Die
herkömmlichen
Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im wesentlichen nach
zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylierungsspezifische
Restriktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische
Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (sog.: Bisulfit-Behandlung,
siehe etwa:
DE 101
54 317 A1 ;
DE
100 29 915 A1 ). Die enzymatisch oder chemisch vorbehandelte DNA
wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise
analysiert werden (zur Übersicht:
WO 02/072880 S. 1 ff; Fraga and Esteller: DNA Methylation: A Profile
of Methods and Applications. Biotechniques 33: 632–649, Sept.
2002).
Da
die Behandlung mit methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen
durch die Sequenzspezifität der
Enzyme auf bestimmte Sequenzen beschränkt ist, wird für die meisten
Anwendungen eine Bisulfit-Behandlung durchgeführt (zur Übersicht
DE 100 29 915 A1 S.2, Zeilen
35–46).
Die
Bisulfitbehandlung erfolgt klassischerweise in folgenden Schritten:
Die genomische DNA wird isoliert, durch Scherung oder durch Behandlung
mit Restriktionsenzymen fragmentiert, mit Natriumhydroxid denaturiert,
mit einer konzentrierten Bisulfit-Lösung für mehrere Stunden umgesetzt
und anschließend
desulfoniert und entsalzen (siehe: Frommer et al.: A genomic sequencing
protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues
in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 1; 89(5):
1827–31).
In
der letzten Zeit wurden mehrere technische Verbesserungen dieser
Methode entwickelt. So wird die zu untersuchende DNA bei dem sog.
Agarose-Bead-Verfahren in einer Agarose-Matrix eingeschlossen. Hierdurch
werden Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert. Alle Fällungs-
und Reinigungsschritte werden anschließend durch ein schnelle Dialyse
ersetzt. Mit dieser Methode ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner
Zellen zu untersuchen. Allerdings gibt es Schwierigkeiten bei sehr
kleinen Fragmenten, die durch Diffusion verloren gehen (Olek et
al.: A modified and improved method for bisulphite based cytosine
methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064–6.). In
der Patentanmeldung
DE
100 29 915 A1 (WO 01/98528) ist ein Bisulfit-Verfahren
beschrieben, bei dem eine DNA-Probe mit einer Bisulfit-Lösung im
Konzentrationsbereich von 0,1 mol/l bis 6 mol/l in Anwesen heit eines
denaturierenden Reagenzes und/oder Lösemittel sowie mindestens eines
Radikalfängers
inkubiert wird. Dabei sind in dieser Patentanmeldung viele unterschiedliche
geeignete denaturierende Stoffe und Radikalfänger beschrieben. In der Patentanmeldung
DE 101 54 317 (WO 03/038121)
ist ein Verfahren offenbart, bei dem die zu untersuchende DNA während der
Bisulfit-Behandlung an eine Oberfläche gebunden wird, wodurch
Aufreinigungs- und Waschschritte vereinfacht werden.
Ein
grundsätzliches
Problem der Bisulfit-Behandlung besteht allerdings darin, dass lange
Reaktionszeiten erforderlich sind, um eine vollständige Umwandlung
sicherzustellen und so beispielsweise falsch-positive Resultate
auszuschließen.
Gleichzeitig aber kommt es durch die langen Reaktionszeiten zu einer
Degradation der DNA. Dabei führen
höhere
Reaktionstemperaturen zwar zu einer höheren Umwandlungsrate, aber auch
zu einem stärkeren
Abbau der DNA. Die Wechselwirkungen zwischen Temperatur, Reaktionsdauer,
Umwandlungs- und Abbaurate wurden kürzlich systematisch untersucht.
