DE112010000680T5

DE112010000680T5 - Nanorauhes Legierungssubstrat

Info

Publication number: DE112010000680T5
Application number: DE112010000680T
Authority: DE
Inventors: Steven W. Ek
Original assignee: Arthrosurface Inc
Current assignee: Arthrosurface Inc
Priority date: 2009-02-23
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2012-12-13
Also published as: WO2010096826A1; GB201114417D0; GB2479514A; US20100185294A1

Abstract

Ein CoCr-Substrat für die Züchtung von Säugetierzellen und insbesondere von Chrondrozyten und synovialen Stammzellen. Das Substrat kann elektrolytisch behandelt werden, um eine Flächentopographie zu erzeugen, die zugänglich ist für Zellwachstum und Migration. Das Substrat zeigt verbesserte Adhäsions- und Migrationscharakteristiken und kann nützlich sein als Prothese oder Implantat und insbesondere als Prothese in einem Gelenk wie beispielsweise dem Knie.

Description

Hintergrund
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Oberflächen für die Züchtung von Zellen und insbesondere Substrate, die als Träger für Chondrozyten und synoviale Stammzellen geeignet sind.
2. Stand der Technik
Knochenerkrankungen oder Knochenverletzungen lassen sich durch die Verwendung von Implantaten oder Prothesen mitunter kontrollieren, heilen oder bessern. Diese Implantate oder Prothesen können aus biokompatiblen Materialien bestehen, die verwendbar sind, um Gewebe wie Knochen und/oder Knorpel zu ergänzen oder zu ersetzen. In manchen Fällen können diese Materialien ein Substrat bilden, auf dem Zellen wie Knochen- und/oder Knorpelzellen haften und/oder wachsen können.
Übersicht
Der Gegenstand dieser Anmeldung kann in manchen Fällen damit verbundene Produkte, alternative Losungen für ein spezielles Problem und/oder eine Vielzahl von unterschiedlichen Verwendungen eines einzelnen Systems oder Artikels umfassen.
Gemäß einem Aspekt wird eine Gelenkprothese angegeben, die eine erste Oberfläche mit einer Krümmung aufweist, die im Wesentlichen an die Kontur einer nativen Gelenkfläche angepasst ist, wobei die erste Oberfläche eine Kobalt-Chrom-Legierung umfasst, die eine Oberflächenformation einer durchschnittlichen Größe zwischen 10 und 30 nm hat.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird eine Prothese zur Unterstützung des Wachstums von Säugetierzellen angegeben, wobei die Prothese eine Kobalt-Chrom-Legierungsoberfläche mit einer Oberflächenenergie von mehr als 30 mJ/m² umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird eine Prothese zur Unterstützung von Säugetierzellen angegeben, wobei die Prothese eine konturierte Oberfläche aufweist, die eine Kobalt-Chrom-Legierung mit einem Kontaktwinkel von weniger als 60 Grad umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Chondrozytenadhäsion;
2 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Adhäsion der synovialen Stammzellen;
3 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Chondrozytenmigration;
4 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Migration der synovialen Stammzellen;
5 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Chondrozyten-GAG-Synthese;
6 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die GAG-Synthese der synovialen Stammzellen;
7 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Chondrozyten-Kollagensynthese;
8 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Kollagensynthese der synovialen Stammzellen;
9 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Adsorption von Fibronektin, Vitronektin und IgG;
10 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der Versuchsergebnisse betreffend die Zellbindungsregionen für RGD und Heparinsulfat; und
11 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung Versuchsergebnisse betreffend die Zelldichte für vier verschiedene CoCr-Substrate;
12 ist eine Photographie eines Mikro-CT-Scan (Koronalebene);
13 ist eine Photographie eines Mikro-CT-Scan (Sagittalebene) eines Implantats, das eine behandelte CoCr-Außenfläche aufweist;
14 ist eine Photographie zur Darstellung eines produzierten Kondylendefekts bei einem Versuchstier;
15 ist eine Photographie zur Darstellung der Oberfläche eines unbehandelten Implantats nach 26 Wochen;
16 ist eine Photographie zur Darstellung der Oberfläche eines behandelten Implantats nach sechs Wochen;
17 ist eine Photographie zur Darstellung des Gewebewachstums über der Oberfläche eines behandelten Implantats nach 12 Wochen.
