DE10324799A1

DE10324799A1 - Ligandenbindedomäne des Ecdyson-Rezeptors

Info

Publication number: DE10324799A1
Application number: DE2003124799
Authority: DE
Inventors: Graham Dr. Holmwood; Michael Prof. Dr. Schindler; Klaus-Günther Dr. Tietjen; Dino Dr. Moras; Isabelle Dr. Billas-Massobrio; Natacha Dr. Rochel-Guiberteau; Thomas Dr. Iwema
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 2003-06-02
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2004-12-23

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft den Ecdyson-Rezeptor und insbesondere die räumliche Struktur der Ligandenbindedomäne des Ecdyson-Rezeptors aus dem Tabakschwärmer Heliothis virescens sowie Liganden des Ecdyson-Rezeptors, die als Insektizide oder als künstliche Agonisten oder Antagonisten Verwendung finden können. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der hier beschriebenen Kristallstruktur des Ecdyson-Rezeptors aus dem Tabakschwärmer Heliothis virescens zur Erzeugung von Proteinmodellen verwandter Rezeptoren und die Identifizierung von Agonisten und Antagonisten verwandter Proteine.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Ecdyson-Rezeptor und insbesondere die räumliche Struktur der Ligandenbindedomäne des Ecdyson-Rezeptors aus dem Tabakschwärmer Heliothis virescens, sowie Liganden des Ecdyson-Rezeptors, die als Insektizide oder als künstliche Agonisten oder Antagonisten Verwendung finden können. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der hier beschriebenen Kristallstruktur des Ecdyson-Rezeptors aus dem Tabakschwärmer Heliothis virescens zur Erzeugung von Proteinmodellen verwandter Rezeptoren und die Identifizierung von Agonisten und Antagonisten verwandter Proteine.

Insekten und Spinnentiere steuern ihre Entwicklung von der Larve zum adulten Tier durch das Entwicklungshormon Ecdyson (Thummel, 1995). Das Ecdyson wirkt dabei über den sogenannten Ecdyson-Rezeptor (im Folgenden als EcR bezeichnet), der zur Familie der in allen Tieren vorkommenden Kernrezeptoren (Nuclear Receptors, NR) gehört. Diese Kernrezeptoren befinden sich im Zellinneren. Sie binden als Homo- oder Heterodimere an responsive Elemente auf der DNA und regulieren die Expression von Genen. Um aktiv zu sein, müssen sie spezielle kleine, oft hydrophobe Liganden (z.B. Steroide, Retinoide, Vitamin D) binden. Kernrezeptoren besitzen eine modulare Struktur mit funktionellen Domänen für DNA-Bindung, Ligandenbindung und Transaktivierung. Während die DNA-Bindedomäne der Kernrezeptoren hoch konserviert ist, zeigen die Ligandenbindedomänen nur moderate Homologien untereinander. Die räumlichen Strukturen verschiedener Ligandenbindedomänen wurden bereits bestimmt (Zusammenfassung in Moras & Gronemeyer, 1998) und geben einen Einblick in den der Genexpressionsaktivierung zugrunde liegenden Mechanismus, der starke Konformationsänderungen der Ligandenbindedomänen beinhaltet. Die Bindung eines Agonisten an einen Kernrezeptor ermöglicht darauffolgend die Bindung von sogenannten Co-Aktivatorproteinen und die gleichzeitige Verdrängung von Co-Repressorproteinen. Die Rezeptoren binden an bestimmte DNA-Abschnitte und die gebundenen Co-Aktivatorproteine leiten die Expression der jeweiligen in der DNA-Sequenz folgenden Gene ein. Die Bindung von Antagonisten verhindert dagegen die Wechselwirkung mit dem Co-Aktivator und somit die Genexpression.

Der EcR ist aus zwei verschiedenen Untereinheiten, dem eigentlichen EcR-Protein und dem sogenannten Ultraspiracle Protein (USP), zusammengesetzt (Oro et al., 1990; Yao et al., 1993; Hall & Thummel, 1998; Lezzi et al., 1999). Das Hormon Ecdyson (in seiner aktiven Form 20-Hydroxyecdyson) ist seit langem als Ligand für die EcR-Untereinheit bekannt. Die Entwicklung der Insekten wird aber nicht nur über das Steroidhormon Ecdyson, sondern auch über dessen Gegenspieler Juvenilhormon, ein Isoprenoid, gesteuert (Thummel, 1995; Segraves, 1994; Henrich & Brown, 1995; Truman, 1996). Es wurde lange vermutet, dass USP einen Rezeptor für Juvenilhormone darstellt, doch wurde dafür erst vor kurzem der experimentelle Beleg gefunden (Xu et al., 2002). Auch die vor kurzem gelöste Kristallstruktur der Ligandenbindedomäne des USP spricht dafür, dass USP ein Juvenilhormonrezeptor ist ( EP 1 176 152 A2 ).

Da das Ecdyson spezifisch nur in Insekten und Spinnentieren vorkommt, und für diese eine essentielle Rolle spielt, stellt der EcR ein wichtiges Target für Insektizide dar. Wird er außerhalb des in der Insektenentwicklung dafür vorgesehenen zeitlichen Fensters aktiviert, so führt dies zu schweren Störungen bis hin zum Absterben des Insekts. Auf diesem Mechanismus beruhen die schon bekannten insektiziden Ecdyson-Agonisten, bei denen es sich um nicht-steroidale Liganden der EcR-Untereinheit handelt (Mikitani, 1996; Dhadialla et al., 1998). Alle bisher bekannten Insektizide mit diesem Wirkungsmechanismus wirken allerdings spezifisch nur auf Lepidopteren (Sundaram et al., 1998). Die Kenntnis der räumlichen Struktur der Ligandenbindedomäne des EcR würde das Verständnis der Wechselwirkungen der Liganden mit dem Protein ermöglichen, und dadurch nicht nur die Konzeption von neuartigen Strukturen mit insektizider Wirkung auf Lepidopteren ermöglichen, sondern auch Erweiterung der Wirkung auf andere Insekten und Spinnentiere. Für das vollständige Verständnis der Wirkungsweise der Insektizide ist darüberhinaus die Kennt nis des heterodimeren Komplexes der Ligandenbindedomänen von EcR und USP notwendig.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die räumliche Struktur der Ligandenbindedomäne (im Folgenden als LBD bezeichnet) des EcR und insbesondere die räumliche Struktur der Ligandenbindedomänen des EcR/USP-Heterodimers zur Verfügung zu stellen, sowie die Ligandenbindenische des EcR-Proteins und die Wechselwirkungen der EcR-Untereinheit mit der USP-Untereinheit zu beschreiben.

Die Aufgabe wurde gelöst durch die Bereitstellung der EcR-LBD/USP-LBD in kristalliner Form mit gebundenem Steroidhormon Ponasteron A bzw. mit gebundenem nicht-steroidalem Insektizid BYI06830 und die erfolgreiche Durchführung der Röntgenstrukturanalyse der so erhaltenen Kristalle.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die EcR-LBD in kristalliner Form.

Insbesondere handelt es sich bei der erfindungsgemäßen kristallinen EcR-LBD um die LBD des EcR von Heliothis virescens.

Bei den erfindungsgemäßen kristallinen LBDs handelt es sich bevorzugt um die EcR-LBD des EcR/USP-Komplexes von Heliothis virescens.

Besonders bevorzugt weist die erfindungsgemäße LBD die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 (hvEcR) auf oder umfasst diese Sequenz.

