DE10338657A1 - Vorrichtung zum Sortieren von Makromolekülen und Nanopartikeln mittels optischer Pinzette für analytische, synthetische und diagnostische Zwecke - Google Patents

Vorrichtung zum Sortieren von Makromolekülen und Nanopartikeln mittels optischer Pinzette für analytische, synthetische und diagnostische Zwecke Download PDF

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Abstract

Die Vorrichtung beinhaltet in verschiedene Richtungen weisende Matrices von gleichgerichteten, staffelförmig hintereinander angeordneten Mikrotubuli, die als Leitbahnen für den Motorprotein-(Kinesin-)gestützten vektoriellen Transport von Molekülen, Nanopartikeln oder Mikropartikeln (zusammen als Cargoes bezeichnet), die auch an Carrier gebunden sein können (der Komplex aus Cargo und Carrier wird im weiteren Last genannt) genutzt werden, die dazu dienen, Lasten in eine vorbestimmte Richtung zu lenken und über eingekoppelte Analysatoren bzw. einen Operator entsprechend ihren Eigenschaften mit Hilfe einer oder mehrerer optischer Pinzetten von einer Leitbahn (der Ausgangsleitbahn) auf eine andere Leitbahn (Kollektorleitbahn) zu übertragen. Die durch Kinesin diesen Leitbahnen entlang transportierten Lasten können ihren Eigenschaften entsprechend an einen definierten Ort gebracht, dort gesammelt und z. B. für analytische, synthetische oder diagnostische Zwecke genutzt werden.

Description

  • Stand der Technik: Kinesin ist ein Motorprotein, welches in nahezu allen eukaryotischen Zellen exprimiert wird. Es bindet an Mikrotubuli und bewegt sich in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) und Magnesiumionen in präzisen 8-nm Schritten richtungsorientiert entlang der 25 nm-dicken Mikrotubuli (Kojima et al. 1997), die bei diesem Vorgang die Funktion von Schienen bzw. Leitbahnen haben. Pro Schritt verbraucht jedes Kinesinmolekül jeweils ein Molekül ATP (Schnitzer und Block 1997). Bei der Bewegung werden in der Zelle Vesikel oder genetisches Material transportiert. Von jedem Kinesinmolekül wird pro Schritt eine Kraft von 4-8 pN generiert (Meyhöfer und Howard 1995; Svoboda and Block 1994).
  • Kinesin und Mikrotubuli realisieren auch in zellfreier Umgebung Bewegungs- und Transportprozesse (Vale et al. 1985; Böhm et al. 1997). Die Geschwindigkeit der Bewegung bzw. des Transportes liegt dabei zwischen 0,6 μm/s und 0,8 μm/s (Vale et al. 1985; von Massow et al. 1989).
  • Es wurden Bedingungen erarbeitet, unter denen Mikrotubuli über Kinesin-beschichtete Substrate (Glas, Silizium, Quarz, Gold) gleiten oder unter denen artifizielle Kinesin-beschichtete Lasten (z.B. Latex-, Glas- oder Goldpartikel; Böhm et al. 2001) entlang von immobilisierten Mikrotubuli transportiert werden. Die Bewegung der Mikrotubuli lässt sich mit Hilfe der Videogestützten differentiellen Interferenzkontrastmikroskopie (Weiss und Maile 1982) sichtbar machen.
  • Das für die Untersuchungen benötigte Motorprotein kann im Labormaßstab durch rekombinante Expression in unbegrenzten Mengen gewonnen werden (Navone et al. 1992).
  • Die gegenwärtigen Arbeiten mit Zielrichtung nanoaktuatorische Applikation des Kinesin-Motors konzentrieren sich darauf, den Transport auch außerhalb der Zelle in eine vorbestimmte Richtung zu lenken. Dazu wurden verschiedenartige Oberflächen genutzt, in die Kanäle eingearbeitet waren, deren Breite deutlich geringer als die Länge der als Leitbahnen genutzten Mikrotubuli (meist 10 bis 30 μm lang) war. Wenn die Kanaloberfläche mit Kinesin beschichtet ist, werden die relativ steifen, gleitenden Mikrotubuli gezwungen, in ihrer Bewe gung dem Verlauf des jeweiligen Kanals zu folgen (Dennis et al. 1999; Turner et al. 1995; Moorjani et al. 2003). In solchen Kanälen bewegen sich die Mikrotubuli auf parallelen Bahnen, jedoch ist ihre Bewegungsrichtung (vorwärts oder rückwärts) unbestimmt.
