DE112016004413T5

DE112016004413T5 - Verfahren zum reinigen von reinem thioflavin t, verfahren zum herstellen von reinem thioflavin t, zusammensetzung, die thioflavin t enthält, und amyloid-nachweisverfahren

Info

Publication number: DE112016004413T5
Application number: DE112016004413.5T
Authority: DE
Inventors: Akinori Oda; Hiroshi Satozono; Tomomi Shinke; Yohei Takata
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2016-08-15
Publication date: 2018-08-02
Also published as: US11186557B2; WO2017056758A1; JP6971848B2; US20180273498A1; JPWO2017056758A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen von reinem Thioflavin T, welches einen Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polarem Lösungsmittel gelöst wird, einen Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper, und einen Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper umfasst.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen von reinem Thioflavin T. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen von reinem Thioflavin T, eine Zusammensetzung, die Thioflavin T enthält, und ein Verfahren zum Nachweisen von Amyloid.
Stand der Technik
Thioflavin T (ThT) ist das berühmteste Material, das als ein fluoreszierendes Färbepigment für Amyloid, welches ein spezielles Proteinaggregat ist, bekannt ist, und es wird für verschiedene Untersuchungen verwendet.
Es ist bekannt, dass von einem im Handel erhältlichen ThT-Reagenz zwei Arten von Fluoreszenz beobachtet werden. Diese zwei Arten von Fluoreszenz sind eine Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm (die Anregungswellenlänge ist zum Beispiel 350 nm) und eine Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 480 nm (die Anregungswellenlänge ist zum Beispiel 430 nm). Es bleibt noch immer unklar, ob die Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen (Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm) von ThT oder von Verunreinigungen in einem ThT-Reagenz herrührt.
Zum Beispiel wurde gemäß frühen Untersuchungen in Nicht-Patentliteratur 1 berichtet, dass die Verunreinigungen in einem ThT-Reagenz eine Absorption für eine Wellenlänge von 350 nm aufweisen und sie in Hexan oder Cyclohexan gelöst werden. Da die Fluoreszenz mit der Wellenlänge 445 nm selbst nach einer Wiederholung der ThT-Reinigung (Umkristallisation) erhalten bleibt, wird mittlerweile gemäß Nicht-Patentliteratur 2 der Schluss gezogen, dass es eine Fluoreszenz ist, die von ThT herrührt, und als Fluoreszenz kategorisiert, welche von einem Teil einer funktionellen Gruppe, die ThT bildet, emittiert wird (lokale Fluoreszenz). Diese lokale Fluoreszenz-Hypothese wird von Nicht-Patentliteratur 3 gestützt und der physikalische und chemische Ursprung der Hypothese wird in dem gleichen Dokument erörtert. Mittlerweile wird in Nicht-Patentliteratur 4 berichtet, dass ThT eine Photoreaktion bei Belichtung mit Licht verursacht und, indem es eine Absorptionsbande in der Nähe einer Wellenlänge von 350 nm aufweist, ein Photoreaktionsprodukt erzeugt, welches eine Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 450 nm emittiert, und es wird beschrieben, dass die Verunreinigungen in einem ThT-Reagenz von einem Photoreaktionsprodukt von ThT herrühren.
Liste der zitierten Literatur
Patentliteratur

Nicht-Patentliteratur 1: J. Appl. Spectrosc., 2003, Bd. 70, Nr. 6, S. 868-874
Nicht-Patentliteratur 2: J. Chem. Biol., 2010, Bd. 3, S. 1-18
Nicht-Patentliteratur 3: Dyes Pigments, 2014, Bd. 110, S. 97-105
Nicht-Patentliteratur 4: J. Phys. Chem. B, 2013, Bd. 117, S. 3459-3468

Zusammenfassung der Erfindung
Probleme, die durch die Erfindung gelöst werden sollen
Der Grund dafür, dass es noch immer unklar bleibt, ob die Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen (Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm) von ThT oder Verunreinigungen in einem ThT-Reagenz herrührt, ist der, dass gemäß einer Methode des Standes der Technik ein ThT-Reagenz, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, (reines ThT) nicht erhalten werden kann.
In Anbetracht des technischen Hintergrundes, welcher vorstehend beschrieben ist, ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Erhalten eines ThT-Reagenzes, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, d. h., ein Verfahren zum Erhalten von reinem ThT bereitzustellen.
Mittel zum Lösen der Probleme
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen von reinem Thioflavin T, das einen Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird, einen Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper, und einen Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper einschließt.
Da das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung Thioflavin T in Kontakt mit einem unpolaren polymeren porösen Körper bringen soll, nachdem das Thioflavin T als eine Lösung in einem polaren Lösungsmittel hergestellt wurde, kann ein ThT-Reagenz, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, (reines ThT) erhalten werden. Dies bedeutet auch, dass die Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen nicht die Fluoreszenz ist, die von ThT herrührt, sondern die Fluoreszenz, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt. Außerdem wird es gemäß den Untersuchungen, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, auch offensichtlich, dass die fluoreszierenden Verunreinigungen erneut erzeugt werden, wenn ThT, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, Licht ausgesetzt ist (insbesondere Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger). Es wird nämlich angenommen, dass die fluoreszierenden Verunreinigungen ein Photoreaktionsprodukt von ThT sind.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet das „rohe Thioflavin T (rohe ThT)“ eine Mischung aus den vorstehend erwähnten fluoreszierenden Verunreinigungen und ThT. Die herkömmlicherweise als „ThT“ bezeichneten Substanzen entsprechen rohem ThT der vorliegenden Beschreibung, da sie alle die fluoreszierenden Verunreinigungen enthalten, die vorstehend beschrieben sind.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet das „reine Thioflavin T (reine ThT)“ ein ThT-Reagenz, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, und das „ThT-Reagenz“ hat die gleiche Bedeutung wie eine molekulare Anordnung, die ThT enthält (Zusammensetzung). Somit kann das „reine ThT“ auch als eine molekulare Anordnung von ThT, welche im Wesentlichen keine fluoreszierenden Verunreinigungen enthält, oder eine molekulare Anordnung, welche im Wesentlichen aus ThT besteht, erkannt werden. Es ist bevorzugt, dass das „reine ThT“ eine molekulare Anordnung von ThT, welche keine fluoreszierenden Verunreinigungen enthält, oder eine molekulare Anordnung, welche aus ThT besteht, ist.
