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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Elektrofusionieren
von Zellen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
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In
den letzten Jahren ist der Fusion von Zellen zur Herstellung heterologer
Hybride immer mehr Bedeutung zugekommen. Die Fusionprodukte finden Anwendung
in der Krebstherapie (Hybride aus dendritischen Zellen und Tumorzellen),
bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern (Hybridomazellen), in
der Reproduktionstechnologie (Hybride aus Eizellen und Spermazellen)
und in vielen anderen Gebieten.
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Für die Erzeugung
von Zellhybriden stehen grundsätzlich
drei Methoden zur Auswahl: Die Fusion der Zellen kann entweder chemisch
(mittels Polyethylenglycol), rezeptorvermittelt oder elektrisch
induziert werden, wobei im Hinblick auf die spätere klinische Anwendung die
Methode der Elektrofusion eindeutig von Vorteil ist.
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Die
Standardmethode der Elektrofusion sieht vor, dass die beiden Fusionpartner
(Zelltyp 1 und Zelltyp 2) gemischt und in eine Fusionskammer gegeben
werden. Eine solche Kammer besteht aus zwei Elektroden, die in einem
definierten Abstand angeordneten sind. In den so entstehenden Zwischenraum
wird die Zellsuspension (Mix aus Zelltyp 1 und Zelltyp 2) gegeben.
Durch Anlegen eines schwachen elektrischen Gleichstrom-Feldes werden
die Zellen in engen Kontakt miteinander gebracht. Bei diesem sogenannten
Alignment werden durch Anlegen des Feldes Dipole innerhalb der Zellen
induziert. Die Zellen wandern dann in den Bereich der höchstens
Feldintensität
und reihen sich dabei in einer sogenannten „Perlenkette" an. Anschließend werden
die Zellen durch einen kurzen Puls fusioniert.
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Wenn
die Aneinanderreihung der beiden Zelltypen in der Perlenkette statistisch
verteilt erfolgen würde,
läge bei
einer 1:1-Mischung der Zelltypen die maximale theoretische Bildung
von heterologen Hybriden bei 50 %. Real wurden bisher nur 10-20
% erreicht, da zum einen nicht alle Zellen fusionieren und zum anderen
homologe Fusionen gegenüber
heterologen bevorzugt werden. Des weiteren ist zu beobachten, dass
schon in der Aufreihung der Zellen keine statistische Verteilung
vorliegt, sondern sich Zellen gleichen Zelltyps (auf Grund ähnlicherer
Zelleigenschaften) anhäufen.
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Dadurch
treten die ungewollten homologen Fusionen gehäuft auf.
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Zur
Lösung
dieses Problemes gab es in den letzten Jahren grundsätzlich nur
drei Ansätze.
Jaroszeski et al. versuchten bei der „mechanisch vereinfachten
Zell-Zell-Fusion" (Biophys. J. 1994,
67: 1574-1581) die beiden Zelltypen in Monoschichten auf einem Filter
anzuordnen und diese beiden Filter dann mechanisch miteinander in
Kontakt zu bringen. Die mit dieser Methode erreichte maximale Fusionseffizienz
lag bei 10 %.
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Die
Arbeiten von Strömberg
et al. (Anal. Chem. 2001, 73: 126-130), die Einzelzellen microfluidisch
anordneten, oder von Bakker Schut et al. (Biophys. J. 1993, 65(2):
568-72), die die beiden Fusionspartner durch eine Avidin-Biotin-Brücke aneinander banden,
um dann die so gekoppelten Zellen in einem umgebauten Durchflusszytometer
zu fusionieren, brachten bessere Ergebnisse bezüglich der Fusionseffizienz,
sind aber nur für
Einzelzellfusionen konzipiert. Für
die Herrstellung einer grossen Menge an vitalen Hybriden sind diese
Methoden somit nicht ausgelegt.
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Die
Verfahren nach dem Stand der Technik führen zu niedrigen Fusionsausbeuten
oder sind lediglich geeignet kleine Zellmengen zu fusionieren.
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Es
ist daher die Aufgabe der Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung
zu schaffen, mit denen Zellen, vorzugsweise verschiedenartige Zellen, mit
einer höheren
Ausbeute fusioniert werden können.
Es soll auch die Möglichkeit
geschaffen werden, möglichst
viele Zellen in kurzer Zeit zu fusionieren.
