DE10339312A1

DE10339312A1 - Verfahren zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einer Probe vorhandenen Farbstoffen

Info

Publication number: DE10339312A1
Application number: DE10339312A
Authority: DE
Inventors: Frank Olschewski
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2005-03-31
Also published as: US7280203B2; US20050046835A1

Abstract

Es ist ein Verfahren zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einem Objekt (15) vorhandenen Farbstoffen offenbart. Zunächst erfolgt die Aufnahme eines spektralen Scans des Fluoreszenzspektrums aller im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe. In einer Datenbank des Rechnersystems sind die den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Fluoreszenzspektren abgelegt. Nach dem spektralen Entfalten des aufgenommenen gemischten Fluoreszenzspektrums erfolgt das Vergleichen der durch das spektrale Entfalten ermittelten, gemessenen Einzelspektren mit den den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Fluoreszenzspektren. Schließlich wird ein lineares Entfalten des aufgenommenen gemischten Fluoreszenzspektrums durchgeführt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einer Probe vorhandenen Farbstoffen.

Die deutsche Patentanmeldung DE 100 06 800.6 offenbart eine Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens eines Spektralbereichs eines spektral aufgefächerten Lichtstrahls (SP-Modul). Im aufgefächerten des von dem zu untersuchenden Objekt kommenden Lichts sind Selektionsmittel vorgesehen, die als Schieber ausgebildet sind, um somit Teile des aufgefächerten Lichtstrahls auf verschiedene Detektoren zu lenken. Die Signale der Detektoren werden dann zu Bilderzeugung verwendet. Die DE 100 06 800.6 offenbart nicht die Betätigung der Schieber in der Art und Weise, dass eine schnelle und zuverlässige Detektion eines speziellen Spektrums möglich ist.

Aus der deutschen Patentanmeldung DE 102 27 111.9 ist ein Spektralmikroskop und Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop bekannt. Es werden Verfahren und Systeme zur Erfassung maximaler Information von einem fluoreszierenden mikroskopischen Objekt erfasst. Mit diesem Verfahren ist jedoch nicht eine fehlertolerante und adaptive Datenaufnahme möglich.

In der von Demandolx und Davoust beschriebenen Mehrfarbanalyse werden biologische Strukturen durch das Einbringen einzelner Farbstoffe lokalisiert (siehe Demandolx, Davoust: Multicolour Analysis and local Image Correlation in Confocal Microscopy; Journal of Microscopy, Vol. 185, Pt. 1, January 1997, pp. 21–36). Reagiert eine Struktur auf einen Farbstoff, so spricht man von Lokalisation. Reagiert eine Struktur auf mehr als einen Farbstoff gleichzeitig spricht man von Ko-Lokalisation und die Anzahl der im Intensitätsvektorraum zu beobachtenden Geraden ist größer als die Anzahl der Farbstoffe. Dieser Sachverhalt wird durch eine geschickte Visualisierung bei der Analyse sichtbar gemacht. Die von Demandolx und Davoust eingeführten Techniken des Zytofluorogramms, visualisiert ein Ensemble zweidimensionaler Intensitäten {I→ _i} (in der Mikroskopie die Pixel eines Bildes, Voxel eines Volumens oder einer zeitlich aufeinanderfolgenden Serie dergleichen, in der Zytofluorometrie die Messungen mehrerer Proben) als zweidimensionalen Scatter-Plot, welches im wesentlichen eine zweidimensionales Häufigkeitsverteilung darstellt. Auf dieser Basis erhält man eine Schätzung der Verbundwahrscheinlichkeitsfunktion der Intensitäten I→, ein Verfahren das in der mathematischen Datenanalyse Stand der Technik ist und dessen Güte nur von der Größe des Ensembles abhängt. Durch eine geeignete Farbcodierung und grafischer Darstellung erhält man ein Bild der Intensitätsverteilung, in dem die Geraden als verbreiterte Spuren durch das Auge des Benutzers zu lokalisieren ist. Die Verbreiterung existiert aufgrund aller Formen des Rauschens und evtl. im Hintergrund wirkender chemischer Einflüsse.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einer Probe vorhandenen Farbstoffen zu schaffen, das fehlertolerant ist und eine Anpassung an spektrale Veränderungen ermöglicht.

Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 1 aufweist.

