineans
	Variovorax boronicumulans	Vibrio diazotrophicus	Weissella hellenica	Xanthomonas alfalfae
Undibacterium	Variovorax boronicumulans	Vibrio fluvialis	Weissella kandleri	Xanthomonas arboricola
Undibacterium pigrum	Variovorax dokdonensis	Vibrio furnissii	Weissella koreensis	Xanthomonas axonopodis
	Variovorax paradoxus	Vibrio gazogenes	Weissella minor	Xanthomonas campestris
Ureaplasma	Variovorax soli	Vibrio halioticoli	Weissella paramesenteroides	Xanthomonas citri
Ureaplasma urealyticum		Vibrio harveyi	Weissella paramesenteroides	Xanthomonas codiaei
	Veillonella	Vibrio ichthyoenteri	Weissella soli	Xanthomonas cucurbitae
	Veillonella atypica	Vibrio mediterranei	Weissella thailandensis	Xanthomonas euvesicatoria
	Veillonella caviae	Vibrio metschnikovii	Weissella viridescens	Xanthomonas fragariae
Ureibacillus	Veillonella criceti	Vibrio mytili		Xanthomonas fuscans
Ureibacillus composti	Veillonella dispar	Vibrio natriegens	Williamsia	Xanthomonas gardneri
Ureibacillus suwonensis	Veillonella montpellierensis	Vibrio navarrensis	Williamsia marianensis	Xanthomonas hortorum
Ureibacillus terrenus	Veillonella montpellierensis	Vibrio nereis	Williamsia maris	Xanthomonas hyacinthi
Ureibacillus thermophilus	Veillonella parvula	Vibrio nigripulchritudo	Williamsia serinedens	Xanthomonas perforans
Ureibacillus thermosphaericus	Veillonella ratti	Vibrio ordalii		Xanthomonas phaseoli
	Veillonella rodentium	Vibrio orientalis	Winogradskyella	Xanthomonas pisi
		Vibrio parahaemolyticus	Winogradskyella thalassocola	Xanthomonas populi
	Venenivibrio	Vibrio pectenicida	Winogradskyella thalassocola	Xanthomonas theicola
	Venenivibrio stagnispumantis	Vibrio penaeicida		Xanthomonas translucens
	Venenivibrio stagnispumantis	Vibrio proteolyticus	Wolbachia
		Vibrio shilonii	Wolbachia persica	Xanthomonas vesicatoria
		Vibrio splendidus
		Vibrio tubiashii		Xylella
	Verminephrobacter	Vibrio vulnificus		Xylella fastidiosa
	Verminephrobacter eiseniae		Wolinella
	Verminephrobacter eiseniae		Wolinella succinogenes	Xylophilus
				Xylophilus ampelinus


	Verrucomicrobium		Zobellia
	Verrucomicrobium		Zobellia galactanivorans
	spinosum		Zobellia uliginosa

			Zoogloea
			Zoogloea ramigera
			Zoogloea resiniphila

Xenophilus	Yangia	Yersinia mollaretii	Zooshikella	Zobellella
Xenophilus azovorans	Yangia pacifica	Yersinia philomiragia	Zooshikella ganghwensis	Zobellella denitrificans
		Yersinia pestis		Zobellella taiwanensis
Xenorhabdus	Yaniella	Yersinia	Zunongwangia
Xenorhabdus beddingii	Yaniella flava	pseudotuberculosis	Zunongwangia profunda
Xenorhabdus bovienii	Yaniella halotolerans	Yersinia rohdei
Xenorhabdus cabanillasii		Yersinia ruckeri	Zymobacter	Zeaxanthinibacter
Xenorhabdus doucetiae	Yeosuana		Zymobacter palmae	Zeaxanthinibacter enoshimensis
Xenorhabdus griffiniae	Yeosuana aromativorans	Yokenella		Zeaxanthinibacter enoshimensis
Xenorhabdus hominickii		Yokenella regensburgei	Zymomonas
Xenorhabdus koppenhoeferi	Yersinia		Zymomonas mobilis	Zhihengliuella
Xenorhabdus nematophila	Yersinia aldovae	Yonghaparkia		Zhihengliuella halotolerans
Xenorhabdus poinarii	Yersinia bercovieri	Yonghaparkia alkaliphila	Zymophilus
	Yersinia enterocolitica		Zymophilus paucivorans	Xylanibacterium
Xylanibacter	Yersinia entomophaga	Zavarzinia	Zymophilus raffinosivorans	Xylanibacterium ulmi
Xylanibacter oryzae	Yersinia frederiksenii	Zavarzinia compransoris	Zymophilus raffinosivorans
	Yersinia intermedia
	Yersinia kristensenii

ACE-Hemmer mit	Dekongestiva	Respiratorische Wirkstoffe	Ohrenwirkstoffe
Kalziumkanalblockern	Dermatologische Wirkstoffe	Geschlechtshormone	Reninhemmer
ACE-Hemmer mit Thiaziden	Diagnostische Radiopharmazeutika	Topische Wirkstoffe	Respiratorische Wirkstoffe
Adamantan -V irostatika	Diarylchinoline	Unklassifizierte Wirkstoffe	Respiratorische
Kortikosteroide	Dibenzazepin-Antikonvulsiva	Vaginale Wirkstoffe	Inhalationswirkstoffe
Kortikosteroidhemmer adrenerge Bronchodilatoren	Verdauungsenzyme	Mitosehemmer	Rifamycinderivate
Kortikosteroidhemmer adrenerge Bronchodilatoren	Dipeptidylpeptidase-4-Hemmer	Monoaminoxidasehemmer	Salicylate
Mittel für hypertensive Krisen	Diuretika	Mund- und Halsprodukte	Verödungsmittel
Mittel für Lungenhochdruck	dopaminerge Anti-Parkinson-Mittel	mTOR-Hemmer	Cephalosporine der 2.
