DE10351627A1

DE10351627A1 - Modulation der Angiogenese durch Bartonella henselae

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Publication number: DE10351627A1
Application number: DE10351627A
Authority: DE
Inventors: Volkhard Dr. Kempf; Tanja Dipl.-Biol. Riess; Ingo Prof. Dr. Autenrieth; Kari Prof. Dr. Alitalo
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2003-11-05
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2023-11-06
Also published as: ATE537248T1; US20060286122A1; WO2005049786A3; WO2005049786A2; EP1680499B1; EP1680499A2; DE10351627B4; EP1680499B8; US7638489B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Bartonella henselae zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Angiogenese; ein Nukleinsäuremolekül, das sich von dem Gen kodierend für das Bartonella-henselae-Adhesin-A-Protein (BadA) ableitet; ein dieses Nukleinsäuremolekül umfassender Vektor; ein Wirt, der dieses Nukleinsäuremolekül bzw. diesen Vektor enthält; ein (Poly)peptid kodiert von diesem Nukleinsäuremolekül; eine Zusammensetzung, die Barnonella-henselae-Bakterien aufweist; eine Zusammensetzung, die das vorstehende (Poly)peptid aufweist; sowie ein Verfahren zum Nachweisen einer Bartonella-Infektion bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Bartonella henselae zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Angiogenese; ein Nukleinsäuremolekül, das sich von dem Gen kodierend für das Bartonella-henselae-Adhesin-A-Protein (BadA) ableitet; ein dieses Nukleinsäuremolekül umfassender Vektor; ein Wirt, der dieses Nukleinsäuremolekül bzw. diesen Vektor enthält; ein (Poly)peptid kodiert von diesem Nukleinsäuremolekül; eine Zusammensetzung, die Bartonella-henselae-Bakterien aufweist; eine Zusammensetzung, die das vorstehende (Poly)peptid aufweist; sowie ein Verfahren zum Nachweisen einer Barto nella-Infektion bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen.
Die Angiogenese oder auch Neovaskularisierung bezeichnet einen Vorgang, bei dem unter physiologischen Bedingungen neue Blutgefäße aus dem bestehenden Gefäßsystem aussprossen. Die Angiogenese ist bspw. während der Embryonalentwicklung, im Corpus luteum (Menstruation) zu beobachten. Ferner kommt der Angiogenese eine pathophysiologische Bedeutung zu; sie ist bei der Wundheilung, bei diabetischen Retinopathien, bei Hämangiomen, Arthritis und Psoriasis sowie bei bösartigen Tumoren zu beobachten. Besonders bedeutsam sind in diesem Zusammenhang ischämische Krankheiten, bei denen häufig eine Störung der Angiogenese auf tritt.
Vor diesem Hintergrund besteht in der Medizin und Pharmakologie großer Bedarf an der Bereitstellung von pharmakologisch wirksamen Substanzen, mit denen die Angiogenese moduliert werden kann. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Substanz bereitzustellen, mittels der die Angiogenese moduliert werden kann. Ferner soll eine solche Substanz bereitgestellt werden, die einfach und kostengünstig erhältlich bzw. herstellbar ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von Bartonella henselae zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Angiogenese gelöst.

Die Erfinder konnten überraschenderweise zeigen, dass es durch die Inkubation von biologischem replizierendem Material, wie bspw. HeLa-Zellen, mit Bartonella henselae zu einer Beeinflus sung des genetischen Programmes des biologischen Materials kommt, das die Angiogenese reguliert. Mit anderen Worten gelang den Erfindern der Nachweis, dass es sich bei Bartonella henselae um eine Substanz handelt, die für die gezielte Modulation der Angiogenese geeignet ist.

Dabei war die Erkenntnis, dass ein gramnegatives Bakterium der Gattung Bartonella, nämlich Bartonella henselae, eine Modulation der Angiogenese ermöglicht und deshalb therapeutisches Potenzial aufweist, besonders überraschend, da dieses Bakterium im Stand der Technik bislang im Wesentlichen als ein Auslöser für eine Vielzahl von verschiedenen Erkrankungen beschrieben wird: Bartonella henselae konnte bei immunsupprimierten Patienten, bspw. HIV-Patienten, im Blut nachgewiesen werden. Bei diesen Patienten kann sich dabei eine solche Infektion mit Bartonella henselae über eine bazilläre Angiomatose, bazilläre Peliose (Befall innerer Organe), Fieber, Bakteriämie und Endokarditis äußern. Beim immunkompetenten Wirt gilt Bartonella henselae als der Haupterreger der Katzenkratzkrankheit (cat scratch disease, CSD).

Weiterhin ist bekannt, dass Bartonella henselae die Produktion von Wachstumsfaktoren bzw. Cytokinen anregt, bspw. von Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF; vgl. hierzu Kempf et al. (2001), „Evidence of a leading role for VEGF in Bartonella henselae-induced endothelial cell proliferations", Cell. Microbiol. 3(9), 623–632; Resto-Ruiz et al. (2002), „Induction of a potential paracrine angiogenetic loop between human THP-1 macrophages and human microvascular endothelial cells during Bartonella henselae infection", Infection and Immunity 70(8), 4564–4570.