Im Vergleich zum Stand der Technik hat das Verfahren hat den Vorteil, dass eine Schutzfunktion den Benutzer vor Fehlern bewahrt. So erfolgt zunächst das Aufnehmen eines spektralen Scans und dadurch das Ermitteln eines gemischten Fluoreszenzspektrum aller im Objekt vorhandenen Farbstoffe. Durch einen Benutzer werden an ein, einem Scanmikroskop zugeordnetem Rechnersystem die im Objekt vorhandenen Farbstoffe übermittelt, wobei den jeweiligen Farbstoffen zugeordnete Fluoreszenzspektren in einer Datenbank des Rechnersystems abgelegt sind. Ein spektrales Entfalten des aufgenommenen gemischten Fluoreszenzspektrums wir durchgeführt und anschließend werden die gemessenen Einzelspektren mit den den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Fluoreszenzspektren verglichen. Schließlich erfolgt ein lineares Entfalten des aufgenommenen gemischten Fluoreszenzspektrums.

Hinzu kommt, dass dem Benutzer eine Warnung ausgegeben wird, wenn der Vergleich der durch das spektrale Entfalten ermittelten, gemessenen Einzelspektren mit den den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Fluoreszenzspektren eine mangelnde Übereinstimmung ergibt.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines Scanmikroskops, wobei dem Detektor ein SP Modul vorgeschaltet ist;
2 eine schematische Darstellung des SP-Moduls im Detail, und
3 eine schematische Darstellung des Ablaufs des erfindungsgemäßen Verfahrens;
In 1 ist das Ausführungsbeispiel eines konfokalen Scanmikroskops 100 schematisch gezeigt. Dies soll jedoch nicht als Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden und dem Fachmann ist hinreichend bekannt das die gleichen erfindungsrelevanten Komponenten auch in Fluorometern, Cytometern und Mikroskopsystem anderer Bauart verbaut sind. Das von mindestens einem Beleuchtungssystem 1 kommende Beleuchtungslicht 3 wird von einem Strahlteiler oder einem geeigneten Umlenkmittel 5 zu einem Scanmodul 7 geleitet. Bevor das Beleuchtungslicht 3 auf das Umlenkmittel 5 trifft, passiert dieses ein Beleuchtungspinhole 6. Das Scanmodul 7 umfasst einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 9, der das Beleuchtungslicht 3 durch eine Scanoptik 12 und eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw. durch ein Objekt 15 führt. Das Beleuchtungslicht 3 wird bei nicht transparenten Objekten 15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Objekten 15 (Präparaten) oder transparenten Objekten kann das Beleuchtungslicht 3 auch durch das Objekt 15 geführte werden. Zu diesen Zwecken werden nichtleuchtende Präparate ggf. mit einem oder mehreren geeigneten Farbstoffen präpariert (nicht dargestellt, da etablierter Stand der Technik). Die in dem Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe werden durch das Beleuchtungslicht 3 angeregt und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des Spektrums aus. Die Spektren der verschiedenen Farbstoffe sind überlagert und es gilt nun das Scanmikroskop 100 derart einzustellen, dass eine Trennung und somit Detektion der einzelnen im Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe möglich ist.
Das vom Objekt 15 ausgehende Licht ist ein Detektionslicht 17. Dieses gelangt durch die Mikroskopoptik 13, die Scanoptik 12 und über das Scanmodul 7 zum Umlenkmittel 5, passiert dieses und gelangt über ein Detektionspinhole 18 auf mindestens einen Detektor 36, 37, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Es ist dem Fachmann klar, dass auch andere Detektionskomponenten, wie z.B. Dioden, Diodenarrays, Photomultiplierarrays, CCD Chips oder CMOS Bildsensoren eingesetzt werden können. Das vom Objekt 15 ausgehende bzw. definierte Detektionslicht 17 ist in 1 als gestrichelte Linie dargestellt. In den Detektoren 36, 37 werden elektrische, zur Leistung des vom Objekt 15 ausgehenden Lichtes, proportionale Detektionssignale erzeugt. Da, wie bereits oben erwähnt, vom Objekt 15 Licht mit einem charakteristischen Spektrum ausgesandt wird, ist es sinnvoll vor dem mindestens einen Detektor 36, 37 ein SP-Modul 20 vorzusehen. Die von dem mindestens einen Detektor 36, 37 erzeugten Daten werden an ein Rechnersystem 23 weitergegeben. Dem Rechnersystem 23 ist mindestens ein Peripheriegerät 27 zugeordnet. Das Peripheriegerät kann z.B. ein Display sein, auf dem der Benutzer Hinweise zur Einstellung des Scanmikroskops 100 erhält oder den aktuellen Setup und auch die Bilddaten in graphischer Form entnehmen kann. Ferner ist mit dem Rechnersystem 23 ein Eingabemittel zugeordnet, das z.B. aus einer Tastatur 28, einer Einstellvorrichtung 29 für die Komponenten des Mikroskopsystems und einer Maus 30 besteht.
Das SP Modul 20 (2) ist derart ausgebildet, dass es einen kompletten Lambda Scan aufnehmen kann, d.h., das alle vom Objekt 15 ausgehenden Wellenlängen aufgezeichnet werden. Mit anderen Worten es wird ein kompletter Wellenlängenbereich aufgenommen, um somit alle von einem Objekt ausgehenden Wellen zu erfassen. Die Daten werden an das Rechnersystem 23 übertragen und können dann in einer von Benutzer bestimmbaren Weise auf dem Display 27 dargestellt werden. Das Detektionslicht 17 wird mit einem Prisma 31 räumlich spektral aufgespalten. Eine weitere Möglichkeit der spektralen Aufspaltung ist die Verwendung eines Reflexions-, oder Transmissionsgitters. Der spektral aufgespaltene Lichtfächer 32 wird mit der Fokussieroptik 33 fokussiert und trifft anschließend auf eine Spiegelblendenanordnung 34, 35. Die Spiegelblendenanordnung 34, 35, die Mittel zur spektralen, räumlichen Aufspaltung, die Fokussieroptik 33 und die Detektoren 36 und 37 werden zusammen als SP-Modul 20 (oder Mutibanddetektor) bezeichnet.