Dabei konnte gezeigt werden, dass die höchsten Konversionsraten bei
Temperaturen von 55°C
(bei Reaktionszeiten zwischen 4 und 18 Stunden) sowie bei 95°C (bei einer
Reaktionszeit von einer Stunde) erreicht werden. Ein großes Problem
besteht allerdings in der Degradation der DNA. So werden bei einer
Reaktionstemperatur von 55°C
84–96
% der DNA abgebaut. Bei 95°C
ist die Degradation sogar noch höher
(Grunau et al.: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation
of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul
1; 29(13): E65-5). Dementsprechend verwenden die meisten Autoren
Reaktionstemperaturen von etwa 50°C
(vgl.: Frommer et al. a.a.o. 1992, S. 1827; Olek et al., a.a.o.
1996, S. 5065; Raizis et al: A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping
that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20;
226(1): 161–6,
162). Neben der hohen Abbaurate der DNA besteht ein weiteres Problem
der herkömmlichen
Bisulfitverfahren darin, dass eine schlagkräftige Aufreinigungsmethode
der umgewandelten DNA bisher nicht beschrieben ist. So benutzen
viele Autoren Fällungen
(Vgl.: Grunau et al. a.a.o.). Auch eine Aufreinigung über DNA-bindende
Oberflächen
ist beschrieben (Vgl.: Kawakami et al.: Hypermethylated APC DNA
in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma
Journal of the National Cancer Institute, Vol 92, No. 22, 2000,
pp. 1805–11).
Die Ausbeute dieser Aufreinigungen ist aber begrenzt.
Durch
die hohen Verluste der herkömmlichen
Bisulfitbehandlung ist es problematisch, diese Verfahren für Untersuchungen
einzusetzen, in denen die Menge der zu analysierenden DNA limitiert
ist. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet der Methylierungsanalyse
liegt jedoch gerade darin, mittels DNA aus Körperflüssigkeiten, etwa aus Blut oder
Urin, Krebserkrankungen oder andere mit einer Veränderung
des Methylierungsstatus assoziierte Krankheiten zu diagnostizieren.
In Körperflüssigkeiten
kommt die DNA jedoch nur in geringen Konzentrationen vor, so dass
die Anwendbarkeit der Methylierungsanalyse durch die geringe Ausbeute
der herkömmlichen
Bisulfitbehandlung beschränkt
ist.
Demnach
besteht aufgrund der besonderen Bedeutung der Cytosinmethylierung
und aufgrund der erwähnten
Nachteile der konventionellen Methodik ein großen technisches Bedürfnis an
verbesserten Verfahren zur Bisulfitumwandlung.
Es
wurde nun ein überraschend
ein Weg gefunden, bei dem durch ein neues Aufreinigungsverfahren die
Ausbeute der Bisulfitreaktion unerwartet deutlich gesteigert werden
kann. Dabei wird die Reaktionslösung mittels
einer Ultrafiltration aufgereinigt. Zwar ist eine DNA-Isolierung mittels
Ultrafiltration bereits bekannt. Eine entsprechende Aufreinigung
bisulfit-behandelter DNA ist jedoch noch nicht beschrieben und ermöglicht eine unerwartet
hohe Ausbeute. Zudem kann der letzte Schritt der Bisulfit-Umwandlung, die Desulfonierung,
ebenfalls auf der Ultrafiltrationsmembran erfolgen, so dass es zudem
zu einer Zeitersparnis kommt. Durch eine Kombination mit neuen Lösemitteln
und optimierten Reaktionsbedingungen lässt sich die Ausbeute der Bisulfit-Umwandlung
zusätzlich
deutlich steigern. Eine sensitive Methylierungsanalyse aus Gewebe
oder aus Körperflüssigkeiten
isolierter DNA ist möglich.
Beschreibung
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Bisulfit-Umwandlung von DNA ist dadurch gekennzeichnet, dass
die Aufreinigung der umgewandelten DNA mittels Ultrafiltration erfolgt.
Die Ultrafiltration ermöglicht
eine überraschend
hohe Ausbeute (s.u.).
