Die
herkömmlichen
Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im wesentlichen nach
zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylierungsspezifische
Restriktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische
Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (sog.: Bisulfit-Behandlung,
siehe etwa:
DE 101
54 317 A1 ;
DE
100 29 915 A1 ). Die enzymatisch oder chemisch vorbehandelte
DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise
analysiert werden (zur Übersicht:
WO 02/072880 S. 1 ff; Fraga and Esteller: DNA Methylation: A Profile
of Methods and Applications. Biotechniques 33:632–649, Sept.
2002).
Da
die Behandlung mit methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen
durch die Sequenzspezifität
der Enzyme auf bestimmte Sequenzen beschränkt ist, wird für die meisten
Anwendungen eine Bisulfit-Behandlung durchgeführt (zur Übersicht
DE 100 29 915 A1 S.2, Zeilen
35–46).
Die
Bisulfitbehandlung erfolgt klassischerweise in folgenden Schritten:
Die genomische DNA wird isoliert, durch Scherung oder durch Behandlung mit
Restriktionsenzymen fragmentiert, mit Natriumhydroxid denaturiert,
mit einer konzentrierten Bisulfit-Lösung für mehrere Stunden umgesetzt
und anschließend
desulfoniert und entsalzen (siehe: Frommer et al.: A genomic sequencing
protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues
in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1;
89(5): 1827–31).
In
der letzten Zeit wurden mehrere technische Verbesserungen dieser
Methode entwickelt. So wird die zu untersuchende DNA bei dem sog.
Agarose-Bead-Verfahren in einer Agarose-Matrix eingeschlossen. Hierdurch
werden Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert. Alle Fällungs-
und Reinigungsschritte werden anschließend durch ein schnelle Dialyse
ersetzt. Mit dieser Methode ist es möglich, den Methylierungsstatus
einzelner Zellen zu untersuchen. Allerdings gibt es Schwierigkeiten
bei sehr kleinen Fragmenten, die durch Diffusion verloren gehen
(Olek et al.: A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064–6.). In
der Patentanmeldung
DE
100 29 915 A1 (WO 01/98528) ist ein Bisulfit-Verfahren
beschrieben, bei dem eine DNA-Probe mit einer Bisulfit-Lösung im
Konzentrationsbereich von 0,1 mol/l bis 6 mol/l in Anwesen heit eines
denaturierenden Reagenzes und/oder Lösemittel sowie mindestens eines
Radikalfängers
inkubiert wird. Dabei sind in dieser Patentanmeldung viele unterschiedliche
geeignete denaturierende Stoffe und Radikalfänger beschrieben. In der Patentanmeldung
DE 101 54 317 (WO 03/038121)
ist ein Verfahren offenbart, bei dem die zu untersuchende DNA während der
Bisulfit-Behandlung an eine Oberfläche gebunden wird, wodurch Aufreinigungs-
und Waschschritte vereinfacht werden.
Ein
grundsätzliches
Problem der Bisulfit-Behandlung besteht allerdings darin, dass lange
Reaktionszeiten erforderlich sind, um eine vollständige Umwandlung
sicherzustellen und so beispielsweise falsch-positive Resultate
auszuschließen.
Gleichzeitig aber kommt es durch die langen Reaktionszeiten zu einer
Degradation der DNA. Dabei führen
höhere Reaktionstemperaturen
zwar zu einer höheren
Umwandlungsrate, aber auch zu einem stärkeren Abbau der DNA. Die Wechselwirkungen
zwischen Temperatur, Reaktionsdauer, Umwandlungs- und Abbaurate wurden
kürzlich
systematisch untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die höchsten Konversionsraten
bei Temperaturen von 55°C
(bei Reaktionszeiten zwischen 4 und 18 Stunden) sowie bei 95°C (bei einer
Reaktionszeit von einer Stunde) erreicht werden. Ein großes Problem
besteht allerdings in der Degradation der DNA. So werden bei einer
Reaktionstemperatur von 55°C
84–96%
der DNA abgebaut. Bei 95°C
ist die Degradation sogar noch höher (Grunau
et al.: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of
critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1;
29(13): E65–5). Dementsprechend
verwenden die meisten Autoren Reaktionstemperaturen von etwa 50°C (vgl.:
Frommer et al. a.a.o. 1992, S. 1827; Olek et al., a.a.o. 1996, S.