Wie aus 2 ersichtlich ist, kann mittels der Spiegelblendenanordnung 34, 35 eine gewünschter Teil des Spektrums des Detektionslichts 17 ausgewählt bzw. systematisch selektiert werden. In dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Spaltblendenanordnung 34, 35 mit einem ersten und einem zweiten Schieber 40 und 41 ausgestattet. Es ist selbstverständlich, dass für die Selektion von mehr als zwei spektralen Bereichen eine entsprechende Anzahl von Schiebern vorgesehen sein muss. Eine entsrpechende Erhöhung der Speigelschieber ergibt direkt eine Erhöhung der parallel zu erfassenden spektralen Bändern. Dem ersten Schieber 40 ist ein erster Motor 44 und dem zweiten Schieber 41 ist ein zweiter Motor 45 zugeordnet. Die Motore 44 und 45 veranlassen eine gemäß den nachstehenden Verfahren beschriebene Verstellung der Schieber 40 und 41. Durch die Verstellung der Schieber 40 und 41 passiert nur ein Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 32 des Detektionslichts 17, der nur Licht des vorgewählten Spektralbereichs die Spiegelblendenanordnung 34, 35 und wird von dem Detektor 36, der als Photomultiplier ausgeführt ist detektiert. Ein anderer Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 32 wird an der Spiegelblendenanordnung 35 reflektiert und gelangt zu Detektor 37, der ebenfalls als Photomultiplier ausgeführt ist.
3 offenbart eine schematische Darstellung des Ablaufs des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein Objekt 15 ist in der Regel mit mehr als einem fluoreszierenden Farbstoff versehen. Jeder Farbstoff besitzt ein individuelles Emissionsspektrum. Es ist leicht einsehbar, dass sich die individuellen Emissionsspektren der einzelnen Farbstoffe überlagern und somit ein gemischtes Fluoreszenzspektrum bilden. Um zu bestimmen welche Emission von welchen Farbstoff kommt, ist eine Trennung der Fluoreszenzspektren der einzelnen im Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe notwendig. Hierzu erfolgt zunächst das Aufnehmen eines spektralen Scans, wodurch das gemischte Fluoreszenzspektrum aller im Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe ermittelt wird. Das gemischte Fluoreszenzspektrum wird mit dem SP-Modul 20 aufgenommen. Ebenso übermittelt ein Benutzer an ein dem Scanmikroskop 100 zugeordnetes Rechnersystem die im Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe. Die den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Fluoreszenzspektren sind in einer Datenbank des Rechnersystems abgelegt. Die Datenbank kann natürlich durch Referenzmessungen des Benutzers erweitert werden. Das aufgenommene, gemischte Fluoreszenzspektrum wird spektral entfaltet. Das aufgenommene und spektral entfaltete Fluoreszenzspektrum, also die Einzelspektren, werden mit den den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Fluoreszenzspektren aus der Datenbank verglichen. Das Ergebnis des Vergleichs bestimmt den weiteren Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ist der Vergaich mangelhaft so wird ein Alarmsignal erzeugt. Das Alarmsignal, kann z.B. akustischer oder optischer natur sein. Ebenso ist eine Kombination aus den beiden Signalarten denkbar. Ist das Ergebnis des Vergleichs akzeptabel, so erfolgt schließlich ein lineares Entfalten des aufgenommenen gemischten Fluoreszenzspektrums und die Darstellung auf dem zugeordneten Display.
Der wesentliche Kerngedanke ist die Schutzfunktion. Zu Ihrer Implementierung bieten sich unterschiedliche Methoden an, wobei eine im folgenden kurz umrissen wird. Jeder Pixel eines Spektralen Bildes läßt sich als Vektor I ∈ R” darstellen. In diesem Raum bildet jeder einzelner Farbstoff einen ihn identifizierenden Referenzvektor I REF / Farbstoff ∈ R” aus. Beobachtungen von Farbstoffkonzentrationen dieses Farbstoffs liegen immer auf einer Geraden durch den Ursprung die von diesem Referenzvektor aufgespannt wird. Hat man zwei Farbstoffe, so liegen alle Beobachtungen in einer Ebene die durch beide Farbstoffreferenzvektoren aufgespannt werden. Bei drei Farbstoffen hat man ein Volumen, bei vier ein Hypervolumen,.... Jeden einzelnen Messpunkt I kann man demnach in zwei Vektoren zerlegen I = I_‚ + I_„, wobei I_‚ den Anteil in dem zugehörigen aufgespannten Mannigfaltigkeit und I_„ der Anteil senkrecht dazu. Diese Zerlegung kann über die Hesse Normalform geschehen und gehöhrt zum Handwerkszeug eines Abiturenten. Der Anteil I_„ entspricht dem Anteil der nicht dem Modell entspricht. Er wird im wesentlichen durch Rauschen bestimmt und sollte dementsprechend klein sein. Die Gesamtenergie (Betragsquadrat) dieser Abweichung sollte dementsprechend im Verhältnis zu Gesamtenergie innerhalb des modellanteils klein sein, was durch eine Schwellwertprüfung trivial zu implementieren ist.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