Aldosteronrezeptorantagonisten	Wirkstoffe zur Verwendung bei	Mukolytika	Generation selektive
Alkylierungsmittel	Alkohlabhängigkeit	Multikinasehemmer	Generation selektive
Allergenika	Echinocandine	Muskelrelaxanzien	Östrogenrezeptormodulatoren selektive Immunsuppressiva selektive Phosphodiesterase-4
Alpha-Glucosidase-Hemmer	EGFR-Hemmer	Mydriatika
Alternative Arzneimittel	Östrogenrezeptorantagonisten	Narkotische Analgesika-
Amöbenmittel	Östrogene	Kombinationen	Hemmer selektive Serotonin-
Aminoglykoside	Expektorantien	Narkosemittel	Hemmer selektive Serotonin-
Aminopenicilline	Faktor Xa-Hemmer	Nasale Antiinfektionsmittel	Wiederaufnahmehemmer
Aminosalicylate	Aus Fettsäuren abgeleitete	Nasale Antihistaminika und	Serotonin -Noradrenalin-
AMPA-Rezeptorantagonisten	Antikonvulsiva	Dekongestiva	Wiederaufnahmehemmer serotoninerge neuroenterische
Amylin-Analoga	Fibrinsäurederivate	Nasale Gleitmittel und	Wiederaufnahmehemmer serotoninerge neuroenterische
Kombinierte Analgesika	Cephalosporine der 1. Generation	Nasenduschen	Modulatoren
Analgesika	Cephalosporine der 4. Generation	Nasale Präparate	Geschlechtshormone-
Androgene und Anabolika	Mittel gegen funktionelle	nasale Steroide	Kombinationen
ACE-Hemmer	Darmstörung	Natürliche Penicilline	Geschlechtshormone
Angiotensin II-Hemmer mit	Gallenstein-Lösungshifsmittel	Neprilysinhemmer	SGLT-2-Hemmer
Kalziumkanalblockern	Gammaaminobuttersäure-Analoga	Neuraminidasehemmer	Skelettmuskelrelaxanzien -
Angiotensin II-Hemmer mit	Gammaaminobuttersäure-	Neuromuskuläre Blocker	Kombinationen
Thiaziden	Wiederaufnahmehemmer	neuronale Kaliumkanalöffner	Skelettmuskelrelaxanzien
Angiotensinrezeptorblocker	Magen-Darm-Wirkstoffe	Cephalosporine der nächsten	Raucherentwöhnungsmittel
Angiotensinrezeptorblocker und	Anästhetika	Generation	Somatostatin und
Neprilysinhemmer	Urogenitalwirkstoffe	Nikotinsäurederivate	Somatostatinanaloga
Anorektale Präparate	Magen-Darm-Stimulantien	NK1-Rezeptorantagonisten	Spermizide
Appetithemmer	Glukokortikoide	NNRTIs	Statine sterile Spüllösungen
Antazide	Glukoseerhöhungsmittel	Nicht kardioselektive Betablocker	Statine sterile Spüllösungen
Wurmmittel	Glykopeptid-Antibiotika	Nicht jodierte Kontrastmittel	Streptomyces- Derivate
Antiangiogene Ophthalmika	Glykoprotein-	Nicht ionische jodierte	Succinimid -Antikonvulsiva
Anti-CTLA-4-monoklonale	Thrombozytenaggregationshemmer	Kontrastmittel	Sulfonamide
Antikörper	Glycylcycline	Nicht-Sulfonylhamstoffe	Sulfonylharnstoffe
Antiinfektionsmittel	GnRH (gonadotropin releasing hormines)	Nichtsteroidale Antirheumatika	Synthetische
Anti-PD-1-monoklonale	GnRH (gonadotropin releasing hormines)	NS5A-Hemmer	Eisprungstimulanzien tetrazyklische Antidepressiva
Antikörper	GnRH-Antagonisten	Nukleosid-Reverse-Transcriptase-	Eisprungstimulanzien tetrazyklische Antidepressiva
Antiadrenergika (zentral) mit	Gonadotropine	Hemmer (NRTIs)	Tetracycline therapeutische Radiopharmaka therapeutische Impfstoffe
Thiaziden	Antiarrhythmika der Gruppe I	Nutraceuticals
Antiadrenergika (peripher) mit	Antiarrhythmika der Gruppe II	Ernährungsprodukte
Thiaziden	Antiarrhythmika der Gruppe III	Augenanästhetika	Thiazid-Diuretika
Antiadrenergika, zentral wirkend	Antiarrythmika der Gruppe IV	Ophthalmische	Thiazolidindione
Antiadrenergika, zentral wirkend	Antiarrythmika der Gruppe V	Antiinfektionsmittel	Thioxanthene
Antiadrenergika, peripher wirkend	Somatotropin-Rezeptorblocker	Ophthalmische Antiphlogistika	Cephalosporine der 3.
