Die
herkömmlichen
Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im wesentlichen nach
zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylierungsspezifische
Restriktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische
Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (sog.: Bisulfit-Behandlung,
siehe etwa:
DE 101
54 317 A1 ;
DE
100 29 915 A1 ). Die enzymatisch oder chemisch vorbehandelte
DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise
analysiert werden (zur Übersicht:
WO 02/072880 S. 1 ff; Fraga and Esteller: DNA Methylation: A Profile
of Methods and Applications. Biotechniques 33:632-649, Sept. 2002).
Da
die Behandlung mit methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen
durch die Sequenzspezifität
der Enzyme auf bestimmte Sequenzen beschränkt ist, wird für die meisten
Anwendungen eine Bisulfit-Behandlung durchgeführt (zur Übersicht
DE 100 29 915 A1 S.2, Zeilen
35-46).
Die
Bisulfitbehandlung erfolgt klassischerweise in folgenden Schritten:
Die genomische DNA wird isoliert, durch Scherung oder durch Behandlung mit
Restriktionsenzymen fragmentiert, mit Natriumhydroxid denaturiert,
mit einer konzentrierten Bisulfit-Lösung für mehrere Stunden umgesetzt
und anschließend
desulfoniert und entsalzen (siehe: Frommer et al.: A genomic sequencing
protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues
in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1;89(5):1827-31).
In
der letzten Zeit wurden mehrere technische Verbesserungen dieser
Methode entwickelt. So wird die zu untersuchende DNA bei dem sog.
Agarose-Bead-Verfahren in einer Agarose-Matrix eingeschlossen. Hierdurch
werden Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert. Alle Fällungs-
und Reinigungsschritte werden anschließend durch ein schnelle Dialyse
ersetzt. Mit dieser Methode ist es möglich, den Methylierungsstatus
einzelner Zellen zu untersuchen. Allerdings gibt es Schwierigkeiten
bei sehr kleinen Fragmenten, die durch Diffusion verloren gehen
(Olek et al.: A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6.). In
der Patentanmeldung
DE
100 29 915 A1 (WO 01/98528) ist ein Bisulfit-Verfahren
beschrieben, bei dem eine DNA-Probe mit einer Bisulfit-Lösung im Konzentrationsbereich
von 0,1 mol/l bis 6 mol/l in Anwesenheit eines denaturienden Reagenzes
und/oder Lösemittel
sowie mindestens eines Radikalfängers inkubiert
wird. Da bei sind in dieser Patentanmeldung viele unterschiedliche
geeignete denaturierende Stoffe und Radikalfänger beschrieben. In der Patentanmeldung
DE 101 54 317 (WO 03/038121)
ist ein Verfahren offenbart, bei dem die zu untersuchende DNA während der
Bisulfit-Behandlung an eine Oberfläche gebunden wird, wodurch
Aufreinigungs- und Waschschritte vereinfacht werden.
Ein
grundsätzliches
Problem der Bisulfit-Behandlung besteht allerdings darin, dass lange
Reaktionszeiten erforderlich sind, um eine vollständige Umwandlung
sicherzustellen und so beispielsweise falsch-positive Resultate
auszuschließen.
Gleichzeitig aber kommt es durch die langen Reaktionszeiten zu einer
Degradation der DNA. Dabei führen
höhere Reaktionstemperaturen
zwar zu einer höheren
Umwandlungsrate, aber auch zu einem stärkeren Abbau der DNA. Die Wechselwirkungen
zwischen Temperatur, Reaktionsdauer, Umwandlungs- und Abbaurate wurden
kürzlich
systematisch untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die höchsten Konversionsraten
bei Temperaturen von 55°C
(bei Reaktionszeiten zwischen 4 und 18 Stunden) sowie bei 95°C (bei einer
Reaktionszeit von einer Stunde) erreicht werden. Ein großes Problem
besteht allerdings in der Degradation der DNA. So werden bei einer
Reaktionstemperatur von 55°C
84-96 % der DNA abgebaut. Bei 95°C
ist die Degradation sogar noch höher (Grunau
et al.: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of
critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1;29(13):E65-5). Dementsprechend
verwenden die meisten Autoren Reaktionstemperaturen von etwa 50°C (vgl.:
Frommer et al. a.a.o. 1992, S. 1827; Olek et al., a.a.o. 1996, S.