Bei den erfindungsgemäßen kristallinen LBDs handelt es sich bevorzugt auch um eine mutierte Form der EcR-LBD, insbesondere im Komplex mit der USP-LBD von Heliothis virescens. Bevorzugt weist die erfindungsgemäße EcR-LBD dabei die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 (hvEcRmut) auf.

Die erfindungsgemäße EcR-LBD/USP-LBD mit gebundenem Steroidhormon Ponasteron A weist vorzugsweise die in Tabelle 1 definierten Strukturkoordinaten auf. Die dreidimensionale Struktur wurde mit Hilfe von Proteinkristallen, die einer Röntgenstrukturanalyse zugänglich sind, mittels molekularem Ersatz gelöst und bei einer Auflösung von 2,9 Å vollständig verfeinert. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die anhand dieser Strukturkoordinaten ermittelbare dreidimensionale Struktur des EcR-LBD/USP-LBD/Ponasteron A-Komplexes.

Die erfindungsgemäße EcR-LBD/USP-LBD mit gebundenem nicht-steroidalen Insektizid BYI06830 weist vorzugsweise die in Tabelle 2 definierten Strukturkoordinaten auf. Die dreidimensionale Struktur wurde mit Hilfe von Proteinkristallen, die einer Röntgenstrukturanalyse zugänglich sind, mittels molekularem Ersatz gelöst und und bei einer Auflösung von 3,0 Å vollständig verfeinert. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die anhand dieser Strukturkoordinaten ermittelbare dreidimensionale Struktur des EcR-LBD/USP-LBD/BYI06830-Komplexes.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein EcR-LBD/LTSP-LBD/Ponasteron A-Komplex, der eine Ligandenbindenische umfasst, welche durch die folgenden Aminosäuren im 4,5 Å Abstand vom gebundenen Liganden definiert ist: Hydrophobe Aminosäuren: Pro³¹¹, Ile³³⁹ Met³⁴², Met³⁸⁰, Val³⁸⁴, Leu³⁹⁶, Phe³⁹⁷, Ala³⁹⁷, Met⁴¹³, Val⁴¹⁶, Leu⁴²⁰; polare Aminosäuren: Gln³¹⁰, Thr³⁴⁰, Thr³⁴³, Thr³⁴⁶, Tyr⁴⁰⁸, Asn⁵⁰⁴, Trp⁵²⁶; geladene oder potentiell geladene Aminosäuren: Glu³⁰⁹, Arg³⁸³, Arg³⁸⁷. Die Sequenz und Positionsangaben beziehen sich auf SEQ ID NO: 1 (hvEcR) und 3 (hvEcRmut), wie sie unter der Überschrift "Erläuterungen zum Sequenzprotokoll" dargestellt sind.

Weiterhin ist ein EcR-LBD/USP-LBD/BYI06830-Komplex Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der eine Ligandenbindenische umfasst, welche durch die folgenden Aminosäuren im 4,5 Å Abstand vom gebundenen Liganden definiert ist: Hydrophobe Aminosäuren: Ile³³⁹, Met³⁸⁰, Met³⁸¹, Val³⁸⁴, Met⁴¹³, Val⁴¹⁶, Leu⁴²⁰, Leu⁵⁰⁰, Met⁵⁰⁷, Leu⁵¹¹; polare Aminosäuren: Thr³⁴⁰, Thr³⁴³, Ser³⁷⁷, Tyr⁴⁰³, Gln⁵⁰³, Asn⁵⁰⁴, Trp⁵²⁶; geladene oder potentiell geladene Aminosäuren: Asp⁴¹⁹. Die Sequenz und Positionsangaben beziehen sich auf SEQ ID NO: 1 (hvEcR) und 3 (hvEcRmut), wie sie unter der Überschrift "Erläuterungen zum Sequenzprotokoll" dargestellt sind.

Weiterhin sind eine EcR-LBD bzw. EcR-LBD/USP-LBD und ein EcR-LBD/USP-LBD/Ligand-Komplex Gegenstände der vorliegenden Erfindung, welche eine Ligandenbindenische umfassen, die durch die oben beschriebenen Aminosäuren definiert ist, und in der eine oder mehrere dieser Aminosäuren mutiert sind. Vorzugsweise handelt es sich dabei um konservative Mutationen, in der ein Austausch durch eine Aminosäure mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften erfolgt.

Die hierin beschriebene dreidimensionale Struktur einer EcR-LBD bzw. eines EcR-LBD/USP-LBD-Komplexes ist von großer Bedeutung für die Suche nach Liganden mit praktischer Nutzanwendung. Solche Liganden können z.B. als Insektizide mit neuem Wirkmechanismus Verwendung finden. Die Ecdyson/Juvenilhormon gesteuerte Entwicklung ist nur bei Invertebraten zu finden und kommt in Vertebraten nicht vor; sie stellt also einen für den Anwender sicheren insektiziden Mechanismus dar. Weiterhin können solche Liganden als Agonisten oder Antagonisten in künstlichen Genexpressionssystemen (Gene Switch) dienen.

Durch die Bindung eines Liganden an den EcR/USP-Komplex kann die Struktur des EcR/USP-Komplexes Veränderungen erfahren. Oft beschränken sich diese Veränderungen auf Seitenkettenkonformationen, jedoch können sich auch ganze Gruppen von Aminosäuren mit ihrem Peptidrückgrat bewegen. Nachstehend ist zum Beispiel die Anpassung der Struktur des EcR/USP-Komplexes an die beiden Liganden Ponasteron A und BYI06830 beschrieben. Darüberhinaus treten in Kernrezeptoren mit unbesetzter Ligandenbindenische oder in Kernrezeptoren, deren Ligandenbindenische mit Antagonisten besetzt sind, typische Konformationsänderungen auf. Solche Veränderungen beinhaltet diese Erfindung ebenfalls.

Unter Einsatz der erfindungsgemäßen dreidimensionalen Struktur der EcR-LBD/USP-LBD können mit Hilfe etablierter automatisierter Computerprozesse Datenbanken durchgemustert werden, die die Strukturen einer großen Zahl von Verbindungen enthalten (Virtual Screening). Für das virtuelle Screenen können zum Beispiel Algorithmen wie FLEXX (Rarey et al., 1996) oder GOLD (Jones et al., 1997) verwendet werden. Durch diese Vorgehensweise können Verbindungen identifiziert werden, deren dreidimensionale Struktur es ermöglicht, in die Bindetasche zu gelangen und dort zu binden, beispielsweise durch Bildung von Wasserstoffbrücken, durch hydrophobe Wechselwirkung, durch Ladungswechselwirkungen, durch van-der-Waals-Wechselwirkungen oder durch Dipol-Wechselwirkungen. Die so identifizierten Verbindungen können synthetisiert werden und dann z.B. als Insektizide oder als Effektoren in künstlichen Genexpressionssystemen auf der Basis des EcR/USP-Komplexes Verwendung finden.

Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen dreidimensionalen Struktur des EcR-LBD/USP-LBD-Komplexes liegt in der Generierung neuer Liganden. Hierzu werden unter Einsatz der Struktur und mit Hilfe etablierter de novo Designprogramme am Computer Strukturformeln für neue Liganden generiert, die in die Bindetasche gelangen und dort binden können, beispielsweise durch Bildung von Wasserstoffbrücken, durch hydrophobe Wechselwirkung, durch Ladungswechselwirkungen, durch van-der-Waals-Wechselwirkungen oder durch Dipol-Wechselwirkungen. Beispiele für mögliche de novo Designprogramme sind LUDI (Böhm, 1992), LEGEND (Nishibata & Itai, 1991) oder GROW (Moon & Howe, 1991). Solcherart generierte Verbindungen können synthetisiert und dann ebenfalls z.B. als Insektizide oder als Effektoren in künstlichen Genexpressionssystemen auf der Basis des EcR/USP-Komplexes genutzt werden.