Detailbeschreibung
Gemäß einem Aspekt kann ein metallisches Substrat als eine Trägerfläche für Säugetierzellen wie Chondrozyten und synoviale Stammzellen verwendet werden. Das Substrat kann für den Einsatz bei einer oder mehreren Flächen eines Säugetiergelenks geeignet sein und kann einen Teil einer Prothese oder eine gesamte Prothese bilden. Die Prothese kann einen Gewindebereich aufweisen, der aus dem Substratmaterial oder aus einem davon verschiedenen Material hergestellt ist. Zum Beispiel kann die Prothese einen Oberflächenbereich aus CoCr und einen Gewindebereich aus CoCr oder Ti aufweisen. Das Substrat kann ein Metall oder eine Metalllegierung wie beispielsweise Kobalt-Chrom (CoCr) aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann das CoCr zum Beispiel mit Molybdän (CoCrMo) dotiert sein. in weiteren Ausführungsformen kann die Legierung auch Zirkon enthalten. Das Substrat kann zunächst durch Anwendung von Verfahren wie Gießen oder Sintern gebildet werden. Das Material kann ein einheitliches, durchgehendes Substrat oder ein Überzug auf einem alternativen Material sein. Zum Beispiel kann eine Titanschraube mit einer CoCr-Legierung versehen sein. Die behandelte Oberfläche kann so geformt sein, dass sie an die Kontur des Bereichs, in dem sie eingesetzt wird, angepasst ist. Eine CoCr-Kappe beispielsweise kann eine halbkugelförmige Oberfläche aufweisen, die im Wesentlichen an die Kontur des Knorpels angepasst ist, in den sie implantiert ist. Die Oberfläche des Substrats kann sehr kleine Formationen im Nanometerbereich aufweisen. Zum Beispiel kann das Substrat Oberflächenformationen aufweisen, die kleiner als 50 nm, kleiner als 40 nm oder kleiner als 30 nm sind und die größer als 10 oder 20 nm sein können. Es kann die gesamte Oberfläche des Substrats behandelt sein, oder die Behandlung kann auf bestimmte Flächen beschränkt sein, zum Beispiel auf solche, auf denen das Zellwachstum gefördert werden soll. In manchen Ausführungsformen beträgt die durchschnittliche Dimension der Oberflächenformationen zwischen 5 und 30 nm, zwischen 10 und 30 nm oder zwischen 15 und 25 nm, gemessen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM). Die Oberfläche kann auch über eine verbesserte Benetzbarkeit verfügen, wie das ein Kontaktwinkel von weniger als 50°, weniger als 40°, weniger als 30°, weniger als 20° oder weniger als 15° beweist. Die Oberflächenenergie kann größer als bei üblichen CoCr-Oberflächen und in manchen Fällen größer als 12 mJ/m², größer als 20 mJ/m², größer als 30 mJ/m² oder größer als 40 mJ/m² sein. Diese Merkmale können für eine verbesserte Zell-(z. B. Chondrozyten)Adhäsion und/oder für ein verbessertes Wachstum auf dem Substrat sorgen. Zellen können direkt auf der Oberfläche der behandelten Legierung gezüchtet werden, wenn ein anderes Beschichtungsmaterial fehlt. Die Formationen können auf der Oberfläche des Substrats gebildet werden, indem in einer sauren Elektrolytlösung wie 1 M H₂SO₄ Strom durch das Material (als positive Elektrode) geleitet wird. Die Oberfläche des Materials kann nach diesem Verfahren als ”anodisiert” betrachtet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Vorbereitung eines Materials als Substrat für eine Zelladhäsion und/oder Zellzüchtung angegeben. Das Material kann ein Metall wie eine metallische Legierung sein. Bevorzugte Legierungen enthalten CoCr, das Mo, Ta und/oder W enthalten oder frei davon sein kann. Das CoCr kann eines oder mehrere der Elemente Kohlenstoff, Molybdän und Stickstoff enthalten. In manchen Ausführungsformen kann die Zusammensetzung des CoCr (in Gewichtsprozent) 0,01 bis 1,0% C, 20 bis 40% Co, 1 bis 10% Mo, 0,01 bis 1,0% N und den Rest Co enthalten. In einer Gruppe von Ausführungsformen enthält die CoCr-Legierung 0,2 bis 0,3% C, 26 bis 30% Co, 5 bis 7% Mo, 0,15 bis 0,2% N und den Rest Co. Ein Beispiel eines Materials, das sich als nützlich erwiesen hat, ist die Legierung BioDur^® CCM Plus^®, die von Carpenter Specialty Alloys bezogen werden kann. Andere bevorzugte Metalle umfassen beispielsweise Titan, das unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren in der gleichen Weise behandelt werden kann. In manchen Ausführungsformen kann das Material im Wesentlichen aus CoCr bestehen. Das Material kann so vorbereitet werden, dass es eine Oberflächenstruktur zeigt, die offen ist für die Adhäsion und das Wachstum von Säugetierzellen wie Chondrozyten und synoviale Stammzellen. Das Material kann Oberflächenformationen aufweisen, wie sie vorliegend beschrieben sind. Das Material kann dann für eine Implantation in einem Versuchstier bereitgestellt und für solche Einsätze gefördert werden.
Das Behandlungsverfahren kann einen elektrolytischen Prozess umfassen, der vorliegend als Anodisation bezeichnet werden kann. Es versteht sich jedoch, dass jegliche chemische Umwandlung an der Oberfläche des Materials möglicherweise nicht identisch ist mit jener, die über die traditionelle Anodisation erreicht wird, wenn beispielsweise Aluminium anodisiert wird. Das Material, das vorbereitet wird, kann in dem elektrolytischen Prozess als Anode (positive Elektrode) konfiguriert sein. Die Kathode kann aus einem beliebigen geeigneten Material bestehen, zum Beispiel aus einem Edelmetall wie Platin. Das Anodenmaterial kann in einer sauren Lösung wie einer Mineralsäure angeordnet sein. Beispiele solcher speziellen Säuren, die verwendet werden können, sind unter anderem Chromsäure, Hydrofluorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder eine organische Säure. Die Lösung kann in einem Glas- oder Polymerbehälter enthalten sein, der für die Verwendung mit dem gewählten Elektrolyt geeignet ist. In einer Gruppe von Ausführungsformen ist der Elektrolyt Schwefelsäure. Die Konzentration der Säurelösung kann zum Beispiel zwischen 0,1 und 5 M, zwischen 0,5 und 2 M oder circa 1,0 M betragen. in einer Ausführungsform werden 1,0 M Schwefelsäure verwendet. in einigen Ausführungsformen kann die angelegte Spannung niedriger als jene sein, die bei üblichen Anodisationsprozessen verwendet wird. Zum Beispiel kann die Spannung niedriger als 20 V sein. Bereiche für die angelegte Spannung können beispielsweise größer als 100 mV und kleiner als 30 V sein. Alternative Spannungsbereiche können 100 mV bis 10 V, 500 mV bis 5 V, 1 V bis 3 V und 2 V sein. Die Spannung kann über eine Dauer angelegt werden, die ausreicht, um den gewünschten Oberflächeneffekt zu erzielen. In manchen Fällen kann diese Zeitspanne weniger als eine Stunde, weniger als 10 Minuten, weniger als 5 Minuten oder weniger als zwei Minuten betragen. In anderen Ausführungsformen kann die Spannung länger als 10 Sekunden, länger als 30 Sekunden oder länger als eine Minute angelegt werden. in einer speziellen Gruppe von Ausführungsformen wird eine Ladung von zwei Volt für eine Dauer von zwei Minuten angelegt. Während des Elektrolysevorgangs kann die Lösung beispielsweise durch magnetische Bewegung bewegt werden.