  • Hiratsuka et al. stellte 2001 eine Anordnung aus engen Kanälen vor, welche mit pfeilspitzenförmigen Erweiterungen (geometrische Gleichrichter) ausgestattet sind, die die Gleitbewegung von Mikrotubuli über Kinesin-beschichtete Oberflächen nur in eine Richtung zulässt. Für die Bewegung großer Lasten (z.B. μm-großer Carrier-Partikel) ist es zwingend erforderlich, Arrays von Mikrotubuli mit paralleler und isopolarer Anordnung zu nutzen. Es wurde gezeigt, dass sich solche Arrays bei der Einwirkung von Flüssigkeitsströmungen auf über Kinesin-beschichtete Oberflächen gleitende Mikrotubuli ausbilden (Stracke et al. 2000). Diese lassen sich immobilisieren und chemisch stabilisieren und sind geeignete Leitbahnen für den Kinesin-vermittelten Transport von verschiedenartigen Lasten aus Glas, Gold oder Latex (Böhm et al. 2001). Es wurde gezeigt, das es mit solchen Arrays gelingt, Lasten quasi eindimensional über Strecken im Millimeterbereich mit Geschwindigkeiten von 0,5 bis 1,0 μm/s zu einem bestimmten Zielort zu bringen (Böhm et al. 2001).
    •
  • Bislang methodologisch nicht gelöst ist das Problem, eine Last in einem zweidimensionalen Koordinatensystem zu ihrem Bestimmungsort zu transportieren und Lasten während des Kinesin-vermittelten Transports entlang mikrotubulärer Leitbahnen zu selektieren bzw. den Transport in vorzugebender Richtung zu definierten Zielpunkten, die durch das Ende der Mikrotubuli bzw. die Begrenzung der mikrotubulären Arrays definiert sind, zu realisieren.
  • In eigenen Untersuchungen wurde nun überraschenderweise gefunden, dass sich Lasten (Definition: s. Patentansprüche und Zusammenfassung) mit Hilfe von optischen Pinzetten von einem Mikrotubulus auf einen anderen bzw. von einem Array auf ein anderes umsetzen lassen, ohne dass das Kinesin seine Fähigkeit verliert, Bewegung bzw. Transport von Lasten zu ermöglichen.
  • Auf dieser Basis lassen sich damit Vorrichtungen zum Analysieren, Sortieren und Sammeln von Makromolekülen und Nano- bzw. Mikropartikeln mittels optischer Pinzette konstruieren, die u.a. für analytische, synthetische und diagnostische Zwecke eingesetzt werden können.
    •
  • Ausführungsbeispiel:
  • Es werden Arrays einer Größe (2,2 mm × 50 mm) (s. 1a und 1b) mit isopolar parallelisierten Mikrotubuli hergestellt und als Matrix für den richtungsorientierten Transport von Kinesin-beschichteten Partikeln (Lasten) eingesetzt.
  • Die Mikrotubuli werden aus gereinigtem Tubulin (präpariert aus Schweinehirn nach Shelanski et al. 1973) durch Zugabe von Guanosintriphosphat und Magnesiumionen bei 37° C assembliert und mit Taxol stabilisiert. Kinesin wird aus Schweinehirn isoliert und aufgereinigt (Kusnetsov und Gelfand 1986) bzw. als rekombinantes Protein nach Expression in E. coli gewonnen.
  • Das Kinesin bindet die Mikrotubuli an die Glasoberfläche der Kammer und bringt sie in Gegenwart von ATP zufallsorientiert zum Gleiten. Durch Anlegen einer Strömung von Pufferlösungen werden die Mikrotubuli isopolar parallelisiert und gestaffelt angeordnet. Das erreichte Ausmaß an Parallelisierung der Mikrotubuli, ihrer Orientierung wie auch die Positionierung der Leitbahnen wird mit Hilfe der Videokontrastmikroskopie kontrolliert und mit Hilfe einer Fixierung durch Glutaraldehyd stabilisiert. (1; zu weiteren Details s. Offenlegungsschrift DE 199 17 848 A1 sowie Stracke et al. 2000; Böhm et al. 2001).