Die erfindungsgemäße dreidimensionale Struktur der USP-LBD ermöglicht es auch, die dreidimensionale Struktur einer EcR-LBD bzw. einer EcR-LBD/USP-LBD aus anderen Organismen als Heliothis virescens durch Modelling vorherzusagen. Solche Proteinmodelle können in der gleichen Weise verwendet werden, wie die hier gelöste dreidimensionale Struktur. Durch Vergleich der Unterschiede in den Aminosäuresequenzen ist es möglich, Unterschiede in den Ligandenbindenischen verschiedener Organismen vorherzusagen. Dies ist nützlich, wenn für spezifische Organismen spezifische Liganden gesucht werden, oder wenn im umgekehrten Fall gerade breit wirksame unspezifische Liganden gesucht werden. Darüberhinaus kann die erfindungsgemäße dreidimensionale Struktur zur Erstellung von Proteinmodellen anderer in der Sequenz verwandter Kernrezeptoren dienen.

Insbesondere sind die folgenden Gegenstände und Verfahren von der vorliegenden Erfindung umfasst:

1) Ein Verfahren zum Auffinden von Liganden des EcR, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer LBD gemäß der vorliegenden Erfindung, und (b) Computer-unterstütztes Durchsuchen (virtuelles Screenen) von Datenbanken, die Strukturdaten von chemischen Verbindungen enthalten, nach solchen Strukturen, die die Fähigkeit besitzen, spezifische Wechselwirkungen mit einer LBD gemäß der vorliegenden Erfindung einzugehen.
2) Ein Verfahren zum Auffinden von Liganden des EcR, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer LBD gemäß der vorliegenden Erfindung, und (b) Computer-unterstütztes Modellieren von chemischen Verbindungen mit Strukturen, die die Fähigkeit besitzen, spezifische Wechsel wirkungen mit einer LBD gemäß der vorliegenden Erfindung einzugehen.
3) Ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen für den Pflanzenschutz, insbesondere von chemischen Verbindungen, welche durch Bindung an eine LBD gemäß der vorliegenden Erfindung zur Aktivierung oder Hemmung des EcR bzw. des EcR/USP-Komplexes führen, umfassend die folgenden Schritte: (a) Durchführen eines der oben genannten Verfahren zum Auffinden von Liganden des EcR, (b) Synthetisieren der als Liganden identifizierten Verbindung(en), und (c) Detektieren der biologischen Aktivität der im Schritt (b) synthetisierten Verbindung durch Transaktivierungstests, Verdrängungstests oder Biotests.
4) Die Wirkstoffe, die mit dem oben genannten Verfahren gefunden werden.
5) Ein Verfahren zum Auffinden von Effektoren, welche durch Bindung an eine erfindungsgemäße LBD zur Aktivierung oder Hemmung des EcR bzw. des EcR/USP-Komplexes führen und zur steuerbaren Expression von Zielgenen genutzt werden können, umfassend die folgenden Schritte: (a) Durchführen eines der oben genannten Verfahren zum Auffinden von Liganden des EcR, (b) Synthetisieren der als Liganden identifizierten Verbindung(en), (c) Applizieren einer im Schritt (b) synthetisierten Verbindung auf Wirtszellen oder Wirtsorganismen, welche ein auf EcR bzw. EcR/USP basierendes Expressionssystem enthalten, und (d) Detektieren einer Induktion oder Hemmung des Expressionssystems.
6) Die Effektoren, die durch das oben genannte Verfahren gefunden werden.
7) Die Verwendung einer LBD gemäß der vorliegenden Erfindung zum Auffinden von Wirkstoffen für den Pflanzenschutz oder von Effektoren zur kontrollierten Expression von Zielgenen in Wirtszellen oder ganzen Wirtsorganismen.
8) Ein Verfahren zum Erstellen von Proteinmodellen von EcR-LBDs oder von LBDs verwandten Kernrezeptoren, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer erfindungsgemäßen LBD, und (b) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer LBD mit einer mutierten Aminosäuresequenz.
9) Ein Verfahren zum Erstellen von Proteinmodellen von EcR-Ligandenbindenischen oder von Ligandenbindenischen verwandten Kernrezeptoren, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer erfindungsgemäßen LBD, und (b) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer Ligandenbindenische mit den Aminosäuren eines gewählten Organismus oder eines anderen Kernrezeptors.

Erläuterungen zu den Abbildungen und zum Sequenzprotokoll:

Die 1 zeigt die Struktur des Heterodimer-Komplexes aus EcR-LBD (rechts) und USP-LBD (links) mit eingebundenem Ecdysteroid-Agonisten Ponasteron A. In der USP-Untereinheit ist ein eingebundenes Phospholipid gezeigt.

Die 2 zeigt eine schematische Darstellung der EcR-Ligandenbindenische mit eingebundenem Ponasteron A.

Die 3 zeigt die Struktur des Heterodimer-Komplexes aus EcR-LBD (rechts) und USP-LBD (links) mit eingebundenem nicht-steroidalen Liganden BAYI06830. In der USP-Untereinheit ist ein eingebundenes Phospholipid gezeigt.

Die 4 zeigt eine schematische Darstellung der EcR-Ligandenbindenische mit eingebundenem nicht-steroidalen Liganden BAYI06830.

Die 5 zeigt die schematische Darstellung der EcR-Ligandenbindenische mit eingebundenem nicht-steroidalen Liganden BAYI09181 (Design eines neuen EcR-Liganden).

Die 6 stellt die Funktionsfähigkeit der Vierfachmutante hvEcR dar: Aktivierungsfähigkeit nach Transfektion in HEK-293 Zellen. Genauere Beschreibung in Beispiel 2.

Die 7 stellt die Funktionsfähigkeit der Vierfachmutante hvEcR dar: Bindung von Ponasteron A an isolierten hvEcR-LBD/USP-LBD-Heterodimer-Komplex. Genauere Beschreibung in Beispiel 2.

SEQ ID NO: 1 (hvEcR) zeigt die Aminosäuresequenz der EcR-LBD von Heliothis virescens:

SEQ ID NO: 2 (hvUSP) zeigt die Aminosäuresequenz der USP-LBD von Heliothis virescens:

SEQ ID NO: 3 (hvEcRmut) zeigt die Aminomutationen (W³⁰³Y-A³⁶¹S-L⁴⁵⁶S-C⁴⁸³S) der mutierten EcR-LBD von Heliothis virescens:

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele genauer beschrieben.