Was das vorstehend beschriebene Verfahren anbelangt, ist es bevorzugt, dass der Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper und der Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper in einem Zustand durchgeführt wird, in welchem Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger blockiert ist. Entsprechend kann die Produktion eines neuen Photoreaktionsprodukts (fluoreszierende Verunreinigungen) stärker unterdrückt werden und somit kann reines ThT mit noch höherer Effizienz gereinigt werden.
Es ist auch möglich, dass das Verfahren außerdem einen Schritt des Messens der Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz einer abgetrennten Thioflavin T-Lösung, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist, und des Bestimmens, ob die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht, einschließt, wobei, wenn in dem Bestimmungsschritt festgestellt wird, dass die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau nicht erreicht, weiterhin ein Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper; und ein Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper für die Thioflavin T-Lösung durchgeführt werden. Entsprechend ist es möglich, einen Fortgang der Reinigung zu haben, während die von den fluoreszierenden Verunreinigungen herrührende Fluoreszenz überwacht wird.
Das polare Lösungsmittel kann ein Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem wässrigen Lösungsmittel, Methanol, Ethanol, Acetonitril und Dimethylsulfoxid, und ein Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind, sein.
Der unpolare polymere poröse Körper ist vorzugsweise ein poröser Strukturkörper, welcher aus einem Polymer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polysulfon, Polyethersulfon, Nylon, Celluloseacetat, und Nitrocellulose, und zwei oder mehr Arten davon, gebildet ist. Durch Verwenden des porösen Strukturkörpers kann reines ThT mit noch höherer Effizienz gereinigt werden.
Das vorstehend erwähnte Verfahren ist vorzugsweise ein Verfahren, in welchem der unpolare polymere poröse Körper eine unpolare Polymermembran ist, und der Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper; und der Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper durch Filtration einer Thioflavin T-Lösung mit der vorstehend erwähnten unpolaren Polymermembran durchgeführt werden. Durch Ausführen der Reinigung auf der Grundlage eines Filtrationsvorgangs kann reines ThT bequem und schnell gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Herstellen von reinem Thioflavin T bereit, das einen Reinigungsprozess zum Durchführen des vorstehenden Verfahrens zum Reinigen von reinem Thioflavin T einschließt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, die Thioflavin T enthält, in welcher die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm auf dem Hintergrundniveau liegt.
Da die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine ThT-haltige Zusammensetzung ist, in welcher fluoreszierende Verunreinigungen nicht enthalten sind, kann, wenn sie zum Beispiel für die Fluoreszenzfärbung von Amyloid verwendet wird, der Einfluss der fluoreszierenden Verunreinigungen ausgeschlossen werden, so dass die Testergebnisse und Diagnoseergebnisse mit höherer Genauigkeit erhalten werden können. Als solche ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung zum Nachweisen von Amyloid geeignet.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweisen von Amyloid bereit, welches einen Schritt des Inkontaktbringens einer Untersuchungsprobe mit einem fluoreszierenden Reagenz, das Thioflavin T enthält, und einen Schritt des Nachweisens der Fluoreszenz des Thioflavin T einschließt, in welchem das fluoreszierende Reagenz die vorstehend beschriebene Zusammensetzung ist.
Gemäß dem Verfahren zum Nachweisen von Amyloid der vorliegenden Erfindung kann Amyloid mit höherer Genauigkeit nachgewiesen werden unter dem Gesichtspunkt, dass das Verfahren eine ThT-haltige Zusammensetzung verwendet, in welcher fluoreszierende Verunreinigungen nicht enthalten sind.
Das Amyloid kann Amyloid-ß sein. Es ist bekannt, dass sich Amyloid-ß im Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit ansammelt (senile Plaques). Der Nachweis von Amyloid-ß mit hoher Genauigkeit kann sehr zu der Aufklärung von Symptomen beitragen, die mit der Alzheimer-Krankheit oder dergleichen verbunden sind.
Das Reinigungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beruht auf einem neuen Befund, dass fluoreszierende Verunreinigungen durch Inkontaktbringen einer Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper entfernt werden können. Sie kann nämlich als eine Erfindung erkannt werden, in welcher ein unpolarer polymerer poröser Körper für eine neue Verwendung zum Entfernen von fluoreszierenden Verunreinigungen aus rohem Thioflavin T eingesetzt wird. Als solches stellt die vorliegende Erfindung auch ein eine Verunreinigung entfernendes Mittel zum Entfernen von fluoreszierenden Verunreinigungen aus rohem Thioflavin T bereit, wobei das eine Verunreinigung entfernende Mittel aus einem unpolaren polymeren porösen Körper gebildet ist. Die vorliegende Erfindung kann auch als eine Verwendung oder eine Anwendung eines unpolaren polymeren porösen Körpers zum Entfernen von fluoreszierenden Verunreinigungen aus rohem Thioflavin T erkannt werden.