Die aus dem vorstehenden Verfahren entstandene Substratoberfläche kann einzigartige Oberflächencharakteristiken aufweisen, die sie ideal für Zelladhäsion und Zellwachstum machen. Zum Beispiel kann die Oberfläche für eine verbesserte Adhäsion und für ein verbessertes Wachstum von Chondrozyten und/oder synovialen Stammzellen sorgen. Diese Formationen können in ihrer Größe zwischen 10 und 30 nm und in manchen Fällen zwischen 20 und 25 nm liegen. Die Formationen können im Wesentlichen kugelförmig sein, was bedeutet, dass die Formationen im Wesentlichen die Form eines Teils einer Kugel haben, der sich von der Substratoberfläche nach außen erstreckt. Die Abstände zwischen diesen Formationen können gleich oder willkürlich sein. Die Formationen sind durch Atomkraftmikroskopie (AFM) detektierbar, wobei die Rasterung 1 μm beträgt, die bei manchen Gruppen von Ausführungsformen RMS-Werte von etwa 23,5 nm ergab. Die Größe der Formationen des behandelten CoCr beträgt also etwas 20 nm, wohingegen bei unbehandeltem Material keine Oberflächenformationen auf Nanometerebene zu beobachten (detektierbar) sind. Die unbehandelten Proben gelten daher als ”nanoglatt”. Wenn die Rasterung beim Scannen 5 μm beträgt, ist festzustellen, dass der RMS-Wert sowohl bei dem unbehandelten als auch bei dem behandelten Material bei etwa 50 nm liegt. Ähnlich beträgt der RMS-Wert der Formationen bei einer Rasterung von 25 μm sowohl bei dem behandelten als auch bei dem unbehandelten CoCr etwa 2 μm.
Eine Behandlung unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Elektrolyseverfahrens kann auch die Oberflächenenergie und den Kontaktwinkel des Substrats verändern. Was den Kontaktwinkel betrifft, so zeigt unbehandeltes CoCr in typischer Weise einen Kontaktwinkel von 65 Grad (gemessen mittels des nachstehend beschriebenen Verfahrens), wohingegen das gleiche Material nach einer Elektrolysebehandlung einen Kontaktwinkel von 13 Grad zeigt. Ähnlich lässt sich die Oberflächenenergie nach der Behandlung von 12 mJ/m² auf 45 mJ/m² erhöhen.
Versuchsergebnisse
Eine Probe von CoCr (Legierung BioDur^® CCM Plus^®, enthaltend 0,2 bis 0,3% C, 26 bis 30% Cr, 5 bis 7% Mo, 0,15 bis 0,2% N und den Rest Co) wurde durch Anodisieren des Materials bei einer Spannung von 2 Volt und einer Dauer von 2 Minuten in einer 1 M H₂SO₄-Lösung behandelt. Das gleiche Material wurde in allen Versuchen verwendet, sofern nicht anders angegeben. Die Merkmale und Eigenschaften des Substrats wurden dann wie nachstehend angegeben charakterisiert. Die Oberflächenformationen wurden mittels Atomkraftmikroskopie (AFM) charakterisiert.
Die Nanometermessungen der Oberflächenrauheit sowohl unbehandelter als auch (wie oben) behandelter CoCr-Proben wurden unter Verwendung eines Mehrmoden-AFM (Dimension 3100, Veeco, CA) durchgeführt. Es wurden Scan-Bereiche von 1 μm × 1 μm (Nanobereich), 5 μm × 5 μm (unterer Mikronbereich) und 25 μm × 25 μm (oberer Mikronbereich) verwendet. Handelsübliche AFM-Spitzen (der Radius der Spitzenkrümmung betrug weniger als 10 nm, NSC15/ALBS, Micro-Masch, OR) wurden in einem Tapping-Modus bei einer Scan-Rate von 0,5 Hz verwendet. Die Vollkegelwinkel der Spitzen betrugen 30°, jedoch weniger als 10° bei dem Spitzenscheitel von 200 nm (die Spitzenhöhe betrug 25 μm, mit einer Konstantkraft von 40 N/m). Die exakte Nanometeroberflächenformation der Proben wurde quantitativ anhand des 1 μm × 1 μm AFN-Scan bestimmt. Die Scans, die bei 5 × 5 μm und bei 25 × 25 μm durchgeführt wurden, zeigten in den Formationen einen geringen oder keinen Unterschied zwischen der unbehandelten und der behandelten Probe. Wurden die Proben jedoch bei 1 μm × 1 μm gescannt, stellte man eine signifikante Änderung der Landschaft fest. Während die unbehandelte Probe Formationen von lediglich etwa 1 nm zeigte, konnten bei den behandelten Proben Formationen einer Größe von 23,5 nm festgestellt werden. Wenngleich diese Änderung der Oberflächenstruktur nur in dem Bereich von 1 μm × 1 μm detektierbar ist, kann sie doch bedeutend sein, und es wird angenommen, dass diese Änderung für ein deutlich verbessertes Zellsubstrat sorgt. Das anodisierte Material wird vorliegend als ”nanorauhes” Material bezeichnet. Die (nachstehende) Tabelle 1 enthält die Daten betreffend die durch AFM detektierte Oberflächenstruktur.