Die
zu untersuchende DNA kann je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher
Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische
Untersuchungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben,
aber auch Körperflüssigkeiten,
insbesondere Serum. Möglich
ist auch, die DNA aus Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit
zu verwenden. Bevorzugt wird die DNA aus den biologischen Proben
isoliert. Die DNA-Extraktion
erfolgt nach Standardmethoden, aus Blut etwa unter Verwendung des
Qiagen U1traSens DNA Extraktions-Kits.
Andere Methoden zur Aufreinigung von DNA sind dem Fachmann bekannt.
Anschließend kann
die isolierte DNA etwa durch Umsatz mit Restriktionsenzymen fragmentiert
werden. Die Reaktionsbe dingungen und die in Frage kommenden Enzyme
sind dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den von den
Herstellern mitgelieferten Protokollen.
Die
Bisulfit-Umwandlung kann nach den bekannten, oben angegebenen Protokollen
erfolgen. Dabei kann die Umsetzung sowohl in Lösung wie auch an einer festen
Phase stattfinden (Vgl.:
DE
100 29 915 ;
DE 101
54 317 ). Bevorzugt wird Natriumdisulfit (=Natriumbisulfit/Natriummetabisulfit)
verwendet, da es über
eine höhere
Wasserlöslichkeit
als Natriumsulfit verfügt.
Das Disulfitsalz disproportioniert in wässriger Lösung zu den für die Cytosin-Umwandlung
benötigten
Hydrogensulfitanionen. Wird im folgenden von Bisulfitkonzentration
gesprochen, so bezieht sich dies auf die Konzentration der Hydrogensulfit-
und Sulfitanionen in der Reaktionslösung. Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind Konzentrationsbereiche von 0,1 bis 6 mol/l möglich (Vgl.:
DE 100 29 915 ). Besonders
bevorzugt ist ein Konzentrationsbereich von 1–6 mol/l. Bei Verwendung bestimmter
Lösemittel
kann die maximal einsetzbare Konzentration allerdings unter 6 mol/l
liegen (s.u.). Bei der Wahl der Bisulfit-Konzentration ist zu berücksichtigen,
daß eine
hohe Konzentration an Bisulfit zu einer hohen Konversion, aber auch
zu einer hohen Abbaurate führt.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Umsetzung in Gegenwart eines Radikalfängers sowie
einer denaturierenden Reagenz oder eines entsprechenden Lösemittels
(Vgl. ausführlich:
DE 10029 915 A1 ).
Dabei können
unterschiedliche, dem Fachmann bekannte Radikalfänger eingesetzt werden (Vgl.:
DE 100 29 915 A1 ).
Besonders bevorzugt werden Chroman-Derivate verwendet, etwa 6-Hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carbonsäure. Als
denaturierendes Lösemittel
wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Dioxan, eines seiner
Derivate oder ein ähnlicher,
aliphatischer cyclischer Ether eingesetzt. Di oxan liegt im Reaktionsansatz
bevorzugt in einer Konzentration von 10 bis 35 Vol.% vor. Ein höherer Dioxananteil
als 35% ist problematisch, da es dann zu einer Zweiphasenbildung
in der Reaktionsmischung kommt. Besonders bevorzugt ist eine Dioxankonzentration
von 20–30
%, insbesondere von 22–28
%, wobei die Bisulfit-Konzentration zwischen 3,3 und 3,6 mol/l beträgt. Ganz
besonders bevorzugt ist ein Dioxananteil von 25 % bei einer Bisulfitkonzentration
von 3,5 mol/l.
In
einer anderer besonders bevorzugten Ausführungsform werden als denaturierende
Lösemittel
Verbindungen der nachfolgenden Formel verwendet:
wobei
n = 1–35000
m
= 1–3
R1
= H, Me, Et, Pr, Bu
R2 = H, Me, Et, Pr, Bu
ist.