Im Stand der Technik werden jedoch keinerlei Hinweise gegeben, die einen Zusammenhang zwischen Bartonella henselae und der Modulation der Angiogenese zeigen oder nahelegen.

Im Rahmen der Erfindung wird dabei unter Modulation der Angiogenese jegliche im Wesentlichen gezielte Beeinflussung der Angiogenese bei einem menschlichen oder tierischen Organismus oder Teilen bzw. Organen hiervon durch Bartonella henselae oder Teilen dieses Bakteriums verstanden, sei es die Stimulation bzw. Induktion oder Inhibition der Angiogenese.

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn zur Modulation der Angiogenese das gesamte Bakterium verwendet wird.

Dies bedeutet, dass gemäß dieser Ausführungsform die Angiogenese modulierende Aktivität von dem gesamten Bakterium ausgeht, dieses deshalb ohne weitere Arbeitsschritte als solches als wirksames Agens, bspw, gemäß einer gezielten Infektion, verwendet werden kann. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das gesamte Bakterium in großen Mengen zur Verfügung steht, und sich mit allgemein bekannten mikrobiologischen Methoden kultivieren und vermehren lässt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zur Modulation der Angiogenese ein genetisch verändertes Bakterium verwendet.

Dabei wird unter einem genetisch veränderten Bakterium ein solches Bartonella-henselae-Bakterium verstanden, das sich in seinem Phäno- oder Genotyp in irgendeiner Art und Weise gegenüber dem des Wildtyps unterscheidet. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass hiermit einerseits die Angiogenese modulierende Aktivität des Bakteriums mittels molekularbiologischer Methoden gezielt verändert werden kann, wobei gleichzeitig mögliche pathogene Faktoren gezielt ausgeschaltet werden können. Verfahren zur genetischen Veränderung des Bakteriums sind im Stand der Technik hinreichend bekannt; vgl. hierzu bspw. Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001), „Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 3rd Edition.

Ferner ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn zur Modulation der Angiogenese ein abgetötetes Bakterium verwendet wird.

Unter einem abgetöteten Bakterium wird erfindungsgemäß ein solches verstanden, das seine Teilungsfähigkeit und/oder Stoffwechselaktivität verloren hat, jedoch noch in der Lage ist, die Angiogenese zu modulieren. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solches Bartonella-henselae-Bakterium zwar noch in der Lage ist, in biologischem Material diese erfindungsgemäß erkannte Aktivität zu zeigen, jedoch ohne ein pathogene Aktivität aufzuweisen.

Gemäß einer erfindungsgemäßen Variante wird zur Modulation der Angiogenese ein Peptid verwendet, das ein Fragment des Bartonella-henselae-Adhäsin-A-Proteins (BadA) aufweist.

Die Erfinder konnten ein neues mit Bartonella-henselae-Adhesin-A (BadA) bezeichnetes Protein identifizieren, bei dem es sich um einen der entscheidenden bakteriellen Faktoren von Bartonella henselae handelt, die in die Modulation der Angiogenese involviert sind. BadA ist ein 340 kD großes bakterielles Protein, das von einem ca. 9,3 kB großen Gen kodiert wird. Die DNA-Gensequenz von BadA ist in 7 und im beiliegenden Sequenzprotokoll als SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Dieses Protein wird an der bakteriellen Oberfläche von Bartonella henselae exprimiert und ist auf Grund seiner enormen Größe im Elektronenmikroskop sichtbar.

Wie die Erfinder erkannt haben, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung und gemäß dieses bevorzugten Ausführungsbeispiels zur Modulation der Angiogenese ein für BadA charakteristisches Peptidfragment verwendet werden, d.h. ein solches, das die für die Modulation der Angiogenese verantwortliche biologische Aktivität von BadA aufweist, wie bspw, der Abschnitt des Gesamtproteins, der für die Adhäsion des Bakteriums an Zellen bzw. Endothelzellen verantwortlich ist. Abschnitte des BadA-Proteins, die in keinem Zusammenhang mit der Antiogenese modulierenden Aktivität stehen, wie möglicherweise Proteindomänen, die lediglich zur Verankerung des Proteins in der Membran dienen, können hierbei vernachlässigt werden. Selbstverständlich kann im Rahmen der Erfindung zur Modulation der Angiogenese auch gesamtes BadA-Protein verwendet werden sowie Fusionsproteine, die ein entsprechend vorstehend bezeichnetes Fragment von BadA aufweisen. Auch ist von der vorliegenden Erfindung die Verwendung solcher Peptide umfasst, die ein gegenüber dem Wildtyp modifiziertes Fragment von BadA aufweisen, bspw. modifizierte oder substituierte Aminosäuren aufweisen, sofern dadurch die Angiogenese modulierende Aktivität von BadA nicht verloren geht.

Auf Grund der therapeutischen Bedeutung der Erkenntnisse der Erfinder ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn bei den vorste hend erläuterten Verwendungen die Modulation der Angiogenese im Rahmen der Behandlung einer ischämischen Krankheit erfolgt.