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Ausgehend
vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im
kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
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Mit
dem Verfahren und der Vorrichtung können nunmehr Fusionen, vorzugsweise
verschiedener Zelltypen, mit einer hohen Ausbeute und in kurzer Zeit
durchgeführt
werden.
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Im
Folgenden soll die Erfindung beispielhaft erläutert werden.
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Die
Figuren zeigen den schematischen Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung
sowie Darstellungen von verschiedenen Stadien des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Es
zeigt:
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1:
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung
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2:
Die Vorrichtung gemäß 1 mit
einströmenden
Zellen.
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3:
Die Vorrichtung gemäß 1 mit
Zellen bei einem angelegten elektrischen Feld.
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1 zeigt
eine erfindungsgemäße Vorrichtung
mit Vorratsbehältern 1 und 2 für zu fusionierende
Zellen 3 und 4. Die Vorratsbehälter 1 und 2 sind mit
einer Zuleitung an Pumpen 5 und 6 angeschlossen.
Beide Pumpen 5, 6 haben mindestens eine Zuleitung 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 8c, 8d zu
einer Elektrofusionskammer 9, die an zwei gegenüberliegenden Seiten
mit Elektroden 10, 11 ausgestattet ist. Die Zuleitungen 7a,
b, c 8a, b, c, d münden
dabei nebeneinander alternierend in die Elekrofusionskammer 9. Auf
der, der Seite mit der Zuleitung gegenüberliegenden Seite, befindet
sich mindestens eine Ableitung 12 für die fusionierten Zellen sowie
ein Auffangbehälter 13 für die fusionierten
Zellen. Die Elektrofusionskammer 9 ist durch eine Bodenplatte
und eine Deckplatte abgeschlossen, welche in der Figur nicht abge bildet
sind. Die Elektrofusionskammer 9 bildet daher bis auf die
Zu- und Ableitung einen geschlossenen Raum.
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In
den 2 und 3 besitzen die selben Vorrichtungsmerkmale
die gleichen Bezugszeichen.
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Bei
Betrieb werden in die Vorratsbehälter 1, 2 zu
Fusionierende Zellen 3, 4 gegeben, die mit den Pumpen 5, 6 über die
Zuleitungen 7a, b, c und 8a, b, c, d in die Elektrofusionskammer 9 gefördert werden. Die
zu fusionierenden Zellen bilden in der Elektrofusionskammer 9 Reihen
von zu fusionierenden Zellen, die beispielhaft in 2 dargestellt
sind. In der Elektrofusionskammer 9 wird über die
Elektroden 10, 11 eine Spannung angelegt, welche
bewirkt, dass sich die Zellen 3, 4 idealerweise
gemäß 3 in
einer Linie anordnen (Alignment), so dass die verschiedenen Zelltypen
im Fall der heterologen Fusion entlang der Richtung der Feldlinien
alternieren. Haben die Zellen 3, 4 diese Anordnung
erreicht, so wird ein Strompuls appliziert, bei dem die Elektrofusion
stattfindet.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
und das erfindungsgemäße Verfahren
kann grundsätzlich
für die
Fusion aller möglichen
Zellen eingesetzt werden. Es können
gleiche Zelltypen aber auch verschiedene Zelltypen fusioniert werden.
Vorzugsweise werden verschiedene Zelltypen miteinander fusioniert,
die sich in den verschiedenen Vorratsbehältern 1 und 2 befinden.
Das Fusionieren von verschiedenartigen Zellen birgt nach den Verfahren
nach dem Stand der Technik besondere Probleme, da sich gleichartige Zellen
bei den Elektrofusionsverfahren nach dem Stand der Technik beim
Anlegen einer Spannung bevorzugt aneinander lagern. Grundsätzlich können beliebige
Zellkombinationen fusioniert werden. Die Wahl der zu fusionierenden
Zellen richtet sich nach der jeweiligen Problemstellung. So können beispielsweise
Krebszellen mit Immunzellen, z.B. dendritische Zellen, Antikörper produzierende
Zellen mit Tumorzellen fusioniert werden. Grundsätzlich ist es auch denkbar
Eizellen mit Samenzellen zu befruchten.
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Die
zu fusionierenden Zellen 3 und 4 liegen in den
Vorratsbehältern 1, 2 in
einer Flüssigkeit,
Fusionspuffer oder isotonische Kohlenhydratlösung oder allgemeiner isotonischer
Lösung
vor mit der sie in die Elektrofusionskammer 1 eingebracht
werden. Es können
die für
die Elektrofusion von Zellen bekannten Flüssigkeiten eingesetzt werden.