5065; Raizis et al: A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes
template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20; 226(1): 161–6, 162).
Neben der hohen Abbaurate der DNA besteht ein weiteres Problem der
herkömmlichen
Bisulfitverfahren darin, dass eine schlagkräftige Aufreinigungsmethode
der umgewandelten DNA bisher nicht beschrieben ist. So benutzen
viele Autoren Fällungen
(vgl.: Grunau et al. a.a.o.). Auch eine Aufreinigung über DNA-bindende
Oberflächen
ist beschrieben (vgl.: Kawakami et al.: Hypermethylated APC DNA
in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma
Journal of the National Cancer Institute, Vol 92, No. 22, 2000,
pp. 1805–11). Die
Ausbeute dieser Aufreinigungen ist aber begrenzt.
Durch
die hohen Verluste der herkömmlichen
Bisulfitbehandlung ist es problematisch, diese Verfahren für Untersuchungen
einzusetzen, in denen die Menge der zu analysierenden DNA limitiert
ist. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet der Methylierungsanalyse
liegt jedoch gerade darin, mittels DNA aus Körperflüssigkeiten, etwa aus Blut oder Urin,
Krebserkrankungen oder andere mit einer Veränderung des Methylierungsstatus
assoziierte Krankheiten zu diagnostizieren. In Körperflüssigkeiten kommt die DNA jedoch
nur in geringen Konzentrationen vor, so dass die Anwendbarkeit der
Methylierungsanalyse durch die geringe Ausbeute der herkömmlichen
Bisulfitbehandlung beschränkt
ist.
Demnach
besteht aufgrund der besonderen Bedeutung der Cytosinmethylierung
und aufgrund der erwähnten
Nachteile der konventionellen Methodik ein großen technisches Bedürfnis an
verbesserten Verfahren zur Bisulfitumwandlung.
Es
wurde nun ein überraschend
wirkungsvoller Weg gefunden, bei dem die Umwandlungsrate der Bisulfitreaktion
unerwartet deutlich erhöht
werden kann, während
gleichzeitig die erforderliche Reaktionsdauer und damit auch die
Degradationsrate der DNA deutlich verringert wird. Dabei wird die
Reaktionstemperatur der Bisulfitumwandlung im Laufe der Reaktion
kurzzeitig erhöht.
Durch Kombination der Temperaturerhöhungen mit neuen Lösemitteln
und neuen Aufreinigungsmethoden lässt sich die Effizienz der
Umsetzung zusätzlich
deutlich steigern. Eine sensitive Methylierungsanalyse aus Gewebe
oder aus Körperflüssigkeiten
isolierter DNA ist möglich.
Beschreibung
Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Bisulfitumwandlung bei milden Reaktionstemperaturen (0–80°C) durchgeführt. Im
Laufe der Umsetzung wird dann die Reaktionstemperatur mindestens einmal
kurzzeitig deutlich erhöht.
Diese kurzzeitigen Temperaturerhöhungen
werden im folgenden „Thermospikes" genannt. Die „normale" Reaktionstemperatur
außerhalb
der Thermospikes wird als Reaktionsgrundtemperatur bezeichnet.
Demnach
handelt es sich bei der Erfindung um ein Verfahren zur Bisulfit-Umwandlung
von DNA, wobei die Reaktionsgrundtemperatur zwischen 0°C und 80°C beträgt, und
die Reaktionstemperatur im Laufe der Umsetzung mindestens einmal
kurzzeitig auf über
85°C erhöht wird.
Die
zu untersuchende DNA kann je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher
Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische
Untersuchungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben,
aber auch Körperflüssigkeiten,
insbesondere Serum. Möglich
ist auch, die DNA aus Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit
zu verwenden. Bevorzugt wird die DNA aus den biologischen Proben
isoliert. Die DNA-Extraktion
erfolgt nach Standardmethoden, aus Blut etwa unter Verwendung des
Qiagen U1traSens-DNA-Extraktions- Kits.
Andere Methoden zur Aufreinigung von DNA sind dem Fachmann bekannt.
Anschließend kann
die isolierte DNA etwa durch Umsatz mit Restriktionsenzymen fragmentiert werden.
Die Reaktionsbedingungen und die in Frage kommenden Enzyme sind
dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den von den Herstellern mitgelieferten
Protokollen.