Gerade bei ischämischen Krankheiten, also solchen, bei denen es zu einer Verminderung oder Unterbrechung der Durchblutung eines Organs, Organteils oder Gewebes in Folge mangelnder arterieller Blutzufuhr kommt, soll häufig eine gezielte Modulation der Angiogenese erfolgen, um die Durchblutung zu normalisieren, was im Stand der Technik bislang nicht oder nur auf sehr unbefriedigende Art und Weise möglich ist. Hier schafft die vorliegende Erfindung wirksam Abhilfe, indem bspw. zielgerichtet genetische Faktoren wie Wachstumsfaktoren oder Cytokine aktiviert bzw. hochreguliert werden und dadurch bei einem betroffenen Patienten die Angiogenese induziert wird.

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn bei den vorstehend erläuterten Verwendungen die Modulation der Angiogenese einer Stimulation entspricht.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass hiermit gerade ischämische Zustände behoben bzw. reduziert werden können und dadurch betroffenen Patienten gezielt geholfen werden kann. Die Erfinder konnten nämlich zeigen, dass Bartonella henselae bzw. BadA ein besonderes Angiogenese stimulierendes Potenzial aufweist, das über die Hochregulierung von einer Vielzahl von Angiogenese induzierenden Genen in biologischem Material erfolgt, wenn dieses für eine bestimmte Zeit zusammen mit Bartonella henselae oder BadA inkubiert wird, bzw. wenn Zellen mit Bartonella henselae infiziert werden.

Die Angiogenese soll häufig gerade bei Tumorerkrankungen gezielt beeinflusst werden, um bspw. zielgerichtet die Durchblutung von Tumoren zu modulieren bzw. zu hemmen. Dementsprechend ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn bei den vorstehend erläuterten Verwendungen die Modulation der Angiogenese im Rahmen der Behandlung einer Tumorerkrankung erfolgt. Dabei können selbstverständlich zusätzlich weitere antikanzerogene Maßnahmen, wie bspw. die einer Chemotherapie o.ä., durchgeführt werden.

In diesem Zusammenhang können auf Grund der Erfindung nunmehr auch bisher nicht bekannte Substanzen auf ihre Fähigkeit hin, die Angiogenese zu modulieren, untersucht werden, indem diese in einem in vitro-Testsystem darauf hin gescreent werden, ob sie sich zu Bartonella henselae bzw. BadA kompetitiv verhalten, d.h. eine entsprechend gleichgerichtete bspw. Angiogenese stimulierende Aktivität aufweisen, oder ob sie sich in ihrer Aktivität entgegengesetzt zu Bartonella henselae bzw. BadA verhalten, d.h. bspw. eine Angiogenese hemmende Aktivität aufweisen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Nukleinsäuremolekül kodierend ein (Poly)peptid, das mit der Modulation der Angiogenese assoziiert ist, wobei das Nukleinsäuremolekül einen Abschnitt der Sequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.

Bei der Sequenz SEQ ID Nr. 1, die in 7 dargestellt ist, handelt es sich um die Sequenz des 9,3 kB großen Gens für das bakterielle Bartonella-henselae-Adhäsin-A-Protein (BadA). Erfindungsgemäß ist mit dem vorstehend bezeichneten Nukleinsäuremolekül ein solches umfasst, das für das gesamte BadA kodiert aber auch ein solches, das für Proteinabschnitte kodiert, die BadA-Aktivität, d.h. Angiogenese modulierende Aktivität aufweisen. Darüber hinaus sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung solche Nukleinsäuremoleküle, die von BadA abgeleitete (Poly)peptide kodieren, bei denen bspw. verschiedene Aminosäuren ausgetauscht bzw. chemisch modifiziert wurden, sofern dieses (Poly)peptid BadA-Aktivität, d.h. Angiogenese modulierende Aktivität, aufweist. Ferner ist mit diesem Gegenstand erfindungsgemäß ein solches Nukleinsäuremolekül umfasst, das 5'- und/oder 3'-wärts weitere von SEQ ID Nr. 1 unabhängige Sequenzen aufweist, die bspw. der Expression, Replikation, Reinigung etc. der genetischen Information bzw. des (Poly)peptids dienen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus ein Vektor, der das vorstehend beschriebene Nukleinsäuremolekül umfasst, d.h. ein entsprechend genetisch verändertes Element, wie ein Plasmid, Virus, Bakteriophage oder Cosmid, das zur Übertragung und/oder zum Einbau des Nukleinsäuremoleküls in eine Wirtszelle verwendet werden kann. Weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Wirt wie ein Bakterium, eine Zelle oder ein sonstiger Organismus, in den das vorstehend beschriebene Nukleinsäuremolekül bzw. der dieses Nukleinsäuremolekül umfassende Vektor eingebracht wurde. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein (Poly)peptid, das von dem vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremolekül kodiert wird.

Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Zusammensetzung, die Bartonella-henselae-Bakterien bzw. das vorstehend bezeichnete (Poly)peptid aufweist, das sich von dem Bartonella-henselae-Adhäsin-A-Protein (BadA) ableitet bzw. BadA entspricht. Das Bakterium kann in dieser Zusammensetzung sowohl in lebendem als auch abgetötetem Zustand vorliegen.