Besonders
bevorzugt sind dabei n-Alkylenglykol-Verbindungen, inbesondere deren Dialkylether,
insbesondere wiederum Diethylenglykoldimethylether (DME).
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in unterschiedlichen Konzentration eingesetzt werden. DME wird bevorzugt
in Konzentrationen zwischen 1–35%
eingesetzt. Bevorzugt sind zwischen 5 und 25%, besonders bevorzugt
10% DME. Die Bisulfitkonzentration liegt dabei vorzugsweise zwischen
0,1–6
mol/l, besonders bevorzugt zwischen 1–6 mol/l, ganz besonders bevorzugt
zwischen 3–4,5
mol/l.
Die
Bisulfitumwandlung kann in einem weiten Temperaturspektrum durchgeführt werden
(s.o.). Dabei verwendet das erfindungsgemäße Verfahren Reaktionsgrundtemperaturen
von 0 bis 80 °C.
Bei Wahl der Reaktionsgrundtemperatur ist zu berücksichtigen, dass ein höhere Temperatur
nicht nur zur einer Beschleunigung der Umwandlung, sondern auch
zu einem Anstieg der Abbaurate führt.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt die Reaktionsgrundtemperatur
daher zwischen 30–70°C. Besonders
bevorzugt ist ein Bereich zwischen 45–60°C; ganz besonders bevorzugt
sind 50–55°C.
Die
optimale Reaktionszeit der Bisulfitbehandlung hängt von der Reaktionstemperatur
ab. Die Reaktionszeit beträgt
normalerweise zwischen 1 und 18 Stunden (Vgl.: Grunau et al. 2001
a.a.o.). Für
eine Reaktionstemperatur von 50°C
liegt die Reaktionszeit gewöhnlich
bei 4–6
Stunden.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Bisulfitumwandlung bei milden Reaktionstemperaturen durchgeführt, wobei
im Laufe der Umsetzung die Reaktionstemperatur dann mindestens einmal
kurzzeitig deutlich erhöht
wird. Hierdurch lässt
sich die Effektivität
der Bisulfitumwandlung überraschend
deutlich erhöhen.
Die kurzzeitigen Temperaturerhöhungen
werden im folgenden „Thermospikes" genannt. Die „normale" Reaktionstemperatur
außerhalb
der Thermospikes wird als Reaktionsgrundtemperatur bezeichnet. Die
Reaktionsgrundtemperatur beträgt
wie oben beschrieben zwischen 0 und 80°C, bevorzugt zwischen 30–70°C, besonders
bevorzugt 45°–55°C. Die Reaktionstemperatur
wird durch mindestens einen Thermospike auf über 85°C erhöht. Die optimale Anzahl der
Thermospikes steht in Abhängigkeit
von der Reaktionsgrundtemperatur. Dabei ist die optimale Anzahl
der Thermospikes umso höher,
je niedriger die Reaktionsgrundtemperatur ist. Erforderlich ist
in jedem Falle zumindest ein Thermospike. Auf der anderen Seite
sind prinzipiell beliebig viele Thermospikes denkbar. Zu berücksichtigen
ist allerdings, dass bei einer großen Anzahl von Temperaturerhöhungen auch
die Abbaurate der DNA steigt, und somit eine optimale Umsetzung
nicht mehr gewährleistet
ist. Die bevorzugte Anzahl der Thermospikes liegt daher je nach
Reaktionsgrundtemperatur zwischen 1 und 10 Thermospikes. Besonders
bevorzugt sind dabei 2 bis 5 Thermospikes. Die Thermospikes erhöhen die
Reaktionstemperatur bevorzugt auf 85 bis 100°C, besonders bevorzugt auf 90–98°C, ganz besonders
bevorzugt auf 94°C–96°C.
Die
Zeitdauer der Temperaturerhöhungen
hängt auch
von den Volumina der Reaktionsansätze ab. Es muss gewährleistet
werden, dass die Temperatur gleichmäßig in der gesamten Reaktionslösung erhöht ist.