  • Lasten (z.B. Latex-Beads einer Größe von 0,5 bis 2 μm werden auf der Kammerseite eingetragen (Applikationsfeld, s 1), der die Minus-Enden der Mikrotubuli zugekehrt sind, die als Leitbahnen für den Lasttransport dienen.
  • Diese Lasten werden unter optischer Kontrolle durch manuelles Schalten einer optischen Pinzette von einer mikrotubulären Leitbahn (Ausgangsleitbahn) auf eine andere Leitbahn (Kollektorleitbahn) umgesetzt (2)
  • Diese Umsetzung kann auch mittels eines Fluoreszenzsignals erfolgen, das vom Bead ausgeht und die optische Pinzette steuert (3).
  • Die Leistung der optischen Pinzette lässt sich so steuern, dass die Transportgeschwindigkeit der Last durch Kinesin vor und nach dem Sortier- und Umsetzungsvorgang von der Ausgangsleitbahn auf die Kollektorleitbahn im Rahmen der Genauigkeit videomikroskopischen Messungen mit einem Argus 20 Image Processor (Hamamatsu) gleich bleibt.
  • Die Lasten wandern auf der Ausgangsleitbahn (nicht umgesetzte Lasten) bzw. der Kollektorleitbahn (umgesetzte Lasten) getrennt voneinander in Richtung Sammelfeld 1 bzw. 2 und stehen dort zum Sammeln und Analysieren zur Verfügung.
  • Carrier (zum Beispiel Latexpartikel) können Gruppen für die Affinitätsbindung tragen und werden nach Affinitätsprinzipien (z.B. nach dem Biotin/Streptavidin Prinzip) mit verschiedenartigen Cargoes beladen. Diese Lasten können sowohl in der Cargo- als auch Carrier-Komponente fluochromiert (z.B. mit Rhodamin oder Fluorescein) werden. Sie sind damit durch ein System spezieller Detektoren erfassbar, mit deren Signal die optische Pinzette angesteuert und die Last einem Sortiervorgang unterzogen wird.
  • Mit einer solchen Anordnung gelingt es, neben Nano- und Mikropartikeln auch einzelne Makromoleküle zu sortieren, sie an bestimmten, definierten Orten zu sammeln und zu analysieren.
  • Es zeigen:
  • 1 Kammer zur Herstellung von Arrays (bestehend aus gestaffelten und isopolar orientierten Mikrotubuli), die als Leitbahnen für den Transport von Carrier-Beads mit unterschiedlichen Cargoes genutzt werden.
    • 1
    Support (Glasobjektträger)
    2
    Deckglas, welches mit 2 Streifen doppelseitig klebendem Bands am Objektträger befestigt ist. Zwischen beiden Streifen ist Spalt von 2,2 mm freigelassen mit räumlich getrennten Leitbahnen die im Funktionsbereich der optischen Pinzette eine Verbindung aufweisen. Diese Verbindung ist frei von Leitbahnen. Leitbahnen stellen isopolar ausgerichtete, gestaffelt angeordnete und am Objektträger immobilisierte Mikrotubuli dar. Im Arbeitszustand ist der Zugang zur Kollektorleitbahn B am Applikationsfeld verschlossen.
    3
    Applikationsfeld für Carrier-Beads mit unterschiedlichen Eigenschaften
    4
    Sammelfeld für zu selektierende Beads
    5
    Sammelfeld für nicht selektierte Beads
    6
    Funktionsbereich der optischen Pinzette für den Transfer von Lasten von der Ausgangsleitbahn A auf die Kollektorleitbahn B;
  • 2 Über Kinesin-beschichtete Glasobjektträger gleitende Mikrotubuli nach isopolarer Parallelisierung und Immobilisierung.
    Links: Darstellung mit Video-gestützter Interferenzkontrastmikroskopie.