5065; Raizis et al: A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes
template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20;226(1):161-6, 162).
Neben der hohen Abbaurate der DNA besteht ein weiteres Problem der
herkömmlichen
Bisulfitverfahren darin, dass eine schlagkräftige Aufreinigungsmethode
der umgewandelten DNA bisher nicht beschrieben ist. So benutzen
viele Autoren Fällungen
(Vgl.: Grunau et al. a.a.o Auch eine Aufreinigung über DNA-bindende
Oberflächen
ist beschrieben (Vgl.: Kawakami et al.: Hypermethylated APC DNA
in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma
Journal of the National Cancer Institute, Vol 92, No. 22, 2000,
pp. 1805-11). Die Ausbeute dieser Aufreinigungen ist aber begrenzt.
Durch
die hohen Verluste der herkömmlichen
Bisulfitbehandlung ist es problematisch, diese Verfahren für Untersuchungen
einzusetzen, in denen die Menge der zu analysierenden DNA limitiert
ist. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet der Methylierungsanalyse
liegt jedoch gerade darin, mittels DNA aus Körperflüssigkeiten, etwa aus Blut oder Urin,
Krebserkrankungen oder andere mit einer Veränderung des Methylierungsstatus
assoziierte Krankheiten zu diagnostizieren. In Körperflüssigkeiten kommt die DNA jedoch
nur in geringen Konzentrationen vor, so dass die Anwendbarkeit der
Methylierungsanalyse durch die geringe Ausbeute der herkömmlichen
Bisulfitbehandlung beschränkt
ist.
Aufgrund
der besonderen Bedeutung der Cytosinmethylierung und aufgrund der
erwähnten Nachteile
der konventionellen Methodik besteht ein großen technisches Bedürfnis an
verbesserten Verfahren zur Bisulfitumwandlung.
Es
wurde nun überraschend
gefunden, dass der Zusatz von Dioxan die Umwandlungsrate der Bisulfitreaktion
unerwartet deutlich erhöht,
während gleichzeitig
die erforderliche Reaktionsdauer und damit auch die Degradationsrate
der DNA unerwartet deutlich verringert wird. Zwar ist die Verwendung
denaturierender Lösemittel
in der Bisulfitreaktion bereits bekannt (
DE 100 29 915 ). Einen derart starken Effekt,
wie er hier zum ersten Mal für
Dioxan beschrieben wird, konnte der Fachmann jedoch nicht erwarten.
Neben der deutlich erhöhten
Umwandlungsrate und der verringerten Degradation der DNA hat die
Verwendung von Dioxan einen weiteren wichtigen Vorteil. Denn die
konventionellen Bisulfit-Umwandlungen werden oft in Gegenwart hoher
Konzentrationen von Bisulfit durchgeführt. So empfehlen etwa Fraga
and Estelle eine finale Konzentration von 5 mol/l (a.a.o. S. 642,
linke Spalte, 2. Absatz). Eine solche hohe Salzkonzentration führt jedoch
zu einer hohen Abbaurate sowie zu Schwierigkeiten bei der Aufreinigung
und bei der nachfolgenden Amplifikation der umgewandelten DNA. Das
erfindungsgemäße Verfahren
kommt dagegen mit deutlich geringeren Bisulfit-Konzentrationen aus
und ermöglicht
daher eine effektivere Umwandlung, Aufreinigung und Amplifikation.
Durch Kombination des Einsatzes von Dioxan mit optimierten Reaktionsbedingungen
und Aufreinigungsmethoden lässt
sich die Effizienz der Umsetzung zusätzlich deutlich steigern. Eine
sensitive Methylierungsanalyse aus Gewebe oder aus Körperflüssigkeiten
isolierter DNA ist möglich.