Die Kontaktwinkel und die Oberflächenenergie der Proben wurden ebenfalls bestimmt. Es wurde ein Tropfenkonturanalysesystem (EasyDrop-Kontaktwinkelsystem, Krüss, Deutschland) mit Analysesoftware (DSA1) für die Bestimmung der Oberflächenkontaktwinkel an den Proben verwendet. Als Kontaktlösung wurde destilliertes Wasser verwendet. Sämtliche Daten wurden fünf Sekunden nach dem Aufbringen des Tropfens auf der Oberfläche unter Umgebungsbedingungen gewonnen. Für die Berechnung der Oberflächenenergie wurde die Formel E_s = E_Iv – cosθ angewendet, wobei bei reinem Wasser bei 20°C E_Iv = 72,8 m/J betrug und θ der statische Kontaktwinkel war. Hier war E_s die Oberflächenenergie der Kontaktfläche und E_Iv die Oberflächenenergie zwischen dem Wasser und Luft unter Umgebungsbedingungen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben und zeigen, dass sich die Oberflächenenergie an dem CoCr-Substrat von 12 mJ/m² auf der unbehandelten Oberfläche auf 45 mJ/m² auf der behandelten Oberfläche erhöht hat.

Zwischen den Versuchen wurden die Proben durch Einweichen und Ultraschall getrennt in Azeton und Ethanol gereinigt. Die Materialien wurden dann hinsichtlich der Eigenschaften wie oben beschrieben und hinsichtlich der Chemie mittels EDS (energiedispersiver Röntgenspektroskopie unter Verwendung eines Oxford INCH 250 Detektors und zugehöriger Software: Oxford Instrument America, Inc., Concord, MA) erneut charakterisiert. Die Unterschiede zwischen der Materialcharakterisierung und den Zell/Protein-Studien wurden unter Anwendung einer Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, gefolgt von Student T-Tests. Tabelle 1: Materialcharakterisierung von anodisierten und nichtanodisierten CoCr-Proben

Probenbehandlung	AFM RMS (Rasterung 1 μm)	AFM RMS (Rasterung 5 μm)	AFM RMS (Rasterung 25 μm)	Durchschnittliche Größe der Oberflächenformation auf nm-Ebene	Kontaktwinkel (Grad)	Oberflächenenergie (mJ/m²)
Unbehandelt	1,1 nm	57 nm	2,1 μm	nicht detektierbar	65	12
Elektrolytisch behandelt	23,5 nm*	50 nm	1,9 μm	Kugeln von 20 nm Durchmesser*	13*	45*

* p < 0,01 (verglichen mit nichtanodisiertem CoCr)

Für die Bewertung des Einsatzes von nanorauhem CoCr-Material als Substrat für die Adhäsion und Züchtung von Zellen wurden weitere Versuche gestaltet und durchgeführt. Das behandelte CoCr-Material wurde sowohl bei humanen Gelenkchondrozyten als auch synovialen Stammzellen evaluiert.
Humane Gelenkchondrozyten (knorpelsynthetisierende Zellen, bezogen von Cell Applications Inc.) wurden in einem Chondrozyten-Kultivierungsmedium (Cell Applications Inc.) auf 100 mm Petrischalen kultiviert. Die Zellen wurden unter den üblichen fachbekannten Zellkulturbedingungen in einer sterilen, befeuchteten Umgebung, 5% CO₂, 95% Luft, 37°C, inkubiert. Der Phänotyp der Chondrozyten wurde durch die Synthese von in Chondrozyten exprimiertem Protein-68 (CEP 68) bis zu 21 Tage lang in Kultur und unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben charakterisiert.
Als Quelle synovialer Stammzellen wurden Primärzellen aus der Synovialmembran von Kniegelenken vier Monate alter weiblicher Schweine durch Zerkleinern und enzymatische Digestion unter Verwendung von 0,25%igem Trypsin für eine Dauer von 30 Minuten und von 0,4%iger Collagenase II für eine Dauer von einer Stunde und anschließende Filtration durch 70 μm Zellsiebe isoliert. Die Zellen wurden in hochglykämischem DMEM (4,5 μg/L D-Glukose, L-Glutamin, 1 mg/l Natriumpyruvat) expandiert und mit 1,0% FBS, 1,0% ITS Premix, 1,00 U/ml Penicillin, 1,00 pg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 2,5 μg/ml Amphotericin B ergänzt. Das gleiche Medium wurde für die Zellkultur verwendet.
Für die Charakterisierung der Zelladhäsion und Zelldichte wurden die folgenden Versuche sowohl an unbehandeltem als auch behandeltem (nanorauhen) Material durchgeführt: Chondrozyten und synoviale Stammzellen wurden getrennt mit 3.500 Zellen pro Quadratzentimeter ausgebracht und für die Dauer einer Stunde kultiviert. Am Ende jedes Zeitpunkts wurden nichtadhärente Zellen durch Spülen mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS-Lösung) abgespült, während adhärente Zellen fixiert, gefärbt und gezählt wurden. Für diesen Zweck wurde zur Zellfärbung die Lebend/Tot-Färbung (Molekularsonden) angewendet. Die Ergebnisse des Vergleichs zwischen nichtanodisiertem CoCr und behandeltem CoCr sind in dem Balkendiagramm von 1 (Chondrozyten) und 2 (synoviale Stammzellen) gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass überraschenderweise 100% der Zellen an der behandelten Oberfläche hafteten. Weniger als zwei Drittel der Zellen hafteten an dem unbehandelten CoCr-Substrat.
