Aufgabe der Erfindung war es daher,
Verbindungen bereitzustellen, mit denen die mit Kälte assoziierten
Durchblutungsstörungen,
insbesondere das Raynaud-Syndrom, einfach, sicher und effektiv diagnostiziert
und therapiert werden können.
Die Erfindung löst dieses technische Problem
durch die Bereitstellung eines isolierten Nucleinsäuremoleküls – und der
durch dieses codierten Peptides – ausgewählt aus der Gruppe umfassend
- a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz,
die für
Peptid codiert, das folgende Aminosäuresequenzen umfasst: ITTCHDVL, ITTCHDAL
oder LNITTCHD,
- b) ein Nucleinsäuremolekül, welches
zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) komplementär ist,
- c) ein Nucleinsäuremolekül, welches
mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder
b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
- d) ein Nucleinsäuremolekül umfassend
eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist,
um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a), b)
oder c) funktionsanalog zu sein,
- e) ein Nucleinsäuremolekül, das infolge
des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis
d) degeneriert ist und
- f) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer
Nucleotidsequenz nach a) bis e), welches durch Deletionen, Additionen,
Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen
modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis
e) ist.
Die Erfindung betrifft demgemäß die überraschende
Lehre, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle sowie
die sie codierenden Peptide bei Missfunktionen der Wärmeregulation
und von Durchblutungsstörungen,
insbesondere von kleinen Blutgefäßen, die
vor allem Hände,
Füße, Ohren, Wangen,
Nase und Brustwarzen mit Blut versorgen, zur Diagnose und Therapie
eingesetzt werden können.
Insbesondere die von den Nucleinsäuremolekülen codierenden biologischen
Strukturen – bevorzugt Peptide – sind in
der Prophylaxe, Diagnose, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung
von Durchblutungsstörungen,
insbesondere der Kälteallergie
und besonders bevorzugt dem Raynaud-Syndrom, in verschiedenen Formen
einsetzbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül, das eine
ausreichende Homologie aufweist, um mit der Nukleinsäuresequenz
gemäß Punkt
a), b) und/oder c) funktionsanalog zu sein, mindestens zu 40 homolog.
Im Sinne der Erfindung heißt,
um zu den genannten Nucleotidsequenzen bzw. mit diesen Nucleotidsequenzen
hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die Homologen
bei Durchblutungsstörungen,
insbesondere der Kälteallergie,
ein Verhalten zeigen, dass sie sicher und effektiv bei der Diagnose und/oder
der Therapie dieser Erkrankungen bzw. pathogenen Zustände, die
mit diesen Krankheiten assoziiert sind, einsetzbar sind. Funktionsanaloge
Sequenzen im Sinne der Erfindung sind all jene Sequenzen, die der
Fachmann durch Routineversuche als gleichwirkend identifizieren
kann.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung weist das Nukleinsäuremolekül mindestens
60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt
90 %, Homologie zu einem Nukleinsäuremolekül gemäß Punkt d) auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül eine genomische
DNA, eine cDNA und/oder eine RNA.
Die Erfindung betrifft auch einen
Vektor umfassend ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül und weiterhin
auch eine Wirtszelle, die den Vektor umfasst.
Die Erfindung betrifft bevorzugt
auch ein Peptid, das durch ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül sowie
die bevorzugten funktionsanalogen Nucleinsäuremoleküle codiert wird. Das erfindungsgemäße Peptid
kann überraschenderweise
bei der Diagnose und/oder Therapie von mit Kälteunverträglichkeit im Zusammenhang stehenden
Erkrankungen eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide
werden insbesondere von Autoantikörpern von Patienten gebunden,
die an der Akrozyanose, der Kältehämagglutinationskrankheit,
dem Hyperviskositätssyndrom,
dem Ischämiesyndrom,
der Akrotrophoneurose, der Sklerodermie, dem Kälteerythem, der Kältepurpura,
der Kälteurtikaria,
der Kryopathie und/oder der Kryoglobulinämie, insbesondere der Kälteallergie
und besonders bevorzugt dem Raynaud-Syndrom, erkrankt sind.