Auswirkungen der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, reines ThT zu erhalten, welches nicht durch eine Methode des Standes der Technik erhalten werden kann.
ThT ist ein fluoreszierendes Färbereagenz, welches die erste Wahl für die Amyloidfärbung ist, und es wird nicht nur für eine Untersuchung von Amyloid verwendet, sondern auch für eine pathologische Diagnose einer Erkrankung, die mit Amyloid zusammenhängt. Durch die Verwendung von reinem ThT für die Amyloidfärbung kann der Einfluss von fluoreszierenden Verunreinigungen auf Messergebnisse ausgeschlossen werden und somit können Testergebnisse und Diagnoseergebnisse mit höherer Genauigkeit erhalten werden.
Figurenliste

1(A) ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 1 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). 1(B) ist eine Zeichnung, die das Anregungsspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 1 vergleicht (Beobachtungswellenlänge: 440 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus PVDF gebildete Filtrationsmembran.
2(A) ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 2 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). 2(B) ist eine Zeichnung, die das Anregungsspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 2 vergleicht (Beobachtungswellenlänge: 440 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus einem gemischten Celluloseester (MCE) gebildete Filtrationsmembran.
3 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 3 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus Celluloseacetat gebildete Filtrationsmembran.
4 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 4 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus Nylon gebildete Filtrationsmembran.
5 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 5 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus Polysulfon gebildete Filtrationsmembran.
6 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 6 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus Polyethersulfon gebildete Filtrationsmembran.
7 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 7 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus Polytetrafluorethylen gebildete Filtrationsmembran.
8 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 8 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus einem Acrylcopolymer gebildete Filtrationsmembran.
9 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 9 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus Polypropylen gebildete Filtrationsmembran.
10 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 10 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus Regeneratcellulose gebildete Filtrationsmembran.
11 ist eine Zeichnung, die das Fluoreszenzspektrum vor und nach der Reinigung in Beispiel 11 vergleicht (Anregungswellenlänge: 350 nm). Der unpolare polymere poröse Körper ist eine aus Glasfaser gebildete Filtrationsmembran.

Ausführungsformen zum Durchführen der Erfindung
Nachstehend werden Ausführungsformen zum Durchführen der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Ausführungsformen beschränkt, die nachstehend angegeben sind.
[Thioflavin T]
Thioflavin T (ThT) ist durch die folgende chemische Formel wiedergegeben und ist eine bekannte chemische Verbindung, die auch als 4-(3,6-Dimethyl-1,3-benzothiazol-3-ium-2-yl)-N,N-dimethylanilin-chlorid bezeichnet wird.
ThT weist eine Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 480 nm auf (die Anregungswellenlänge ist zum Beispiel 430 nm). Mittlerweile erzeugt ThT bei Belichtung mit Licht ein Photoreaktionsprodukt (fluoreszierende Verunreinigungen), welches eine Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist (die Anregungswellenlänge ist zum Beispiel 350 nm). Bis jetzt bleibt es unmöglich, ThT von einer Mischung (rohem ThT) aus den fluoreszierenden Verunreinigungen und ThT abzutrennen.
Das Verfahren zum Erhalten von rohem ThT unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Es ist zum Beispiel möglich, es durch Kaufen eines im Handel erhältlichen ThT-Reagenzes oder durch Synthetisieren desselben gemäß einem bekannten Verfahren zu erhalten.
[Verfahren zum Reinigen von Thioflavin T]
Das Verfahren zum Reinigen von Thioflavin T gemäß dieser Ausführungsform schließt einen Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird (Herstellungsschritt), einen Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper (Kontaktschritt) und einen Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper (Abtrennungsschritt) ein. Außerdem ist es auch möglich, ferner einen Schritt des Messens der Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz einer abgetrennten Thioflavin T-Lösung, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist, und des Bestimmens, ob die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht (Bestimmungsschritt) einzuschließen. Gemäß dem Reinigungsverfahren dieser Ausführungsform kann reines ThT erhalten werden.
In dem Herstellungsschritt wird eine Thioflavin T-Lösung hergestellt, in welcher rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst ist. Die ThT-Lösung kann durch Lösen von rohem ThT in einem polaren Lösungsmittel hergestellt werden. Außerdem kann, wenn ThT als eine Lösung hergestellt wird, wobei es in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird, während es synthetisiert wird oder dergleichen, die Lösung als eine ThT-Lösung genommen werden.
Als das polare Lösungsmittel kann ein Lösungsmittel, in welchem ThT gelöst werden kann, ohne irgendeine besondere Beschränkung verwendet werden. Als das polare Lösungsmittel kann zum Beispiel ein Lösungsmittel mit einer relativen Permittivität von 10 oder mehr verwendet werden. Spezifische Beispiele für das polare Lösungsmittel schließen ein wässriges Lösungsmittel, Methanol, Ethanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid und ein Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind, ein. Beispiele für das wässrige Lösungsmittel schließen Wasser (welches gereinigtes Wasser, das für pharmazeutische Produkte verwendet wird, Ionenaustauschwasser, das durch Ionenaustausch, Ultrafiltration oder dergleichen hergestellt wird, und ultrareines Wasser einschließt), eine Pufferlösung, wie phosphatgepufferte physiologische Salzlösung (PBS) und Trisgepufferte physiologische Salzlösung (TBS), und physiologische Salzlösung ein. Das polare Lösungsmittel, das verwendet werden soll, wird in Abhängigkeit von der Verwendung von ThT nach der Reinigung in geeigneter Weise ausgewählt. Zum Beispiel ist ein wässriges Lösungsmittel als ein polares Lösungsmittel bevorzugt, wenn ThT nach der Reinigung für den Nachweis von Amyloid verwendet wird.