Für die nachstehend angegebenen Differenzierungsstudien wurden Zellen mit 50.000 Zellen pro Quadratzentimeter ausgebracht, wobei als Zeitpunkte für die Anlagerung und das Wachstum der Zellen 3, 5 und 7 Tage bestimmt wurden. Am Ende eines jeden Zeitpunkts wurden nichtadhärente Zellen durch Spülen mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS-Lösung) abgespült. Die Zellzählungen in diesen langen Zeiträumen erfolgten mittels des Cytotox 96 Tests (Promega) nach den Anweisungen des Herstellers. Insbesondere wurden die Substrate in sauberen Wells angeordnet, bei –70°C für eine Dauer von 30 Minuten tiefgefroren und dann zum Lysieren der Zellen bei 37°C für eine Dauer von 15 Minuten inkubiert. Die entstandene Lösung wurde bei 250 × g für eine Dauer von 4 Minuten zentrifugiert, und 50 μL der Lösung wurden in ein Well einer 96 Well-Platte gegeben. Insgesamt wurden 50 μL Substratmix (Cytotox 96, Progmega) zugegeben, und die Platte wurde für eine Dauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur und lichtgeschützt inkubiert. Nach der Inkubation wurde jedem Well eine Stopplösung (Cytotox 96, Promega) zugegeben, und es wurde die Lichtabsorbanz mit Hilfe eines Mikroplattenlesers und eines Spektrophotometers (SpectraMax 190, Molecular Devices Corp.) bei 490 mit bestimmt, wozu Computersoftware (SoftMax Pro 3.12, Molecular Devices Corp.) verwendet wurde. Das Ergebnis der Lichtabsorbanz wurde mit einer Standardkurve verglichen, um die Zellenzahl zu berechnen. Eine Standardkurve wurde durch eine lineare Regressionsanalyse erstellt, wobei die Lichtabsorbanz von Zelllysaten in bekannten Konzentrationen verwendet wurde.
Die Zellmigration (Oberflächenokkupanz) wurde sowohl bei behandelten als auch unbehandelten CoCr-Proben evaluiert. Sterile PTFE-Zäune wurden auf den behandelten und unbehandelten CoCr-Substraten platziert und bedeckten die gesamte Substratfläche, mit Ausnahme eines zentralen kreisrunden Well-Bereichs. Zellen (25.000 Zellen) wurden in dem zentralen Well der Zäune in einem jeweiligen Kulturmedium ausgebracht, und man ließ sie unter Standard-Zellkulturbedingungen für eine Dauer von 4 Stunden anwachsen. An diesem Zeitpunkt wurden die Zäune vorsichtig entfernt (um eine Störung von adhärenten Zellen zu vermeiden), und das Medium in den Wells wurde angesaugt. Die konfluente Zellkolonie wurde vorsichtig mit einer phosphatgepufferten Salzlösung gespült (um nichtadhärente Zellen zu entfernen) und wurde dann in einem jeweiligen Medium unter Standard-Zellkulturbedingungen für eine Dauer von vier Tagen kultiviert. Auf den Substraten vorhandene Zellen wurden dann mit 4%igem Formaldehyd für eine Dauer von 10 Minuten in situ fixiert, mit Hoechst 33258 gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie (365 nm Erregung; 400 nm Emission) visualisiert. Die gesamte Migrationsdistanz (in mm), die von jeder Zellkultur belegt wurde, wurde mit Hilfe von Image Pro bestimmt. Die graphischen Ergebnisse (Durchschnitt +/– REM; N = 3; p < 0,01 (behandelt im Vergleich zu unbehandelt)) der Studie für Chondrozyten sind in 3 angegeben, und die Ergebnisse für synoviale Stammzellen sind in 4 angegeben. Die Ergebnisse für beide Zellarten zeigen eine Zunahme der Migration von etwa 5X bei behandeltem CoCr im Vergleich zu unbehandeltem CoCr.
Zur Bestimmung der Wirkung der Substrat-Topologie bei Zelldifferenzierung wurde ein Experiment zur Messung einiger Proteine (speziell des gesamten interzellularen Kollagens und der Glykosaminoglykane (GAGs)), die durch Chondrozyten und synoviale Stammzellen in situ synthetisiert wurden, entwickelt. Die Menge der produzierten Proteine wurde als Maß der Zelldifferenzierung bei Kultivierung auf behandelten und unbehandelten CoCr-Substraten ermittelt. GAGs wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Tests auf Spektrophotometerbasis (Blyscan Assay Kit, Biocolor) gemäß Herstelleranweisung bestimmt. Zu diesem Zweck wurden 50 μl von Teilportionen von Zellextrakten, die aus Zelllysaten gewonnen wurden (durch drei Gefrier-Tau-Zyklen destillierten Wassers am Ende jeder Zeitperiode), in ein Set von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufgegeben. Die Röhrchen wurden bis zu 100 μl mit PBS gefüllt. Allen Röhrchen wurde Blyscan Färbemittel (1 ml) zugegeben und die Röhrchen wurden für eine Dauer von 30 Minuten auf einen Shaker gesetzt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Röhrchen bei 10.000 × g für eine Dauer von 10 Minuten zentrifugiert, und die Färbemittellösung wurde vorsichtig entfernt, ohne den GAG-Niederschlag auf dem Boden des Röhrchens zu stören. Dann wurde den Röhrchen 1 ml des Dissoziationsreagens zugegeben und mit Hilfe eines Vortex-Mischers für eine Dauer von 10 Minuten gründlich gemischt. Jede Probe (200 μl) wurde in ein Well einer 96-Well Platte überführt, und die Absorbanz wurde mit Hilfe eines Spektrophotometers bei 656 nm abgelesen. Der GAG-Gehalt wurde für die Zellzahl (wie vorstehend beschrieben bestimmt) und für die Substratfläche normiert. Die normierten Ergebnisse der GAG-Produktion (Durchschnitt +/– REM; N = 3; p < 0,01) sind für die behandelten und die unbehandelten CoCr-Substrate in 5 (Chondrozyten) und 6 (synoviale Stammzellen) graphisch dargestellt. Bei dem Vergleich des behandelten CoCr mit dem unbehandelten Material zeigten die Ergebnisse nach drei, fünf und sieben Tagen eine Zunahme der GAG-Synthese von etwa 4X.