Ferner können auch hier genetisch veränderte Bakterien verwendet werden. Mittels beider Maßnahmen können Pathogenitätsfaktoren ausgeschaltet werden, wobei die Angiogenese modulierende Aktivität erhalten bleibt, ggf. sogar verstärkt wird. Diese Zusammensetzungen sind vorzugsweise pharmazeutische Zusammensetzungen zur Modulation der Angiogenese und weisen einen pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie ggf. weitere pharmazeutische Hilfsstoffe auf. Solche pharmazeutischen Hilfsstoffe sind im Stand der Technik allgemein bekannt; vgl. hierzu bspw. A. Kibbe, „Handbook of Pharmaceutical Excipients", American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, 3. Auflage (2000).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Nachweisen einer Bartonella-Infektion bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellen einer biologischen Probe des Lebewesens; (b) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen das Bartonella-henselae-Adhesin-A-Protein (BadA), und (c) Korrelation eines positiven Befundes in Schritt (b) mit dem Vorliegen einer Bartonella-Infektion.

Im Stand der Technik werden Bartonella-Infektionen bislang serologisch durch den Einsatz eines Immunfluoreszenztestes nachgewiesen. Dazu werden z.B. Affennierenepithelzellen mit Bartonellen kokultiviert. Mit dem Zelllysat, das ganze Bakterien und Zelltrümmer enthält, werden nachfolgend Objektträger beschichtet. Diese Objektträger werden mit Patientenseren inkubiert. Enthält ein derartiges Serum Antikörper gegen Bartonellen, werden diese an die intakten Bakterien binden und können mit einem Sekundärantikörper (z.B. anti-human IgG) unter Fluo reszenzlicht sichtbar gemacht werden. Die Herstellung derartiger Antigenpräparationen und die Durchführung der immunfluoreszenztechnischen Untersuchung ist sehr aufwendig, kostenintensiv, erfordert besonders geschultes Personal und birgt eine Vielzahl von potenziellen Fehlerquellen. Dazu im Gegensatz ist das vorstehend dargestellte Verfahren einfach und kostengünstig durchführbar und liefert mit hoher Zuverlässigkeit fehlerfreie Ergebnisse.

Dabei kann im Rahmen dieses Verfahrens in der biologischen Probe, bspw. im Blutserum, das Vorliegen von Antikörpern gegen das BadA-Protein oder von Fragmenten dieses Proteins nachgewiesen werden, d.h. unter Verwendung von Patientenserum lässt sich bspw. im Rahmen eines Immunblots über die Detektion von spezifischen Antikörpern im Serum auf indirektem Wege nachweisen, dass bei diesem Patienten in der Vergangenheit eine Infektion mit Bartonella-Bakterien stattgefunden hat

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird nun nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert, aus denen sich weitere Vorteile ergeben. Dabei zeigt:

1 den Verlauf einer Bartonella-henselae-Infektion von HeLa-Zellen, analysiert mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie;

2 die Induktion von proangiogenetischen wirtszelltranskripten und -proteinen in HeLa-Zellen nach einer Bartonella-henselae-Infektion;

3 die Aktivierung von HIF-1α in HeLa-Zellen nach einer Bartonella-henselae-Infektion;

4 die Aktivierung von HIF-1α in BA-Patientenproben;

5 die Erhaltung der Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen nach einer Bartonella-henselae-Infektion;

6 die Induktion von proangiogenetischen Faktoren in HeLa-Zellen nach einer Bartonella-henselae-Infektion in Abhängigkeit von BadA;

7 die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, die sich von BadA ableitet;

8 die Adhäsion von Bartonella henselae in Abhängigkeit von BadA, und

9 die Immunreaktivität von CSD-Patientenseren für BadA.

Beispiel 1 Induktion eines Angiogenese modifizierenden genetischen Programms durch Bartonella henselae

HeLa-Zellen wurden von den Erfindern mit Bartonella henselae infiziert und 6 h nach der Infektion mit nicht infizierten HeLa-Zellen in einer Standard-RNA-Microarray-Analyse (Affy metrix^® Microarray Suite 5.0; Affymetrix Data Mining Tool 3.0) verglichen, um festzustellen, ob die Infektion zu einer Veränderung des genetischen Programms der Zellen führt. Die Infektion selbst wurde mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie überprüft. Das Ergebnis einer solchen mikroskopischen Untersuchung ist in 1 dargestellt.

Die linke Aufnahme der infizierten HeLa-Zellen in 1 spiegelt die Situation 1 h, die mittlere 3 h und die rechte 6 h nach der Infektion wider. Der dargestellte Balken entspricht 20 μm. Die hellen, im Cytoplasma lokalisierten Strukturen, die deutlich in der mittleren und rechten Aufnahme zu sehen sind, entsprechen Bakterien, die mittels FITC-konjugierten Antikörpern, die gegen das Bakterium gerichtet waren, nachgewiesen wurden. Die Auswertung dieser Aufnahmen ergab, dass 6 h nach der Infektion > 99% der HeLa-Zellen infiziert waren.

