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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Elektrofusionierung
von Zellen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
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In
den letzten Jahren ist der Fusion von Zellen zur Herstellung heterologer
Hybride immer mehr Bedeutung zugekommen. Die Fusionprodukte finden Anwendung
in der Krebstherapie (Hybride aus dendritischen Zellen und Tumorzellen),
bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern (Hybridomazellen), in
der Reproduktionstechnologie (Hybride aus Eizellen und Spermazellen)
und in vielen anderen Gebieten.
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Für die Erzeugung
von Zellhybriden stehen grundsätzlich
drei Methoden zur Auswahl: Die Fusion der Zellen kann entweder chemisch
(mittels Polyethylenglycol), rezeptorvermittelt oder elektrisch
induziert werden, wobei im Hinblick auf die spätere klinische Anwendung die
Methode der Elektrofusion eindeutig von Vorteil ist.
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Die
Standardmethode der Elektrofusion sieht vor, dass die beiden Fusionpartner
(Zelltyp 1 und Zelltyp 2) gemischt und in eine Fusionskammer gegeben
werden. Eine solche Kammer besteht aus zwei Elektroden, die in einem
definierten Abstand angeordneten sind. In den so entstehenden Zwischenraum
wird die Zellsuspension (Mix aus Zelltyp 1 und Zelltyp 2) gegeben.
Durch Anlegen eines schwachen elektrischen Gleichstrom-Feldes werden
die Zellen in engen Kontakt miteinander gebracht. Bei diesem sogenannten
Alignment werden durch Anlegen des Feldes Dipole innerhalb der Zellen
induziert. Die Zellen wandern dann in den Bereich der höchstens
Feldintensität
und reihen sich dabei in einer sogenannten „Perlenkette" an. Anschließend werden
die Zellen durch einen kurzen Puls fusioniert.
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Wenn
die Aneinanderreihung der beiden Zelltypen in der Perlenkette statistisch
verteilt erfolgen würde,
läge bei
einer 1:1-Mischung der Zelltypen die maximale theoretische Bildung
von heterologen Hybriden bei 50 %. Real wurden bisher nur 10-20
% erreicht, da zum einen nicht alle Zellen fusionieren und zum anderen
homologe Fusionen gegenüber
heterologen bevorzugt werden. Des weiteren ist zu beobachten, dass
schon in der Aufreihung der Zellen keine statistische Verteilung
vorliegt, sondern sich Zellen gleichen Zelltyps (auf Grund ähnlicherer
Zelleigenschaften) anhäufen.
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Dadurch
treten die ungewollten homologen Fusionen gehäuft auf.
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Zur
Lösung
dieses Problemes gab es in den letzten Jahren grundsätzlich nur
drei Ansätze.
Jaroszeski et al. versuchten bei der „mechanisch vereinfachten
Zell-Zell-Fusion" (Biophys. J. 1994,
67: 1574-1581) die beiden Zelltypen in Monoschichten auf einem Filter
anzuordnen und diese beiden Filter dann mechanisch miteinander in
Kontakt zu bringen. Die mit dieser Methode erreichte maximale Fusionseffizienz
lag bei 10 %.
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Die
Arbeiten von Strömberg
et al. (Anal. Chem. 2001, 73: 126-130), die Einzelzellen microfluidisch
anordneten, oder von Bakker Schut et al. (Biophys. J. 1993, 65(2):
568-72), die die beiden Fusionspartner durch eine Avidin-Biotin-Brücke aneinander banden,
um dann die so gekoppelten Zellen in einem umgebauten Durchflusszytometer
zu fusionieren, brachten bessere Ergebnisse bezüglich der Fusionseffizienz,
sind aber nur für
Einzelzellfusionen konzipiert. Für
die Herstellung einer grossen Menge an vitalen Hybriden sind diese
Methoden somit nicht ausgelegt.
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Die
Verfahren nach dem Stand der Technik führen zu niedrigen Fusionsausbeuten
oder sind lediglich geeignet kleine Zellmengen zu fusionieren.
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Es
ist daher die Aufgabe der Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung
zu schaffen, mit denen Zellen, vorzugsweise verschiedenartige Zellen mit
einer höheren
Ausbeute fusioniert werden können.