Beispiel 1:
Proteinherstellung
Die EcR-LBD ist in Abwesenheit der USP-LBD alleine unlöslich. Dagegen wurde gezeigt, dass die Koexpression der EcR-LBD und der USP-LBD zu guter Ausbeute an löslichem EcR-USP-Protein führt (Li et al., 1997). Deshalb wurde der Weg der Koexpression von EcR-LBD und USP-LBD gewählt. Darüberhinaus wurde durch Einführen verschiedener Mutationen in das Wildtyp (wt) EcR-Protein eine höhere Löslichkeit erreicht (siehe Beispiel 2).
Die mutierten EcR-Proteine (siehe Beispiel 2) wurden parallel zum wt EcR gereinigt und einem Screening nach geeigneten Kristallisationsbedingungen unterworfen. In zwei Fällen wurden gute Kristalle erhalten, und zwar für das wt hvEcR-LBD/hvUSP-LBD-Heterodimer im Komplex mit Ponasteron A und für das Heterodimer aus der Mutante W³⁰³Y-A³⁶¹S-L⁴⁵⁶S-C⁴⁸³S hvEcR-LBD und wt hvUSP-LBD im Komplex mit BYI06830.
Die hvUSP-LBD (Aminosäuren 205-466) wurde mit Hilfe des T7-Promoters des Plasmidvektors pACYC11b exprimiert. Die Wildtyp hvEcR-LBD (Aminosäuren 285-532) wurde mit Hilfe des Expressionsvektors pET28b als NH₂-terminal mit einem His₆-Rest markiertes Fusionsprotein exprimiert. Die mutierte hvEcR-LBD wurde mit Hilfe des Expressionsvektors pET32b als N-terminal His₆-Rest-Thioredoxin markiertes Fusionsprotein exprimiert.
Mit USP-LBD- und EcR-LBD-Expressionsplasmiden transformierte BL21(DE3)-Zellen wurden bei 37°C in zweifach konzentriertem LB-Medium angezogen und anschließend mit 0,8 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid bei 15°C für 18 Stunden induziert. Im Falle der Expression der wt EcR-LBD vom Plasmid pET28b wurden 50 μM Ponasteron A zum Kulturmedium gegeben. Im Falle der Koexpression der EcR-LBD (pET32b) mit USP-LBD wurde dagegen kein Ligand zugefügt. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert, resuspendiert, mit Hilfe von Ultraschall lysiert und durch erneute Zentrifugation abgetrennt. Der lösliche Überstand wurde auf eine Kobaltchelat-Chromatographiesäule (TALON Superflow, Clonetech) geladen. Nach Waschen wurde der Heterodimer-Komplex mit 250 mM Imidazol (pH 8,0) eluiert. Die Markierungen wurden mit Thrombin abgespalten. Das Protein wurde mit Centri-prep 50K (Amicon) Einheiten aufkonzentriert und auf einer Superdex 200 16/60-Säule (Pharmacia Biotech) weiter gereinigt. Durch N-terminale Amninosäuresequenzierung, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Elektrospray-Massenspektrometrie wurde ein molares 1:1 Verhältnis von EcR-LBD zu USP-LBD bestätigt.
Beispiel 2:
Herstellung einer funktionsfähigen Vierfach-Mutantenform von hvEcR-LBD
Zur Verbesserung der Löslichkeitseigenschaften von exprimierten Proteinen, wie z.B. der EcR-LBD, sind oft bestimmte Mutationen nützlich. Insbesondere sind Mutationen an Stellen vorteilhaft, die auf der Lösungsmittel-zugänglichen Oberfläche liegen und die zwischen verschiedenen Proteinfamilienmitgliedern nicht konserviert sind. Solche Mutationen sollten helfen, den Rezeptor-Heterodimer-Komplex zu solubilisieren und zu stabilisieren, um damit auch die Kristallisation zu erleichtern, ohne aber die Gesamtstruktur und Funktionsfähigkeit des Proteins zu verändern.
In diesem Sinne wurden vier nicht-konservierte Aminosäuren auf der Oberfläche der hvEcR-LBD mutiert. Die vier Mutationen W303Y, A361S, L456S und C483S erfolgten alle zu neuen Resten, die in anderen EcR-Proteinen natürlicherweise an diesen Stellen vorkommen.
Im Folgenden wird gezeigt, dass diese Mutationen die Transaktivierungsfähigkeit der hvEcR nicht beeinträchtigen.
HEK-293 EBNA-Zellen wurden in 24-Loch Platten mit Expressionsplasmiden für Wildtyp- oder Vierfachmutanten-hvEcR sowie für hvUSP und für TK-PAL1 Luciferase plus β-Galactosidase als Reporter transfiziert. Die Zellen wurden danach 20 Stunden mit entweder Ponasteron A oder BYI06830 behandelt und anschließend auf Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivität getestet. Das in 6 gezeigte Ergebnis belegt, dass zwischen Wildtyp und Vierfachmutante kein signifikanter Unterschied besteht. Die Werte der β-Galactosidase-Aktivität wurden dabei als Normalisierungsdaten für die Luciferase-Aktivität verwendet.
Außerdem wurde die Affinität von Ponasteron A für Wildtyp- oder Vierfachmutanten-hvEcR durch Electrospray Ionization Time-of-Flight Massenspektrometrie (ESI-TOF MS) bestimmt. Dafür wurde der EcR-LBD/USP-LBD-Heterodimer-Komplex wie in Beispiel 1 beschrieben in Gegenwart von Ponasteron A exprimiert und gereinigt. Das Protein wurde auf etwa 3 mg/ml konzentriert und gegen 200 mM NH₄OAc (pH 6,5) dialysiert (Centricon-50 Konzentratoren von Amicon). Dann wurde auf eine Versuchskonzentration von 10^–5 M Protein verdünnt. Die Bildung von Ligand-Rezeptor-Komplexen wurde wie von Potier et al. (2003) beschrieben bestimmt. Dafür wurde ein ESI-TOF-Massenspektrometer (LCT, Micromass, Manchester) und ein kontinuierlicher Einstrom der Probe in die Ionenquelle bei einer Flussrate von 4 μl/min (Kolbenpumpe Harvard Model 11 von Harvard Apparatus) verwendet. Das in 7 gezeigte Ergebnis belegt, dass zwischen Wildtyp und Vierfachmutante kein signifikanter Unterschied besteht.
Beispiel 3:
Kristallisierung und Datenanalyse