Dabei sind bei Verwendung eines Thermocyclers für einen 20 μl Reaktionsansatz 30 Sekunden
Temperaturerhöhung
ausreichend. Bei einem Volumina von 100 μl sind 1,5 Minuten und bei 600 μl 3 Minuten
Temperaturerhöhung
erforderlich.
Nach
Abschluß der
Bisulfit-Umwandlung erfolgt eine Desulfonierung und eine Aufreinigung
der DNA. Hierzu sind unterschiedliche Verfahren beschrieben (siehe
etwa:
DE 101 54 317
A1 ;
DE 100
29 915 A1 ; Grunau et al. 2001, a.a.o.). Normalerweise wird
die Reaktionslösung
zunächst
mit Natronlauge behandelt. Anschließend erfolgt eine Neutralisation
und eine Alkoholfällung
der DNA.
Erfindungsgemäß wird zur
Aufreinigung eine Ultrafiltration verwendet. Eine solche Vorgehensweise hat
mehrere technische Vorteile und führt zu einer überraschend
effektiven Aufreinigung. So ist die Wiederfindungsrate der umgewandelten
DNA sehr hoch (> 85%,
siehe Beispiel 1). Dies gilt sowohl für hochmolekulare DNA wie auch
für fragmentierte
DNA, wie sie etwa in Körperflüssigkeiten auftritt.
Die herkömmlichen
Verfahren zur Isolierung bisulfit-behandelter DNA führen dagegen
nur zu einer Wiederfindungsrate von etwa 25 %. Die Ultrafiltration
hat zudem weitere Vorteile. So ist die Aufreinigung bezüglich der
Volumina der einzusetzenden Proben sehr flexibel. Außerdem können die
Bisulfitsalze nahezu vollständig
entfernt werden. Nicht zuletzt ist eine Desulfonierung auf der Filtermembran
möglich,
was zusätzlich
zu einer Zeitersparnis führt.
Dem
Fachmann sind unterschiedliche kommerziell erhältliche Ultrafiltrationssysteme
bekannt, die für das
erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Microcon-Säulen
von Millipore verwendet. Die Aufreinigung kann dabei nach einem
modifizierten Herstellerprotokoll erfolgen. Dazu wird die Bisulfit-Reaktionslösung mit
Wasser versetzt und auf die Ultrafiltrationsmembran gegeben. Anschließend wird
die Reaktionslösung
für etwa
15 Minuten abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die
DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt
die Desulfonierung. Hierzu wird 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min
inkubiert. Anschließend
erfolgt eine weitere Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt
mit 1 × TE-Puffer.
Anschließend
wird die DNA eluiert. Hierzu wird die Membran für 10 Minuten mit 50 μl warmen
1 × TE-Puffer
(50°C) versetzt.
Die Membran wird nach Herstellerangaben gewendet und es erfolgt
eine erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt
wird. Das Eluat kann direkt für
die Nachweisreaktionen eingesetzt werden. Dem Fachmann ist bekannt,
dass bei anderen Ultrafiltrationsystemen anderer Vorgehensweisen
angezeigt sein können,
und dass eine gute Ausbeute auch bei Variation der oben angegebenen
Bedingungen erzielt werden kann. Die entsprechenden Ausführungsformen
sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.
Die
umgewandelte und aufgereinigte DNA kann über unterschiedliche Wege analysiert
werden. Dazu sind dem Fachmann eine Vielzahl von möglichen
Verfahren bekannt (zur Übersicht:
Fraga and Esteller 2002, a.a.o. S. 634, 641 ff). Besonders bevorzugt
ist es, die DNA zunächst
mittels einer Polymerasekettenreaktion zu amplifizieren. Über unterschiedliche
Verfahren lässt
sich dabei eine selektive Amplifikation der ursprünglich methylierten
bzw. unmethylierten DNA sicherstellen, etwa über die sog. „Heavy-Methyl"-Methode (zur Übersicht:
WO 02/072880) oder die sog. „methylierungssensitive
PCR" ("MSP"; vgl.: Herman et
al.: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation
status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci US A. 1996 Sep 3; 93(18):
9821–6).