Beschreibung
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Bisulfit-Umwandlung von DNA ist dadurch gekennzeichnet, dass
die Reaktion in Gegenwart von Dioxan oder einem seiner Derivate
oder einem ähnlichen,
aliphatischen cyclischen Ether erfolgt.
Die
zu untersuchende DNA kann je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher
Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische
Untersuchungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben,
aber auch Körperflüssigkeiten,
insbesondere Serum. Möglich
ist auch, die DNA aus Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit
zu verwenden. Bevorzugt wird die DNA aus den biologischen Proben
isoliert. Die DNA-Extraktion
erfolgt nach Standardmethoden, aus Blut etwa unter Verwendung des
Qiagen U1traSens-DNA-Extraktions-Kits.
Andere Methoden zur Aufreinigung von DNA sind dem Fachmann bekannt.
Anschließend kann
die isolierte DNA etwa durch Umsatz mit Restriktionsenzymen fragmentiert werden.
Die Reaktionsbedingungen und die in Frage kommenden Enzyme sind
dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den von den Herstellern mitgelieferten
Protokollen.
Die
Bisulfit-Umwandlung kann ausgehend von den bekannten, oben angegebenen
Protokollen erfolgen. Dabei kann die Umsetzung sowohl in Lösung wie
auch an einer festen Phase stattfinden (Vgl.:
DE 100 29 915 ;
DE 101 54 317 ).
Das
Dioxan kann in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt werden.
Bevorzugt beträgt die
Dioxankonzentration 10 bis 35 %, besonders bevorzugt 20 bis 30 %,
ganz besonders bevorzugt 22-28 %, insbesondere 25 %. Ein höherer Dioxananteil
als 35% ist problematisch, da es dann zu einer Zweiphasenbildung
innerhalb der Reaktionslösung kommt.
Bevorzugt
wird Natriumdisulfit (= Natriumbisulfit/Natriummetabisulfit) verwendet,
da es über
eine höhere
Wasserlöslichkeit
als Natriumsulfit verfügt. Das
Disulfitsalz disproportioniert in wässriger Lösung zu den für die Cytosin-Umwandlung
benötigten
Hydrogensulfitanionen. Wird im folgenden von Bisulfitkonzentration
gesprochen, so bezieht sich dies auf die Konzentration der Hydrogensulfit- und Sulfitanionen
in der Reaktionslösung.
Bei der Wahl der Bisulfit-Konzentration ist zu berücksichtigen,
dass eine hohe Konzentration an Bisulfit zu einer hohen Konversion,
aber aufgrund des niedrigeren pH-Wertes auch zu einer hohen Abbaurate
führt.
Abhängig
von der Dioxankonzentration (s.u.) sind für das erfindungsgemäße Verfahren
Konzentrationsbereiche von 0,1 bis 6 mol/l möglich (Vgl.:
DE 100 29 915 ). Besonders bevorzugt
ist ein Konzentrationsbereich von 1-6 mol/l, ganz besonders bevorzugt
von 2-4 mol/l. In der
besonders bevorzugten Ausführungsformen
mit einer Dioxankonzentration von 22-28 % beträgt die finale Bisulfitkonzentration
3,3 bis 3,6 mol/l, in der ganz besonders bevorzugten Ausführungsform
mit einer Dioxankonzentration von 25 % 3,5 mol/l (Siehe Beispiele).
Vorzugsweise
wird zusätzlich
mindestens ein Radikalfänger
verwendet. Einsetzbare Radikalfänger
sind dem Fachmann bekannt (Vgl.:
DE 100 29 915 A1 ). Besonders bevorzugt werden
Chroman-Derivate benutzt, etwa 6-Hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carbonsäure.
Die
Bisulfitumwandlung kann in einem weiten Temperaturspektrum von 0
bis 95 °C
durchgeführt
werden (s.o.). Dabei ist zu berücksichtigen, dass
bei höheren
Temperaturen mit der Umwandlungs- auch die Abbaurate der DNA steigt.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt die Reaktionstemperatur
daher zwischen 30-70°C.
Besonders bevorzugt ist ein Bereich zwischen 45-60°C; ganz besonders
bevorzugt sind 50-55°C.