Das heißt, die Erfindung betrifft
sämtliche Peptide,
die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, bevorzugt
die, die mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 und ganz
besonders bevorzugt 90 % Homologie zu einem Nucleinsäuremolekül gemäß Punkt
d) aufweisen. Selbstverständlich
können
diese funktionsanalogen Nucleinsäuremoleküle durch
Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversionen und/oder
Insertionen so modifiziert sein, dass die durch sie codierten Peptide mit
Autoantikörpern,
die mit dem Raynaud-Syndrom assoziiert
sind, interagieren. Der Fachmann kann durch die Offenbarung der
erfindungsgemäßen Lehre
weitere äquivalente
Peptide generieren, die funktionsanalog zu Peptiden mit der Sequenzabfolge: ITTCHDVL,
ITTCHDAL oder LNITTCHD sind. Beispielsweise ist es möglich, einzelne
oder Gruppen von Aminosäuren
auszutauschen, ohne dass die Aktivität der Peptide in Bezug auf
die Lösung
der erfindungsgemäßen Aufgabe
nachteilig beeinflusst wird. Für
den Austausch derartiger Aminosäuren
sei auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Genetik
verwiesen.
Im Stand der Technik sind verschiedene Möglichkeiten
zur Herstellung von Peptiden offenbart. Peptide, die von den erfindungsgemäßen Peptiden
ausgehend mit solchen Verfahren designt werden, sind von der erfindungemäßen Lehre
mit erfasst. Eine Möglichkeit
des Generierens von funktionsanalogen Peptiden ist beispielsweise
in PNAS USA 1998, Oct. 13; 9521: 12179–84, WO 99/62933 und/oder WO
02/38592 beschrieben; diese Lehren sind in den Offenbarungsgehalt
der Erfindung mit aufgenommen. Das heißt, sämtliche Peptide, Peptidfragmente
oder Strukturen, die Peptide umfassen, die mit den genannten Verfahren – von den
erfindungsgemäßen Peptiden
ausgehend – generiert wurden,
sind Peptide im Sinne der Erfindung, sofern sie die erfindungsgemäße Aufgabe
lösen,
insbesondere mit den krankheitsverursachenden Autoantikörpern wechselwirken.
Bei diesen Autoantikörpern kann
es sich beispielsweise um agonistische Autoantikörper handeln, die Rezeptoren
aktivieren. Im folgenden sind bevorzugte dieser Rezeptoren beschrieben.
Die Peptidsequenzen können beispielsweise ein
natürlicher
Bestandteil der zweiten extrazellulären Schleife des Thrombin-Rezeptors
(PAR-1), dem Trypsin- und Tryptase-Rezeptor (PAR-2) und/oder des
Thrombin-Rezeptors bzw. Rezeptor unbekannter Proteasen (PAR-3) sein. Über raschenderweise wechselwirken
die Autoantikörper
spezifisch mit dem zweiten extrazellulären Loop bzw. der Schleife
des jeweiligen Protease-aktivierten Rezeptors (PAR). Die Erfindung
betrifft demgemäß auch die überraschende
Lehre, dass das Hauptepitop der Autoantikörper, die mit Kälteinduzierten
Krankheiten assoziiert sind, insbesondere der Kälteallergie und besonders bevorzugt
dem Raynaud-Syndrom, Peptide mit der Aminosäuresequenz ITTCHDVL, ITTCHDAL
und/oder LNITTCHD sind. Diese Sequenz ist auf dem PAR-1 und PAR-2
vorzugsweise völlig
identisch. Bei PAR-3 ist das nahe dem C-terminalen Ende gelegene
Valin (V) durch Alanin (A) ersetzt. Bei den Autoantikörpern kann
es sich demgemäß um Antikörper handeln,
die als agonistische Autoantikörper
fungieren, d.h. diese Autoantikörper
sind in der Lage, durch die Bindung an die entsprechenden Rezeptoren
diese zu aktivieren. Durch diese Aktivierung des Rezeptors können verschiedene
Krankheiten bzw. pathogene Veränderungen
induziert und/oder begleitet werden. Beispielsweise ist es möglich, dass
durch die Aktivierung der Rezeptoren die Produktion von Messenger-Molekülen moduliert
wird. Es ist jedoch auch möglich, dass
die Autoantikörper
die Rezeptoren der Zellen schädigen,
die für
eine im wesentlichen normale Durchblutung der Gliedmaßen verantwortlich
sind. Im Gegensatz zu der Wirkung der agonistischen Autoantikörper steht
bei nicht-agonistischen Autoantikörpern die üblicherweise bei Antikörpern beobachtete
Funktion des Attackierens und Schädigens durch chronische Beanspruchung
des entsprechenden Targets im Vordergrund; dies schließt jedoch eine
Aktivierung oder Deaktivierung der Rezeptoren nicht aus.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Peptid zusätzlich Aminogruppen, Amide,
Acetylgruppen, Biotingruppen, Marker, Spacer und/oder Linker.