    Rechts: Schematische Darstellung der parallelen und gestaffelten Anordnung;
  • 3 Selektion von Carrier-Beads mit definierten Eigenschaften und Umsetzung mittels optischer Pinzette auf eine neue Laufbahn zum Erreichen eines definierten neuen Kollektor-Zielpunktes
    • 1
    Generator der Carrier-Beads
    2
    Supportoberfläche
    3
    Detektor/Operator (visuelle Selektion)
    4
    Steuercomputer/Operator
    5
    optische Pinzette
    6
    Kollektor für Carrier alpha
    7
    Kollektor für Carrier beta
    A
    Leitbahn A
    B
    Leitbahn B
  • Dunkle Carrier-Beads: nicht zu selektierende Beads
  • Helle Carrier-Beads: zu selektierende Beads
  • Literatur:
    • Böhm K.J., Unger E.: Kinesin and nanoactuators. In: Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology (ed. H.S. Nalwa) American Scientific Publishers 2003 (in press)
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    • Böhm K.J., Steinmetzer P., Daniel A., Vater W., Baum M., Unger E.: Kinesin-driven microtubule motility in the presence of alkaline-earth metal ions. Indication for calcium iondependent motility. Cell Motility and Cytoskeleton 37, 226-231 (1997)
    • Dennis J.R., Howard J., Vogel V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnol. 10, 232-236 (1999)
    • Hiratsuka Y., Tada T., Oiwa K., Kanayama T., Uyeda T.Q.P. Controlling the direction of kinesin-driven microtubule movements along microlithographic tracks. Biophys. J. 81, 1555-1561 (2001)
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    • Hunt A.J., Gittes F., Howard J. The force exerted by a single kinesin molecule against a viscous load. Biophys. J. 67, 766-781 (1994)
    • Kojima N., Muto E., Higuchi H., Yanagida T.: Mechanics of single kinesin molecules measured by optical trapping nanometry. Biophys. J. 73 2012-2022 (1997)
    • Kuznetsov S.A., Gelfand V.I. Bovine brain kinesin is a microtubule-activated ATPase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8530-8534 (1986)
    • Limberis L., Stewart R.J. Toward kinesin-powered microdevices. Nanotechnol. 11, 47-51 (2000)
    • Meyhofer E., Howard J.: The force generated by a single kinesin molecule against an elastic load. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 574-578 (1995)
    • Moorjani S.G., Jia L., Jackson T.N., Hancock W.O.: Lithographically Patterned Channels Spatially Segregate Kinesin Motor Activity and Effectively Guide Microtubule Movements. Nano Lett. 3, 633-637 (2003)
    • Navone F., Niclas J., Hom-Booher N., Sparks L., Bernstein H.D., McCaffrey G., Vale R.D.: Cloning and expression of a human kinesin heavy chain gene: interaction of the COOH-terminal domain with cytoplasmic microtubules in transfected CV-1 cells. J. Cell Biol. 117, 1263-1275 (1992)
    • Shelanski M.L., Gaskin F., Cantor C.R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 765-768 (1973)
    • Svoboda K., Block S.M.: Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell 77 773-784 (1994)
    • Stracke R., Böhm K.J., Burgold J., Schacht H.J., Unger E. Physical and technical parameters determining the functioning of kinesin-based nanoactuators. Nanotechnol. 11, 52-56 (2000)
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    • Vale R.D., Reese T.S., Sheetz M.P.: Identification of a novel force-generating protein, kinesin, involved in microtubule-based motility. Cell 42, 39-50 (1985)
    • Weiss, D.G., Maile, W.: Principles, practice, and applications of video-enhanced contrast microscopy. In Shotton, D.M., (ed.) Electronic Light Microscopy. New York. Wiley-Liss, pp 105-140 (1992)
    • von Massow A., Mandelkow E.M., Mandelkow E.: Interaction between kinesin, microtubules, and microtubule-associated protein 2. Cell Motil Cytoskeleton 14, 562-571 (1989)

Claims (13)

  1. Vorrichtung zum Sortieren (Sorter) von Molekülen oder Nanopartikeln oder Mikropartikeln (im weiteren Cargoes genannt), die gerichtet bewegt oder transportiert werden.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Cargoes für analytische, synthetische und diagnostische Zwecke sortiert und gesammelt werden können.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, bei der die Cargoes oder Carrier, an die Cargoes gebunden sind, spezifisch oder unspezifisch an Motorproteine (auch mechano-chemische Proteine genannt) gekoppelt werden, die sie an Filamenten und Tubuli entlang transportieren. (Cargoes sowie Carrier mit gebundenen Cargoes werden zusammen als Lasten bezeichnet, sie können unterschiedliche Eigenschaften aufweisen und werden entsprechend als Lasten mit Merkmalen α, β, γ, δ usw. unterschieden).