Die RNA-Microarray-Analyse ergab, dass in den HeLa-Zellen zumindest 7 Gene nach der Infektion mehr als zweifach hochreguliert wurden, die bekanntermaßen eine Rolle in der Regulation der Angiogenese und Gefäßreifung spielen: Interleukin-8 (IL-8, 6,41fache Induktion), Stanniocalcin-2 (STC2, 5,16fache Induktion), Adrenomedullin (ADN, 3,88fache Induktion), Ephrin Al (EFNA1, 3,74fache Induktion), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF, 3,54fache Induktion), Insulin-like Growth Factor-Binding Protein-3 (IGFBP-3, 2,67fache Induktion) und Endothelin 2 (ET-2, 2,13fache Induktion). Bis auf IL-8 werden sämtliche der aufgefundenen induzierten Gene direkt oder indirekt über den Hypoxia-Inducible-Factor-1 (HIF-1), dem Schlüsseltranskriptionsfaktor der Angiogenese, reguliert, was dafür spricht, dass es sich bei dem Haupttrigger Haupttrigger für die Induktion des Angiogenese modifizierenden genetischen Programms durch Bartonella henselae um HIF-1 handelt.

Die aus der RNA-Microarray-Analyse erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer quantitativen Echtzeit-PCR bzw. semiquantitativer RT-PCR und auf Proteinebene mittels Westernblot verifiziert. Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in 2 dargestellt.

Dabei wurden HeLa-Zellen mit Bartonella henselae (B.h.) infiziert, die Gesamt-RNA wurde 6 h nach der Infektion extrahiert und in cDNA transkribiert. Die Geninduktion wurde mittels Echtzeit-PCR (VEGF, IL-8) oder RT-PCR (ADM, IGFBP-3, HK2) ausgewertet. Zur Bestimmung des Levels an sekretiertem Protein wurden die Zellen infiziert und die Zellkulturüberstände wurden 48 h nach der Infektion über ELISA [VEGF (VEGF₁₆₅-ELISA-Kit, Quantikine, R & D Systems, Wiesbaden); IL-8 (Schulte et al. (2000), „Yersinia enterocolitica invasin protein triggers IL-8 production in epithelial cells via activation of Rel p65-p65 homodimers", FASEB J 14, 1471–1484)] oder RIA [ADM (RKD10-10, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Deutschland); IGFBP-3 (Blum et al. (1990), „A specific radioimmunoassay for the growth hormone (GH)-dependent somatomedin-binding protein: its use for diagnosis of GH deficiency", J C1in. Endocrinol. Metab 70, 1292–1298)] analysiert. Für Westernblots [HK2 (Antikörper SC6521, Santa Cruz)] wurden 8 h nach der Infektion Zellextrakte präpariert. C: Kontrolle, nicht infizierte Zellen.

Auch diese Ergebnisse bestätigen die Erkenntnisse der Erfinder, dass es durch die Inkubation von biologischem Material bzw. die Infektion von HeLa-Zellen mit Bartonella henselae zur Induktion eines Angiogenese modifizierenden genetischen Programms kommt. Der mRNA- und Proteinlevel sämtlicher untersuchter Angiogenese modulierender Faktoren stieg nach der Infektion deutlich an.

Beispiel 2 Aktivierung von HIF-1 durch Bartonella henselae

Die Erfinder haben im Nachfolgenden untersucht, ob der Transkriptionsfaktor HIF-1 nach Bartonella-henselae-Infektion in der Wirtszelle ebenfalls induziert wird. Das Ergebnis entsprechender Experimente ist in 3 dargestellt.

Teilabbildung (a) zeigt die Detektion von HIF-1-Protein in HeLa-Zellen 4 h nach der Infektion mittels Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung von spezifischen gegen HIF-1α gerichteten monoklonalen Antikörpern (MB100-131, Novus Biologicals, Littleton, Colorado, USA) und TRITC-markierten Sekundärantikörpern (Dianova, Hamburg, Deutschland) (obere Reihe). Die Zellkerne und Bakterien wurden mit DAPI gefärbt (untere Reihe). Der dargestellte Balken entspricht 20 μm. Dabei zeigt sich bei mit Bartonella henselae infizierten HeLa-Zellen 4 h nach der Infektion ein Auftauchen von HIF-1α-assoziierten Signalen im Zellkern (B.h., mittlere Aufnahme, helle Strukturen). Diese Antwort zeigt sich auch in hypoxiebehandelten Zellen (vgl. Raleigh et al. (1998), Cancer Res. 58, 3765–3768) (H, rechte Aufnahme). Demgegenüber lässt sich in nicht infizierten HeLa-Zellen nahezu kein HIF-1α nachweisen (C, linke Aufnahme).

Die Induktion von HIF-1α-Protein in den HeLa-Zellen wurde ferner mittels Westernblots 4 h nach der Infektion verifiziert. Die hiermit erhaltenen Ergebnisse (3b) sind mit denen aus der Immunfluoreszenzanalyse konsistent. Auch hier zeigt sich 3 h nach der Bartonella-henselae-Infektion in den HeLa-Zellen ein deutlicher Anstieg des HIF-1α-Proteins, während in den nicht infizierten Kontrollzellen nahezu kein HIF-1α-Protein nachgewiesen werden konnte (vgl. Spuren 3 bis 6 mit 1 und 2).