Die optimale Reaktionszeit der Bisulfitbewandlung hängt von
der Reaktionstemperatur ab. Die Reaktionszeit beträgt normalerweise
zwischen 1 und 18 Stunden (Vgl.: Grunau et al. 2001 a.a.o.). Für eine Reaktionstemperatur
von 50°C
liegt die Reaktionszeit gewöhnlich
bei 4-6 Stunden.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Bisulfitumwandlung bei milden Reaktionstemperaturen durchgeführt, wobei
im Laufe der Umsetzung die Reaktionstemperatur dann mindestens einmal kurzzeitig
deutlich erhöht
wird. Hierdurch lässt sich die
Effektivität
der Bisulfitumwandlung überraschend deutlich
erhöhen.
Die kurzzeitigen Temperaturerhöhungen
werden im folgenden „Thermospikes" genannt. Die „normale" Reaktionstemperatur
außerhalb der
Thermospikes wird als Reaktionsgrundtemperatur bezeichnet. Die Reaktionsgrundtemperatur
beträgt
wie oben beschrieben zwischen 0 und 80°C, bevorzugt zwischen 30-70°C, besonders
bevorzugt 45°-55°C. Die Reaktionstemperatur
wird durch mindestens einen Thermospike auf über 85°C erhöht. Die optimale Anzahl der
Thermospikes steht in Abhängigkeit
von der Reaktionsgrundtemperatur. Dabei ist die optimale Anzahl
der Thermospikes umso höher,
je niedriger die Reaktionsgrundtemperatur ist. Erforderlich ist
in jedem Falle zumindest ein Thermospike. Auf der anderen Seite
sind prinzipiell beliebig viele Thermospikes denkbar. Zu berücksichtigen
ist allerdings, dass bei einer großen Anzahl von Temperaturerhöhungen auch
die Abbaurate der DNA steigt, und somit eine optimale Umsetzung
nicht mehr gewährleistet
ist. Die bevorzugte Anzahl der Thermospikes liegt daher je nach
Reaktionsgrundtemperatur zwischen 1 und 10 Thermospikes. Besonders
bevorzugt sind dabei 2 bis 5 Thermospikes. Die Thermospikes erhöhen die
Reaktionstemperatur bevorzugt auf 85 bis 100°C, besonders bevorzugt auf 90-98°C, ganz besonders
bevorzugt auf 94°C-96°C.
Die
Zeitdauer der Temperaturerhöhungen hängt auch
von den Volumina der Reaktionsansätze ab. Es muss gewährleistet
werden, dass die Temperatur gleichmäßig in der gesamten Reaktionslösung erhöht ist.
Dabei sind bei Verwendung eines Thermocyclers für einen 20 μl Reaktionsansatz 30 Sekunden Temperaturerhöhung ausreichend.
Bei einem Volumina von 100 μl
sind 1,5 Minuten und bei 600 μl
3 Minuten Temperaturerhöhung
erforderlich.
Nach
Abschluss der Bisulfit-Umwandlung erfolgt eine Desulfonierung und
eine Aufreinigung der DNA. Hierzu sind unterschiedliche Verfahren
bekannt (siehe etwa:
DE
101 54 317 A1 ;
DE
100 29 915 A1 ; Grunau et al. 2001, a.a.o.). Normalerweise
wird die Reaktionslösung
zunächst
mit Natronlauge behandelt. Anschließend erfolgt eine Neutralisation
und eine Alkoholfällung
der DNA.
Erfindungsgemäß bevorzugt
geschieht die Aufreinigung mittels einer Gelfiltration, etwa mit
Sephadex-G25-Säulen.
Hiermit kann das Bisulfitsalz sehr effektiv entfernt werden, ohne
dass weitere Waschschritte erforderlich wären. In einer zweiten bevorzugten
Ausführungsform
erfolgt die Aufreinigung über
DNA-bindende Oberflächen,
etwa über das
Wizard DNA Aufreinigungsharz von Promega (Vgl.: Kawakami et al a.a.o).
