JP6971535B2 - 純粋なチオフラビンｔを精製する方法、純粋なチオフラビンｔの製造方法、チオフラビンｔを含有する組成物、及びアミロイドの検出方法 - Google Patents

純粋なチオフラビンｔを精製する方法、純粋なチオフラビンｔの製造方法、チオフラビンｔを含有する組成物、及びアミロイドの検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、純粋なチオフラビンＴを精製する方法に関する。本発明はまた、純粋なチオフラビンＴの製造方法、チオフラビンＴを含有する組成物、及びアミロイドの検出方法にも関する。
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、タンパク質の特殊な凝集体であるアミロイドの蛍光染色色素として最も有名な物質であり、多くの研究で用いられている。
市販されているＴｈＴ試薬には、２種類の蛍光が観察されることが知られている。この２種類の蛍光は、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、３５０ｎｍ）、及び４８０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、波長４３０ｎｍ）である。短波長側の蛍光（４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光）は、それがＴｈＴ由来であるか、又はＴｈＴ試薬中の不純物由来であるかについて、未だ明らかになっていない。
例えば、初期の研究において、非特許文献１には、ＴｈＴ試薬中の不純物は波長３５０ｎｍに吸収があり、それがヘキサンやシクロヘキサンに溶解することが報告されている。これに対し、非特許文献２は、ＴｈＴの精製（再結晶）を繰り返しても、波長４４５ｎｍの蛍光が残ることから、これがＴｈＴ由来の蛍光であると結論し、ＴｈＴを構成する官能基の一部から発せられる蛍光（局所蛍光）に帰属している。非特許文献３は、この局所蛍光説を支持し、その物理化学的な起源について論じている。一方、非特許文献４は、ＴｈＴは光照射により光反応を起こし、波長３５０ｎｍ付近に吸収帯があり波長４５０ｎｍの蛍光を発する光反応物が生じることを報告し、ＴｈＴ試薬中の不純物は、ＴｈＴの光反応生成物に由来するとしている。
Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．，２００３年，７０巻６号，ｐｐ．８６８−８７４ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１０年，３巻，ｐｐ．１−１８ Ｄｙｅｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，２０１４年，１１０巻，ｐｐ．９７−１０５ Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２０１３年，１１７巻，ｐｐ．３４５９−３４６８
短波長側の蛍光（４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光）が、ＴｈＴ由来であるか、又はＴｈＴ試薬中の不純物由来であるか未だ明らかになっていない理由は、従来の技術では、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴ試薬（純粋なＴｈＴ）を得ることができないためである。
本発明は、上述した技術背景に鑑み、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴ試薬を得る方法、すなわち、純粋なＴｈＴを得る方法を提供することを目的とする。
本発明は、粗チオフラビンＴが極性溶媒に溶解したチオフラビンＴ溶液を用意するステップと、チオフラビンＴ溶液を無極性溶媒で液液抽出するステップと、を備える、純粋なチオフラビンＴを精製する方法を提供する。
本発明に係る方法は、チオフラビンＴを極性溶媒の溶液としたうえで、無極性溶媒で液液抽出するものであるため、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴ試薬（純粋なＴｈＴ）を得ることができる。このことはまた、短波長側の蛍光は、ＴｈＴ由来の蛍光ではなく、蛍光性不純物に由来する蛍光であることを意味する。また、本発明者らの検討によれば、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴを光（特に、波長４７５ｎｍ以下の光）に曝すと、この蛍光性不純物が再度生じることも明らかになった。つまり、蛍光性不純物は、ＴｈＴの光反応物であると考えられる。