Es soll auch die Möglichkeit
geschaffen werden, möglichst
viele Zellen in kurzer Zeit zu fusionieren.
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Ausgehend
vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im
kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
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Mit
dem Verfahren und der Vorrichtung können nunmehr Fusionen, vorzugsweise
heterologe Fusionen, mit einer hohen Ausbeute und in kurzer Zeit
durchgeführt
werden.
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Im
Folgenden soll die Erfindung beispielhaft erläutert werden.
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Die
Figuren zeigen den schematischen Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung
sowie Darstellungen von verschiedenen Stadien des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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1:
Eine Fusionskammer.
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2:
Eine Fusionskammer mit Streifen von Haftmitteln.
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3:
Eine Fusionskammer mit Zellen, die auf den Haftmitteln angebracht
sind.
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4:
Eine Fusionskammer in der zwei Zelltypen eingebracht sind.
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5:
Eine Fusionskammer mit zwei Zelltypen, die in einem elektrischen
Feld ausgerichtet sind.
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6a,b,c:
Verschiedene Arten der Haftung von Zellen an einer Oberfläche.
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7a:
Eine Ausführungsform
ohne Haftstreifen.
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7b:
Eine Ausführungsform
mit einem breiten Haftstreifen.
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7c:
Eine Ausführungsform
mit einem breiten Haftstreifen, an dem Zellen der ersten Zellart anhaften.
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7d:
Die Ausführungsform
nach 7b bei der die erste und die zweite Zellart aufgebracht wurde.
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7e:
Die mit den beiden Zellarten beschickte Ausführungsform gemäß 7b bei
der ein elektrisches Feld angelegt ist.
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In 1 ist
eine Elektrofusionskammer 1 mit zwei Elektroden 2 und 3 dargestellt,
die eine Oberfläche 4 der
Elektrofusionskammer 1 begrenzen. Die Elektroden 2,3 sind
parallel zueinander an zwei gegenüberliegenden Seiten der Elektrofusionskammer 1 angebracht.
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In
den folgenden Figuren haben die selben Vorrichtungsmerkmale die
gleichen Bezugszeichen.
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2 zeigt
Haftstreifen 5, die parallel zu den Elektroden 2,3 in
im wesentlichen äquidistanten
Abständen
angeordnet sind.
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3 zeigt
eine Elektrofusionskammer 1 bei der Zellen einer ersten
Zellart 6 auf den Haftstreifen 5 aufgetragen sind.
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4 zeigt
die Elektrofusionskammer 1 in einem Zustand, in dem bereits
eine zweite Zellart 7 eingebracht ist.
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In 5 ist
die Elektrofusionskammer 1 dargestellt, die mit Zellen 6,7 beschickt
ist und bei der ein elektrisches Feld angelegt ist.
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6a zeigt
eine Oberfläche 4 auf
der ein Haftmittel als Haftstreifen 5 angebracht ist, sowie
die Zellen 6,7 und zellspezifische Oberflächenmoleküle 8a, 8b.
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6b zeigt
zusätzlich
zu 6a zellspezifische Antikörper 9, die an die
Zellen gebunden sind und an den Haftstreifen binden.
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6c zeigt
Adaptermoleküle 10,
die an die Zellspezifischen Antikörper 9 angebunden
sind und die an das Haftmittel des Haftstreifens 5 binden.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
und das erfindungsgemäße Verfahren
können
grundsätzlich für die Fusion
aller möglichen
Zellen eingesetzt werden. Es können
gleiche Zelltypen aber auch verschiedene Zelltypen fusioniert werden.
Vorzugsweise werden verschiedene Zelltypen miteinander fusioniert.
Das Fusionieren von verschiedenartigen Zellen birgt nach den Verfahren
nach dem Stand der Technik besondere Probleme, da sich gleichartige
Zellen bei den Elektrofusionsverfahren nach dem Stand der Technik
bevorzugt aneinander lagern. Grundsätzlich können beliebige Zellkombinationen
fusioniert werden. Die Wahl der zu fusionierenden Zellen richtet sich
nach der jeweiligen Problemstellung. So können beispielsweise Krebszellen
mit Immunzellen, z.B. dendritische Zellen, Antikörper produzierende Zellen und
Tumorzellen fusioniert werden. Grundsätzlich ist es auch denkbar
Eizellen mit Samenzellen zu befruchten.