Antiadrenergika, peripher wirkend	Somatotropine	Ophthalmische Antihistaminika und Dekongestiva	Generation
Antiandrogene	Guanylatcyclase-C-Agonisten	Ophthalmische Antihistaminika und Dekongestiva	Thrombinhemmer
Anti-Angina-Mittel	H. pylori-Ausrottungsmittel	Augendiagnostika	Thrombolytika
Antiarrhythmika	H2-Antagonisten	Ophthalmische Glaukom-Mittel	Schilddrüsenmittel
Antiasthmatische	Hedgehog-Signalweg-Hemmer	Ophthalmische Gleitmittel und	TNF alfa-Hemmer
Kombinationen	Hämatopoetische Stammzellen-	Augenspülungen	Tokolytika
Antibiotika/Antineoplastika anticholinerge Antiemetika anticholinerge Antiparkinson-Mittel anticholinerge	Mobilisierungsmittel	Augenpärparate	Topische Akne-Wirkstoffe
	Heparin-Antagonisten	Augensteroide	Topische Wirkstoffe
	Heparine	Augensteroide mit	Topische Anästhetika
	HER2-Hemmer	Antiinfektionsmitteln	Topische Antiinfektionsmittel
	Pflanzliche Produkte	Mittel für Augenchirurgie	Topische Anti-Rosazea-Mittel
Bronchodilatoren anticholinerge Chronotropika	Histondeacetylasehemmer	Orale Nahrungsergänzungsmittel	Topische Antibiotika
Bronchodilatoren anticholinerge Chronotropika	Hormone	Immunstimulanzien	Topische Antimykotika
Anticholinergika/Spasmolytika	Hormone/Antineoplastika	Immunsuppressiva	Topische Antihistaminika
Antikoagulantien-Gegenmittel	Hydantoin-Antikonvulsiva	Ohrenanästhetika	Topische Antineoplastika
Antikoagulantien	Hydrazidderivate	Ohren-Antiinfektionsmittel	topical Antipsoriatika
Antikonvulsiva	Immunglobuline	Ohrenpräparate	Topische Virostatika
Antidepressiva	Immunologische Wirkstoffe	Ohrensteroide	Topische Adstringentien
Antidiabetika	Immunstimulanzien	Ohrensteroide mit	Topische
Antidiabetische Kombinationen	Immunsuppressiva	Antiinfektionsmitteln	Nekrosenablösungsmittel
Antidiarrhoika	Mittel gegen Impotenz	Oxazolidindion-Antikonvulsiva	Topische
Antidiuretische Hormone	Biologische Produkte zur in vivo-	Oxazolidinon-Antibiotika	Depigmentierungsmittel
Antidote	Diagnose	Nebenschilddrüsenhormon und	Topische Weichmacher
Antiemetika/Anti-Schwindel-	Incretinmimetika	Analoga	Topische Keratolytika
Mittel	Inhalierte Antiinfektionsmittel	PARP-Hemmer	Topische nichtsteroidale
Antimykotika	Inhalierte Kortikosteroide	PCSK9-Hemmer	Antiphlogistika topische
Antigonadotropika	Inotropika	penicillinaseresistente Penicilline	Antiphlogistika topische
Anti-Gicht-Mittel	Insulin	Penicilline	Photochemotherapeutika
Antihistaminika	Insulinähnlicher Wachstumsfaktor	Periphere	Topische Hautrötungsmittel
Antihyperlipidämika antihyperlipidämische	Integrase-Strangtransferhemmer	Opioidrezeptorenantagonisten	Topische Steroide
Antihyperlipidämika antihyperlipidämische	Interferone	Gemischte periphere	Topische Steroide mit
Kombinationen	Interleukinhemmer	Opioidrezeptoragonisten/-	Antiinfektionsmitteln
antihypertensive	Interleukine	antagonisten	Triazin-Antikonvulsiva trizyklische Antidepressiva
Kombinationen	Intravenöse Ernährungsprodukte	periphere Vasodilatatoren	Triazin-Antikonvulsiva trizyklische Antidepressiva
Antihyperurikämika	Jodierte Kontrastmittel	Peripher wirkende Mittel gegen	Trifunktionelle monoklonale
Malaria-Mittel antimalariale Kombinationen antimalariale Chinoline	Ionische jodierte Kontrastmittel	Adipositas	Antikörper
	Eisenerzeugnisse	Phenothiazin- Antiemetika	Ultraschallkontrastmittel
	Ketolide	Phenothiazin - Antip sychotika	Kombinationen für die oberen
Antimetaboliten	Abführmittel	Phenylpiperazin - Antidepressiva	Atemwege