本明細書において、「粗チオフラビンＴ（粗ＴｈＴ）」とは、上述の蛍光性不純物とＴｈＴとの混合物を意味する。従来“ＴｈＴ”と呼ばれていたものは、いずれも上述の蛍光性不純物を含むものであるため、本明細書における粗ＴｈＴに該当する。
本明細書において、「純粋なチオフラビンＴ（純粋なＴｈＴ）」とは、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴ試薬を意味し、「ＴｈＴ試薬」とは、ＴｈＴを含む分子集合体（組成物）と同義である。したがって、「純粋なＴｈＴ」は、蛍光性不純物を実質的に含まないＴｈＴの分子集合体、又は実質的にＴｈＴからなる分子集合体ということもできる。「純粋なＴｈＴ」は、好ましくは蛍光性不純物を含まないＴｈＴの分子集合体、又はＴｈＴからなる分子集合体である。
上記方法では、液液抽出するステップが、波長４７５ｎｍ以下の光を遮光した状態で行われるのが好ましい。これにより、光反応物（蛍光性不純物）が新たに生成することをより抑制できるため、より一層効率よく純粋なＴｈＴを精製することができる。
上記方法は、チオフラビンＴ溶液の４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度を測定し、測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達したか否かを判定するステップを更に備え、判定するステップにおいて、測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達していないと判定された場合、当該チオフラビンＴ溶液に対して更に液液抽出するステップを実行するものであってもよい。これにより、蛍光性不純物に由来する蛍光をモニターしながら精製を進めることができる。
上記極性溶媒は、水系溶媒、メタノール、エタノール、アセトニトリル及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒からなる群から選択されるものであってもよい。また、上記無極性溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、トルエン及びキシレン、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒からなる群から選択されるものであってもよい。
本発明はまた、上述した純粋なチオフラビンＴを精製する方法を実施する精製工程を備える、純粋なチオフラビンＴの製造方法を提供する。
本発明はさらに、チオフラビンＴを含有する組成物であって、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度がバックグラウンドレベルである、組成物を提供する。
本発明に係る組成物は、蛍光性不純物が含まれないＴｈＴ含有組成物であるため、例えば、アミロイドの蛍光染色に用いる際に、蛍光性不純物による影響を排除することができ、より精度の高い試験結果及び診断結果を得ることができる。したがって、本発明に係る組成物は、アミロイド検出用として好適に用いられる。
本発明はさらにまた、アミロイドの検出方法であって、被験試料にチオフラビンＴを含む蛍光試薬を接触させる工程と、チオフラビンＴの蛍光を検出する工程と、を含み、上記蛍光試薬が、上記組成物である、検出方法を提供する。
本発明に係るアミロイドの検出方法によれば、蛍光性不純物が含まれないＴｈＴ含有組成物を用いていることから、より精度よくアミロイドを検出することができる。
上記アミロイドは、βアミロイドであってもよい。βアミロイドは、アルツハイマー病患者の脳内に蓄積することが知られている（老人斑）。βアミロイドを高精度で検出できれば、アルツハイマー病の病態の解明等に大きく貢献できる。
本発明によれば、従来の技術では得ることができなかった、純粋なＴｈＴを得ることができる。
ＴｈＴは、アミロイドの染色において第１選択となる蛍光染色試薬であり、アミロイドの研究のみならず、アミロイドに関連する疾病の病理診断にも用いられる。アミロイドの染色に純粋なＴｈＴを使用することにより、蛍光性不純物による測定結果への影響を排除でき、より精度の高い試験結果及び診断結果を得ることができる。
一実施形態に係る精製方法を示すフロー図である。 液液抽出の回数と蛍光強度との関係を示す図である。 精製前後のＴｈＴ溶液の蛍光スペクトルを比較した図である。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔チオフラビンＴ〕
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、下記式で表され、４−（３，６−ジメチル−１，３−ベンゾチアゾール−３−イウム−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンクロリドとも称される公知の化合物である。