Eine dritte bevorzugte Ausführungsform
benutzt zur Aufreinigung magnetische Partikel. Detaillierte technische
Angaben zur Aufreinigung von Nukleinsäuren über Gelfiltration, DNA-bindende
Oberflächen
und magnetischen Partikeln sind dem Fachmann bekannt und ergeben
sich etwa aus den Herstellerangaben. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
erfolgt die Aufreinigung über
Ultrafiltration. Eine solche Vorgehensweise hat mehrere technische
Vorteile und führt
zu einer überraschend
effektiven Aufreinigung. So ist die Wiederfindungsrate der umgewandelten
DNA sehr hoch (>85%).
Dies gilt sowohl für
hochmolekulare DNA wie auch für
fragmentierte DNA, wie sie etwa in Körperflüssigkeiten auftritt. Die herkömmlichen
Verfahren zur Isolierung bisulfit-behandelter DNA führen dagegen
nur zu einer Wiederfindungsrate von etwa 25 %. Die Ultrafiltration
hat zudem weitere Vorteile. So ist die Aufreinigung bezüglich der
Volumina der einzusetzenden Proben sehr flexibel. Außerdem können die
Bisulfitsalze nahezu vollständig
entfernt werden. Nicht zuletzt ist eine Desulfonierung auf der Filtermembran
möglich,
was zusätzlich
zu einer Zeitersparnis führt.
Dem
Fachmann sind unterschiedliche kommerziell erhältliche Ultrafiltrationssysteme
bekannt, die für
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Microcon-Säulen
von Millipore verwendet. Die Aufreinigung kann dabei nach einem modifizierten
Herstellerprotokoll erfolgen. Dazu wird die Bisulfit-Reaktionslösung mit
Wasser versetzt und auf die Ultrafiltrationsmembran gegeben. Anschließend wird
die Reaktionslösung
für etwa
15 Minuten abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die
DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt
die Desulfonierung. Hierzu wird 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min
inkubiert. Anschließend
erfolgt eine weitere Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt
mit 1 × TE-Puffer.
Anschließend
wird die DNA eluiert. Hierzu wird die Membran für 10 Minuten mit 50 μl warmen 1 × TE-Puffer
(50°C) versetzt.
Die Membran wird nach Herstellerangaben gewendet und es erfolgt eine
erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt
wird. Das Eluat kann direkt für
die Nachweisreaktionen eingesetzt werden. Dem Fachmann ist bekannt,
dass bei anderen Ultrafiltrationsystemen anderer Vorgehensweisen
angezeigt sein können,
und dass eine gute Ausbeute auch bei Variation der oben angegebenen
Bedingungen erzielt werden kann. Die entsprechenden Ausführungsformen
sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.
Die
umgewandelte und aufgereinigte DNA kann über unterschiedliche Wege analysiert
werden. Besonders bevorzugt ist es, die DNA zunächst mittels einer Polymerasekettenreaktion
zu amplifizieren. Über
unterschiedliche Verfahren läßt sich
dabei eine selektive Amplifikation der ursprünglich methylierten bzw. unmethylierten
DNA sicherstellen, etwa über
die sog. „Heavy-Methyl"-Methode (zur Übersicht:
WO 02/072880) oder die sog. „methylierungssen sitive PCR" ("MSP"; vgl.: Herman et
al.: Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation
status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6).
Die Detektion der Amplifikate kann über herkömmliche Verfahren erfolgen,
etwa über Primer-Extension-Reaktionen
("MsSNuPE"; siehe etwa:
DE 100 10 280 ) oder über Hybridisierung
an Oligomer-Arrays (Siehe etwa: Adorjan et al., Tumour class prediction
and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic
Acids Res. 2002 Mar 1;30(5):e21). In einer anderen besonders bevorzugten
Ausführungsform
werden die Amplifikate unter Verwendung von PCR-Real-Time-Varianten
analysiert (vgl.:
US 6,331,393 „Methyl-Light"). Bevorzugte Varianten
sind dabei das „Taqman"- und das „Lightcycler"-Verfahren).
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung aller erfindungsgemäßen Ausführungsformen.