Anti-Migräne-Mittel	Leprostatika	Phosphatbinder	Harnstoff- Antikonvulsiva
Antineoplastische	Leukotrien- Modifikatoren	Plasmaexpander	Mittel gegen
Detoxifikationsmittel	Lincomycinderivate	Thrombozytenaggregationshemm er	Harnstoffzyklusstörungen
antineoplastische Interferone	Lokal injizierbare Anästhetika	Thrombozytenaggregationshemm er	Harnwegs-Antiinfektionsmittel
Antineoplastika	Lokal injizierbare Anästhetika mit	Plättchenstimulanzien	Harnwegs-Spasmolytika
Anti- Parkinson- Mittel	Kortikosteroiden	Polyene	Harnwegs-pH-Stellmittel
Thrombozytenaggregationshem mer antipseudomonale Penicilline	Schleifendiuretika	Kaliumschonende Diuretika mit	Uterotonika
	Lungentenside	Thiaziden	Impfstoffkombinationen
	Lymphatische Farbstoffe	Kaliumschonende Diuretika	Vaginale Antiinfektionsmittel
Antipsoriatika	lysosomale Enzyme	Probiotika	Vaginale Präparate
Antipsychotika	Makrolidderivate	Progesteronrezeptormodulatoren	Vasodilatatoren
Antirheumatika	Makrolide	Progestine	Vasopressinantagonisten
Antiseptika und Germizide	Kontrastmittel für	Prolactinhemmer	Vasopressoren
Antithyreoide Mittel	Kernspintomographie	Prostaglandin-D2 -Antagonisten	VEGF/VEGFR-Hemmer
Antitoxine und Gegengifte	Mastzellstabilisatoren	Proteasehemmer	Virusimpfstoffe
Mittel gegen Tuberkulose	Medizinisches Gas	PAR-1-Antagonisten (protease-	Viskosupplementationsmittel
Kombinationen gegen	Meglitinide	activated receptor-1)	Vitamin- und Mineralstoff-
Tuberkulose	Stoffwechselwirkstoffe	Proteasomhemmer	Kombinationen
Antitussiva	Methylxanthine	Protonenpumpenhemmer	Vitamine
Virostatika	Mineralokortikoide	Psoralene	5-alpha-Reduktasehemmer
Virostatische	Mineralstoffe und Elektrolyten	Psychotherapeutika	5-Aminosalicylate
Wiederholungsimpfungen	Wirkstoffe	psychotherapeutische	5HT3-Rezeptorantagonisten
Virostatische Kombinationen	Analgesika	Kombinationen	Chloridkanalaktivatoren
Virostatische Interferone	Antibiotika	Purin-Nukleoside	Cholesterinaufnahmehemmer cholinerge Agonisten
Anxiolytika, Sedativa und	Antikonvulsiva	Pyrrolidin - Antikonvulsiva	Cholesterinaufnahmehemmer cholinerge Agonisten
Hypnotika	Antidepressiva	Chinolone	Cholinerge Muskelstimulanzien
Aromatasehemmer atypische Antipsychotika	Antidiabetika	Ultraschallkontrastmittel	Cholinesterasehemmer
Aromatasehemmer atypische Antipsychotika	Antiemetika	Radiologische Hilfsmittel	ZNS-Stimulanzien
Azol- Antimykotika	Antimykotika	Radiologische Wirkstoffe	Gerinnungsmodifikatoren
Bakterielle Impfstoffe	Antihyperlipidämika	Radiologische Konjugationsmittel	Koloniestimulierende Faktoren
Barbiturat-Antikonvulsiva	antihypertensive Kombinationen	Radiopharmaka recombinante menschliche	Verhütungsmittel
Barbiturate	Antimalariamittel	Radiopharmaka recombinante menschliche	Corticotropin
BCR-ABL-Tyrosinekinasehemmer	Antineoplastika	Erythropoetine	Coumarine und Indandione
BCR-ABL-Tyrosinekinasehemmer	Anti-Parkinson-Mittel	Antikonvulsiva	cox-2-Hemmer
Benzodiazepin-Anticonvulsiva	Antipsychotika	Carboanhydrasehemmer
Benzodiazepine	Mittel gegen Tuberkulose	Herzbelastungsmittel
Betablocker mit	Virostatika	Kardioselektive Betablocker
Kalziumkanalblockern	Anxiolytika, Sedativa und	Herz-Kreislauf-Wirkstoffe
Betablocker mit Thiaziden	Hypnotika	Katecholamine
beta-adrenerge Blocker	Knochen resorptionshemmer	CD20 monoklonale Antikörper
Beta-laktamasehemmer	Herz-Kreislauf-Wirkstoffe	CD30 monoklonale Antikörper
Gallensäurebinder	ZNS-Wirkstoffe	CD33 monoklonale Antikörper