1: Beleuchtungssystem
3: Beleuchtungslicht
5: Umlenkmittel
6: Beleuchtungspinhole
7: Scanmodul
8: mikrostrukturiertes Element
9: Scanspiegel
10: Laser
12: Scanoptik
13: Mikroskopoptik
15: Objekt
17: Detektionslicht
18: Detektionspinhole
20: SP-Modul
23: Rechnersystem
23a: Datenbank
27: Peripheriegerät
29: Einstellvorrichtung
30: Maus
31: Prisma
32: aufgespaltener Lichtfächer
33: Fokussieroptik
34: Spiegelblendenanordnung
35: Spiegelblendenanordnung
36: Detektor
37: Detektor
40: erster Schieber
41: zweiter Schieber
44: erster Motor
45: zweiter Motor
100: Scanmikroskop

Claims

Verfahren zur Trennung von Fluoreszenzspektren von in einem Objekt (15) vorhandenen Farbstoffen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: – Aufnehmen eines spektralen Scans und dadurch Ermitteln eines gemischten Fluoreszenzspektrum aller im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe, – Übermitteln durch einen Benutzer an ein, einem Scanmikroskop (100) zugeordnetem Rechnersystem die im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe, wobei den jeweiligen Farbstoffen zugeordnete Fluoreszenzspektren in einer Datenbank des Rechnersystems abgelegt sind; – Spektrales Entfalten des aufgenommenen gemischten Fluoreszenzspektrums; – Vergleichen der durch das spektrale Entfalten ermittelten, gemessenen Einzelspektren mit den den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Fluoreszenzspektren; und – lineares Entfalten des aufgenommenen gemischten Fluoreszenzspektrums.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Benutzer eine Warnung ausgegeben wird, wenn der Vergleich der durch das spektrale Entfalten ermittelten, gemessenen Einzelspektren mit den den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Fluoreszenzspektren eine mangelnde Übereinstimmung ergibt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Datenbank des Rechnersystems (23) die zu den einzelnen Farbstoffen gehörigen Anregungs- und Emissionsspektren abgelegt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der spektrale Scan des Detektionslichts mittels eines SP-Moduls (20) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die den jeweiligen Farbstoffen zugeordneten Einzelspektren im Detektionslicht mittels des SP-Moduls (20) derart gemessenen werden, dass mittels einer Spiegelblendenanordnung (34, 35) des SP-Moduls (20) ein gewünschter Teil des Spektrums des Detektionslichts (17) ausgewählt und detektiert wird, der den Einzelspektren zugeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass spektralen Scan bei der Detektion pro Pixel ein spektraler Intensitätsvektor I^Det detektiert wird, der sich als Linearkombination der Emmissions-Spektren s em / i, der im Objekt eingebrachten Farbstoffe zusammensetzt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Emmissions-Spektren s em / i, der im Objekt eingebrachten fluoreszenten Farbstoffe zu einer Detektions-Mischmatrix M_Det zusammengefasst werden.