Die HIF-1α-Aktivierung wurde ebenso mittels Electromobility Shift Assays (EMSA) unter Verwendung von Kernextrakten bestätigt (3c). In Kompetitionsexperimenten wurden dabei Kernextrakte von Bartonella-henselae-infizierten HeLa-Zellen mit einer markierten HIF-1α-Sonde in Gegenwart von 100fachem Überschuss von nicht markierter Kompetitorsonde (comp.) inkubiert. Daraus ergibt sich, dass der Transkriptionsfaktor HIF-1 tatsächlich im Zellkern vorliegt und an die entsprechenden Zielsequenzen der wirtszell-DNA binden kann.

In Transfektionsexperimenten, bei denen ein VEGF-Promotor-Luziferase-Reporter verwendet wurde, der spezifisch durch HIF-1 reguliert wird (vgl. Ikeda et al., (1995), J Biol. Chem. 270, 19761–19766), zeigte sich, dass die Infektion von HeLa-Zellen mit Bartonella henselae (B.h.) die VEGF-Gentranskription gegenüber der Kontrolle (C) drei- bis vierfach erhöht; durch Hypoxie (H) wird eine acht- bis zwanzigfache Stimulierung erreicht (3d).

Durch die in 3 dargestellten Ergebnisse aus vier unabhängigen Methoden wird demonstriert, dass durch Bartonella henselae eine Modulierung bzw. Aktivierung der Angiogenese über eine Hochregulierung des HIF-1-Transkriptionsfaktors erfolgt.

Beispiel 3 Aktivierung von HIF-1 in BA-Biopsaten

Um zu untersuchen, ob auch in vivo in Bartonella-henselae-infizierten Geweben eine HIF-1-Aktivierung erfolgt, wurden Schnitte von histologisch bestätigten BA(Bazilläre Angiomatose)- oder BP(Bazilläre Peliosis)-Läsionen auf HIF-1α untersucht. Das Ergebnis eines entsprechenden Experimentes ist in 4 dargestellt.

In Teilabbildung (a) ist die Untersuchung der Haut einer nicht betroffenen Kontrollperson dargestellt und in Teilabbildungen (b) und (c) ist die Untersuchung von zwei histologisch bestätigten BA-Patientenproben dargestellt. Zum Nachweis von HIF-1α in den Geweben wurde ein markierter, gegen HIF-1α gerichteter Antikörper verwendet (MB100-131, a.a.O.). Dabei zeigte sich, dass in den Patientenproben (Teilabbildungen (b), (c)) HIF-1α im Kern von Histiozyten oder Macrophagen, die die BA-Läsionen infiltriert hatten, stark vorhanden war, wohingegen in dem Kontrollgewebe (Teilabbildung (a)) HIF-1α deutlich schwächer vorhanden war (siehe Pfeile).

Diese Ergebnisse belegen, dass über eine Inkubation bzw. Infektion von biologischem Material, wie bspw. HeLa-Zellen, mit Bartonella henselae nicht nur in vitro, sondern auch in vivo eine Modulation der Angiogenese über die Induktion von HIF-1 möglich ist.

Beispiel 4 Bartonella-henselae-infizierte HeLa-Zellen sind lebensfähig

HeLa-Zellen wurden mit Bartonella henselae und mit Y. enterocolitica infiziert und die Zellmorphologie und Zelllebensfähigkeit wurde 12, 24 und 48 h nach der Infektion ausgewertet. Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in 5 dargestellt.

Dabei zeigt Teilabbildung (a) die Auswertung einer Giemsa-Färbung und Teilabbildung (b) die Auswertung eines MTS-Assays (CellTiter-96 RQ_neous; Promega, Mannheim, Deutschland). Die Lebensfähigkeit von nicht infizierten Kontrollzellen (C) wurde auf 100% gesetzt. Jeder errechnete Wert entspricht dem Durchschnitt aus drei Proben pro Gruppe. * deutet auf einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrolle hin (p < 0,05).

Aus diesem Experiment ergibt sich, dass die Infektion der HeLa-Zellen mit Bartonella henselae (B.h.) nach bis zu 48 h nach der Infektion zu keiner Abnahme der Zelllebensfähigkeit führt (vgl. 3a, mittlere Spalte; 3b, mittlere Balken). Hierzu im Gegensatz nimmt die Zelllebensfähigkeit nach einer Infektion mit Y. enterocolitica (Y.e.) drastisch ab (vgl. 3a, rechte Spalte; 3b, rechte Balken).

Dieses Experiment gibt Hinweise auf die pharmakologische Verträglichkeit bzw. Verwendbarkeit von Bartonella henselae und dessen therapeutisches Potenzial als aktiver Bestandteil eines Arzneimittels.

Beispiel 5 Induktion eines Angiogenese modifizierenden genetischen Programms über das Bartonella-henselae-Adhäsin-A-Protein (BadA)

Da, wie die vorstehend dargestellten Experimente zeigen, die Inkubation bzw. Infektion von biologischem Material, wie bspw. HeLa-Zellen oder Gewebe, mit Bartonella henselae zu einer Hochregulation von Angiogenese modifizierenden Genen führt, die über den Schlüsseltranskriptionsfaktor der Angiogenese HIF-1 reguliert werden, wurde von den Erfindern ferner untersucht, ob für diesen biologischen Effekt ein bestimmtes bakterielles Protein ausfindig gemacht werden kann. Im Rahmen der damit verbundenen Experimente wurde auch getestet, ob das von den Erfindern neu aufgefundene 340 kD große Oberflächenprotein von Bartonella henselae, BadA, in die Modulation der Angiogenese bzw. die Hochregulation von Angiogenese modulierenden Wirtszellkomponenten, wie dem Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); Interleukin-8 (IL-8); Insulin-like Growth Factor-Binding Protein-3 (IGFBP-3), involviert ist.

