DE10336511A1

DE10336511A1 - Verfahren zur Erkennung von schwerer Sepsis

Info

Publication number: DE10336511A1
Application number: DE2003136511
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Rußwurm; Hans-Peter Dr. Deigner; Konrad Prof. Reinhart
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2003-08-08
Publication date: 2005-02-24

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis unter Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuresequenzen oder davon abgeleiteten Peptidsequenzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Genaktivitätsmarker für die Diagnose und Therapieoptimierung von schwerer Sepsis. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erkennung von schwerer Sepsis ebenso wie zur entsprechenden Therapieoptimierung bei schwerer Sepsis.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 26, sowie die Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuresequenzen oder davon abgeleiteten Peptidsequenzen gemäß Anspruch 49.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Genaktivitätsmarker für die Diagnose und Therapieoptimierung von schwerer Sepsis. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erkennung von schwerer Sepsis ebenso wie zur entsprechenden Therapieoptimierung bei schwerer Sepsis.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Diagnosemöglichkeiten, die sich aus experimentell abgesicherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Änderungen der Genaktivitäten (Transkription und nachfolgende Proteinexpression) bei Patienten mit schwerer Sepsis ableiten lassen.

Trotz großer Fortschritte im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Infektionserkrankungen bilden Sepsis und konsekutives Organfunktionsstörungen auch heute noch die Haupttodesursache auf nichtkardiologischen Intensivstationen [1–3].

Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsisbegriffs durchgesetzt [4]. Entsprechend dieser Kriterien [4] werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom" (SIRS), „sepsis", „severe sepsis" und „septic shock" unterschieden. Als SIRS (in diesem Patent als „sepsisähnlicher akuter entzündlicher Zustand übersetzt) wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen infektiösen oder nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber > 38°C oder Hypothermie < 36°C, eine Leukozytose > 12G/l oder eine Leukopenie < 4G/l bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe > 20 Atemzüge/min oder ein PaCO2 < 4,3 kPa. Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine sepsisinduzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20% aller Sepsispatienten nachgewiesen.

Die klinische Anwendung von Katecholaminen bei der Behandlung von Patienten mit einer schweren Sepsis ist stark subjektiv geprägt. Während viele Ärzte auf den Abfall des Blutdruckes mit der Verabreichung großer Mengen von Infusionslösungen reagieren und so den Einsatz von Katecholaminen vermeiden, gibt es auch viele Ärzte, welche ein solches Vorgehen ablehnen und bei gleicher klinischer Schwere der Erkrankung viel frühzeitiger Katecholamine verabreichen und diese auch noch höher dosieren. Konsequenz dessen ist, dass in der täglichen Praxis Patienten mit gleicher klinischer Schwere nur auf Grund rein subjektiver Gründe in die Gruppe „severe sepsis" oder „septic shock" [4] eingeordnet werden können. Vor diesem Hintergrund hat es sich im internationalen Schrifttum durchgesetzt, Patienten mit den Schweregraden „severe sepsis" und „septic shock" [4] in einer Gruppe zusammenzufassen. Der in dieser Patentschrift benutzte Begriff „schwere Sepsis" wird deshalb entsprechend der o.g. Konsensuskonferenzdefinition auf Patienten mit Sepsis plus zusätzlichem Nachweis von Organfunktionsstörungen angewendet und umfasst damit alle Patienten der Gruppen „severe sepsis" und „septic shock" entsprechend [4] Die Sterblichkeit der Sepsis beträgt ca. 40% und steigt bei Entwicklung einer schweren Sepsis auf 70–80% an [5,6]. Der Morbiditäts- und letalitätsbeitrag von Sepsis und schwerer Sepsis ist von fachübergreifender Bedeutung. Im Vergleich dazu stieg die Häufigkeit der Erkranungen kontinuierlich an (z.B. zwischen 1979 und 1987 um 139% von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Dadurch werden in zunehmenden Maße die Behandlungeerfolge der fortgeschrittensten oder experimentellen Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie) gefährdet, da diesen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Sepsisrisikos immanent ist. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden. Von namhaften Autoren wird deshalb schon lange kritisiert, dass zu Lasten einer verbesserten Sepsisdiagnose in der vergangenen Dekade zuviel Energie und finanzielle Ressourcen für die Suche nach Sepsistherapeutika aufgewendet wurden.