Die
Bisulfit-Umwandlung kann nach den bekannten, oben angegebenen Protokollen
erfolgen. Dabei kann die Umsetzung sowohl in Lösung wie auch an einer festen
Phase stattfinden (Vgl.:
DE
100 29 915 ;
DE 101
54 317 ). Bevorzugt wird Natriumdisulfit (=Natriumbisulfit/Natriummetabisulfit)
verwendet, da es über
eine höhere
Wasserlöslichkeit
als Natriumsulfit verfügt.
Das Disulfitsalz disproportioniert in wässriger Lösung zu den für die Cytosin-Umwandlung
benötigten
Hydrogensulfitanionen. Wird im folgenden von Bisulfitkonzentration
gesprochen, so bezieht sich dies auf die Konzentration der Hydrogensulfit-
und Sulfitanionen in der Reaktionslösung. Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind Konzentrationsbereiche von 0,1 bis 6 mol/l möglich (Vgl.:
DE 100 29 915 ). Besonders
bevorzugt ist ein Konzentrationsbereich von 1–6 mol/l, ganz besonders bevorzugt
von 2–4
mol/l. Bei Einsatz bestimmter Lösemittel
kann die maximal einsetzbare Konzentration an Bisulfit allerdings
geringer sein (s.u.). Bei der Wahl der Bisulfit-Konzentration ist
zu berücksichtigen,
dass eine hohe Konzentration an Bisulfit zu einer hohen Konversion,
aber aufgrund des niedrigeren pH-Wertes auch zu einer hohen Abbaurate
führt.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Umsetzung in Gegenwart eines Radikalfängers sowie
einer denaturierenden Reagenz oder eines entsprechenden Lösemittels
(Vgl. ausführlich:
DE 10029 915 ). Dabei können unter schiedliche,
dem Fachmann bekannte Radikalfänger
eingesetzt werden (Vgl.:
DE
100 29 915 ). Besonders bevorzugt werden Chroman-Derivate
verwendet, etwa 6-Hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carbonsäure. Als denaturiendes
Lösemittel
wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Dioxan, eines seiner
Derivate oder ein ähnlicher,
aliphatischer cyclischer Ether eingesetzt. Dioxan liegt im Reaktionsansatz bevorzugt
in einer Konzentration von 10 bis 35 Vol.% vor. Ein höherer Dioxananteil
als 35% ist problematisch, da es dann zu einer Zweiphasenbildung
in der Reaktionsmischung kommt. Besonders bevorzugt ist eine Dioxankonzentration
von 20–30
%, insbesondere von 22–28
%, wobei die Bisulfit-Konzentration zwischen 3,3 und 3,6 mol/l beträgt. Ganz
besonders bevorzugt ist ein Dioxananteil von 25 % bei einer Bisulfitkonzentration
von 3,5 mol/l.
In
einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform werden als denaturierende
Lösemittel
Verbindungen der nachfolgenden Formel verwendet:
wobei
n = 1–35000
m
= 1–3
R1
= H, Me, Et, Pr, Bu
R2 = H, Me, Et, Pr, Bu
ist.
Besonders
bevorzugt sind dabei n-Alkylenglykol-Verbindungen, inbesondere deren Dialkylether, insbesondere
wiederum Diethylenglykoldimethylether (DME).
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in unterschiedlichen Konzentration eingesetzt werden. DME wird bevorzugt
in Konzentrationen zwischen 1–35%
eingesetzt. Bevorzugt sind 5 bis 25%, besonders bevorzugt 10% DME.
Die Bisulfitkonzentration liegt dabei vorzugsweise zwischen 0,1–6 mol/l, besonders
bevorzugt zwischen 1–6
mol/l, ganz besonders bevorzugt zwischen 3–4,5 mol/l.
Die
Bisulfitumwandlung kann in einem weiten Temperaturspektrum durchgeführt werden
(s.o.). Dabei verwendet das erfindungsgemäße Verfahren Reaktionsgrundtemperaturen
von 0 bis 80 °C.
Bei Wahl der Reaktionsgrundtemperatur ist zu berücksichtigen, dass ein höhere Temperatur
nicht nur zur einer Beschleunigung der Umwandlung, sondern auch
zu einem Anstieg der Abbaurate führt.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt die Reaktionsgrundtemperatur
daher zwischen 30–70°C. Besonders
bevorzugt ist ein Bereich zwischen 45–60°C; ganz besonders bevorzugt
sind 50–55°C.