Die ThT-Konzentration in der ThT-Lösung unterliegt keiner besonderen Beschränkung. Sie liegt jedoch im Allgemeinen in einem Bereich von 0,001 bis 10 mmol/l. Unter dem Gesichtspunkt der weiteren Unterdrückung einer neuen Erzeugung eines Photoreaktionsprodukts (fluoreszierende Verunreinigungen) während des Reinigungsprozesses ist es bevorzugt, eine niedrige ThT-Konzentration zu haben. Zum Beispiel liegt die ThT-Konzentration vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 7,5 mmol/l. Sie liegt mehr bevorzugt in einem Bereich von 0,1 bis 5 mmol/l und noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 0,5 bis 2 mmol/l. Außerdem kann die ThT-Konzentration in der ThT-Lösung in Abhängigkeit von der Verwendung des ThT nach der Reinigung so eingestellt werden, dass es nicht notwendig ist, erneut eine Verdünnung oder Konzentration durchzuführen.
In dem Kontaktschritt wird die ThT-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper in Kontakt gebracht. In dem Abtrennungsschritt wird die ThT-Lösung nach dem Kontakt mit dem unpolaren polymeren porösen Körper von dem unpolaren polymeren porösen Körper abgetrennt.
Der unpolare polymere poröse Körper ist ein poröser Strukturkörper, der aus einem unpolaren Polymer gebildet ist.
Als das unpolare Polymer kann ein Polymer mit einer relativen Permittivität von weniger als 10 verwendet werden (zum Beispiel ein organisches Polymer und ein anorganisches Polymer). Zu spezifischen Beispielen für das unpolare Polymer gehören Regeneratcellulose (relative Permittivität: 3,2 bis 7,5), Polyvinylidenfluorid (PVDF, relative Permittivität: 8,4), Polytetrafluorethylen (relative Permittivität: 2,1), Celluloseacetat (relative Permittivität: 3,2 bis 7,0), Nitrocellulose (relative Permittivität: 6,2 bis 7,5), Polyethylen (relative Permittivität: 2,2 bis 2,4), Polypropylen (relative Permittivität: 1,5 bis 1,8), Polysulfon (relative Permittivität: 3,0 bis 3,1), Polyethersulfon (relative Permittivität: 3,8), Polycarbonat (relative Permittivität: 2,9 bis 3,0), Nylon (relative Permittivität: 4,0 bis 5,0), ein Acrylpolymer (Polymer oder Copolymer von Acrylsäure, Methacrylsäure oder ein Derivat davon (zum Beispiel Ester wie Methylacrylat und Methylmethacrylat), relative Permittivität: 2,7 bis 4,5), Glasfaser (relative Permittivität: 3,7 bis 7,0), und eine Mischung aus 2 oder mehr Arten davon. Als das unpolare Polymer sind Polyvinylidenfluorid, Polytetrafluorethylen, Celluloseacetat, Nitrocellulose, Polysulfon, Polyethersulfon, Nylon und eine Mischung aus 2 oder mehr Arten davon bevorzugt. Polyvinylidenfluorid, Polysulfon, Polyethersulfon, Nylon und eine Mischung aus Celluloseacetat und Nitrocellulose sind stärker bevorzugt.
Der poröse Strukturkörper ist ein Strukturkörper mit darin gebildeten feinen Poren, und zu spezifischen Beispielen dafür gehören eine Membran (Film), eine Folie, ein partikulärer Körper und ein geschäumter Körper.
Der unpolare polymere poröse Körper kann durch ein gewöhnliches Verfahren wie ein Phasentrennungsverfahren, Extraktionsverfahren, Streckverfahren, Spurenätzverfahren und Calcinierungsverfahren hergestellt werden.
Zu Beispielen für den unpolaren polymeren porösen Körper gehören eine unpolare polymere Membran (Filtrationsmembran) und ein unpolarer polymerer partikulärer Körper. Als der unpolare polymere poröse Körper kann ein im Handel erhältliches Produkt verwendet werden und zu Beispielen dafür gehören eine Polyvinylidenfluorid-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Membranfilter Millex-GV (hergestellt von Merck Millipore)), eine Filtrationsmembran aus einer Mischung aus Celluloseacetat und Nitrocellulose (zum Beispiel der Membranfilter Vented-Millex-GS (hergestellt von Merck Millipore)), ein Celluloseacetat-Membranfilter (zum Beispiel der Spritzenfilter ASFIL (hergestellt von As One Corporation)), eine Nylon-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Spritzenfilter ASFIL (hergestellt von As One Corporation)), eine Polysulfon-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Filter Ekicro Disc 25 (hergestellt von SHIMADZU CORPORATION)), eine Polyethersulfon-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Spritzenfilter ASFIL (hergestellt von As One Corporation)), eine Polytetrafluorethylen-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Spritzenfilter ASFIL (hergestellt von As One Corporation)), eine Acrylcopolymer-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Filter Ekicro Disc 13 (hergestellt von SHIMADZU CORPORATION)), eine Polypropylen-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Spritzenfilter Puradisc 25 (hergestellt von GE Healthcare)), eine Regeneratcellulose-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Filter Minisart RC15 (hergestellt von Minisart)) und eine Glasfaser-Filtrationsmembran (zum Beispiel der Spritzenfilter GF (hergestellt von As One Corporation)).