Sepsis ist ein Ergebnis von komplexen und stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrundeliegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, daß die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [9].

Daher ist ein dringender Bedarf für innovative diagnostische Mittel entstanden, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollen, Patienten mit Sepsis frühzeitig zu diagnostizieren, die Schwere einer Sepsis auf molekularer Ebene messbar zu machen und im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten, und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.

Technologische Fortschritte, insbesondere die Entwicklung der Mikroarray-Technologie, versetzen den Fachmann nun in die Lage, 10 000 oder mehr Gene und deren Genprodukte gleichzeitig zu vergleichen. Die Anwendung solcher Mikroarray-Technologien kann nun Hinweise auf den Status von Gesundheit, Regulationsmechanismen, biochemischer Wechselwirkungen und Signalisierungsnetzwerken geben. Das Verbessern des Verständnisses darüber, wie ein Organismus auf Infektionen reagiert, sollte die Entwicklung von verstärkten Erkennungs-, Diagnose- und Behandlungsmodalitäten für Sepsis-Erkrankungen erleichtern.

Mikroarrays stammen vom „Southern blotting" [10] ab, was die erste Herangehensweise darstellt, DNA-Moleküle in einer räumlich ansprechbaren Art und Weise auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die ersten Mikroarrays bestanden aus DNA-Fragmenten, oft mit unbekannter Sequenz, und wurden auf eine poröse Membran (normalerweise Nylon) punktweise aufgebracht. Routinegemäß wurden cDNA, genomische DNA oder Plasmid-Bilbliotheken verwendet, und das hybridisierte Material wurde mit einer radioaktiven Gruppe markiert [11–13].

Kürzlich hat es die Verwendung von Glas als Substrat und Fluoreszenz zur Detektion zusammen mit der Entwicklung neuer Technologien für die Synthese und für das Aufbringen der Nukleinsäuren in sehr hohen Dichten erlaubt, die Nukleinsäurearrays zu miniaturisieren bei gleichzeitiger Erhöhung des experimentellen Durchsatzes und des Informationsgehaltes [14–16].

Weiterhin ist aus WO 03/002763 bekannt, dass Mikroarrays grundsätzlich für die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen verwendet werden können.

Eine Begründung für die Anwendbarkeit der Mikroarray-Technologie wurde zunächst durch klinische Untersuchungen auf dem Gebiet der Krebsforschung geliefert. Hier haben Expressionsprofile ihre Nützlichkeit bei der Identifizierung von Aktivitäten einzelner Gene oder Gengruppen gezeigt, die mit bestimmten klinischen Phänotypen korrelieren [17]. Durch die Analyse vieler Proben, die von Individuen mit oder ohne akute Leukämie oder diffuse Lymphome großer B-Zellen stammten, wurden Genexpressionsmarker (RNA) gefunden und auf die Klassifizierung dieser Krebsarten angewandt [17,18]. Golub et al. haben herausgefunden, daß verläßliche Vorhersagen nicht aufgrund von irgendeinem einzelnen Gen gemacht werden können, aber daß Vorhersagen, die auf den Expressionsspiegeln von 53 Genen (ausgewählt aus über 6000 Genen, die auf den Arrays vertreten waren) basieren, sehr genau sind [17].

Alisadeh et al. [18] untersuchten große B-Zell Lymphome (DLBCL). Die Autoren erarbeiteten Expressionsprofile mit einem „Lymphochip", einem Mikroarray, der 18 000 Klone komplementärer DNA trug und entwickelt worden war, um Gene zu überwachen, die in normale und abnormale Lymphozytenentwicklung involviert sind. Unter Verwendung von Cluster-Analyse waren sie in der Lage, DILBCL in zwei Kategorien einzuteilen, welche starke Unterschiede bezüglich der Überlebenschancen der Patienten aufzeigten. Die Genexpressionsprofile dieser Untergruppen entsprachen zwei bedeutsamer Stadien der B-Zelldifferenzierung.