Figure 0006971535
ＴｈＴは、４８０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、４３０ｎｍ）を発する。一方、ＴｈＴは、光照射により、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、３５０ｎｍ）を発する光反応物（蛍光性不純物）を生じる。これまで、この蛍光性不純物とＴｈＴとの混合物（粗ＴｈＴ）からＴｈＴを単離することはできなかった。
粗ＴｈＴの入手方法は、特に制限されるものではなく、例えば、市販されているＴｈＴ試薬を購入して入手してもよいし、公知の方法により合成して入手してもよい。
〔チオフラビンＴの精製方法〕
本実施形態に係るチオフラビンＴの精製方法は、粗チオフラビンＴが極性溶媒に溶解したチオフラビンＴ溶液を用意するステップと、チオフラビンＴ溶液を無極性溶媒で液液抽出するステップと、を備える。また、チオフラビンＴ溶液の４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度を測定し、測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達したか否かを判定するステップを更に備えていてもよい。本実施形態に係る精製方法により、純粋なＴｈＴを得ることができる。
図１は、一実施形態に係る精製方法を示すフロー図である。以下、図１に基づいて、精製方法の一例を説明する。
第１のステップは、粗ＴｈＴが極性溶媒に溶解したＴｈＴ溶液を用意するステップである。ＴｈＴ溶液は、例えば、粗ＴｈＴを極性溶媒に溶解させて調製してもよく、またＴｈＴを合成等した際に極性溶媒に溶解した溶液となっている場合は、当該溶液をＴｈＴ溶液としてもよい。
極性溶媒は、ＴｈＴが溶解する溶媒を特に制限なく使用することができる。極性溶媒としては、例えば、比誘電率が１０以上である溶媒を使用することができる。極性溶媒の具体例としては、例えば、水系溶媒、メタノール、エタノール、アセトニトリル及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒が挙げられる。水系溶媒としては、例えば、水（医薬品に用いられる精製水、イオン交換、超ろ過等により調製したイオン交換水、超純水等を含む。）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）等の緩衝液、並びに生理食塩水等が挙げられる。使用する極性溶媒は、精製後のＴｈＴの用途に応じて適宜選択すればよい。例えば、精製後のＴｈＴをアミロイドの検出に使用する場合、極性溶媒としては水系溶媒が好ましい。
ＴｈＴ溶液におけるＴｈＴ濃度に特に制限はないが、通常、０．００１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。精製過程での光反応物（蛍光性不純物）の新たな生成をより一層抑制するという観点からは、ＴｈＴ濃度が低い方が好ましく、例えば、０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましく、０．０２５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることがより好ましく、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが更に好ましい。また、ＴｈＴ溶液におけるＴｈＴ濃度は、精製後のＴｈＴの用途に応じて、改めて希釈又は濃縮を行う必要がないように設定してもよい。
第２のステップは、ＴｈＴ溶液を無極性溶媒で液液抽出するステップである。このステップにより、ＴｈＴがＴｈＴ溶液中に留まる一方で、蛍光性不純物がＴｈＴ溶液から無極性溶媒へと移動し、ＴｈＴ溶液が洗浄される。液液抽出（分液）は、公知の方法に従って行えばよい。具体的には例えば、分液ロート又は液体抽出器を使用して液液抽出を行うことができる。
無極性溶媒は、ＴｈＴが溶解せず、かつＴｈＴ溶液と層分離する溶媒を特に制限なく使用することができる。無極性溶媒としては、例えば、比誘電率が１０未満である有機溶媒を使用することができる。無極性溶媒の具体例としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン及びシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素、トルエン及びキシレン等の芳香族炭化水素、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒を挙げることができる。