Die
optimale Reaktionszeit der Bisulfitbehandlung hängt von der Reaktionstemperatur
ab. Die Reaktionszeit beträgt
normalerweise zwischen 1 und 18 Stunden (vgl.: Grunau et al. 2001
a.a.o.). Für
eine Reaktionstemperatur von 50°C
liegt die Reaktionszeit gewöhnlich
bei 4–6
Stunden. Wird mit Thermospikes gearbeitet, so lässt sich die erforderliche
Reaktionszeit allerdings deutlich verringern (Siehe Beispiele).
Die
optimale Anzahl der Thermospikes steht in Abhängigkeit von der Reaktionsgrundtemperatur. Dabei
ist die optimale Anzahl der Thermospikes umso höher, je niedriger die Reaktionsgrundtemperatur
ist. Erforderlich ist in jedem Falle zumindest ein Thermospike.
Auf der anderen Seite sind prinzipiell beliebig viele Thermospikes
denkbar. Zu berücksichtigen
ist allerdings, dass bei einer großen Anzahl von Temperaturerhöhungen auch
die Abbaurate der DNA steigt, und somit eine optimale Umsetzung
nicht mehr gewährleistet
ist. Die bevorzugte Anzahl der Thermospikes liegt daher je nach
Reaktionsgrundtemperatur zwischen 1 und 10 Thermospikes. Besonders
bevorzugt sind dabei 2 bis 5 Thermospikes.
Die
Thermospikes erhöhen
die Reaktionstemperatur bevorzugt auf 85 bis 100°C, besonders bevorzugt auf 90–98°C, ganz besonders
bevorzugt auf 94°C–96°C.
Die
Zeitdauer der Temperaturerhöhungen hängt auch
von den Volumina der Reaktionsansätze ab. Es muß gewährleistet
werden, dass die Temperatur gleichmäßig in der gesamten Reaktionslösung erhöht ist.
Dabei sind bei Verwendung eines Thermocyclers für einen 20 μl Reaktionsansatz 30 Sekunden Temperaturerhöhung ausreichend.
Bei einem Volumina von 100 μl
sind 1,5 Minuten und bei 600 μl
3 Minuten Temperaturerhöhung
erforderlich.
Nach
Abschluss der Bisulfit-Umwandlung erfolgt eine Desulfonierung und
eine Aufreinigung der DNA. Hierzu sind unterschiedliche Verfahren
bekannt (siehe etwa:
DE
101 54 317 A1 ;
DE
100 29 915 A1 ; Grunau et al. 2001, a.a.o.). Normalerweise
wird die Reaktionslösung
zunächst
mit Natronlauge behandelt. Anschließend erfolgt eine Neutralisation
und eine Alkoholfällung
der DNA.
Erfindungsgemäß bevorzugt
geschieht die Aufreinigung mittels einer Gelfiltration, etwa mit
Sephadex-G25-Säulen. Hiermit
kann das Bisulfitsalz sehr effektiv entfernt werden, ohne dass weitere Waschschritte
erforderlich wären.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung über DNA-bindende
Oberflächen,
etwa über das
Wizard DNA Aufreinigungsharz von Promega (Vgl.: Kawakami et al a.a.o).
Angaben zur Aufreinigung von Nukleinsäuren über Gelfiltration oder DNA-bindende
Oberflächen
sind dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den Herstellerangaben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung über Ultrafiltration.
Eine solche Vorgehensweise hat mehrere technische Vorteile und führt zu einer überraschend
effektiven Aufreinigung. So ist die Wiederfindungsrate der umgewandelten
DNA sehr hoch (> 85%).
Dies gilt sowohl für
hochmolekulare DNA wie auch für
fragmentierte DNA, wie sie etwa in Körperflüssigkeiten auftritt. Die herkömmlichen
Verfahren zur Isolierung bisulfit-behandelter DNA führen dagegen
nur zu einer Wiederfindungsrate von etwa 25 %. Die Ultrafiltration
hat zudem weitere Vorteile. So ist die Aufreinigung bezüglich der
Volumina der einzusetzenden Proben sehr flexibel. Außerdem können die
Bisulfitsalze nahezu vollständig
entfernt werden. Nicht zuletzt ist eine Desulfonierung auf der Filtermembran
möglich,
was zusätzlich
zu einer Zeitersparnis führt.