Das Verfahren zum Inkontaktbringen der ThT-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper unterliegt keiner besonderen Beschränkung. Spezifische Beispiele für das Kontaktverfahren schließen ein Verfahren, in welchem bei einem Filtrationsvorgang eine ThT-Lösung durch eine unpolare Polymermembran geleitet wird, um einen Kontakt zu haben (Membranfiltrationsverfahren), ein Verfahren, in welchem eine ThT-Lösung durch eine mit einem partikulären Körper aus einem unpolaren Polymer gefüllte Säule fließen gelassen wird, um einen Kontakt zu haben (Säulenfiltrationsverfahren), und ein Verfahren, in welchem ein unpolarer polymerer poröser Körper mit beliebiger Gestalt zu einer ThT-Lösung zugegeben und darin gerührt wird, ein. Unter dem Gesichtspunkt, dass der Kontaktschritt und Abtrennungsschritt bequem und schnell durchgeführt werden kann, sind das Membranfiltrationsverfahren und Säulenfiltrationsverfahren bevorzugt. Das Membranfiltrationsverfahren ist stärker bevorzugt.
Das Verfahren zum Abtrennen einer ThT-Lösung von einem unpolaren polymeren porösen Körper unterliegt keiner besonderen Beschränkung und es kann ein beliebiges Verfahren verwendet werden, das üblicherweise für eine Fest-Flüssig-Trennung verwendet wird.
In dem Bestimmungsschritt wird die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz einer abgetrennten ThT-Lösung, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist, gemessen und die Bestimmung erfolgt, um zu sehen, ob die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht.
In dem Bestimmungsschritt wird ein Teil der von einem unpolaren polymeren porösen Körper abgetrennten ThT-Lösung gesammelt, um eine Messprobe zu erhalten, und die Fluoreszenzintensität wird gemessen. Für die Messung der Fluoreszenzintensität kann ein Fluoreszenzspektralphotometer, ein Fluoreszenzplattenlesegerät oder dergleichen verwendet werden. Genauer gesagt wird eine Messprobe mit Licht mit einer Wellenlänge von 300 bis 430 nm belichtet und die Lichtemission mit einer Wellenlänge von 440 bis 460 nm (Fluoreszenz) wird entsprechend gemessen. Die Wellenlänge des Lichts zur Belichtung kann innerhalb des vorstehend erwähnten Bereichs in geeigneter Weise festgelegt werden. Es ist jedoch vorzugsweise eine Wellenlänge von 350 nm. Die Wellenlänge der Fluoreszenz, die gemessen werden soll, kann innerhalb des vorstehend erwähnten Bereichs in geeigneter Weise festgelegt werden. Es ist jedoch vorzugsweise eine Wellenlänge von 440 nm.
Anschließend erfolgt eine Bestimmung, um zu sehen, ob die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht. Wenn festgestellt wird, dass die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau nicht erreicht, werden der Kontaktschritt und der Abtrennungsschritt zusätzlich wiederholt. Wenn festgestellt wird, dass die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht, ist die Reinigung beendet.
Das „Hintergrundniveau“ bedeutet, dass die Fluoreszenzintensität einer gereinigten ThT-Lösung nahezu die gleiche ist wie die Fluoreszenzintensität einer reinen ThT-Lösung. Die Bestimmung des „Hintergrundniveaus“ kann zum Beispiel so durchgeführt werden, wie es nachstehend beschrieben ist. Zusätzlich zu der Fluoreszenzintensität einer gereinigten ThT-Lösung bei einer Wellenlänge von 440 nm wird nämlich auch die Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 480 nm gemessen, und das Fluoreszenzverhältnis, das durch Dividieren der Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge 440 nm durch die Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 480 nm resultiert, wird erhalten. Wenn das Fluoreszenzverhältnis innerhalb eines Bereichs von 0,4 bis 1,0 liegt, kann es als „Hintergrundniveau“ festgesetzt werden. Hierin wird es vorzugsweise als „Hintergrundniveau“ festgesetzt, wenn das Fluoreszenzverhältnis innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 0,9 liegt, und es wird mehr bevorzugt als „Hintergrundniveau“ festgesetzt, wenn das Fluoreszenzverhältnis innerhalb eines Bereichs von 0,6 bis 0,8 liegt. Außerdem kann es, kürzer gefasst, als „Hintergrundniveau“ festgesetzt werden, wenn der Messwert der Fluoreszenzintensität, welche in dem Bestimmungsschritt gemessen wird, nicht weiter abnimmt.
Die ThT-Lösung kann nach der Beendigung der Reinigung direkt für die nächste Verwendung eingesetzt werden. Falls erforderlich, kann sie nach dem Entfernen des polaren Lösungsmittels als ThT-Puffer für die nächste Verwendung eingesetzt werden. Sie kann auch für die nächste Verwendung eingesetzt werden, nachdem ThT-Pulver erneut in einem beliebigen Lösungsmittel aufgelöst wurde.
Das vorstehend erwähnte Reinigungsverfahren wird vorzugsweise in einem Zustand durchgeführt, in welchem Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger blockiert ist. Entsprechend wird die Produktion von neuen fluoreszierenden Verunreinigungen unterdrückt, so dass die Wirksamkeit des gesamten Reinigungsverfahrens noch gesteigert werden kann. Es ist möglich, dass der gesamte Prozess des Reinigungsverfahrens in einem Zustand durchgeführt wird, in dem Licht blockiert ist. Es ist jedoch auch möglich, dass der Prozess nach dem Kontaktschritt in einem Zustand durchgeführt wird, in dem das Licht blockiert ist. Das Verfahren zum Blockieren von Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger kann in geeigneter Weise ausgewählt werden. Speziell ist es möglich, den Reinigungsvorgang unter Rotlicht durchzuführen oder den Reinigungsvorgang in einem Zustand durchzuführen, in dem Licht (vollständig) blockiert ist.