第２のステップは、例えば、ＴｈＴ溶液に未抽出の無極性溶媒を加えて充分に混和して溶質を分配させた後、ＴｈＴ溶液（極性溶媒層）と無極性溶媒層を層分離させる操作を１回の抽出操作としたとき、当該抽出操作を２回以上繰り返すステップであってもよい。抽出操作を２回以上繰り返す場合は、例えば、層分離したＴｈＴ溶液を回収し、回収したＴｈＴ溶液に未抽出の無極性溶媒を加えて、上述の操作を繰り返せばよい。
抽出操作を繰り返す回数は、使用する極性溶媒、無極性溶媒の種類、溶質濃度に応じて、純粋なＴｈＴを得るために必要な回数を適宜設定すればよい。純粋なＴｈＴを得るために必要な回数は、例えば、第２のステップと後述の第３のステップを交互に繰り返し、蛍光強度がバックグラウンドレベルになることを確認することで設定することができる。例えば、極性溶媒として水（純粋）を使用し、無極性溶媒としてヘキサンを使用する場合、抽出操作を１０回以上繰り返すことにより、純粋なＴｈＴを得ることができる。
第３のステップは、ＴｈＴ溶液の４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度（蛍光強度）を測定するステップである。４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光は、蛍光性不純物に特有のものである。
第３のステップでは、例えば、液液抽出後のＴｈＴ溶液（極性溶媒層）の一部を採取して測定サンプルとし、蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定には、例えば、蛍光分光光度計、蛍光プレートリーダーを使用することができる。より具体的には、測定サンプルに波長３００〜４３０ｎｍの光を照射し、これに応じた波長４４０〜４６０ｎｍの発光（蛍光）を測定する。照射光の波長は上記範囲内から適宜設定することができるが、波長３５０ｎｍが好ましい。測定する蛍光の波長は上記範囲内から適宜設定することができるが、波長４４０ｎｍが好ましい。
第４のステップは、第３のステップで測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達したか否かを判定する。バックグラウンドレベルに達していないと判定された場合は、第２のステップ（液液抽出するステップ）及び第３のステップ（発光強度を測定するステップ）を更に繰り返し、バックグラウンドレベルに達していると判定された場合は、精製を終了する。
なお、予め液液抽出の条件（抽出回数、極性溶媒／無極性溶媒の容量比等）を決定しておけば、第３のステップ及び第４のステップの実施は必須ではない。
「バックグラウンドレベル」とは、精製されたＴｈＴ溶液の蛍光強度が、純粋なＴｈＴ溶液の蛍光強度と同程度であることを意味する。「バックグラウンドレベル」の判定は、例えば、以下のようにして実施することができる。すなわち、精製されたＴｈＴ溶液の波長４４０ｎｍの蛍光強度に加えて、波長４８０ｎｍの蛍光強度も測定し、波長４４０ｎｍの蛍光強度を波長４８０ｎｍの蛍光強度で除した蛍光比を求める。この蛍光比が、０．４〜１．０の範囲内にある場合に「バックグラウンドレベル」と判定することができる。ここで、蛍光比が０．５〜０．９の範囲内にある場合に「バックグラウンドレベル」と判定することが好ましく、０．６〜０．８の範囲内にある場合に「バックグラウンドレベル」と判定することがより好ましい。また、より簡易的には、第３のステップで測定された蛍光強度の測定値がそれ以上低下しない場合に「バックグラウンドレベル」と判定してもよい。
精製終了後のＴｈＴ溶液は、そのまま次の用途に用いてもよいし、必要に応じて極性溶媒を除去し、ＴｈＴ粉末として次の用途に用いてもよいし、ＴｈＴ粉末を任意の溶媒に再溶解させたものを次の用途に用いてもよい。
上述した精製方法は、波長４７５ｎｍ以下の光を遮光した状態で行われることが好ましい。これにより、蛍光性不純物が新たに生成することを抑制できるため、精製方法全体の効率をより一層向上させることができる。精製方法の全工程に亘って遮光した状態としてもよいが、第２のステップ以降を遮光した状態としても問題はない。波長４７５ｎｍ以下の光を遮光する方法は、適宜選択することができる。具体的には、例えば、赤色光下で精製操作を行う、又は（完全に）遮光した状態で精製操作を行うことができる。
〔チオフラビンＴの製造方法〕
本実施形態に係るチオフラビンＴの製造方法は、上述したチオフラビンＴの精製方法を実施する精製工程を備える。本実施形態に係る製造方法により、純粋なＴｈＴを得ることができる。
本実施形態に係る製造方法は、精製工程の前に、ＴｈＴを合成する合成工程、粗ＴｈＴを極性溶媒に溶解させる溶解工程等を備えていてもよい。また、精製工程の後に、得られた純粋なＴｈＴを包装する包装工程を備えていてもよい。包装工程は、例えば、遮光瓶（褐色瓶等）等の容器にＴｈＴ溶液を充填する工程であってもよい。
〔チオフラビンＴを含有する組成物〕