Dem
Fachmann sind unterschiedliche kommerziell erhältliche Ultrafiltrationssysteme
bekannt, die für
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Microcon-Säulen
von Millipore eingesetzt. Die Aufreinigung kann dabei nach einem modifizierten
Herstellerprotokoll erfolgen. Dazu wird die Bisulfit-Reaktionslösung mit
Wasser versetzt und auf die Ultrafiltrationsmembran gegeben. Danach wird
die Reaktionslösung
für etwa
15 Minuten abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die
DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt
die Desulfonierung. Hierzu wird 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min inkubiert.
Anschließend
erfolgt eine weitere Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt
mit 1 × TE-Puffer.
Anschließend
wird die DNA eluiert. Hierzu wird die Membran für 10 Minuten mit 50 μl warmen
1 × TE-Puffer
(50°C) versetzt.
Die Membran wird nach Herstellerangaben gewendet und es erfolgt
eine erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt
wird. Das Eluat kann direkt für
die Nachweisreaktionen eingesetzt werden. Dem Fachmann ist bekannt,
dass bei anderen Ultrafiltrationsystemen andere Vorgehensweisen
angezeigt sein können, und
dass eine gute Ausbeute auch bei Variation der oben angegebenen
Bedingungen erzielt werden kann. Die entsprechenden Ausführungsformen
sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.
In
einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung
mit Hilfe magnetischer Partikel, etwa mit Hilfe des Magna-Pure-Verfahrens
(Roche). Diese Aufreinigungsmethode führt insbesondere mit DME und
den anderen oben erwähnten
Verbindungen zu besonders guten Ergebnissen. Die Aufreinigung erfolgt
dabei im wesentlichen nach Herstellerangaben. Dem Fachmann ist bekannt,
dass bei Variation der Herstellerangaben durch Standardversuche
eine erhöhte
Ausbeute erzielbar sein kann. Entsprechend optimierte Protokolle
sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.
Die
umgewandelte und aufgereinigte DNA kann über unterschiedliche Wege analysiert
werden. Dazu sind dem Fachmann eine Vielzahl von möglichen
Verfahren bekannt (zur Übersicht:
Fraga and Esteller 2002, a.a.o. 5. 634, 641 ff). Besonders bevorzugt
ist es, die DNA zunächst
mittels einer Polymerasekettenreaktion zu amplifizieren. Über unterschiedliche
Verfahren läßt sich
dabei eine selektive Amplifikation der ursprünglich methylierten bzw. unmethylierten
DNA sicherstellen, etwa über
die sog. „Heavy-Methyl"-Methode (zur Übersicht:
WO 02/072880) oder die sog. „methylierungssensitive
PCR" ("MSP"; vgl.: Herman et
al.: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation
status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3; 93(18): 9821–6). Die
Detektion der Amplifikate kann über herkömmliche
Verfahren erfolgen, etwa über
Primer-Extension-Reaktionen ("MsSNuPE"; siehe etwa:
DE 100 10 280 ) oder über Hybridisierung
an Oligomer-Arrays (Siehe etwa: Adorjan et al., Tumour class prediction
and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic
Acids Res. 2002 Mar 1; 30(5): e21). In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform
werden die Amplifikate unter Verwendung von PCR-Real-Time-Varianten
analysiert (vgl.:
US 6,331,393 „Methyl-Light"). Bevorzugte Varianten
sind dabei das „Taqman"- und das „Lightcycler"-Verfahren).
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung aller erfindungsgemäßen Ausführungsformen.
Werden krankheitsspezifische Cytosinpositionen untersucht, so eignet
sich das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere zur Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen oder
anderen mit einer Veränderung
des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten. Hierzu gehören u.a.