[Verfahren zum Herstellen von Thioflavin T]
Das Verfahren zum Herstellen von Thioflavin T gemäß dieser Ausführungsform schließt einen Reinigungsprozess zum Durchführen des Verfahrens zum Reinigen von Thioflavin T ein, welcher vorstehend beschrieben worden ist. Gemäß dem Herstellungsverfahren dieser Ausführungsform kann reines ThT erhalten werden.
Das Herstellungsverfahren gemäß dieser Ausführungsform kann auch vor dem Reinigungsprozess einen Syntheseprozess zum Synthetisieren von ThT, einen Auflösungsprozess zum Auflösen von rohem ThT in einem polaren Lösungsmittel oder dergleichen einschließen. Es ist auch möglich, dass ein Verpackungsprozess zum Verpacken des erhaltenen reinen ThT nach dem Reinigungsprozess eingeschlossen ist. Der Verpackungsprozess kann zum Beispiel ein Prozess sein, in welchem die ThT-Lösung in einen Behälter wie eine lichtundurchlässige Flasche (wie etwa eine braune Flasche) eingefüllt wird.
[Thioflavin T enthaltende Zusammensetzung]
Die Thioflavin T enthaltende Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform ist eine Zusammensetzung, in welcher die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm sich auf dem Hintergrundniveau befindet. Sie ist nämlich eine Zusammensetzung, welche im Wesentlichen keine fluoreszierenden Verunreinigungen einschließt, oder eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus ThT besteht (molekulare Anordnung). Die Zusammensetzung gemäß einer Ausführungsform ist eine Zusammensetzung, welche Thioflavin T enthält und, wenn sie mit Licht mit einer Wellenlänge von 350 nm belichtet wird, eine Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 440 nm auf dem Hintergrundniveau aufweist.
Die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform kann eine beliebige von einer flüssigen Phase und einer festen Phase sein. Unter dem Gesichtspunkt der Unterdrückung der Erzeugung der fluoreszierenden Verunreinigungen wird die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform vorzugsweise in einen Behälter wie eine lichtundurchlässige Flasche (wie etwa eine braune Flasche) gefüllt.
Die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform kann durch das Reinigungsverfahren oder Herstellungsverfahren für ThT erhalten werden, welche vorstehend beschrieben sind.
Da die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform im Wesentlichen keine fluoreszierenden Verunreinigungen enthält, kann, wenn sie für die Färbung von Amyloid verwendet wird, der Einfluss der fluoreszierenden Verunreinigungen auf die Messergebnisse ausgeschlossen werden, so dass die Testergebnisse und Diagnoseergebnisse mit noch höherer Genauigkeit erhalten werden können. Somit kann die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform in geeigneter Weise als eine Zusammensetzung zur Verwendung zum Nachweisen von Amyloid (Fluoreszenzreagenz zum Nachweisen von Amyloid) verwendet werden.
[Verfahren zum Nachweisen von Amyloid]
Amyloid stellt ein spezielles Aggregat eines Proteins dar, welches eine spezifische β-Faltblattstruktur aufweist. Als ein Protein zum Bilden von Amyloid sind verschiedene Arten vorhanden, wie etwa Insulin, β2-Mikroglobulin und Amyloid-β. Die Ansammlung von gewissem Amyloid in einem menschlichen Körper kann eine Krankheitsursache sein. Zum Beispiel hängt β2-Mikroglobulin mit Dialyse-Amyloidose zusammen und Amyloid-β hängt mit der Alzheimer-Krankheit zusammen.
Das Verfahren zum Nachweisen von Amyloid gemäß dieser Ausführungsform kann gemäß einem gewöhnlichen Verfahren durchgeführt werden, mit der Ausnahme, dass die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung als ein Fluoreszenzreagenz verwendet wird.
[Eine Verunreinigung entfernendes Mittel]
Der vorstehend erwähnte unpolare polymere poröse Körper fängt fluoreszierende Verunreinigungen ein, wenn er mit einer ThT-Lösung in Kontakt gebracht wird, in welcher rohes ThT in einem polaren Lösungsmittel gelöst ist. Unter Verwendung dieser charakteristischen Eigenschaft kann der unpolare polymere poröse Körper sich zur Verwendung zum Entfernen der fluoreszierenden Verunreinigungen aus rohem ThT eignen.
Das eine Verunreinigung entfernende Mittel gemäß dieser Ausführungsform besteht aus einem unpolaren polymeren porösen Körper. Es ist auch möglich, dass das eine Verunreinigung entfernende Mittel gemäß dieser Ausführungsform als eine Säule zum Entfernen von Verunreinigungen bereitgestellt wird, wobei ein unpolarer polymerer poröser Körper in die Säule eingefüllt wird, oder ein Filter zum Entfernen von Verunreinigungen bereitgestellt wird, wobei ein unpolarer polymerer poröser Formkörper in einem porösen Körper mit der Gestalt einer Membran bereitgestellt wird.
Beispiele
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung auf der Grundlage von Beispielen genauer beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
[Beispiel 1]
Beispiel 1 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus PVDF gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper.