Biologische Wirkstoffe	Gerinnungsmodifikatoren	CD38 monoklonale Antikörper
Bisphosphonate	Diagnostische Farbstoffe	CD52 monoklonale Antikörper
BMP (bone morphogenetic proteins)	Diuretika	ZNS-Wirkstoffe
BMP (bone morphogenetic proteins)	Urogenitalwirkstoffe	Cephalosporine
Knochen resorptionshemmer	Magen-Darm-Wirkstoffe	Cephalosporine/Beta-laktamasehemmer
Bronchodilator-Kombinationen	Hormone	Cephalosporine/Beta-laktamasehemmer
Bronchodilatoren	Stoffwechselwirkstoffe	Cerumenolytika
Kalzimimetika	Opthalmika	CFTR-Kombinationen
Calcineurinhemmer		CFTR-Potentiatoren
Calcitonin		Komplexbildner
Kalziumkanalblocker		Chemokinrezeptorantagonist
Carbamat-Antikonvulsiva
Carbapeneme
Carboanhydrasehemmer

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2015/058018 [0006]
US 2015139943 [0006]
WO 2013063361 [0070]
US 9113616 [0070]
US 20130109053 [0070]
US 20160081314 [0070]
WO 2016044745 [0070]
WO 2012079000 A1 [0083, 0084, 0095, 0099, 0100, 0109, 0110, 0111, 0112]
US 8906682 [0083, 0112]
US 8911993 [0083, 0112]
US 8916381 [0083, 0112]
US 8975071 [0083, 0112]
US 9101584 [0083, 0112]
US 9102760 [0083, 0112]
US 9102761 [0083, 0112]
US 9328156 [0083, 0112]
US 9464140 [0083, 0112]
US 9481728 [0083, 0112]
US 9499629 [0083, 0112]
US 9518123 [0083, 0112]
US 9540445 [0083, 0112]
US 20130287748 [0083, 0112]
US 20130288368 [0083, 0112]
US 20130309258 [0083, 0112]
US 20140106449 [0083, 0112]
US 20140370017 [0083, 0112]
US 20150050729 [0083, 0112]
US 20150093822 [0083, 0112]
US 20150099299 [0083, 0112]
US 20150118202 [0083, 0112]
US 20160130355 [0083, 0112]
US 20160159907 [0083, 0112]
US 20160194404 [0083, 0112]
US 20160208012 [0083, 0112]
WO 2014012001 [0083]
US 20150290244 [0083]
WO 2015136541 [0279]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Methods Mol Biol. 2012;907:645-66. doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_36, „Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy“, Cheadle EJ et al. [0003]
Discov Med. 2014 Nov;18(100):265-71, „Challenges to chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy for cancer“, Magee MS & Snook AE [0005]
Cell. 2007 Oct 5;131(1):33-45, „Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system“, Garrett WS et al. [0052]
Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al., „Interleukin 17-producing CD41 effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages“, Nat Immunol. 2005;6(11): 1123-1132 [0054]
Park H, Li Z, Yang XO, et al., „A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17“, Nat Immunol. 2005; 6(11):1133-1141 [0054]
Nature, 2014 Jun 5;510(7503):152-6. doi: 10.1038/nature13279. Epub 2014 Apr 13, „Focused specificity of intestinal Th17 cells towards commensal bacterial antigens“, Yang Y et al. [0057]
J Immunother. 2009 Sep; 32(7): 689-702, doi: 10.1097/CJI.0b013e3181ac6138, „Construction and Pre-clinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor“, James N. Kochenderfer et al [0083]
Turnbaugh, P. J., R. E. Ley, M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon. 2006, „An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest“, Nature 444:1027-1131 [0163]
Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251-8. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; „A modular master on the move: the Tn916 family of mobile genetic elements“, Roberts A, Mullany P [0246]