Besonders wertvoll hat sich die Bestimmung von Genexpressionsprofilen zur differentialdiagnostischen Unterscheidung von Krankheitserscheinungen, die auf systemische mikrobielle Infektionen zurückzuführen sind, von anderen Krankheitserscheinungen nichtinfektiöser Ätiologie erwiesen, die aufgrund ihres klinischen Erscheinungsbildes auf eine Sepsis hindeuten könnten, jedoch in Wirklichkeit nicht auf eine systemische mikrobielle Infektion zurückzuführen sind, z.B. von Krankheitserscheinungen, die auf nicht-infektiöse Entzündungen einzelner Organe zurückzuführen sind (20, 21, 22). Die Messung von Genexpressionprofilen zur Diagnose einer schweren Sepsis aus Körperflüssigkeiten wurde noch nicht beschrieben.

Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, daß vor der Diagnose von schwerer Sepsis in biologischen Proben eines Individuums sich von normalen Werten unterscheidende RNA-Spiegel, bzw. sich davon ableitbare Peptid- und Teilpeptid-Spiegel in einem Serum oder Plasma eines Patienten, bei dem ein Sepsisrisiko besteht bzw. bei dem sepsistypische Krankheitserscheinungen festgestellt werden, feststellbar sind.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Erkennung, die Beurteilung des Schweregrads und/oder die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung von Sepsis und schweren Infektionen, insbesondere sepsisähnlichen systemischen Infektionen, ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 oder 26 gelöst.

Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Verwendungsmöglichkeit von Markern in einem Verfahren gemäß Anspruch 1–48 zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung gemäß Anspruch 49 gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit eines Individuums die Aktivität eines oder mehrerer Markergene bestimmt und aus der festgestellten Anwesenheit und/oder Menge des bestimmten Genprodukts schwere Sepsis und/oder den Erfolg einer therapeutischen Behandlung ableiten kann.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis, dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgende Schritte umfaßt:

a) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;
b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker;
c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen;
d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für schwerer Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist;
e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA;
f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für schwerer Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von schwerer Sepsis und/oder systemischen Entzündungen und/oder Infektionen eingesetzt wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für schwerer Sepsis spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 130, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.

Diese Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 130 sind durch den Umfang der vorliegenden Erfindung mit umfaßt und sind dem angefügten 67-seitigen, 130 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen offenbart. Dieses Sequenzprotokoll beinhaltet zudem eine Zuordnung der einzelnen Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 130 zu deren GenBank Accession Nr. (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden markiert werden. Für diese Ausführungsform finden selbstkomplementäre Oligonukleotide, so genannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so daß sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haarnadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenzsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die als cDNA von den in Anspruch 10 aufgelisteten Genen ersetzt wird durch synthetische Analoga, sowie Peptidonukleinsäuren.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die synthetische Analoga der Gene 5–100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Ep, ³³P oder ³H verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophobische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

a) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;
b) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;
c) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für schwerer Sepsis spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;
d) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für schwerer Sepsis spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;
e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide;
f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für schwerer Sepsis spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunoassay ausgebildet ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Gewebe- oder Zellproben gegebenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für schwerer Sepsis spezifische Peptid ein Expressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 130, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker und/oder quantum dots oder ein elektrische messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels Adsorption an das Trägermaterial immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunoassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.

Eine weiter Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für schwerer Sepsis spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von Sepsis, sepsisähnlichen systemischen entzündlichen Zuständen und sepsisähnlichen systemischen Infektionen.

Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.

Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Weiterhin werden im Sinne der Erfindung alle von den Markergenen kodierten Proteine, Peptide bzw. Partialsequenzen oder synthetische Peptidomimetica verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.

Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar. Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten des Menschen verstanden.

Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Messung der differentiellen Genexpression bei schwerer Sepsis. Hierzu wird die RNA aus dem Vollblut von entsprechenden Patienten und eine Kontrollprobe eines gesunden Probanden oder eines nicht an schwerer Sepsis erkrankten Patienten isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit ³²P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle und/oder Detektionssignale eingesetzt werden. Entsprechende Moleküle und/oder Verfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.

Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten cDNA-Molekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten cDNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß Anspruch 10 dieser Erfindung für die Messung von schwerer Sepsis dar.

Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschluss durch geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen der Patientenprobe und der Kontrolle bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich wie in den nachstehend dargestellten Experimenten Rückschlüsse auf schwere Sepsis ziehen.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitende Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, daß Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden, und/oder für die Bestimmung des Ansprechens auf eine spezialisierte Therapie und/oder auf die Festlegung des Therapieendes im Sinne eines „drug monitoring" bei Patienten mit schwerer Sepsis. Hierzu wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Proben-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen mit der Kontrollprobe markiert und mit ausgewählten Genen gemäß dem Anspruch 10, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den jeweiligen Expressionsverhältnissen läßt sich somit beurteilen, welche Wahrscheinlichekit besteht, daß Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden und/oder ob die begonnene Therapie wirksam ist und/oder wie lange die Patienten noch entsprechend therapiert werden müssen und/oder ob der maximale Therapieeffekt mit der verwendeten Dosis und Dauer schon erreicht worden ist.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung des Bindungsgrades von Proteinen, beispielsweise monoklonaler Antikörper, mittels der Verwendung von Immunoassays, Protein- oder Peptidarrays oder Präpitationsassays. Durch die Bestimmung der Konzentration der von den Sequenzen der in Anwendungsbeispiel 1 aufgeführten Nukleinsäuren entsprechenden Proteine oder Peptide kann auf ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer Sepsis oder sepsisähnlicher Zustände geschlossen werden. Weiterhin ermöglicht diese Verfahrenweise die differentialdiagnostische Erkennung bei Patienten mit schwerer Sepsis.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung des Ausführungsbeispiels.