Vorzugsweise können
hypoosmolare Lösungen
verwendet werden, da die Zellen bei deren Verwendung aufquellen
und so noch besser fusionieren.
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Die
zu fusionierenden Zellen aus den Vorratsbehältern 1 und 2 werden über Pumpen 5 und 6 in
die Zuleitungen 7a, b, c, und 8a, b, c, d gefördert. Die
Pumpen 5, 6 sowie die Zuleitungen 7 und 8 dienen
als Mittel zum Zuführen
von im wesentlichen parallel in der Elektrofusionskammer 9 vorliegenden Ketten
bzw. Reihen von Zellen, die im Folgenden als Einzelzell-Ströme bezeichnet
werden.
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Die
Anzahl der Zuleitungen 7a, b, c und 8a, b, c,
d ist variabel und kann beispielsweise bei 8 Zuleitungen
für jede
Zellsorte liegen. Eine Begrenzung wird lediglich durch physikalische
Parameter gegeben. Pro Vorratsbe hälter 1 und 2 können bis
zu 100 Zuleitungen 7, 8, vorzugsweise 1-20 besonders
bevorzugt 5-10 Zuleitungen in die Elektrofusionskammer 9 führen. Die
Zuleitungen 7a, b, c und 8a, b, c, d können sich
in der Elektrofusionskammer 9 ein Stück fortsetzen.
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Für eine besonders
effektive Elektrofusion münden
die Zuleitungen 7, 8 mit den verschiedenen Zelltypen
alternierend in einer Ebene in die Elektrofusionskammer 9.
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Die
Zuleitungen 7, 8 sind Vorzugsweise so ausgebildet,
dass ihr Durchmesser den Durchtritt vom im wesentlichen einer Zelle
ermöglicht,
so dass pro Zuleitung eine Kette von einzelnen Zellen gefördert wird,
die dann in die Elektrofusionskammer 9 eintritt. Der Durchmesser
der Zuleitungen 7, 8 kann bei variierenden Zellen
durchaus verschieden sein. Er kann in einem Bereich von beispielsweise
5-200 μm,
vorzugsweise 10-100 μm,
besonders bevorzugt 40-60 μm
liegen.
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Die
Zuleitungen 7, 8 können den gleichen oder einen
unterschiedlichen Durchmesser besitzen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Zuleitungen 7 und 8 so angeordnet, dass
sie in einer Ebene in die Elektrofusionskammer 9 einmünden, jedoch
aus verschiedenen Richtungen zugeführt werden. So können die
Zuleitungen 7 beispielsweise von oben und die Zuleitungen 8 von
unten zugeführt
werden. Es sind aber auch Zuführrichtungen von
oben oder unten in einer Kombination mit einer Zufuhrrichtung denkbar,
die mit der Strömungsrichtung
in der Elektrofusionskammer 9 eine im Wesentlichen gerade
Linie bildet. Der Vorteil eine Zuführung der verschiedenen Zellen
aus verschiedenen Richtungen besteht darin, dass die Herstellung
einer derart ausgestalteten Vorrichtung einfach zu realisieren ist.
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Durch
die Pumpen 5, 6 und die Zuleitungen 7, 8 werden
die Zellen in die Elektrofusionskammer 9 eingebracht.
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Die
Elektrofusionskammer 9 kann verschiedene Abmessungen haben.
Als Tiefe wird die Länge in
Fließrichtung
verstanden. Die Breite ist die Länge, auf
der die Einzelzellströme
nebeneinander angeordnet sind und die Höhe ist die Abmessung, die senkrecht
zu der Fließrichtung
und der Breite angeordnet ist. Die Abmessungen liegen bei einer
Höhe von
mindestens 10 μm
bis 250 μm
und bevorzugt 15 bis 150 μm.
Die Breite kann beispielsweise bei 1 cm liegen, ist jedoch in sehr
weiten Bereichen variabel und hängt
im wesentlichen von der Anzahl der Einzelzellströme ab. Die Tiefe kann beispielsweise
1 bis 10 cm bevorzugt 2 bis 6 cm betragen. Länge und Breite bestimmen die
Anzahl der zu einem Zeitpunkt zu elektrofusionierenden Zellen. Die
Höhe soll
so ausgelegt sind, dass die Zellen ungestört fließen können, das heisst, die Höhe soll
die Zelldicke nicht unterschreiten.