Der gereinigte hvEcR-LBD/hvUSP-LBD/Ponasteron A-Komplex und auch der gereinigte W³⁰³Y-A³⁶¹S-L⁴⁵⁶S-C⁴⁸³S-hvEcR-LBD/hvUSP-LBD/BYI06830-Komplex wurden auf 25 mM TRIS (pH 8,0), 100 mM NaCl, 100 mM KCl, 4 mM CHAPS, 2 % Glycerin (v/v) und 500 nM Ligand konditioniert und auf 4–6 mg/ml konzentriert. Kristallisationsexperimente wurden bei 24°C sowohl mit der Methode des hängenden Tropfens als auch des sitzenden Tropfens durchgeführt. Für den hvEcR-LBD/hvUSP-LBD/Ponasteron A-Komplex wurden folgende Kristallisationsbedingungen gefunden: 30 % PEG 4000, 0,2 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Na-citrat (pH 5,6). Für den W³⁰³Y-A³⁶¹S-L⁴⁵⁶S-C⁴⁸³S-hvEcR-LBD/hvUSP-LBD/BYI06830-Komplex wurden dagegen folgende Kristallisationsbedingungen gefunden: 10 % PEG 1000, 10 % PEG 8000, 0,3 M MgCl₂, 0,1 M HEPES (pH 7,5). Kristalle wurden nach kurzem Eintauchen in eine Lösung von 15 % Ethylenglykol and 5 % PEG 400 als Cryoprotectant in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Der native Datensatz für den hvEcR-LBD/hvUSP-LBD/Ponasteron A-Komplex wurde im Strahlengang BM30A beim ESRF (Grenoble, Frankreich) aufgenommen, während der Datensatz für den W³⁰³Y-A³⁶¹S-L⁴⁵⁶S-C⁴⁸³S-hvEcR-LBD/hvUSP-LBD/BYI06830-Heterodimer-Komplex im Strahlengang ID14-EH4 beim ESRF (Grenoble, Frankreich) aufgenommen wurde. Die Daten wurden mit Hilfe der HKL-Programme (Otwinikowski und Minor, 1997) weiter verarbeitet (vgl. Tabelle 1). Die Strukturen wurden mit der Methode des molekularen Ersatzes EPMR (Kissinger et al., 1999) unter Zugrundelegung der Vitamin D-Rezeptor-LBD als Suchmodell (26 % Sequenzidentität) gelöst. Klare Lösungen ergaben sich in den Raumgruppen P43₁21 für den Ponasteron A-Komplex und P4321 für den BYI06830-Komplex. In beiden Fällen enthält die assymmetrische Grundeinheit ein EcR-LBD/USP-LBD-Heterodimer. Eine Verfeinerung wurde mit Hilfe der CNS-Torsionswinkeldynamik mit einer Maximum Likelihood Function Target und Lösungsmittelkorrektur vorgenommen (Brünger et al., 1998). Manuelle Adjustierungen wurden mit dem Programm O (Jones et al., 1991) und sigmaA gewichteten Elektronendichtekarten (Read, 1986) durchgeführt (vgl. Tabelle 1).
Beispiel 4:
Architektur des EcR-LBD/USP-LBD-Komplexes von Heliothis virescens
Beide hvEcR/hvUSP-Heterodimer-Komplexe weisen eine vergleichbare Gesamtstruktur auf (1 und 3). Die Schmetterlingsform ist derjenigen der Heterodimer-Komplexe von PRARγ/RXRα and RARα/RXRα ähnlich (Gampe et al., 2000; Bourguet et al., 2000). Beide LBDs beider Heterodimer-Komplexe zeigen die kanonische Kernrezeptorfaltung mit einer antiparallen α-helicalen Schichtbauweise. Die hvUSP-LBD umfasst 11 α-Helices (H1, H3-H12) und zwei kurze β-Stränge (s1-s2). Die Strukturen der hvUSP-LBD in beiden EcR/USP-Heterodimer-Komplexen sind innerhalb einer Abweichung (RMSD) von 0,63 bzw. 0,71 Å über 233 bzw. 231 C_α-Positionen praktisch identisch mit der vorher bestimmten Struktur des isolierten USP-LBD-Proteins (Billas et al., 2001, Clayton et al., 2001). Wie in der Struktur des isolierten USP-Proteins findet sich in der Ligandenbindenische des USP-Proteins ein Phospholipid. Auffällig ist die Blockierung der Aktivierungshelix 2 (AF2-H) der USP-LBD im inaktiven Zustand durch ausgedehnte Kontakte zur Schleife, die die Helices 1 und 3 verbindet. Aufgrund der Konservierung des Interaktionsmotives wurde schon früher vermutet, dass diese Schleife eine besondere funktionelle und strukturelle Rolle in Dipteren und Lepidopteren besitzt (Billas et al., 2001; Clayton et al., 2001). Die USP-LBD enthält einen Bereich zwischen der Helix 5 und dem ersten β-Strang, der in den Strukturen der isolierten USP-LBDs nicht aufgelöst werden konnte. In den Heterodimer-Komplexen dagegen weist die Elektronendichte auf einen Kontakt dieses Bereiches mit der Schleife zwischen H8-H9 im EcR-LBD-Partner hin. Da die Elektronendichte allerdings nicht durchgängig verläuft, ist die genaue Anordnung dieses Bereiches teilweise unklar und durch eine gestrichelte Linie in 1 und 3 angegeben.
Die hvEcR-LBD besitzt im Ponasteron A-Komplex 12 α-Helices (H1-12) und drei β-Stränge, während im Komplex mit dem nicht-steroidalen Liganden BYI06830 die Helix H2 fehlt. In beiden Heterodimer-Komplexen nimmt die EcR-Aktivierungshelix AF2-H die aus anderen Agonist-gebundenen Kernrezeptoren bekannte aktive Lage an (Steinmetz et al., 2001). Die EcR-LBD-Strukturen sind innerhalb einer Abweichung (RMSD) von 1,46 bzw. 2,14 Å über 206 bzw. 204 C_α-Positionen am nächsten der Vitamin D-Rezeptor (VDR)-Struktur ähnlich. In beiden EcR/USP-Heterodimer-Komplexen nehmen also die AF2-H-Helices eine dissymmetrische Lage ein: die EcR-LBD befindet sich in der agonistischen Konformation, während sich die USP-LBD in der antagonistischen Konformation befindet. Dieses ist der erste Fall, in dem im Gegensatz zu den PPARγ/RXRα (beide AF2-H-Helices in agonistischer Lage) oder RARα/RXRα-Heterodimer-Komplexen (beide AF2-H-Helices in antagonistischer Lage) eine solche ungleiche Lage beobachtet wird. Die Kontaktfläche zwischen EcR-LBD und USP-LBD besteht aus einem Netzwerk hydrophober und polarer Wechselwirkungen durch Reste aus den Helices H7, H9 und H10 und der Schleife zwischen H8 und H9 beider LBDs. Diese Kontaktfläche ist also trotz der Dissymmetrie der AF2-H-Helices ähnlich zu der Kontaktfläche der PPARγ/RXRα- und RARα/RXRα-Heterodimer-Komplexe.