  4. Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der die Lasten durch zytoskelettale Motorproteine entlang von Filamenten oder Mikrotubuli bewegt oder transportiert werden.
  5. Vorrichtung nach Anspruch 4, bei der die Lasten durch Motorproteine der Kinesinfamilie (im weiteren Kinesine genannt) entlang von Mikrotubuli und anderen Tubulinassemblaten bewegt oder transportiert werden.
  6. Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der zwei oder mehr Mikrotubuli eine jeweils bekannte Position und Orientierung aufweisen und damit die Richtung der Bewegung oder des Transports der Lasten durch die Orientierung des jeweiligen Mikrotubulus sowie des jeweiligen Kinesins vorgeben.
  7. Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der jeder einzelne Mikrotubulus durch eine Gruppe isopolar parallelisierter und gestaffelt angeordneter Mikrotubuli ersetzt werden kann. (s. 1) (Mikrotubuli nach Anspruch 6 oder Gruppen von Mikrotubuli nach Anspruch 7 werden im weiteren als Leitbahnen bezeichnet).
  8. Vorrichtung nach Anspruch 1, 5 und 7, bei der das Sortieren von Lasten mit Hilfe mindestens einer Optische Pinzette vorgenommen wird. Das Sortieren erfolgt durch Umsetzen der Lasten je nach ihrer Eigenart auf unterschiedliche Leitbahnen (s. 2).
  9. Vorrichtung nach Anspruch 8, bei der die optische Pinzette von einem Signal, das von der Last ausgeht oder von der Last beeinflusst wird, zum Umsetzen der Last geschaltet wird.
  10. Vorrichtung nach Anspruch 9, bei der das Signal ein optisches Signal ist, das von einem Analysator oder Operator erfasst wird, der die optische Pinzette schaltet und steuert.
  11. Vorrichtung nach Anspruch 9 und 10, bei der die optische Pinzette im eingeschalteten Zustand jeweils eine Last von einer Ausgangsleitbahn (Leitbahn, auf der die unsortierten Lasten bewegt oder transportiert werden) zu einer Kollektorleitbahn (Leitbahn, auf der die aussortierten Lasten bewegt oder transportiert werden) oder über eine Kollektorleitbahn transportiert und die Last dort absetzt. Nach diesem Transportvorgang kehrt die optische Pinzette in ihre Ausgangsposition zurück und kann einen nächsten Transportvorgang beginnen.
  12. Vorrichtung nach Anspruch 11, bei der die umgesetzten Lasten auf der Kollektorleitbahn auch in Bereiche bewegt werden, in denen sie gesammelt werden oder funktionell aktiv werden, die außerhalb des Funktionsbereiches der optischen Pinzette liegen oder die Komponenten enthalten, die lichtsensitiv sind. Solche Bereiche können z.B. Bereiche sein, die optisch nicht zugänglich sind.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 11, und 12 bei der von einer oder mehreren optischen Pinzetten mehrere Kollektorleitbahnen angesteuert werden können, wobei sich der Sortiervorgang nach einem oder mehreren Sortierkriterien richtet, die sich nach den Eigenschaften der Last bestimmen. Unterschieden werden: Ausgangsleitbahn A: Leitbahn, auf der sich Lasten vor dem Sortiervorgang bewegen sowie Lasten mit dem Merkmal α, die von der Optischen Pinzette nicht umgesetzt werden. Kollektorleitbahn B: Leitbahn, auf der sich die von der optische Pinzette bzw. von den optischen Pinzetten umgesetzten Lasten mit dem Merkmal β bewegen. Kollektorleitbahn C: Leitbahn, auf der sich die von der optischen Pinzette bzw. den optischen Pinzetten umgesetzten Lasten mit dem Merkmal γ bewegen und so weiter)
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