Die Detektion der Amplifikate kann über herkömmliche Verfahren erfolgen,
etwa über
Primer-Extension-Reaktionen ("MsSNuPE"; siehe etwa:
DE 100 10 280 ) oder über Hybridisierung
an Oligomer-Arrays (Siehe etwa: Adorjan et al., Tumour class prediction
and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic
Acids Res. 2002 Mar 1; 30(5): e21). In einer anderen besonders bevorzugten
Ausführungsform
werden die Amplifikate unter Verwendung von PCR-Real-Time-Varianten
analysiert (vgl.:
US 6,331,393 „Methyl-Light"). Bevorzugte Varianten
sind dabei das „Taqman"- und das „Lightcycler"-Verfahren).
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung aller erfindungsgemäßen Ausführungsformen.
Werden krankheitsspezifische Cytosinpositionen untersucht, so eignet
sich das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere zur Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen oder
an deren mit einer Veränderung
des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten. Hierzu gehören u.a.
CNS-Fehlfunktionen,
Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische
und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und
Persönlichkeitsstörungen;
Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung;
Fehlfunktion, Schädigung
oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als
Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen;
endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen
oder sexuelle Fehlfunktion. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerdem besonders
zur Vorhersage von unerwünschten
Arzneimittelwirkungen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder
Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Erfindungsgemäß ist schließlich auch
ein Kit, der eine Bisulfitreagenz und ein Ultrafiltrationsröhrchen enthält. Weitere
Bestandteile können
ein denaturierendes Lösemittel,
ein Radikalfänger,
Primer, eine Polymerase und weitere für eine Bisulfitumwandlung,
Aufreinigung oder Amplifikation erforderliche Reagenzien sein.
Es
soll gezeigt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr effektive
Bisulfitumwandlung und Aufreinigung ermöglicht. Dazu wurden unterschiedliche
Mengen an M13-DNA und humaner DNA in 100 μl Wasser gelöst. Die DNA-Lösungen
wurden mit 354 μl
Bisulfit-Lösung
(5,89 mol/l) und 146 μl
Dioxan (einschließlich
Radikalfänger
(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, 98,6
mg in 2,5 ml Dioxan) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 min
bei 99°C
denaturiert und anschließend
bei folgendem Temperaturprogramm für insgesamt 5 h inkubiert:
30 min 50°C;
ein Thermospike (99,9°C)
für 3 min;
1,5 h 50°C; ein
Thermospike (99,9°C)
für 3 min;
3 h 50°C.
Die Reaktionsgemische wurden anschließend per Ultrafiltration mittels
einer Millipore-Microcon-Säule
aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte im wesentlichen nach Herstellerangaben.
Dazu wurde das Reaktionsgemisch mit 300 μl Wasser versetzt, auf die Ultrafiltrationsmembran
gegeben, für
15 min abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die
DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt
die Desulfonierung. Hierzu wurde 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min
inkubiert. Anschließend
erfolgte eine Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt mit 1 × TE-Puffer.
Danach wurde die DNA eluiert. Hierzu wurde die Membran für 10 Minuten
mit 50 μl
warmen 1 × TE-Puffer
(50°C) versetzt.
Die Membran wurde nach Herstellerangaben gewendet. Anschließend erfolgte
eine erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt
wurde. Die DNA-Konzentrationen wurden anschließend fluorometrisch (oligreen)
bestimmt. Die Daten sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Wiederfindungsrate der
DNA beträgt
mindestens 75%. Bei den bekannten Verfahren zur Bisulfitumsetzung
und Aufreinigung von DNA liegt die Wiederfindungsrate dagegen unter
25 %.