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Erfindungsgemäß sollen
mindestens zwei im wesentlichen parallel zueinander angeordnete
Reihen heterologer Zel len der Zellart 6 und 7 im
Wesentlichen parallel zu den Elektroden 2,3 angeordnet
werden. Dabei werden Haftstreifen 5 parallel zu den Elektroden 2,3 aufgebracht,
die eine Zellart binden können.
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Der
Anbindemechanismus kann, wie in den 6a-c dargestellt,
erfolgen.
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Im
Beispiel gemäß 6a besteht
das Haftmittel 5 aus einem zellspezifischen Antikörper, an den
zellspezifische Oberflächenmoleküle 8a binden, die
selektiv in den zellspezifischen Antikörper passen. Auf diesem Weg
können
die gewünschten
Zellen der ersten Zellart 6 selektiv an die Haftstreifen 5 angebunden
werden.
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In
dem Beispiel nach 6b sind an die Zellen 6,
die an den Haftstreifen angebunden werden sollen, über zellspezifische
Oberflächenmoleküle 8a an
zellspezifische Antikörper 9 gebunden,
welche wiederum selektiv in dem Haftvermittler 5 eingepasst werden,
der in diesem Fall aus einem sekundären Antikörper besteht.
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6c zeigt
einen Mechanismus, bei dem der zellspezifische Antikörper 9,
der an das zellspezifische Oberflächenmolkül 8a der Zelle 6 gebunden ist,
mittels eines Adaptermoleküls 10 in
den Haftstreifen 5 eingreift, der in diesem Fall aus einer
daran anbindenden Verbindung besteht. Als Adaptermolekül 10 /
Haftstreifen 5 – Kombination
kann zum Beispiel Biotin/Streptavidin eingesetzt werden.
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Vorzugsweise
werden die Haftstreifen 5 mit einem chemischen Linker mit
der Oberfläche 4 verbunden.
Dadurch wird der Haftstreifen 5 besser gegen ein Verrutschen
oder Wegspülen
beim Abspülen überschüssiger Zellen
geschützt.
Als Linker können verschiedene
Verbindungen eingesetzt werden. Beispielsweise kann mindestens eine
Komponente aus der Gruppe der Verbindungen Aminosilane, oder Dialdehyde,
wie beispielsweise Glutardialdehyd eingesetzt werden.
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Bei
der Fusion wird entweder eine Elektrofusionskammer 1 ohne
Haftmittel mit einem Haftmittel streifenförmig beschickt (Haftstreifen 5,5a)
oder es wird eine fertige Elektrofusionskammer 1 mit mindestens
einem Haftstreifen 5, oder 5,(5a, wie
weiter unten beschrieben) verwendet. Diese Elektrofusionskammer 1 wird
mit einer Lösung
der ersten Zellart 6 in Kontakt gebracht. Dabei haften
bzw. binden die Zellen 6 an den oder die Haftstreifen 5 an,
und kommen natürlich
auch mit den nicht mit Haftstreifen 5 versehenen Stellen
der Oberfläche 4 oder
gegebenenfalls mit den Haftstreifen 5a (nicht in den Figuren abgebildet)
in Kontakt. Der Haftstreifen 5a ist in diesem Fall so ausgestaltet,
dass er die Zellen der ersten Zellart 6 nicht bindet, sondern
nur die Zellen der zweiten Zellart 7. Sind die Zellen an
die Haftstreifen 5 angebunden, so wird die, die Zellen 6 enthaltene Flüssigkeit
entfernt und die Oberfläche
nochmals abgespült.
Dabei haften die Zellen 6 an dem Haftmittel 5 an,
während
sie von den Zwischenräumen
abgespült
werden.
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Zum
Auftragen der Zellen 6 kann als Flüssigkeit ein Kulturmedium,
Fusionslösung,
Puffer, Salzlösung,
Kohle hydratlösung
verwendet werden, die beispielsweise als isotone oder hypoosmolare
Lösungen
vorliegen können.