F.A. Ran et al., „In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9,“ Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015 [0256]
Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Patrick Boyaval, Moineau, S., ... Horvath, P. (2007). CRISPRProvides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes. Science, 315(March), 1709-1712. [0333]
Bryksin, A. V, & Matsumura, I. (2010). Rational design of a plasmid origin that replicates efficiently in both gram-positive and gram-negative bacteria. PloS One, 5(10), e13244. [0333]
Chan CTY, Lee JW, Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ: „Deadman“ and „Passcode“ microbial kill switches for bacterial containment. Nat Chem Biol 2015, 12(December): 1-7. [0333]
Horvath, P., Romero, D. A., Coûté-Monvoisin, A.-C., Richards, M., Deveau, H., Moineau, S., . Barrangou, R. (2008). Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology, 190(4), 1401-12. [0333]
Ludwig, E. S., Klipper, R., Magrum L., Wose C., & Stackebrandt, E. (1985). The phylogenetic position of Streptococcus and Enterococcus. Journul of Gencwl Microhiologj., 131, 543-55 1. [0333]
Mercenier, A. (1990). Molecular genetics of Streptococcus thermophilus. FEMS Microbiology Letters, 87(1-2), 61-77. [0333]
Samaržija, D., Antunac, N., & Havranek, J. (2001). Taxonomy, physiology and growth of Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo, 51(1), 35-48. [0333]
Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acids Research, 39(21), 9275-9282. [0333]
Somkuti, G. A., & Steinberg, D. H. (1988). Genetic transformation of Streptococcus thermophilus by electroporation. Biochimie, 70(4), 579-585. [0333]
Sorg, R. A., Kuipers, O. P., & Veening, J.-W. (2014). Gene expression platform for synthetic biology in the human pathogen Streptococcus pneumoniae. ACS Synthetic Biology, 4(3), 228-239. [0333]
Suvorov, a. (1988). Transformation of group A streptococci by electroporation. FEMS Microbiology Letters, 56(1), 95-99. [0333]
ie, Z., Qi, F., & Merritt, J. (2013). Development of a tunable wide-range gene induction system useful for the study of streptococcal toxin-antitoxin systems. Applied and Environmental Microbiology, 79(20), 6375-84. [0333]
Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microbial Biotechnology, 4(1), 98-105. [0333]
Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microbial Biotechnology, 4(1), 98-105. http://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x [0356]
Wegmann, U., O'Connell-Motherway, M., Zomer, A., Buist, G., Shearman, C., Canchaya, C., . Kok, J. (2007). Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Journal of Bacteriology, 189(8), 3256-70. http://doi.org/10.1128/JB.01768-06 [0356]

Claims

Geführtes Nucleasesystem zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Reduzierung einer Krankheit oder eines Zustandes bei einem Patienten, wobei das Verfahren das Modulieren von Immunzellen beim Patienten durch Verändern einer Mikrobiota des Patienten mithilfe einer geführten Nuclease des Systems umfasst, wobei die Krankheit bzw. der Zustand durch Immunzellen (z.B. T-Zellen) vermittelt wird oder durch Veränderung von Aktivitäten oder Populationen von Immunzellen beim Patienten behandelt oder verhütet wird.
System nach Anspruch 1, wobei das Verfahren das selektive Zielen auf das Genom von Zellen einer ersten Art in der Mikrobiota unter Verwendung der geführten Nuclease umfasst, um die Veränderung zu bewirken.