(Herstellung einer ThT-Lösung)
Durch Auflösen von ThT (ultrareine Qualität, hergestellt von AAT Bioquest Inc., entspricht dem rohen ThT in der vorliegenden Beschreibung) in destilliertem Wasser, wurde eine 1 mM ThT-Lösung erhalten.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
2 ml der 1 mM ThT-Lösung wurde unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Membranfilters Millex-GV (Material: hydrophiles PVDF, Porengröße: 0,22 µm, Filterdurchmesser: 33 mm, hergestellt von Merck Millipore) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Messung der Fluoreszenz)
Zu 10 µl der erhaltenen filtrierten Lösung wurden 990 µl destilliertes Wasser zur Verdünnung zugegeben und das Resultat wurde in eine Mikrozelle (Lichtweglänge: 5 mm) eingefüllt. Die mit der Probe befüllte Mikrozelle wurde in ein Fluoreszenzspektralphotometer RF-5000 (hergestellt von SHIMADZU CORPORATION) eingebracht und das Fluoreszenzspektrum wurde bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm gemessen. Außerdem wurde auch das Anregungsspektrum bei einer Beobachtungswellenlänge von 440 nm gemessen.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350nm) sind in 1(A) gezeigt. Wie in 1(A) gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Außerdem sind die Messergebnisse des Anregungsspektrums (Beobachtungswellenlänge: 440 nm) in 1(B) gezeigt. Wie in 1(B) gezeigt ist, erkennt man, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 350 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus PVDF gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 2]
Beispiel 2 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus einem gemischten Celluloseester (Mischung aus Celluloseacetat und Nitrocellulose: MCE) gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper. Die Herstellung einer ThT-Lösung und Messung der Fluoreszenz wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
(Filtrationsreinigung einer ThT-Lösung)
2 ml einer 1 mM ThT-Lösung wurden unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Membranfilters Vented-Millex-GS (Material: MCE, Porengröße: 0,22 µm, Filterdurchmesser: 25 mm, hergestellt von Merck Millipore) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 2(A) gezeigt. Wie in 2(A) gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Außerdem sind die Messergebnisse des Anregungsspektrums (Beobachtungswellenlänge: 440 nm) in 2(B) gezeigt. Wie in 2(B) gezeigt ist, erkennt man, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 350 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus MCE gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 3]
Beispiel 3 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus Celluloseacetat gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper.
(Herstellung einer ThT-Lösung)
Durch Auflösen von ThT (ultrareine Qualität, hergestellt von AAT Bioquest Inc., entspricht dem rohen ThT in der vorliegenden Beschreibung) in destilliertem Wasser wurde eine 10 mM ThT-Lösung erhalten.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
1 ml der 10 mM ThT-Lösung wurde unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Spritzenfilters ASFIL (Material: Celluloseacetat, Porengröße: 0,45 µm, Filterdurchmesser: 25 mm, hergestellt von As One Corporation) filtriert, und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Messung der Fluoreszenz)
Zu 2 µl der erhaltenen filtrierten Lösung wurden 1998 µl destilliertes Wasser zur Verdünnung zugegeben und 1000 µl der verdünnten Lösung wurden in eine Mikrozelle (Lichtweglänge: 5 mm) eingefüllt. Die mit der Probe befüllte Mikrozelle wurde in ein Fluoreszenzspektralphotometer RF-5000 (hergestellt von SHIMADZU CORPORATION) eingebracht und das Fluoreszenzspektrum wurde bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm gemessen.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 3 gezeigt. Wie in 3 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus Celluloseacetat gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 4]
Beispiel 4 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus Nylon gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper. Die Herstellung einer ThT-Lösung und Messung der Fluoreszenz wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
1 ml einer 10 mM ThT-Lösung wurde unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Spritzenfilters ASFIL (Material: Nylon, Porengröße: 0,45 µm, Filterdurchmesser: 25 mm, hergestellt von As One Corporation) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 4 gezeigt. Wie in 4 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang, der eine aus Nylon gebildete Filtrationsmembran verwendet, können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 5]
Beispiel 5 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus Polysulfon gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper. Die Herstellung einer ThT-Lösung und Messung der Fluoreszenz wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
1 ml einer 10 mM ThT-Lösung wurden unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Filters Ekicro Disc 25 (Material: Polysulfon, Porengröße: 0,2 µm, Filterdurchmesser: 25 mm, hergestellt von SHIMADZU CORPORATION) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 5 gezeigt. Wie in 5 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus Polysulfon gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 6]
Beispiel 6 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus Polyethersulfon gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper. Die Herstellung einer ThT-Lösung und Messung der Fluoreszenz wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
1 ml einer 10 mM ThT-Lösung wurde unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Spritzenfilters ASFIL (Material: Polyethersulfon, Porengröße: 0,45 µm, Filterdurchmesser: 25 mm, hergestellt von As One Corporation) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 6 gezeigt. Wie in 6 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus Polyethersulfon gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 7]
Beispiel 7 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus Polytetrafluorethylen gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper.