本実施形態に係るチオフラビンＴを含有する組成物は、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度がバックグラウンドレベルである組成物である。すなわち、蛍光性不純物を実質的に含まない組成物、又は実質的にＴｈＴからなる組成物（分子集合体）である。一実施形態に係る組成物は、チオフラビンＴを含有し、波長３５０ｎｍの光を照射したときの波長４４０ｎｍの蛍光の発光強度がバックグラウンドレベルである組成物である。
本実施形態に係る組成物は、液状、固体状のいずれであってもよい。本実施形態に係る組成物は、蛍光性不純物の生成を抑制するとの観点から、遮光された容器（褐色瓶等）に充填されていることが好ましい。
本実施形態に係る組成物は、上述したＴｈＴの精製方法又は製造方法により得ることができる。
本実施形態に係る組成物は、蛍光性不純物を実質的に含まないため、アミロイドの染色に用いた場合に、蛍光性不純物による測定結果への影響を排除でき、より精度の高い試験結果及び診断結果を得ることができる。したがって、本実施形態に係る組成物は、アミロイド検出用組成物（アミロイド検出用蛍光試薬）として好適に使用できる。
〔アミロイドの検出方法〕
アミロイドとは、βシート構造が特徴的なタンパク質の特殊な凝集状態を示す。アミロイドには、元になるタンパク質の違いにより、様々な種類が存在する。すなわち、インスリンの場合はインスリンアミロイドと呼ばれ、β２ミクログロブリンの場合はβ２ミクログロブリンアミロイドと呼ばれ、アミロイドβタンパク質の場合はβアミロイドと呼ばれる。体内でのアミロイドの蓄積は病気の原因にもなる。例えば、β２ミクログロブリンアミロイドは、透析アミロイド―シス、βアミロイドはアルツハイマー病である。
本実施形態に係るアミロイドの検出方法は、蛍光試薬として本発明に係る組成物を使用すること以外は、常法に従って実施することができる。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
ＴｈＴ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ Ｉｎｃ．社製。本明細書における粗ＴｈＴに該当する。）３．４ｍｇを２０ｍＬの純水に溶解してＴｈＴ溶液を調製した。
次に、ＴｈＴ溶液を分液ロートに入れ、ヘキサン５０ｍＬを添加し、勢いよく混合して抽出操作を行った後、分液ロートの下方のコックからＴｈＴ溶液を取り出した。このＴｈＴ溶液の一部をキュベットに取り、蛍光分光光度計ＲＦ−５０００（株式会社島津製作所製）で励起波長３５０ｎｍ、観測波長４４０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
上記抽出操作を、蛍光強度がバックグラウンドレベルに達するまで（蛍光強度の測定値がそれ以上低下しなくなるまで）、１０回繰り返した。図２に、抽出回数と蛍光強度の関係を示す。１０回目でバックグラウンドレベルに達していることが分かる。また、観測波長４４０ｎｍの蛍光強度と、別途測定した波長４８０ｎｍの蛍光強度との蛍光比は０．６６７であった。この蛍光比からもバックグラウンドレベルと判定できる。
精製後のＴｈＴ溶液の蛍光スペクトルを図３に示す。比較のため、精製前のＴｈＴ溶液の蛍光スペクトルも示した。図３から明らかなように、精製後のＴｈＴ溶液では、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光が完全に消失し、ＴｈＴ由来の４８０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光のみが観察された。すなわち、蛍光性不純物を完全に除去したＴｈＴが得られたと結論付けられる。

Claims (5)

  1. 粗チオフラビンＴが極性溶媒に溶解したチオフラビンＴ溶液を用意するステップと、
    チオフラビンＴ溶液中の蛍光性不純物を無極性溶媒で液液抽出するステップと、を備える、純粋なチオフラビンＴを得る方法。
  2. 液液抽出するステップが、波長４７５ｎｍ以下の光を遮光した状態で行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記極性溶媒が、水系溶媒、メタノール、エタノール、アセトニトリル及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記無極性溶媒が、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、トルエン及びキシレン、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法を実施する精製工程を備える、純粋なチオフラビンＴの製造方法。
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