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Zum
Abspülen
der überzähligen Zellen 6 kann
beispielsweise ein Kulturmedium, Fusionslösung, Puffer, Salzlösung oder
Kohlehydratlösung verwendet
werden, die beispielsweise als isotone Lösungen vorliegen können. Hier
ist die Verwendung von hypoosmolaren Lösungen bevorzugt.
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In
einem weiteren Schritt wird eine Lösung der zweiten Zellart 7 auf
die Oberfläche 4 der
Elektrofusionskammer 1 aufgebracht. Als Flüssigkeit
zum Auftragen der Zellen kann hier ein Fusionspuffer dienen, wenn
ein Haftstreifen 5a vorhanden ist. Liegt eine Ausführungsform
vor, bei der lediglich Haftstreifen 5 und keine Haftstreifen 5a vorhanden
sind, so ist die Verwendung eines Fusionspuffers für das Aufbringen
der zweiten Zellart 7 notwendig.
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Für die zweite
Zellart 7 ist kein weiterer Haftstreifen 5a zwingend
nötig,
da sich die Zellen 7 zwischen den Haftstreifen 5 anordnen.
Es müssen
keine überschüssigen Zellen 7 abgespült werden,
jedoch ist es zu bevorzugen, dass mit der Lösung, die die Zellen 7 enthält im Wesentlichen
die gleich Anzahl von Zellen eingebracht wird, wie bereits an den
Haftstreifen 5 anhaften.
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Bei
einer alternativen Ausführungsform
kann der Bereich zwischen den Haftstreifen 5 für die erste Zellart 6 auch
mit weiteren Haftstreifen 5a, die in den Figuren nicht
dargestellt sind, für
die zweite Zellart 7 beschichtet sein, an die zweite Zellart 7 anbinden kann.
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Bei
diesen Haftstreifen 5a kann es sich analog wie im Fall
der Haftstreifen 5 für
die erste Zellart 6 um die gleichen Haftverbindungsbestandteile
handeln. Es gelten also die gleichen Grundsätze, wie beim befestigen der
ersten Zellart 6 jedoch dürfen die Haftstreifen 5a keine
Verbindungsmittel sein, an die die Zellen der ersten Zellart 6 anhaften
können.
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Die
Haftstreifen 5, 5a können im wesentlichen die gleiche
Breite annehmen, wie die an ihnen zu befestigenden Zellen 6,7.
Es reicht aber auch noch aus, wenn die Breite der Haftstreifen 5,5a 25% der
Breite der zu befestigenden Zellen beträgt.
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Wenn
die Haftstreifen 5,5a eine Breite besitzen, die
größer ist
als die Zellbreite, beispielsweise die dreifache Zellbreite, so
tritt ein besonderer Effekt auf, der in den 7b-e dargestellt
ist. Die Zellen lagern sich dann nämlich bevorzugt am Rand der
Haftstreifen an. Wird die zweite Zellart 7 aufgetragen,
so ordnen sich diese Zellen sowohl zwischen den Haftstreifen, als
auch in der Mitte der Haftstreifen an, ohne dabei besonders an dem
Haftmittel des Haftstreifens 5 anzuhaften. Es entstehen
wiederum alternierende Reihen von Zellen 6 und 7.
In diesem Fall ist es besonders bevorzugt, wenn die Haftstreifen 5 im wesentlichen
einen Durchmesser haben, der dem 2 bis 5 fachen der Zellart 6 besitzt.
Vorzugsweise entspricht dann der Abstand der Haftstreifen 5 von
Rand zu Rand im wesentlichen der Breite der Zellart 7 oder etwas
mehr. Die Breite der Haftstreifen 5,5a kann in einer
Größenordnung
von 5 bis 100 μm
liegen.
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Die
Abstände
zwischen den Haftstreifen 5 für eine Zellart sind im wesentlichen äquidistant
in einem Abstand angeordnet, der gemessen von der Mitte des Haftstreifens
vorzugsweise zwei Zellbreiten beträgt, wenn der Haftstreifen 5 im
Wesentlichen die Breite der Zelle besitzt oder schmaler ist. Der
Abstand zwischen zwei Streifen die für die gleiche Zellart vorgesehen
sind kann dann zwischen 10 und 200 μm, vorzugsweise zwischen 10 μm und 20 μm liegen.