Auf ähnliche Weise wurden die intrazellulären Kollagenkonzentrationen mit Hilfe einer Sirius-Red-Färbung (Direct Red; Sigma) und eines Spektrophotometers bestimmt. Die Zellen wurden wie vorstehend beschrieben durch Anwendung der Gefrier-Tau-Methode lysiert. Insbesondere wurden die Zellextrakte (50 al Well) dreifach pro Substrattyp in 96-Well Platten überführt. Die Platten wurden für die Dauer von 16 h (bei 37°C) in einem Feuchtinkubator und dann mit einem Sikkativ (bei 37°C) in einem Trockeninkubator angeordnet. Jeder Well wurde mit 200 μl destilliertem Wasser drei Mal 1 Minute lang gespült. 100 μl von 0,1%igem Sirius Red Färbemittel (0,05 g Sirius Red Pulver pro 50 ml Pikrinsäure) konnten sich bei Raumtemperatur für die Dauer einer Stunde setzen. Die Platten wurden unter Verwendung von 200 .1 von 0,1 M HCl fünf Mal mit destilliertem Wasser gespült. Das Färbemittel wurde dann mit 200 μl von 0,1 M NaOH fünf Minuten lang gespült und dann gründlich gemischt. Das Färbemittel wurde in eine zweite Platte überführt, um die Absorbanz bei 540 nm in einem Mikroplattenleser abzulesen. Es wurde eine Normkurve als Mikrogramme von Kollagen im Vergleich zur Absorbanz bei 540 nm konstruiert. Für die Normkurve wurde eine 0,1%ige Kollagen Typ I-Lösung (Sigma) in kleinen Schritten verdünnt, und die Lichtabsorbanz des Sirius Red Färbemittels in diesen Verdünnungen wurde aufgezeichnet. Die Gesamtmengen an Kollagen wurden für die Zellzahl und die Substratfläche normiert. Die Ergebnisse sind graphisch in 7 (Chonrdozyten) und 8 (synoviale Stammzellen) dargestellt und zeigen, dass sich bei beiden Zellarten die Kollagensynthese bei dem behandelten CoCr im Vergleich zu dem unbehandelten Material nach drei, fünf und sieben Tagen jeweils mehr als verdoppelt hatte.
Zur Bestimmung der Unterschiede der initialen Protein-Interaktionen auf den CoCr-Substraten wurden die Proteinbindungscharakteristiken der Substrate evaluiert. Die Versuchsproben wurden separat für die Dauer einer Stunde in 200 μl der vorstehend beschriebenen Chondrozytenwachstumsmedien eingeweicht. Die Substrate wurden dann mit PBS gespült, mit 2%igem Rinderserumalbumin (BSA; Sigma) eine Stunde lange geblockt und mit Anti-Bovin-Vitronektin (1:100; Accurate Chemical), Anti-Bovin-Fibronektin (1:100; Chemicon, Temecula, CA) und Anti-IgG für die Dauer einer Stunde (1:100 Chemicon) inkubiert. Unmittelbar danach wurden die Substrate mit Trisgepuffertem salzhaltigen 0,1%igem Triton X-100 (Sigma) gespült und mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1:100; Bio-Rad) inkubiert. Ein ABTS (2,2-Azino-bis (3-Ethylbenzthiazolin-6-Sulfonsäure))-lösliches Substrat-Kit (Vector Labs, Burlingame, CA) wurde für den spektrophotometrischen (SpectroMAX 190, 488 nm; Molecular Devices, Palo Alto, CA) Nachweis von Sekundärantikörpern nach Anweisung der Herstellers verwendet. Dies wurde auch durch die Verwendung von Antikörpern an Arginin-Glyzin-Asparginsäure (RGD; Molecular Probes) und Heparinsulfat-Bindungsbereichen von Proteinen ausgeführt, um die Bioaktivität der adsorbierten Proteine sicherzustellen. Die Ergebnisse der relativen Adsorption von Vitronektin, Fibronektin und IgG sind graphisch in 9 dargestellt. Die Ergebnisse der Vitronektin- und Fibronektin-Adsorption zeigen eine Zunahme von mehr als 10X bei dem behandelten gegenüber dem unbehandelten CoCr. Diese beiden Proteine sind bekannt für die Förderung der Chondrozyten-Adhäsion. Entsprechend zeigen diese Ergebnisse eine signifikante Verbesserung der Chondrozyten-Adhäsion bei behandeltem CoCr. Da IgG bekannt dafür ist, eine entzündliche Reaktion auszulösen, zeigt die Reduktion der IgG-Adhäsion, dass das behandelte CoCr ein ausgezeichnetes Substrat für die Züchtung von Chondrozyten, synovialen Stammzellen und Knorpelgewebe ist.