CNS-Fehlfunktionen,
Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische
und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und
Persönlichkeitsstörungen;
Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung;
Fehlfunktion, Schädigung
oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit
des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als
Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine
und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen
oder sexuelle Fehlfunktion. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerdem zur
Vorhersage von unerwünschten
Arzneimittelwirkungen, zur Festlegung einer spezifischen Arzneimitteltherapie
(personalisierte Medizin) und zur Überwachung des Erfolges einer
Arzneimitteltherapie. Eine weitere Anwendung ist die Unterscheidung
von Zelltypen oder Geweben und die Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Zu
1 μl MssI
verdauter, hochreiner Human-DNA (Promega; 160ng) wurden 2 μl ddH2O gegeben. Die Probe wurden für 10 Minuten
bei 96°C
denaturiert. Anschließend
wurden zügig
10 μl Bisulfit-Lösung (5,85
mol/l) und 7 μl
eines Radikalfänger-Dioxan-Gemisches
(5 μl Dioxan
plus 2 μl
Radikalfänger)
zugesetzt. Anschließend
wurde die erste Probe (0 h-Wert) entfernt und auf Eis gelegt. Das
Reaktionsgemisch wurde für
30 Sekunden bei 96°C
und anschließend
für 59,5
Minuten bei 50°C
inkubiert. Die zweite Probe (1 h-Wert)
wurde entfernt und auf Eis gelegt. Die dritte Probe (2 h-Wert) wurde
noch einmal für
30 Sekunden bei 96°C
und für
59,5 Minuten bei 50°C
inkubiert. Anschließend
wurde auch diese Probe auf Eis gelegt. Die vierte Probe (3 h-Wert)
wurde noch einmal für
30 Sekunden bei 96°C
und für
59,5 Minuten bei 50°C
inkubiert und anschließend
ebenfalls gekühlt.
Zu den Proben wurden 30 μl
ddH2O gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über G25
Sephadex-Säulen
gereinigt. Das Eluat wurde mit 50 μl 100 mmol/l Tris-HCl (pH 9.5)
versetzt und bei 96°C für 20 Minuten
desulfoniert. 2 μl
dieser Lösung
wurden für
jede PCR-Reaktion verwandt. In der PCR wurden jeweils zwei bisulfit-spezifische Fragmente, zwei
unspezifische Fragmente und ein genomisches Fragment amplifiziert.
Die bisulfit-spezifischen
Fragmente werden umso stärker
amplifiziert, je weiter die Bisulfit-Umwandlung vorangeschritten
ist. Die unspezifischen Fragmente werden unabhängig von der Bisulfit-Umwandlung
amplifiziert und geben einen Hinweis auf die Degradation der DNA.
Das genomische Fragment wird nur insoweit amplifiziert, wie noch
genomische, nichtbisulfit-umgewandelte DNA vorhanden ist. Die Amplifikation
der genomischen DNA ist daher ein Maß für eine unvoll ständige Bisulfit-Umwandlung.
Die in Agarosegelen aufgetrennten Amplifkate sind in 1 zu
sehen. Dabei zeigt sich, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
bereits nach einer Stunde ein großer Teil der DNA umgesetzt
ist. Spätestens
nach drei Stunden ist keine genomische DNA mehr nachweisbar, d.h.
die Bisulfit-Umwandlung ist vollständig erfolgt. Bei der herkömmlichen
Bisulfit-Behandlung
ergeben sich entsprechende Werte frühestens nach 5 h (s.u.).
Es
soll gezeigt werden, dass das optimierte Bisulfitverfahren eine
sensitive Methylierungsanalyse von aus Körperflüssigkeiten gewonnener DNA ermöglicht.
Hierzu wurde 1 ml humanes Plasma mit einer bestimmten Menge humaner
DNA versetzt. Die DNA wurde aus den Plasmaproben über das
Magna Pure-Verfahren (Roche) nach Herstellerangaben isoliert. Die
aus der Aufreinigung resultierenden 100 μl Eluat wurden vollständig in
die folgende Bisulfit-Reaktion eingesetzt. Dabei erfolgte als Kontrolle
die Umsetzung nach einem Standardverfahren (Frommer et al. a.a.o).
Für das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde wie folgt vorgegangen: Das Eluat wurde mit 354 μl Bisulfit-Lösung (5,89
mol/l) und 46 μl
DME (einschließlich
Radikalfänger
(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, 98,6
mg in 787 μl DME)
versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 min bei 99°C denaturiert
und anschließend
bei folgendem Temperaturprogramm für insgesamt 5 h inkubiert:
30 min 50°C;
ein Thermospike (99,9°C)
für 3 min;
1,5 h 50°C;
ein Thermospike (99,9°C)
für 3 min; 3
h 50°C.
Die Reaktionsgemische sowohl der Kontrolle wie auch des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden
anschließend
per Ultrafiltration mittels einer Millipore-Microcon-Säule aufgereinigt.
Die Aufreinigung erfolgte im wesentlichen nach Herstellerangaben.
Dazu wurde das Reaktionsgemisch mit 300 μl Wasser versetzt, auf die Ultafiltrationsmembran
gegeben, für
15 min abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die
DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt
die Desulfonierung. Hierzu wurde 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min
inkubiert.