Werden krankheitsspezifische Cytosinpositionen untersucht, so eignet
sich das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere zur Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen oder
anderen mit einer Veränderung
des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten. Hierzu gehören u.a.
CNS-Fehlfunktionen,
Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische
und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und
Persönlichkeitsstörungen;
Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung;
Fehlfunktion, Schädigung
oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit
des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als
Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine
und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen
oder sexuelle Fehlfunktion. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerdem besonders
zur Vorhersage von unerwünschten
Arzneimittelwirkungen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder
Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Erfindungsgemäß ist auch
die Verwendung von Dioxan oder einem seiner Derivate oder einem ähnlichen,
aliphatischen cyclischen Ether zur Bisulfitumwandlung.
Erfindungsgemäß ist schließlich auch
ein Kit, der eine Bisulfitreagenz und Dioxan bzw. ein Dioxanderivat
oder einen ähnlichen,
aliphatischen cyclischen Ether enthält. Weitere Bestandteile können ein Radikalfänger, Ultrafiltrationsröhrchen,
Primer, eine Polymerase und weitere für eine Bisulfitumwandlung, Aufreinigung
oder Amplifikation erforderliche Reagenzien sein.
Es
soll gezeigt werden, dass das optimierte Bisulfitverfahren eine
sensitive Methylierungsanalyse von aus Körperflüssigkeiten gewonnener DNA ermöglicht.
Hierzu wurde 1 ml humanes Plasma mit einer bestimmten Menge humaner
DNA versetzt. Die DNA wurde aus den Plasmaproben über das
Magna Pure-Verfahren (Roche) nach Herstellerangaben isoliert. Die
aus der Aufreinigung resultierenden 100 μl Eluat wurden vollständig in
die folgende Bisulfit-Reaktion eingesetzt. Dabei erfolgte als Kontrolle
die Umsetzung nach einem Standardverfahren (Frommer et al. a.a.o).
Für das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde wie folgt vorgegangen: Das Eluat wurde mit 354 μl Bisulfit-Lösung (5,89
mol/l) und 146 μl
Dioxan (einschließlich
Radikalfänger
(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, 98,6 mg in 2,5 ml Dioxan)
versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 min bei 99°C denaturiert
und anschließend
bei folgendem Temperaturprogramm für insgesamt 5 h inkubiert:
30 min 50°C;
ein Thermospike (99,9°C)
für 3 min;
1,5 h 50°C;
ein Thermospike (99,9°C)
für 3 min;
3 h 50°C.
Die Reaktionsgemische sowohl der Kontrolle wie auch des erfindungsgemäßen Verfahrens
wurden anschließend
per Ultrafiltration mittels einer Millipore-Microcon-Säule aufgereinigt.
Die Aufreinigung erfolgte im wesentlichen nach Herstellerangaben.
Dazu wurde das Reaktionsgemisch mit 300 μl Wasser versetzt, auf die Ultafiltrationsmembran
gegeben, für
15 min abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die DNA bleibt bei
dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt die Desulfonierung.
Hierzu wurde 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min inkubiert. Anschließend erfolgte
eine Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt mit 1 × TE-Puffer.
Danach wurde die DNA eluiert. Hierzu wurde die Membran für 10 Minuten
mit 50 μl
warmen 1 × TE-Puffer
(50°C) versetzt.
Die Membran wurde nach Herstellerangaben gewendet. Anschließend erfolgte
eine erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt wurde.
10 μl des
Eluats wurden für
die folgende Lightcycler-Real-Time-PCR eingesetzt. Hierbei erfolgte
die Amplifikation mittels eines bisulfitspezifischen Assays. Die
Fluoreszenzsignale wurden detektiert und mit der Lightcycler-Software
berechnet. Durch einen Vergleich mit Eichkurven konnte die Menge
der umgewandelten und isolierten DNA quantifiziert werden. Für das optimierte
Verfahren ergab sich dabei eine DNA-Konzentration von 133,21 ng/100μl, während das
herkömmliche
Verfahren zu einer Konzentration von 41,03 ng/100μl führte. Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglichte
daher eine dreifach höhere
Ausbeute als das herkömmliche
Verfahren.