System nach Anspruch 2, wobei das selektive Zielen das Zielen auf (i) Arten desselben Phylums wie die erste Art oder auf (ii) einen unterschiedlichen Stamm der ersten Art vermeidet.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren selektiv erste Zellen in der Mikrobiota tötet, ohne dabei auf zweite Zellen zu zielen, wobei die zweiten Zellen (i) zu einem mit dem Stamm der ersten Art verwandten Stamm gehören oder (ii) zu einer Art gehören, die sich von der ersten Art unterscheidet und mit der ersten Art phylogenetisch verwandt ist, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine 16s ribosomale RNA codierende DNA-Sequenz aufweist, die mit einer 16s ribosomale RNA codierenden DNA-Sequenz der ersten Zellart bzw. des ersten Zellstammes zu mindestens 80 % identisch ist, wobei das Wachstum der zweiten Zellen in der Mikrobiota durch das Verfahren nicht gehemmt wird oder das Wachstum der ersten Zellen um mindestens ein 5-faches der Wachstumshemmung der zweiten Zellen gehemmt wird.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei (a) es sich beim Patienten um einen menschlichen Patienten handelt; (b) es sich bei der Mikrobiota um eine Darmflora handelt; (c) das Verfahren selektives Zielen auf das Genom einer ersten Art in der Mikrobiota unter Verwendung der geführten Nuclease zur Bewirkung der Veränderung umfasst; und (d) wobei das Verfahren selektiv erste Zellen in der Mikrobiota tötet, ohne dabei auf zweite Zellen zu zielen, wobei die zweiten Zellen (a) zu einem mit dem Stamm der ersten Art verwandten Stamm gehören oder (b) zu einer Art gehören, die sich von der ersten Art unterscheidet und mit der ersten Art phylogenetisch verwandt ist, wobei die zweite Art bzw. der zweite Stamm eine 16s ribosomale RNA codierende DNA-Sequenz aufweist, die mit einer 16s ribosomale RNA codierenden DNA-Sequenz der ersten Zellart oder des ersten Zellstammes zu mindestens 80 % identisch ist.
Ex-vivo-Immunzellpopulation zur Verwendung bei einem adoptiven Zelltherapieverfahren bei einem Patienten zur Behandlung bzw. Verhütung einer Krankheit bzw. eines Zustandes beim Patienten, wobei das Verfahren umfasst: (a) Ausführen einer adoptiven Immunzelltherapie beim Patienten, umfassend das Verabreichen von Zellen der Population an den Patienten, wobei die Verabreichung der Immunzellen die Krankheit bzw. den Zustand beim Patienten behandeln kann; und (b) Ändern des relativen Anteils einer Teilgesamtheit von Zellen einer ersten bakteriellen Art bzw. eines ersten bakteriellen Stammes oder archaealen Art oder eines archaealen Stammes in der Darmflora des Patienten, wodurch eine veränderte Darmflora erzeugt wird, die beim Patienten die Immunzelltherapie moduliert; wobei der Schritt (b) durch Zielen auf die Teilgesamtheit der ersten Zellen ausgeführt wird, indem an sie ein antibakterielles bzw. antiarchaeales geführtes Nukleasesystem gleichzeitig oder sequentiell mit der Immunzellpopulation verabreicht wird, wobei erste Zellen getötet werden oder das Wachstum der Teilgesamtheit reduziert wird, wodurch der Anteil der Teilgesamtheit in der Darmflora des Patienten reduziert wird.
System oder Population nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei die ersten Zellen bakterielle oder archaeale Zellen sind, z.B. Firmicutes-Zellen.
System oder Population nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das Verfahren das Modifizieren (z.B. Schneiden und/oder Mutieren) von einer oder mehreren genomischen oder episomalen Zielnukleotidsequenzen von Zellen der ersten Art umfasst.
System oder Population nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei die ersten Zellen eine Population von Wirtszellen umfassen, wobei das Verfahren das Modifizieren einer Zielsequenz bei den Wirtszellen umfasst, wobei die Modifizierung der Zielsequenz ausgeführt wird durch: a. Kombinieren der Mikrobiota mit mehreren Kopien gentechnisch erzeugter Nukleinsäuresequenzen, die wirtmodifizierende (HM) crRNAs codieren, und b. Exprimieren von HM-crRNAs bei Wirtszellen, wobei jede gentechnisch erzeugte Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, mit einer Cas-Nuclease in einer jeweiligen Wirtszelle ein HM-CRISPR/Cas-System zu bilden, und die gentechnisch erzeugte Sequenz umfasst: (i) Spacer- und Repeat-Sequenzen, die eine HM-crRNA codieren; (ii) wobei die HM-crRNA eine Sequenz umfasst, die sich mit einer Zielsequenz einer Wirtszelle hybridisieren kann, um die Cas-Nuclease zur Zielsequenz in der Wirtszelle zu führen; und das HM-System gegebenenfalls eine tracrRNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die eine tracrRNA-Sequenz exprimiert, umfasst, wobei HM-crRNAs die Cas-Modifizierung der Zielsequenzen des Wirts in den Wirtszellen führen, wobei Wirtszellen getötet werden oder das Wachstum der Wirtszellpopulation reduziert wird, wodurch der Anteil der besagten ersten Zellen in der Mikrobiota reduziert wird.
System nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 7 bis 9, wobei die modulierten Immunzellen endogene Zellen des Patienten und/oder (z.B. durch eine adoptive Zelltherapie) verabreichte Zellen umfassen.
System oder Population nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nuklease eine RNA-geführte Nuclease ist.
System oder Population nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das System ein gentechnisch erzeugtes CRISPR/Cas-System, TALEN-System, Meganucleasesystem oder Zinkfingersystem ist.
System oder Population nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren beim Patienten (i) eine T_H1-, T_H17- und/oder T_reg-Zellpopulation hochreguliert oder (ii) eine T_H1-, T_H17- und/oder eine T_reg-Zellpopulation herunterreguliert.
System oder Population nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ein Verfahren zum Modulieren einer Therapie der Krankheit bzw. des Zustandes beim Patienten ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Durchführen der Therapie beim Patienten; und (b) Herbeiführen einer Dysbiose der Darmbakterien beim Patienten durch Ausführen der Veränderung der Mikrobiota unter Verwendung der geführten Nuclease, wobei die Dysbiose beim Patienten die Therapie durch das Modulieren von Immunzellen beim Patienten moduliert.
System oder Population nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich um ein Verfahren handelt zum (a) Verstärken einer Immun-Checkpoint-Antagonismus- bzw. -Agonismus-Therapie beim Patienten, wobei gegebenenfalls die Therapie eine Antikörpertherapie ist, wobei ein Antikörper verwendet wird, der ausgewählt ist aus Ipilimumab (oder YERVOY™), Tremelimumab, Nivolumab (oder OPDIVO™), Pembrolizumab (oder KEYTRUDA™), Pidilizumab, BMS-936559, Durvalumab und Atezolizumab, oder (b) Modulieren einer Impfstofftherapie der Krankheit bzw. des Zustandes; oder (c) Modulieren einer Zelltherapie (z.B. einer adoptiven Immunzelltherapie) der Krankheit bzw. des Zustandes, gegebenenfalls zum Dämpfen der zellbasierten Therapie oder einer Nebenwirkung davon (z.B. Zytokinfreisetzungssyndrom); oder (d) Modulieren einer CAR-T- oder TILs-Therapie zur Behandlung einer Krebserkrankung beim Patienten oder (e) Reduzieren der durch die T_H2-Zell-Zytokinfreisetzung vermittelten Autotoxizität beim Patienten.
System oder Population nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Krankheit bzw. der Zustand eine Krebserkrankung, Autoimmunerkrankung bzw. -zustand, Entzündungserkrankung bzw. -zustand, Virusinfektion (z.B. HIV-Infektion bei einem menschlichen Patienten), allergische Krankheit bzw. Zustand oder eine Krankheit oder ein Zustand ist, der von einer Virusinfektion vermittelt oder verursacht wird.
System oder Population nach einem der Ansprüche 2 bis 16, wobei das Wachstum der ersten Zellpopulation um mindestens ein 5-faches reduziert wird.
System nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 7 bis 17, wobei es sich bei der Mikrobiota um eine Darmflora des Patienten handelt.
System oder Population nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Ausführung des Verfahrens zur Veränderung der Mikrobiota, wodurch Paneth-Zellen beim Patienten stimuliert werden, wodurch Immunzellen moduliert werden und die Krankheit bzw. der Zustand behandelt oder reduziert wird.
Geführte Nuclease zur Verwendung bei dem System nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Ausführung des Verfahrens nach dem jeweiligen Anspruch; oder ein HM-CRISPR/Cas-System, gRNA, HM-Array oder HM-crRNA zur Verabreichung an einen Patienten zur Therapie einer Krankheit bzw. eines Zustands beim Patienten unter Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche; oder ein HM-Array, gRNA oder HM-crRNA zur Verwendung bei einem HM-CRISPR/Cas-System nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Ausführung des Verfahrens nach dem jeweiligen Anspruch; oder ein Vektor, z.B. Bakteriophage, konjugatives Plasmid oder Transposon, das eine erste Zelle infizieren oder umwandeln kann, und das das System HM-Array, gRNA oder HM-crRNA umfasst oder codiert; oder ein Arzneimittel, das das System, HM-Array, gRNA oder HM-crRNA umfasst oder codiert, wobei gegebenenfalls die gRNA eine einzelne Guide-RNA ist.
Verfahren zum Behandeln oder Reduzieren einer Krankheit bzw. eines Zustandes bei einem Patienten, wobei es sich beim Verfahren um ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1-19 handelt.