Die Ergebnisse für die exponierten relativen Bindungsregionen sowohl für RGD als auch Heparinsulfat sind graphisch in 10 dargestellt. Das behandelte CoCr hat einen drei- bis vierfachen Zuwachs an exponierten Bindungsregionen bei jedem dieser Proteine verzeichnet, was der Hinweis auf eine im Vergleich zu unbehandeltem Material verbesserte Fähigkeit ist, Zellen zu binden.
In einem weiteren Versuch wurde das CoCr-Substrat unter verschiedenen Bedingungen durch die Behandlung mit drei verschiedenen Elektrolytlösungen anodisiert. Probe A wurde nicht behandelt, Probe B wurde in 1 M H₂SO₄ behandelt, Probe C wurde in 0,1 M H₂SO₄ behandelt, und Probe D wurde in 1 M H₃PO₄ behandelt. Jede Probe wurde bei einer Spannung von 2 V zwei Minuten lang elektrolytisch behandelt. Die Proben wurden dann gespült und wie vorstehend ausgeführt hinsichtlich der Chondrozytenadhäsion evaluiert. Die Ergebnisse sind graphisch in 11 dargestellt und zeigen, dass das in 0,1 M H₂SO₄ behandelte CoCr-Substrat (Probe C) und das in 1 M H₃PO₄ behandelte Substrat (Probe D) im Vergleich zu der unbehandelten Probe (A) für eine signifikant verbesserte Chondrozytenadhäsion sorgten. Das in 1 M H₂SO₄ behandelte CoCr erzielte jedoch eine Adhäsionsrate von 100%, die mit den anderen Substraten nicht erzielt wurde.
In einem weiteren Versuch wurden Implantate, die ein behandeltes CoCr-Substrat enthielten, evaluiert für den Vergleich des behandelten Substrats mit dem vorher getesteten unbehandelten Substrat. Jedes Implantat enthielt einen Titanschraubenbereich zur Implantation in dem Knochen. Eine exponierte Kappe an jedem Insert bestand aus einer CoCr-Legierung. Das behandelte Implantat wurde elektrolytisch behandelt wie die ”elektrolytisch behandelte” Probe in der vorstehenden Tabelle 1 und zeigte dieselben Oberflächencharakteristiken wie die elektrolytisch behandelte Probe. Die vorher evaluierte unbehandelte Probe war identisch mit der unbehandelten Probe in Tabelle 1. Jedes eingesetzte Implantat war eine Kappe der Größe 12 mit einem Offset von 1,0 mm × 1,5 mm. Die Elemente wurden mit den üblichen klinischen Verfahren, die von KirkerHead et al und Walsh et al entwickelt wurden, implantiert. 6 Wochen nach dem Einsatz war der Verlust eines der Versuchstiere und 12 Wochen nach dem Einsatz der Verlust des anderen Versuchstieres zu verzeichnen.
Jeder Implantat-Typ wurde nach Herbeiführung eines Knorpelschadens in einem hinteren Femur eines anästhesierten zwei Jahre alten Schafes implantiert. Der Einsatz der Implantate erfolgte so, dass die CoCr-Fläche des Implantats etwas vertieft unter der Oberfläche des Knorpels lag. Photokopien von Mikrocomputertomographie-Scans des behandelten Implantats nach sechs Wochen sind in 12 (Koronalebene) und in 13 (Sagittalebene) gezeigt. Die Scans zeigen einen in den Oberschenkelknochen eingesetzten Gewindebereich der Prothese und einen konturierten Oberflächenbereich, der im Wesentlichen an die Krümmung der nativen Gelenkfläche angepasst ist. Eine Photographie des herbeigeführten Defekts vor dem Einsatz des Implantats ist in 14 gezeigt. 15 ist eine Photographie der lateralen und medialen Femurkondylen mit einem unbehandelten CoCr-Insert (rechts) nach 26 Wochen. Die Oberfläche des Implantats zeigt ein mangelndes Zellwachstum über dem exponierten Bereich.
16 ist eine Photographie der lateralen und medialen Femurkondylen mit einem behandelten CoCr-Insert (rechts) nach 6 Wochen. Die Photographie zeigt einen dünnen Zellfilm über der gesamten exponierten Oberfläche des behandelten Materials.
17 ist eine Photographie der lateralen und medialen Femurkondylen mit einem behandelten CoCr-Insert (rechts) nach 12 Wochen. Die Implantatoberfläche ist in der Photographie nicht erkennbar und ist vollständig mit Gewebe bedeckt.
Ein Vergleich der 15 (unbehandelt) mit den 16 und 17 liefert den sichtbaren Beweis eines erheblich verbesserten Zellwachstums im lebenden Organismus, wenn das CoCr-Substrat behandelt wurde, um eine nanorauhe Oberfläche zu bilden. Das behandelte Material mit einem Kontaktwinkel von 13 Grad, einer Oberflächenenergie von 45 mJ/m² und mit AFM RMS Oberflächenformationen von 23,5 nm (Scan-Rasterung 1 μm) sorgte für ein Zellwachstum über der gesamten Oberfläche des Implantats nach sechs Wochen und für ein extensives Gewebewachstum über dem Implantat nach 12 Wochen. Dies steht im Gegensatz zu dem unbehandelten Material, das bei einem Kontaktwinkel von 65 Grad, einer Oberflächenenergie von 12 mJ/m² und AFM RMS Oberflächenformationen von 1,1 nm (Scan-Rasterung 1 μm) nach 26 Wochen ein fehlendes Zellwachstum zeigt.