Bei diesen Untersuchungen wurden zwei Bartonella-henselae-Mutanten verwendet, die kein BadA-Protein exprimieren, sowie als Kontrolle Wildtyp-Bartonella-henselae. Mit diesen Bartonella-henselae-Bakterien wurden HeLa-Zellen infiziert und kultiviert, die Zellkulturüberstände 8, 24, 48 und 72 h nach der Infektion abgenommen, zentrifugiert und bei –20°C eingefroren. Die VEGF-Konzentration in den Überständen wurde unter Verwendung eines Human-VEGF₁₆₅-ELISA-Kit (a.a.O.) bestimmt, IL-8 wurde mittels ELISA bestimmt, wie beschrieben in Schulte et al. (a.a.O.). Das in den Zellkulturüberstand sekretierte IGFBP-3 wurde unter Verwendung eines spezifischen RIA gemessen, vgl. hierzu Blum et al. (a.a.O.). Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in 6 dargestellt.

Dieses Experiment zeigt, dass es nach der Infektion von HeLa-Zellen mit den beiden BadA^–-Mutanten (

erste Mutante;

zweite Mutante) in den infizierten Zellen zu keinerlei Anstieg in der Produktion von Angiogenese modulierenden Faktoren kommt, wohingegen die Infektion mit Wildtyp-Bartonella-henselae (

) zu einem deutlichen Anstieg von Angiogenese modulierenden Cytokinen bei den entsprechend infizierten HeLa-Zellen führt.

In weiteren Experimenten wurden die BadA^–-Mutanten durch das Einbringen eines Expressionsvektors, der funktionelles BadA-Protein exprimiert, wieder komplementiert, d.h. die Mutanten waren anschließend wieder in der Lage, BadA zu synthetisieren und in die Membran einzubauen. Dabei stellte sich bei der Durchführung der vorstehend geschilderten Experimente heraus, dass solche komplementierte BadA^–-Mutanten wieder in der Lage waren, die Produktion von Angiogenese modulierenden Faktoren, wie bspw. VEGF, zu stimulieren (Daten nicht gezeigt).

Hieraus ergibt sich, dass es sich bei BadA um einen der entscheidenden bakteriellen Faktoren von Bartonella henselae handelt, der für die Modulation der Angiogenese verantwortlich ist und damit als Wirkstoff in einem Arzneimittel zur Modulation der Angiogenese geeignet ist.

Die für das bakterielle BadA-Protein kodierende und mit SEQ ID Nr. 1 bezeichnete DNA-Nukleotidsequenz ist in 7 dargestellt. Dabei beginnt die Darstellung wie üblich mit dem 5'-Ende, welches das Startcodon (ATG) aufweist, und erstreckt sich hin zum 3'-Ende, welches das Stopcodon (TAA) aufweist. Die letzten, d.h. am 3'-Ende gelegenen 111 Nukleotide kodieren für die sogenannte Membranankerdomäne, die für die Einlagerung des Proteins in die Bakterienmembran verantwortlich ist.

Beispiel 6 BadA als Schlüsselfaktor bei der Adhäsion von Bartonella henselae an Endothelzellen

Die Erfinder untersuchten daraufhin ferner, ob BadA in die Adhäsion von Bartonella henselae an Endothelzellen involviert ist, u.a. um Informationen über den möglichen Wirkmechanismus der Modulation der Angiogenese zu erhalten.

Dazu wurden Endothelzellen mit den vorstehend genannten Bartonella-henselae-Bakterien (Wildtyp, zwei verschiedene BadA^–-Mutanten) infiziert und 30 min nach der Infektion wurde der Anteil von adhärierenden Bakterien bestimmt. Dazu wurden die Zellkulturüberstände vorsichtig entfernt, die Zellen gründlich mit Clicks/RPMI 1640 Medium gewaschen und die Zellen lysiert, und die Gesamtmenge von adhärierenden Bakterien bestimmt. Die Ergebnisse eines solchen Experimentes sind in 8 dargestellt.

In den oberen Abbildungen wird als Kontrolle in transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen demonstriert, dass Wildtyp-Bartonella-henselae erwartungsgemäß BadA an seiner Oberfläche exprimiert (siehe Pfeile, linke Aufnahme), wohingegen die beiden BadA^–-Mutanten keinerlei BadA exprimieren (mittlere und rechte Aufnahme).

Ferner zeigt sich aus diesem Experiment, dass es bei den BadA^–-Mutanten zu einer drastischen Abnahme der Endothelzelladhäsion kommt (untere Teilabbildung; vgl. mittlere und rechte Säule mit linker Säule).

Die vorstehend beschriebenen Beobachtungen betreffend die Adhäsion der Wildtyp- bzw. genetisch veränderten Bartonella-henselae-Bakterien wurde ferner mittels Immunfluoreszenzanalyse über Laserscanningmikroskopie-Färbung bestätigt (Daten nicht gezeigt).