Ausführungsbeispiel 1:
Untersuchungen zur differentiellen Genexpression bei Patienten mit schwerer Sepsis.
Für die Messung der differentiellen Genexpression bei schwerer Sepsis wurden Untersuchungen von Vollblutproben von Patienten, welche auf einer operativen Intensivstation behandelt worden, durchgeführt.
Als Kontrollproben dienten Vollblutproben von Patienten nach einer unkomplizierten neurochirurgischen Operation, welche auf der gleichen Intensivstation behandelt wurden. Keiner dieser Patienten entwicklete während seiner gesamten stationären Behandlung eine Infektion und/oder wies klinische Zeichen einer generalisierten Entzündungsreaktion (definiert entsprechend SIRS-Kriterien [4]) auf.
Zusätzlich wurden Vollblutproben von sechs männlichen und zwei weiblichen Patienten abgenommen (Patientenproben). Jeder dieser Patienten entwickelte im Zeitraum von 24 Stunden vor Vollblutentnahme neu eine schwere Sepsis mit Organfunktionsstörung. Ausgewählte Charakteristika der Patienten mit schwerer Sepsis sind in Tabelle 1 dargestellt. Dabei werden Angaben zum Alter, Geschlecht, der Ursache der schwerern Sepsis (siehe Diagnose) sowie klinischer Schwere, gemessen anhand der im klinischen Schrifttum gut belegten APACHE-II- und SOFA-Scores (jeweils in Punkte), gemacht. Gleichfalls sind die Plasmaproteinspiegel von Procalcitonin (PCT), einem neuartigen Sepsismarker, und der individuelle Überlebensstatus angegeben.
Tabelle 1: Daten der Patientengruppe
Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen des PAXGene Blood RNA Kit gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert. Im Anschluss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit Aminoallyl-dUTP und Succinimidylester von der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 (Amersham) markiert und hydrolisiert.
Für die Hybridisierung wurden die Microarrays (Lab-Arraytor human 500-1 cDNA) der Firma SIRS-Lab GmbH verwendet. Diese Microarrays sind mit 340 humanen cDNA-Molekülen bestückt. Die 340 humanen cDNA-Moleküle sind auf jedem Microarray 3-fach in drei Subarrays immobilisiert.
Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit den Microarrays entsprechend den Anweisungen des Herstellers hybridisiert und im Anschluss gewaschen. Die Fluoreszenzsignale der hybridisierten Moleküle wurden mittels eines Auslesegerätes (AXON 4000B) gemessen.
Auswertung
Die Auswertung eines Experiments erfolgte aufgrund von eingescannten Bildern der Mikroarrays nach der Hybridisierung. Der mittlere Intensitätswert der detektierten Spots wurde als der gemessene Expressionswert des zugehörigen Gens definiert. In einer Bildanalyse wurden Spots automatisch erkannt und ihre Homogenität überprüft. Die Analyse wurde manuell kontrolliert. Die ermittelten Signale beinhalteten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht wurden. Die Definition des Hintergrundbereichs ermöglichte eine optimale Unterscheidung zwischen Spots und der Chipoberfläche, welche ebenfalls Farbeffekte aufwies. In der Auswertung der Mikroarrays wurden leere Spots als Hintergrund gewählt. Der mittlere Expressionswert ausgewählter leeren Spots innerhalb eines Blocks (von 14 mal 14 Spots) wurde von Expressionswerten der Gene-Spots (im entsprechenden Block) subtrahiert.
Punktuelle Signale, die nicht durch Bindung von Nukleinsäuren sondern durch Staubpartikel oder sonstige Störungen auf dem Filter verursacht wurden, konnten von realen Spots durch ihre Unregelmäßigkeit der Form unterschieden werden und wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
Um die Werte zwischen den 3 Subarrays und zwischen verschiedenen Microarrays miteinander vergleichbar zu machen, wurde anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Microarray wurde als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Für die Berechnung der mittleren Expression pro Gen wurden die zwei (aus drei) Wiederholungen gewählt, welche am nächsten zueinander lagen.
Aus den Signalintensitäten wurden mittels der Software AIDA Array Evaluation die Expressionsverhältnisse zwischen Kontroll- und Patientenproben Probe berechnet. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellte das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse waren die Gene, die in den Patientenproben gegenüber Kontrollproben am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass 41 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren. Weiterhin wird aus Tabelle 3 deutlich, dass 89 Gene der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Gene mit dem Auftreten einer schweren Sepsis korrelieren. Auch korrelieren diese Ergebnisse mit der klinischen Eingruppierung entsprechend [4] sowie PCT-Konzentrationen der Patienten, welche typisch sind für das Auftreten einer schweren Sepsis [23]. Somit stellen die aufgeführten Genaktivitäten der Gene Marker für eine Diagnose einer schweren Sepsis dar.
Tabelle 2: Expressionverhältnis überexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe
Tabelle 3: Expressionverhältnis unterrexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe
Diese charakteristischen Veränderungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 26 ausnutzbar.
Die in den Tabellen 2 und 3 aufgeführten GenBank Accession Nummern (Internet-Zugang Über http://www.ncbi.nlm.nih.gov!) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 67-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 130) zugeordnet. Dieses Sequenzprotokoll ist Teil der vorliegenden Erfindung.
Referenzen

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Claims

Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt: a) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe; b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für schwere Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen; d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für schwere Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für schwere Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß nicht veränderte Gene aus der Proben- und/oder Kontroll-RNA als Bezugsgene für die Quantifizierung genutzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des klinischen Verlaufs, zur individuellen Risikoabschätzung für Patienten, zur Abschätzung des wahrscheinlichen Ansprechens auf eine spezifische Behandlung sowie zur post mortem Diagnose von schwerer Sepsis eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, daß das für schwere Sepsis spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ- ID No. 130, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet, daß die als cDNA von den in Anspruch 6 aufgelisteten Genen ersetzt wird durch synthetische Analoga, sowie Peptidonukleinsäuren.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet daß die synthetische Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Ep, ³³P oder ³H verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden eine Markierung tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophobe Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt: a) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe; b) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für schwere Sepsis spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet; d) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für schwere Sepsis spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für schwere Sepsis spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunoassay ausgebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von schwerer Sepsis und/oder systemischen Entzündungen und/oder Infektionen eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 32 dadurch gekennzeichnet, daß das für schwere Sepsis spezifische Peptid ein Exdpressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 130, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 37 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹⁵⁵Ep, ³³P oder ³H verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass die als Sonden Peptide verwendet werden, welche mit Antikörpern markiert sind und eine Signaländerung bei Bindung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 43 dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophobische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 47 dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunoassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.
Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für schwere Sepsis spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von schwerer Sepsis.