Die Überlagerung beider hvEcR-LBD-Strukturen offenbart überraschende Unterschiede. Am meisten betroffen sind die Regionen um die Helices H6 und H7, die drei β-Stränge sowie die Schleifen zwischen H1 and H3. Es findet eine beträchtliche Verlagerung von H6, dem N-terminalen Teil von H7 und der β-Stränge statt, während die Spitze des β-Faltblattes und die Schleife zwischen H1 and H3 vollständig umgefaltet sind und im Ponasteron A-Komplex eine zusätzliche Helix H2 auftritt (vgl 1 und 3). Der Vergleich zwischen verschiedenen Kernrezeptoren zeigt, dass diese Bereiche hochvariabel sind. Die Schleife zwischen H1 and H3 nimmt in verschiedenen Kernrezeptoren verschiedene Konformationen an (Steinmetz et al., 2001), das β-Faltblatt besteht aus zwei-, drei- oder fünfsträngigen antiparallelen β-Strängen (Steinmetz et al., 2001), und auch die Schleife zwischen H6 und H7 gehört zu den hochflexibeln Elementen (Steinmetz et al., 2001). Im menschlichen Pregnane X- Rezeptor (hPXR) ist H6 durch eine konservierte bewegliche Schleife ersetzt, die am promiskuitiven Charakter des Rezeptors beteiligt ist (Watkins et al., 2001). Dennoch sind alle anderen bisher bekannten Strukturen einer gegebenen Rezeptor-LBD im Komplex mit verschiedenen Liganden untereinander sehr ähnlich. Das gilt z.B. für RAR, RXR, VDR, PPAR, ER (Steinmetz et al., 2001). Nur die EcR-LBD weist zwei so deutlich verschiedene Strukturen in Gegenwart von Ecdysteroid oder nicht-steroidalem Dibenzoylhydrazin auf. Dieser überraschende und extreme Fall der strukturellen Anpassung des Rezeptors an einen gebundenen Liganden eröffnet auch für andere Kernrezeptoren neue Perspektiven in Hinsicht auf die Suche nach neuen Liganden.
Beispiel 5
Die Ligandenbindenische in EcR
Aus den Unterschieden in der Rezeptorfaltung ergeben sich zwei in Form und Lage bemerkenswert unterschiedliche Ligandenbindenischen in den zwei EcR-LBD-Heterodimer-Komplexen (1 bis 4). Die Bindenische im Heterodimer-Komplex mit Ponasteron A ist vergleichsweise länglich und schmal, L-förmig und vollständig im Innern der Rezeptor-LBD verborgen. Im Gegensatz dazu ist die Bindenische im Heterodimer-Komplex mit BYI06830 vergleichsweise geräumig, V-förmig und weist eine zwischen H7 und H10 geöffnete Spalte auf. Diese Öffnung steht mit der Schleife zwischen H8 und H9 aus dem Heterodimer-Partner USP in Berührung. Das Volumen der Bindenische beträgt 690 Å³ bzw. 510 Å³ für den Komplex mit Ponasteron A bzw. BYI06830. Im Vergleich dazu liegen die Volumina der Bindenischen anderer Kernrezeptoren zwischen 369 Å³ (ER) und 697 Å³ (VDR). In der Überlagerung des nicht-steroidalen Liganden BYI06830 mit Ponasteron A, so wie beide in ihren jeweiligen Bindenischen liegen, liegt die tert.-Butyl-Gruppe zusammen mit Benzoylring A des BYI06830 am Platz der C-17 Seitenketten-Hydroxygruppe von Ponasteron A.
Dieser Befund ist höchst überraschend und völlig verschieden von allen bisherigen Vorhersagen und Docking-Studien (Wurtz et al., 2000 und Zitate darin; Kasuya et al., 2003 und Zitate darin). Die Form der Bindenische im Ponasteron A-Komplex ist der Bindenische in der VDR-LBD recht ähnlich. Tatsächlich ergibt die Überlagerung der beiden Liganden, Ponasteron A und 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, eine ähnliche Lage der aliphatischen Seitenketten (betr. Position 17 des D-Ringes). Insgesamt jedoch ist die Bindenische in der VDR-LBD mehr gebogen und spiegelt damit die flexiblere Natur seines Liganden wieder. Die EcR-LBD-Bindenische im Komplex mit Ponasteron A ist eindeutig und klar die natürliche Rezeptorbindenische. Jedoch erlaubt die Plastizität der EcR-LBD eine Umlagerung und Anpassung an den nicht-steroidalen Liganden BYI06830.
Die Ligandenbindenische des Ponasteron A-Komplexes wird durch die folgenden Aminosäuren im 4,5 Å Abstand vom gebundenen Liganden definiert: Hydrophobe Aminosäuren: Pro³¹¹, Ile³³⁹, Met³⁴², Met³⁸⁰, Val³⁸⁴, Leu³⁹⁶, Phe³⁹⁷, Ala³⁹⁸, Met⁴¹³, Val⁴¹⁶, Leu⁴²⁰; polare Aminosäuren: Gln³¹⁰, Thr³⁴⁰, Thr³⁴³, Thr³⁴⁶, Tyr⁴⁰⁸, Asn⁵⁰⁴, Trp⁵²⁶; geladene oder potentiell geladene Aminosäuren: Glu³⁰⁹, Arg³⁸³, Arg³⁸⁷, (2).
Die Ligandenbindenische des BYI06830-Komplexes wird durch die folgenden Aminosäuren im 4,5 Å Abstand vom gebundenen Liganden definiert: Hydrophobe Aminosäuren: Ile³³⁹, Met³⁸⁰, Met³⁸¹, Val³⁸⁴, Met⁴¹³, Val⁴¹⁶, Leu⁴²⁰, Leu⁵⁰⁰, Met⁵⁰⁷, Leu⁵¹¹; polare Aminosäuren: Thr³⁴⁰, Thr³⁴³, Ser³⁷⁷, Tyr⁴⁰³, Tyr⁴⁰⁸, Gln⁵⁰³, Asn⁵⁰⁴, Trp⁵²⁶; geladene oder potentiell geladene Aminosäuren: Asp⁴¹⁹ (4).
Die 13 beiden Komplexen gemeinsamen Aminosäurereste gehören zu den Helices H3, H5, H6, H7, H11 und H2. Die Schleife H1-H3 und die drei β-Faltblätter tragen wesentliche Reste zum Komplex mit Ponasteron A bei, haben aber keine Berührung zur Bindenische des Liganden BYI06830.
Unter den Schlüsselaminosäuren für die Bindung des Ponasteron A befinden sich nur drei Aminosäuren, die auch an der BYI06830-Bindung beteiligt sind (Thr³⁴³, Asn⁵⁰⁴, Tyr⁴⁰⁸), während andere Aminosäuren für die Ecdysteroid-Bindetasche spezifische Reste darstellen (Glu³⁰⁹, Gln³¹⁰, Pr0³¹¹, Met³⁴², Thr³⁴⁶, Arg³⁸³, Arg³⁸⁷, Leu³⁹⁶, Ala³⁹⁸) (2). Die sechs Aminosäuren, die Wasserstoffbrücken zu den Hydroxygruppen des Ponasteron A bilden, sowie die meisten der hydrophoben Reste der Ecdysteroid-Bindetasche sind in allen bisher bekannten Arthropoden-EcR-Sequenzen strikt konserviert. Das ist in Übereinstimmung mit dem allgemeinen Charakter von 20-Hydroxyecdyson, das in allen Arthropoden an den EcR bindet und ihn aktiviert. Die Hydroxylgruppen in Position 2 und 3 sind in einem Wasserstoffbrücken-Netzwerk mit Glu³⁰⁹, Arg³⁸³ und Arg³⁸⁷ eingebunden, mit dem H2 in einer helicalen Konformation fixiert wird. Das C6-Carbonyl des Ponasteron A bildet eine Wasserstoffbrücke zum Hauptkettenamid des Ala³⁹⁸. Diese Wechselwirkung stabilisiert, was ganz wichtig ist, die Aminosäure Phe³⁹⁷, deren Phenylring im Stacking mit dem Phenolring des Tyr⁴⁰³ extensive van-der-Waals-Kontakte mit dem B-Ring des Ponasteron A ausübt (2).