In weiteren Experimenten wurden die BadA^–-Mutanten wieder durch das Einbringen eines Expressionsvektors, der funktionelles BadA-Protein exprimiert, komplementiert (siehe Beispiel 5). Dabei stellte sich bei der Durchführung der vorstehend geschilderten Experimente heraus, dass solche komplementierte BadA^–-Mutanten wieder in der Lage waren, an Endothelzellen zu adhärieren. Ferner konnte gezeigt werden, dass BadA^–-Mutanten im Gegensatz zu Bartonella henselae-Wildtypbakterien nicht mehr an Fibronektin und Kollagen binden können. Dieser Verlust konnte ebenfalls durch das Einbringen des oben genannten BadA-kodierenden Expressionsvektors in die Mutanten rückgängig gemacht werden (Daten nicht gezeigt).

Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Modulation der Angiogenese durch Bartonella henselae über die Adhäsion von BadA an das biologische Material, bspw. an die Endothelzellen, vermittelt bzw. induziert wird.

Beispiel 7 BadA als diagnostischer Marker für Bartonella-Infektionen

In einem nächsten Experiment haben die Erfinder untersucht, ob in Humanseren von Patienten, die von einer Bartonella-henselae-Infektion betroffen sind, gegen BadA gerichtete Antikörper vorhanden sind.

Hierzu wurden Wildtyp-Bartonella-henselae-Bakterien und Bartonella-henselae-BadA^–-Mutanten elektrophoretisch aufgetrennt und in einem Westernblot einmal mit Humanseren inkubiert, die aus Patienten stammten, die an der Katzenkratzkrankheit (CSD) erkrankt waren, und einmal mit Humanseren inkubiert wurden, die aus gesunden Kontrollpatienten stammten. Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in 9 dargestellt.

In den oberen beiden Spuren wurde Wildtyp- (erste Spur von oben) bzw. BadA^–-Bakterienlysat (zweite Spur) aufgetrennt, geblottet und anschließend mit Serum aus einem erkrankten CSD-Patienten inkubiert. In den unteren beiden Spuren wurden Wildtyp- (dritte Spur) bzw. BadA^–-Bakterienlysat (vierte Spur) aufgetrennt und mit Serum aus einer gesunden Kontrollperson inkubiert.

Der eingezeichnete Pfeil zeigt die Position des aufgetrennten BadA an. Es zeigt sich, dass mittels des Humanserums, das aus einem CSD-betroffenen Patienten (Patient) stammt, BadA-Protein detektiert wird, dieser Patient demnach Antikörper gegen das BadA-Protein produziert hat, wohingegen in dem Humanserum, das aus der gesunden Kontrollperson stammt (Kontr.), keinerlei gegen BadA gerichtete Antikörper enthalten sind und deshalb keine immunreaktive Bande auf der Höhe des BadA-Proteins erscheint. Da die BadA^–-Mutanten keinerlei BadA-Protein aufweisen, zeigt sich in den entsprechenden Spuren keine immunreaktive Bande auf der Höhe des BadA-Proteins.

In parallelen Untersuchungen zeigten sechs von neun CSD-Patientenseren eine Reaktivität gegen BadA gegenüber lediglich einem von neun Seren aus gesunden Kontrollpersonen. Eine BadA-Reaktivität konnte ebenfalls mit Seren aus Mäusen und Kaninchen nachgewiesen werden, die mit Bartonella henselae immunisiert wurden (Daten nicht gezeigt).

Aus diesen Experimenten ergibt sich, dass es sich bei BadA um einen geeigneten diagnostischen Marker für Bartonella-Infektionen handelt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung von Bartonella henselae zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Angiogenese.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das gesamte Bakterium verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein genetisch verändertes Bakterium verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein abgetötetes Bakterium verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Peptid verwendet wird, das ein Fragment des Bartonella-henselae-Adhesin-A-Proteins (BadA) aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation im Rahmen der Behandlung einer ischämischen Krankheit erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation einer Stimulation entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation im Rahmen der Behandlung einer Tumorerkrankung erfolgt.
Nukleinsäuremolekül kodierend ein (Poly)peptid, das mit der Modulation der Angiogenese assoziiert ist, wobei das Nukleinsäuremolekül einen Abschnitt der Sequenz SEQ ID Nr. 1 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll aufweist.
Vektor umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9.
Wirt, in den das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9 oder der Vektor nach Anspruch 10 eingebracht wurde.
(Poly)peptid kodiert von dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9.
Zusammensetzung, die Bartonella henselae-Bakterien aufweist.
Zusammensetzung, die das (Poly)peptid nach Anspruch 12 aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, die eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Modulation der Angiogenese ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie ggf. weitere pharmazeutische Hilfsstoffe aufweist.
Verfahren zum Nachweisen einer Bartonella-Infektion bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellen einer biologischen Probe des Lebewesens; (b) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen das Bartonella-henselae-Adhesin-A-Protein (BadA), und (c) Korrelation eines positiven Befundes in Schritt (b) mit dem Vorliegen einer Bartonella-Infektion.