Es wurden mehrere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben und dargestellt. Der Fachmann wird erkennen, dass eine Vielfalt von anderen Mitteln und/oder Strukturen für die Durchführung der Funktionen und/oder für die Erzielung der Ergebnisse und/oder eines oder mehrerer der hier beschriebenen Vorteile möglich ist und dass solche Variationen und/oder Modifikationen innerhalb des Schutzrahmens der vorliegenden Erfindung liegen. Der Fachmann wird ebenso erkennen, dass sämtliche hier angegebenen Parameter, Dimensionen, Materialien und Konfiguration exemplarisch sind und dass die tatsächlichen Parameter, Dimensionen, Materialien und Konfigurationen von der speziellen Anwendung oder von den speziellen Anwendungen, auf welche die erfindungsgemäße Lehre angewandt wird, abhängig sind. Der Fachmann wird in der Lage sein, mit lediglich routinemäßigen Versuchen zahlreiche Äquivalente zu den vorliegend beschriebenen speziellen Ausführungsformen zu erkennen oder herauszufinden. Es versteht sich daher, dass die vorstehenden Ausführungsformen lediglich Beispiele darstellen und dass die Erfindung im Rahmen der Ansprüche und ihrer Äquivalente in anderer Weise als in der Beschreibung und in den Ansprüchen angegeben ausgeführt werden kann. Die Erfindung ist auf jedes einzelne Merkmal, System, jeden einzelnen Gegenstand, jedes einzelne Material, Kit und/oder vorliegend beschriebene Verfahren gerichtet. Darüber hinaus sind Kombinationen von zwei oder mehr solchen Merkmalen, Systemen, Gegenständen, Materialien, Kits und/oder Methoden in dem Schutzrahmen der vorliegenden Erfindung enthalten, sofern solche Merkmale, Systeme, Gegenstände, Materialien, Kits und/oder Verfahren nicht uneinheitlich sind.
Sämtliche der vorliegend verwendeten Definitionen haben Vorrang gegenüber Definitionen in Wörterbüchern, Definitionen in Dokumenten, auf die vorliegend verwiesen wurde, und/oder gegenüber den üblichen Bedeutungen der definierten Begriffe.
Der in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen verwendete unbestimmte Artikel ”ein” hat die Bedeutung von ”mindestens ein”, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.
Der in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen verwendete Begriff ”und/oder” bedeutet ”eines oder beide” der solchermaßen verbundenen Elemente, d. h. der Elemente, die in manchen Fällen zusammen und in manchen Fällen getrennt vorgesehen sind. Sofern nicht anders angegeben, können außer den speziell durch den Begriff ”und/oder” definierten Elementen optional weitere Elemente vorhanden sein, und zwar zusammenhängend oder unzusammenhängend mit den ausdrücklich genannten Elementen.
Auf die Gesamtheit von Patenten und Patentanmeldungen sowie Publikationen, die in vorliegender Anmeldung als Referenz genannt sind, wird hiermit verwiesen.

Claims

Gelenkprothese, umfassend: eine erste Oberfläche mit einer Krümmung, die im Wesentlichen an die Kontur einer nativen Gelenkfläche angepasst ist, wobei die erste Oberfläche eine Kobalt-Chrom-Legierung mit einer Oberflächenformation einer durchschnittlichen Größe zwischen 10 und 30 nm umfasst.
Prothese nach Anspruch 1, wobei die erste Oberfläche Formationen aufweist, die im Wesentlichen sphärisch sind und deren Größe etwa 20 nm beträgt.
Prothese nach Anspruch 1, ferner umfassend eine Schicht aus Säugetierzellen auf der ersten Oberfläche.
Prothese nach Anspruch 1, ferner umfassend eine Schicht von humanen Chondrozyten auf der ersten Oberfläche.
Prothese nach Anspruch 1, wobei die Prothese an Knochengewebe eines menschlichen Patienten befestigt ist.
Prothese nach Anspruch 1, wobei humaner Knorpel an der ersten Oberfläche befestigt ist.
Prothese nach Anspruch 6, wobei die Legierung ferner Molybdän umfasst.
Prothese nach Anspruch 1, wobei die Prothese eine Knieprothese ist.
Prothese zur Unterstützung des Wachstums von Säugetierzellen, wobei die Prothese eine Kobalt-Chrom-Legierung mit einer Oberflächenenergie von mehr als 30 mJ/m² aufweist.
Prothese nach Anspruch 9, wobei die humanen Chondrozyten auf der Oberfläche vorgesehen sind.
Prothese nach Anspruch 9, ferner umfassend Molybdän.
Prothese nach Anspruch 9, die einen Bereich aufweist, der im Wesentlichen aus einer Kobalt-Chrom-Legierung besteht.
Prothese nach Anspruch 9, die einen Bereich aufweist, der im Wesentlichen aus einer mit Molybdän dotierten Kobalt-Chrom-Legierung besteht.
Prothese nach Anspruch 9, umfassend eine Schraube für den Einsatz in dem Knochen.
Prothese nach Anspruch 14, umfassend einen ersten Bereich mit einer konturierten Oberfläche aus einer Kobalt-Chrom-Legierung und einen zweiten Bereich, der eine Titanschraube enthält.
Prothese zum Stützen von Säugetierzellen, wobei die Prothese eine konturierte Oberfläche aufweist, die eine Kobalt-Chrom-Legierung mit einem Kontaktwinkel von weniger als etwa 60 Grad umfasst.
Prothese nach Anspruch 16, wobei der Kontaktwinkel weniger als etwa 45 Grad beträgt.
Prothese nach Anspruch 16, wobei der Kontaktwinkel weniger als etwa 20 Grad beträgt.