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Die
Haftstreifen 5,5a können beispielsweise durch Stempeltechnik
oder mikrofluidisch auf die Oberfläche 4 aufgetragen
werden.
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Vorzugsweise
befinden sich 100, bis 500 Haftstreifen 5 für eine Zellart
nebeneinander, es können
aber auch 1 bis 2000 Haftstreifen 5 sein. Beim Vorliegen
zweier verschiedener Haftstreifen 5,5a, verdoppelt
sich vorzugsweise die Anzahl der Haftstreifen, die insgesamt vorliegen.
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Nach
Auftragen der zweiten Zellart 7 kann in der Ausführungsform
mit zwei verschiedenen Haftstreifen 5,5a wiederum überschüssige Zellen
mit einer Flüssigkeit
abgespült
werden. Diese Flüssigkeit kann
beispielsweise mindestens eine Komponente aus der Gruppe der nach
dem Stand der Technik bekannten Lösungen für die Elektrofusion sein.
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Spätestens
mit dem Einbringen der Zellart 7 muß eine für die Elektrofusion geeignete
Flüssigkeit in
das System eingebracht werden. Diese sind aus dem Stand der Technik
bekannt.
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Nachdem
die beiden Zellarten 6 und 7 auf die Oberfläche 4 aufgebracht
wurden, wird zwischen den Elektroden 2,3 eine
Spannung angelegt, die ein Alignment, also eine Ausrichtung der
Zellen 6 und 7 entlang der Feldlinien bewirkt,
wobei die verschiedenen Zellarten 6,7 entlang
der Feldlinien alternieren.
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Das
anzulegende elektrische Feld ist dem Fachmann bekannt und entspricht
grundsätzlich
der Größenordnung,
wie sie aus anderen Elektrofusionsverfahren bekannt ist. Beispielhaft
können
elektrische Felder einer Stärke
von 100 bis 500 Volt/cm angegeben werden.
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Nach
dem Alignment wird ein Fusionspuls appliziert wodurch es zu einer
Verschmelzung der Zellen 6 und 7 kommt.
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Wurden
die Zellen so ausgerichtet, dass die Ketten in Flussrichtung so
nebeneinander liegen, dass sich entlang der elektrischen Feldlinien
ebenfalls Ketten, im Fall der heterologen Fusion alternierender
Zellen, ausbilden, so wird ein elektrischer Fusionspuls erzeugt,
mit dem die Elektrofusion bewirkt wird. Die Stärke des elektrischen Fusionspulses
liegt in der gleichen Größenordnung
wie bei bekannten Elektrofusionsverfahren und beträgt 250 bis
3000 Volt/cm.
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Die
Dauer des Pulses liegt wie bei anderen Elektrofusionsverfahren in
einem Bereich der sich von 1 μs
bis 1000 ms erstreckt.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
kann aus verschiedenen Materialien bestehen. So kann sie beispielsweise
die Materialien Glas, Kunststoff, PP, Polycarbonat, PMMA sowie PET
umfassen. Dies gilt auch für
die Oberfläche 4,
auf welche die Haftmittel 5,5a aufgebracht sind.
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Durch
die Elektrofusion der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zusammengeführten Zellen
wird eine höhere
Raum-Zeit- Ausbeute an heterolog fusionierten Zellen erreicht als
nach dem Stand der Technik. Während
die Elektrofusion nach dem Stand der Technik bei einer theoretischen
Ausbeute von 50 % lediglich eine praktische Ausbeute von 10 bis
20 % erreicht wird, beträgt
die theoretische Ausbeute für
die heterologe Fusion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 100%. Da es zu
keiner Agglomeration von gleichen Zellen kommt, verringert sich
die Zahl der heterolog fusionierenden Zellen nicht, wie bei dem
Verfahren nach dem Stand der Technik. Es kann daher mit einer Ausbeute
von > 50% gerechnet
werden.