Die Bindung des BYI06830 erfolgt über drei entscheidende polare Reste (Thr³⁴³, Tyr⁴⁰⁸, Asn⁵⁰⁴), die Wasserstoffbrücken zu den Carbonylgruppen des A- und B-Ringes sowie des unsubstituierten Amidstickstoffes ausbilden (4). Diese drei Aminosäuren binden sowohl BYI06830 als auch Ponasteron A. Die tert.-Butyl-Gruppe des BYI06830 liegt in einer hydrophoben Tasche und bildet extensive van-der-Waals-Kontakte mit dem Protein aus (Phe³³⁶, Met⁴¹³, Met⁵⁰⁷, Cys⁵⁰⁸, Leu⁵¹¹, Leu⁵¹⁸, Leu⁵²²). Die tert.-Butyl-Gruppe ist für eine hohe Ecdyson-artige Wirkung der Dibenzoylhydrazine entscheidend. Auch größere Gruppen (wie 2-Cyclohexyl-ethyl), die noch eine vergleichbare biologische Wirkung ausüben, passen gut in die Bindenische. Der Ring A des BYI06830 wird zwischen Met³⁸⁰ und Met³⁸¹ stabilisiert. Fünf Aminosäuren stellen für die Ligandenbindenische der Dibenzoylhydrazine spezifische Reste im 4,5 Å Abstand vom gebundenen Liganden dar: Ser³⁷⁷, Asp⁴¹⁹, Leu⁵⁰⁰, Asn⁵⁰³ und Met⁵⁰⁷.
Die zwei verschiedenen Klassen von Agonisten, die an den EcR mit nanomolarer Affinität binden, Ecdysteroide und Dibenzoylhydrazine, unterscheiden sich erheblich in ihrer Struktur, Größe und physikalisch-chemischen Eigenschaften. Dennoch erlaubt die Flexibilität und Anpassungsfähigkeit der EcR-LBD, diese beiden Arten von Liganden zu binden. Die Bindung des ecdysteroidalen Liganden stabilisiert H2 und die Konformation des β-Faltblattes. Im Gegensatz dazu kann der nicht-steroidale Ligand die notwendigen gerüstbildenden Wechselwirkungen zur Stabilisierung dieser Sekundärstruktwen nicht unterstützen. In der Konsequenz entfaltet sich einerseits H2 zu einer unstrukturierten Schleife, während sich das β-Faltblatt umlagert. An der Umlagerung im β-Faltblatt sind zwei aromatische Reste beteiligt, Phe³⁹⁷ und Tyr⁴⁰³, die dem Dibenzoylhydrazin BYI06830 Platz machen und dann einen Raum einnehmen, der sonst von den A-, B- und C-Ringen der Ecdysteroide besetzt wird (4). Diese beiden Reste sind in allen bisher bekannten Arthropoden-EcRs strikt konserviert. Sie bilden das Sequenz-Motiv FA(V/G)XXXA(S/P)Y und sind an den beiden Seiten der Spitze des β-Faltblattes lokalisiert, wo sie der EcR-LBD durch eine Funktion als Scharnier Flexibilität und Anpassungsfähigkeit geben.
Beispiel 6:
Design eines neuen agonistischen EcR-Liganden
Ausgehend von der Kenntnis hier gelösten Kristallstruktur der Ligandenbindenische im EcR ist es mithilfe von Standardverfahren des Molecular Modellings möglich, neueartige Liganden zu konzipieren.
So sieht man z.B. bei der Einbindung von BAYI06830 die Hydroxygruppe des Tyr⁴⁰⁸, die eine Wechselwirkung mit dem N-H des BAYI06830 eingeht, in gleichzeitiger Nachbarschaft zur ortho-Position des A-Ringes (4). Durch Einbau einer Wasserstoffbrücken-Akzeptorfunktion in Form einer Methoxysubstitution in die ortho-Position des A-Ringes kann theoretisch eine zusätzliche Wechselwirkungsmöglichkeit zum Tyr⁴⁰⁸ erzeugen werden. Aus synthetischen Gründen wurde der A-Ring dann durch ein besser zugängliches Methoxypyridin ersetzt (BAYI09181). Diese Konzeption ist in 5 aufgezeigt.
Ein in dieser Weise konzipiertes Molekül kann mit theoretischen Methoden in die Bindetasche der gelösten Kristallstruktur eingepasst und sein statisches und dynamisches Verhalten durch Simulationsmethoden, wie Energieminimierung und Molecular Dynamics Verfahren, theoretisch überprüft werden. Das Ergebnis dieses Verfahrens, wie z.B. tatsächlich die Vorhersage der Ausbildung einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke zwischen Tyr⁴⁰⁸ und dem Methoxy-Sauerstoff, in diesem Fall war ermutigend, so dass der Wirkstoff BAYI09181 synthetisiert wurde (siehe Beispiel 7).
Ohne Kenntnis der Ligandenbindenische war der Schritt von den bisher bekannten Diacylhydrazinen zur Struktur des BAYI09181 nicht naheliegend. Tatsächlich weist BAYI09181 die gleiche oder teilweise eine bessere biologische Aktivität auf als der Standard Methoxyfenozide (siehe Beispiel 8).
Dieses Beispiel zeigt, dass die Kenntnis der Kristallstruktur der Ligandenbindenische des EcR es ermöglicht, neuartige Insektizide zu konzipieren.
Beispiel 7:
Synthese des neuen agonistischen EcR-Liganden BAYI09181
2-Methoxynikotinsäure ist käuflich. Die Herstellung von N-(3-Methoxy-2-methylbenzoyl)-N'-tert.-butylhydrazin wurde in US 5,530,028 unter Beispiel Nr. 8 beschrieben, und die Weiterreaktion zu N-(3-Methoxy-2-methylbenzoyl)-N'-(2-methoxynikotinoyl)-N'-tert.-butylhydrazin (BAYI09181; siehe 5) wurde in Analogie zu den Vorschriften in der gleichen Patentschrift durchgeführt. Das Produkt hat einen Schmelzpunkt von 178–183°C.
Beispiel 8:
Biologische Aktivität des neuen agonistischen EcR-Liganden BAYI09181
In der Wirkung auf Spodoptera Sf9 Zellen weist BAYI09181 mit einer halbmaximal wirksamen Konzentration von 5 nM eine gleiche ecdysteroide Aktivität auf, wie der Standard Methoxyfenozide. BAYI09181 erzielt dabei jedoch hinsichtlich der Stärke der Aktivierung des EcR, gemessen über ein Reportergenkonstrukt, einen höheren Aktivierungsfaktor als Methoxyfenozide: BAYI09181 erweist sich als gleich effektiv wie 20-Hydroxyecdyson, während Methoxyfenozide nur 50 % der Effektivität von 20-Hydroxyecdyson erzielt.
Die biologische Prüfung von BAYI09181 gegen den Heerwurm (Spodoptera frugiperda) wurde wie folgt durchgeführt: Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung wurde 1 Gewichtsteil Wirkstoff BAYI09181 mit 78 Gewichtsteilen Aceton und 1,5 Gewichtsteilen Dimethylformamid sowie als Emulgator mit 0,5 Gewichtsteilen Alkylarylpolyglykolether vermischt. Dieses Konzentrat wurde zum Test mit emulgatorhaltigem Wasser auf die jeweils gewünschte Konzentration verdünnt.
Maisblattscheiben (Zea mays) wurden mit der Wirkstoffzubereitung der gewünschten Konzentration gespritzt und nach dem Abtrocknen mit Raupen des Heerwurms besetzt. Nach 7 Tagen wurde die Wirkung in % bestimmt. Dabei bedeutet 100 %, dass alle Raupen abgetötet wurden; 0 % bedeutet, dass keine Raupe abgetötet wurde.
Bei diesem Test zeigte BAYI09181 gute Wirksamkeit:

Konzentration BAYI09181 in ppm Wirkung in %

500 100

100 100

20 100

4 100

0,8 25
Beispiel 9:
Agonistische und antagonistische Konformationen
In der hier gelösten Kristallstruktur nimmt die EcR-LBD eine agonistische Konformation ein. Es ist gut bekannt, dass sich die antagonistische – inaktive – Konformation von Kernrezeptoren von der aktiven Konformation vor allem, aber nicht nur, in der Lage der Helix H12 unterscheidet. Diese inaktive Konformation wird normalerweise vom leeren Rezeptor ohne Liganden eingenommen. Insbesondere kann aber auch die Bindung von sperrigen Liganden die agonistische Lage der Helix H12 verhindern. Wenn man solche antagonistischen Liganden mit Hilfe von molekularen Modelling-Methoden konzipieren will, ist es erforderlich, die Konformation des leeren, inaktiven Rezeptors zu kennen. Eine solche antagonistische Konformation kann durch übliche molekulare Modelling-Methoden, basierend auf bekannten agonistischen Proteinkristallstrukturen homologer Kernrezeptoren, aus der hier gelösten agonistische Konformation vorhergesagt werden.
In der hier gelösten Kristallstruktur nimmt die USP-LBD eine antagonistische Konformation ein. Hier kann durch übliche molekulare Modelling-Methoden, basierend auf bekannten agonistischen Proteinkristallstrukturen homologer Kernrezeptoren, die agonistische Konformation vorhergesagt werden.
Am Beispiel des USP selber wurde die Vorhersage der agonistischen Konformation aus der Kenntnis der antagonistischen Konformation beschrieben (Sasorith et al., 2002). In entsprechender Weise läßt sich aus der hier gelösten agonistischen Konformation der EcR-LBD deren antagonistische Konformation vorhersagen.
Tabelle 1: Kristallographische Daten und Verfeinerungsstatistik (Details siehe Beispiel 3)
Werte in Klammern entsprechen der letzten Auflösungsschale
*R_sym(I) = Σ_hkl Σ_i|I_hkl,i – <I_hkl>|/Σ_hkl Σ_i|I_hkl,i| wobei <I_hkl> die mittlere Intensität der multiplen I_hkl,i Beobachtungen von symmetrieäquivalenten Reflexen ist. Mittlere quadratische Abweichungen bezogen auf Idealwerte.
§R_cryst = Σ_hkl|F_obs – F_calc|/Σ_hkl|F_obs wobei F_obs bzw. F_calc die beobachteten und berechneten Strukturamplituden sind. R_free ist R_cryst, allerdings berechnet mit den 10% der Daten, die bei der Verfeinerung nicht berücksichtigt wurden. Tabelle 2: Strukturkoordinaten des EcR-LBD/USP-LBD-Heterodimer-Komplexes mit dem Ecdysteroid-Agonisten Ponasteron A

Tabelle 3: Strukturkoordinaten des Ecdyson Rezeptor/Ultraspiracle (EcR/USP) Heterodimer Komplexes mit dem Ecdysteroid Agonisten BYI06830
Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ligandenbindedomäne (LBD) des Ecdyson-Rezeptors (EcR) in kristalliner Form.
LBD gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die LBD des EcR von Heliothis virescens handelt.
LBD gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die EcR-LBD im Komplex mit der LBD des Ultraspiracle-Proteins (USP) handelt.
LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst oder aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besteht.
LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie Mutationen in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 umfasst.
LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die USP-LBD die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst oder aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 besteht.
LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Komplex mit einem oder zwei Liganden vorliegt.
LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie die in Tabelle 1 oder Tabelle 2 definierten Strukturkoordinaten aufweist.
LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend eine Ligandenbindenische, welche durch die folgenden Aminosäuren im 4,5 Å Abstand vom gebundenen Liganden definiert ist: Hydrophobe Aminosäuren: Pro³¹¹, Ile³³⁹, Met³⁴², Met³⁸⁰, Val³⁸⁴, Leu³⁹⁶, Phe³⁹⁷, Ala³⁹⁸, Met⁴¹³, Val⁴¹⁶, Leu⁴²⁰, polare Aminosäuren: Gln³¹⁰, Thr³⁴⁰, Thr³⁴³, Thr³⁴⁶, Tyr⁴⁰⁸, Asn⁵⁰⁴, geladene oder potentiell geladene Aminosäuren: Glu³⁰⁹, Arg³⁸³, Arg³⁸⁷.
LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend eine Ligandenbindenische, welche durch die folgenden Aminosäuren im 4,5 Å Abstand vom gebundenen Liganden definiert ist: Hydrophobe Aminosäuren: Ile³³⁹, Met³⁸⁰, Met³⁸¹, Val³⁸⁴, Met⁴¹³, Val⁴¹⁶, Leu⁴²⁰, Leu⁵⁰⁰, Met⁵⁰⁷, Leu⁵¹¹; polare Aminosäuren: Thr³⁴⁰, Thr³⁴³, Ser³⁷⁷, Tyr⁴⁰³, Tyr⁴⁰⁸, Gln⁵⁰³, Asn⁵⁰⁴, Trp⁵²⁶, geladene oder potentiell geladene Aminosäuren: Asp⁴¹⁹.
LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend eine Ligandenbindenische, die eine modifizierte Konformation aufweist, welche einem Liganden angepasst ist oder keinen Liganden enthält.
Verfahren zum Auffinden von Liganden des EcR, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, und (b) Computer-unterstütztes Durchsuchen (virtuelles Screenen) von Datenbanken, die Strukturdaten von chemischen Verbindungen enthalten, nach solchen Strukturen, die die Fähigkeit besitzen, spezifische Wechselwirkungen mit einer LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 einzugehen.
Verfahren zum Auffinden von Liganden des EcR, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, und (b) Computer-unterstütztes Modellieren von chemischen Verbindungen mit Strukturen, die die Fähigkeit besitzen, spezifische Wechselwirkungen mit einer LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 einzugehen.
Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen für den Pflanzenschutz, insbesondere von chemischen Verbindungen, welche durch Bindung an eine LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Aktivierung oder Hemmung des EcR bzw. EcR/USP-Komplexes führen, umfassend die folgenden Schritte: (a) Durchführen des Verfahrens gemäß Anspruch 12 oder 13, (b) Synthetisieren der als Liganden identifizierten Verbindung(en), und (c) Detektieren der biologischen Aktivität der im Schritt (b) synthetisierten Verbindung durch Transaktivierungstests, Verdrängungstests oder Biotests.
Wirkstoffe für den Pflanzenschutz, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 14 aufgefunden wurden.
Verfahren zum Auffinden von Effektoren, welche durch Bindung an eine LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Aktivierung oder Hemmung des EcR bzw. des EcR/USP-Komplexes führen und zur steuerbaren Expression von Zielgenen genutzt werden können, umfassend die folgenden Schritte: (a) Durchführen des Verfahrens gemäß Anspruch 12 oder 13, (b) Synthetisieren der als Liganden identifizierten Verbindung(en), (c) Applizieren einer im Schritt (b) synthetisierten Verbindung auf Wirtszellen oder Wirtsorganismen, welche ein auf EcR bzw. EcR/USP basierendes Expressionssystem enthalten, und (d) Detektieren einer Induktion oder Hemmung des Expressionssystems.
Effektoren, welche durch Bindung an eine LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Aktivierung oder Hemmung von EcR bzw. EcR/USP führen und durch das Verfahren gemäß Anspruch 16 aufgefunden wurden.
Verwendung einer LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zum Auffinden von Wirkstoffen für den Pflanzenschutz oder von Effektoren zur kontrollierten Expression von Zielgenen in Wirtszellen oder ganzen Wirtsorganismen.
Verfahren zum Erstellen von Proteinmodellen von EcR-LBDs oder von LBDs verwandten Kernrezeptoren, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer LBD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, und (b) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer LBD mit einer mutierten Aminosäuresequenz.
Verfahren zum Erstellen von Proteinmodellen von EcR-Ligandenbindenischen oder von Ligandenbindenischen verwandten Kernrezeptoren, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer LBD gemäß Anspruch 10, und (b) Computer-unterstütztes Erstellen einer dreidimensionalen Abbildung einer Ligandenbindenische mit den Aminosäuren eines gewählten Organismus oder eines anderen Kernrezeptors.