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Dabei
werden vorzugsweise Parameter gewählt, die dazu führen dass
die Zellen in der Elektrofusionskammer 9 in einer laminaren
Strömung
geführt
werden. Wie in 2 dargestellt, bilden sich bei dieser
Prozessführung
Ein zelzell-Ströme
von gleichartigen Zellen aus, die parallel zueinander alternierend
vorliegen.
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Wie 2 zu
entnehmen ist, ordnen sich die Ketten aus den Zellen nach dem Zufallsprinzip
an, wobei die zu fusionierenden Zellen zumindest teilweise nicht
so zueinander vorliegen, dass eine Elektrofusion möglich ist.
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Im
nächsten
Schritt wird ein elektrisches Feld angelegt. Hierdurch werden die
Zellen in eine Position gebracht, bei der die Zellen der Einzelzell-Ströme entlang
des elektrischen Feldes wiederum Ketten bilden die sich aus alternierenden
Zelltypen zusammensetzen, wie es in 3 dargestellt
ist. Dieser Vorgang wird als Alignment bezeichnet.
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Das
anzulegende elektrische Feld ist dem Fachmann bekannt und entspricht
grundsätzlich
der Größenordnung,
wie sie aus anderen Elektrofusionsverfahren bekannt ist. Beispielhaft
können
elektrische Felder einer Stärke
von 100 bis 500 Volt/cm angegeben werden.
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Beim
Anlegen des elektrischen Feldes kann der Förderstrom verringert oder ganz
abgestellt werden, so dass sich die Zellketten, die aus den Zuleitungen 7, 8 zugeführt werden
in ihrer Geschwindigkeit verlangsamen oder dass sie zum Stillstand
kommen. Dies hat den Vorteil, dass eine besonders gute Anordnung
der zu fusionierenden Zellen hergestellt wird. Das elektrische Feld
kann allerdings auch angelegt werden, wenn der Förderstrom nicht verringert wird.
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Wurden
die Zellen so ausgerichtet, dass die Ketten in Flussrichtung so
nebeneinander liegen, dass sich entlang der elektrischen Feldlinien
ebenfalls Ketten, im Fall der heterologen Fusion alternierender
Zellen, ausbilden, so wird ein elektrischer Fusionspuls erzeugt,
mit dem die Elektrofusion bewirkt wird. Die Stärke des elektrischen Fusionspulses
liegt in der gleichen Größenordnung
wie bei bekannten Elektrofusionsverfahren und beträgt 250 bis
3000 Volt/cm.
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Die
Dauer des Pulses liegt wie bei anderen Elektrofusionsverfahren in
einem Bereich der sich von 1 μs
bis 1000 ms erstreckt.
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Die
Ableitung 12 kann verschiedenartig ausgestaltet sein. Vorzugsweise
werden die Einzelzellströme
in einer Ableitung 12 abgeführt, deren Breite zwischen
der Breite der durch die Elektroden 10, 11 begrenzten
Innenraum der Vorrichtung vorgegeben ist oder bei 25% der Breite
dieses Innenraums liegt. Es sind auch noch Breiten von 5% der Breite
dieses Innenraums möglich.
Alternativ, aber weniger bevorzugt, ist eine Ableitung 12,
bei der mindestens zwei unabhängige
Ströme
an fusionierten Zellen abgeführt
werden.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
kann aus verschiedenen Materialien bestehen. So kann sie beispielsweise
die Materialien Glas, Kunststoff, PP, Polycarbonat, PMMA sowie PET
umfassen.
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Durch
die Elektrofusion der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zusammengeführten Zellen
wird eine höhere Raum-Zeit-
Ausbeute an heterolog fusionierten Zellen erreicht als nach dem
Stand der Technik. Während
die Elektrofusion nach dem Stand der Technik bei einer theoretischen
Ausbeute von 50 % lediglich eine praktische Ausbeute von 10 bis
20 % erreicht wird, beträgt
die theoretische Ausbeute für
die heterologe Fusion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 100%. Da es zu
keiner Agglomeration von gleichen Zellen kommt, verringert sich
die Zahl der heterolog fusionierenden Zellen nicht, wie bei dem
Verfahren nach dem Stand der Technik. Es kann daher mit einer Ausbeute
von > 50% gerechnet
werden.