(Herstellung einer ThT-Lösung)
Durch Auflösen von ThT (ultrareine Qualität, hergestellt von AAT Bioquest Inc., entspricht dem rohen ThT in der vorliegenden Beschreibung) in destilliertem Wasser wurde eine 100 µM ThT-Lösung erhalten.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
2 ml der 100 µM ThT-Lösung wurden unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Spritzenfilters ASFIL (Material: hydrophiles Polytetrafluorethylen, Porengröße: 0,45 µm, Filterdurchmesser: 25 mm, hergestellt von As One Corporation) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Messung der Fluoreszenz)
Zu 100 µl der erhaltenen filtrierten Lösung wurden 900 µl destilliertes Wasser zur Verdünnung zugegeben und 1000 µl der verdünnten Lösung wurden in eine Mikrozelle (Lichtweglänge: 5 mm) gefüllt. Die mit der Probe befüllte Mikrozelle wurde in ein Fluoreszenzspektralphotometer RF-5000 (hergestellt von SHIMADZU CORPORATION) eingebracht und das Fluoreszenzspektrum wurde bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm gemessen.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 7 gezeigt. Wie in 7 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus Polytetrafluorethylen gebildeten Filtrationsmembran können die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 8]
Beispiel 8 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus einem Acrylcopolymer gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper. Die Herstellung einer ThT-Lösung und Messung der Fluoreszenz wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
0,25 ml einer 10 mM ThT-Lösung wurden unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Filters Ekicro Disc 13 (Material: Acrylcopolymer, Porengröße: 0,2 µm, Filterdurchmesser: 13 mm, hergestellt von SHIMADZU CORPORATION) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 8 gezeigt. Wie in 8 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus einem Acrylcopolymer gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 9]
Beispiel 9 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus Polypropylen gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper. Die Herstellung einer ThT-Lösung und Messung der Fluoreszenz wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 durchgeführt.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
1 ml einer 100 µM ThT-Lösung wurde unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Spritzenfilters Puradisc 25 (Material: Polypropylen, Porengröße: 0,45 µm, Filterdurchmesser: 25 mm, hergestellt von GE Healthcare) filtriert, und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 9 gezeigt. Wie in 9 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus Polypropylen gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 10]
Beispiel 10 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus Regeneratcellulose gebildet ist, als ein unpolarer, polymerer poröser Körper. Die Herstellung einer ThT-Lösung und Messung der Fluoreszenz wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 durchgeführt.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
1 ml einer 100 µM ThT-Lösung wurde unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Filters Minisart RC15 (Material: Regeneratcellulose, Porengröße: 0,2 µm, Filterdurchmesser: 15 mm, hergestellt von Minisart) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 10 gezeigt. Wie in 10 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus Regeneratcellulose gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.
[Beispiel 11]
Beispiel 11 ist ein Beispiel für das Reinigen von reinem ThT durch Anwenden eines porösen Strukturkörpers mit der Gestalt einer Membran (Filtrationsmembran), welcher aus Glasfaser gebildet ist, als ein unpolarer polymerer poröser Körper. Die Herstellung einer ThT-Lösung und Messung der Fluoreszenz wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 durchgeführt.
(Filtrationsreinigung der ThT-Lösung)
1 ml einer 100 µM ThT-Lösung wurde unter Verwendung einer Spritze (hergestellt von Terumo Corporation) und eines Spritzenfilters GF (Material: Glasfaser, Porengröße: 1,0 µm, Filterdurchmesser: 25 mm, hergestellt von As One Corporation) filtriert und die filtrierte Lösung wurde gesammelt.
(Bewertung)
Die Messergebnisse des Fluoreszenzspektrums (Anregungswellenlänge: 350 nm) sind in 11 gezeigt. Wie in 11 gezeigt ist, wird festgestellt, dass nach der Filtration die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 440 nm aufweist, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt, verschwunden ist, so dass nur die Fluoreszenz, welche einen Peak in der Nähe der Wellenlänge von 480 nm aufweist, als die ThT innewohnende Fluoreszenz übrigbleibt. Durch den Filtrationsvorgang unter Verwendung einer aus Glasfaser gebildeten Filtrationsmembran können nämlich die fluoreszierenden Verunreinigungen, welche in rohem ThT enthalten sind, entfernt werden.

Claims

Verfahren zum Reinigen von reinem Thioflavin T, umfassend: einen Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird; einen Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper; und einen Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Kontakts und der Schritt der Abtrennung in einem Zustand durchgeführt werden, in welchem Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger blockiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, außerdem umfassend einen Schritt der Messung der Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz einer abgetrennten Thioflavin T-Lösung, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist, und des Bestimmens, ob die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht, wobei, wenn in dem Bestimmungsschritt festgestellt wird, dass die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau nicht erreicht, ein Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper; und ein Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper für die Thioflavin T-Lösung weiterhin durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das polare Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem wässrigen Lösungsmittel, Methanol, Ethanol, Acetonitril und Dimethylsulfoxid, und einem Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der unpolare polymere poröse Körper ein poröser Körper ist, welcher aus einem Polymer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polysulfon, Polyethersulfon, Nylon, Celluloseacetat und Nitrocellulose, und zwei oder mehr Arten davon, gebildet ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der unpolare polymere poröse Körper eine unpolare Polymermembran ist und der Schritt des Inkontaktbringens der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren polymeren porösen Körper; und der Schritt des Abtrennens der Thioflavin T-Lösung nach dem Kontakt von dem unpolaren polymeren porösen Körper durch Filtrieren der Thioflavin T-Lösung durch die unpolare Polymermembran durchgeführt werden.
Verfahren zum Herstellen von reinem Thioflavin T, umfassend einen Reinigungsprozess zum Durchführen des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
Zusammensetzung, enthaltend Thioflavin T, in welcher die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm auf dem Hintergrundniveau ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, zur Verwendung zum Nachweisen von Amyloid.
Verfahren zum Nachweisen von Amyloid, umfassend: einen Schritt des Inkontaktbringens einer Untersuchungsprobe mit einem Fluoreszenzreagenz, das Thioflavin T enthält; und einen Schritt des Nachweisens der Fluoreszenz des Thioflavin T, wobei das Fluoreszenzreagenz die Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 oder 9 ist.
Verfahren zum Nachweisen von Amyloid gemäß Anspruch 10, wobei das Amyloid Amyloid-β ist.
Eine Verunreinigung entfernendes Mittel zum Entfernen von fluoreszierenden Verunreinigungen aus rohem Thioflavin T, wobei das eine Verunreinigung entfernende Mittel aus einem unpolaren polymeren porösen Körper gebildet ist.