Vorteilhafterweise ist es möglich, das
Peptid durch derartige Strukturen in verschiedenen Bereichen der
Diagnose und Therapie von Autoimmunkrankheiten einzusetzen. Dem
Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten
bekannt, Peptide für
verschiedene Verwendungen zu modifizieren. Wenn beispielsweise vorgesehen
ist, die Peptide als Arzneimittel, beispielsweise oral zu geben,
sind bestimmte Veränderungen
an der Struktur der Peptide vorzunehmen, die dem Fachmann bekannt
sind. Es ist jedoch auch möglich,
dass die Peptide an das Trägermaterial
von Affinitätssäulen gebunden
werden, um zur Reinigung von Körperflüssigkeiten,
insbesondere von Blut, verwendet zu werden, die Bindung der Peptide
an eine Matrix erfordert bestimmte strukturelle Modifikationen der
erfindungsgemäßen Peptide,
die dem Fachmann ebenfalls bekannt oder durch Routineversuche zu
ermitteln sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
weist das Peptid die Aminosäuresequenz X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10
auf, wobei
X1 = Aminogruppe, Amid, Acetylgruppe, Biotingruppe,
Marker, Spacer, Linker, GKK, SGKK oder Deletion,
X2 = I, L,
V, A,
X3 = T, N, D, R
X4 = T, I, L, A,
X5 = C, T,
A, S,
X6 = H, T, S, A,
X7 = D, C, G, E,
X8 = V, H,
A, L,
X9 = L, D, Y, F,
X10 = Aminogruppe, Amid, Acetylgruppe,
Biotingruppe, Marker, Spacer, Linker, GKK, SGKK oder eine Deletion
ist.
Dem Fachmann ist bekannt, dass einzelne Aminosäuren analoge
physikochemische Eigenschaften aufweisen, die mit Vorteil dazu führen, dass diese
Aminosäuren
untereinander ausgetauscht werden können. Hierzu gehören beispielsweise
die Gruppe der Aminosäuren
(a) Glycin, Alanin, Valin, Leucin und/oder Isoleucin; bzw. die Aminosäuren (b) Serin
und Threonin, die Aminosäuren
(c) Asparagin und Glutamin, die Aminosäuren (d) Asparaginsäure und
Glutaminsäure;
die Aminosäuren
(e) Lysin und Arginin sowie die Gruppe der aromatischen Aminosäuren (f)
Phenylalanin, Tyrosin und/oder Tryptophan. Aminosäuren innerhalb
ein und derselben Gruppe (a–f)
können
untereinander ausgetauscht werden. Weiterhin ist es möglich, dass
Aminosäuren durch
modifizierte Aminosäuren
oder spezifische Enantiomere ausgetauscht werden. Weitere Modifikationen
sind gemäß der Lehre
nach der WO99/62933 oder WO02/38592 möglich.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Peptid einen Linker und/oder einen Spacer, der ausgewählt ist
aus der Gruppe umfassend: α-Aminocarbonsäuren sowie
deren Homo- und Heterooligomere, α,ω-Aminocarbonsäuren sowie
deren verzweigte Homo- oder Heterooligomere, sonstige Aminosäuren sowie
die linearen und verzweigten Homo- oder Heterooligomere (Peptide);
Amino-oligoalkoxy-alkylamine; Maleinimidocarbonsäure-Derivate; Oligomere von
Alkylaminen; 4-Alkylphenyl-Derivate; 4-Oligoalkoxyphenyl- oder 4-Oligoalkoxyphenoxy-Derivate;
4-Oligoalkylmercaptophenyl- oder 4-Oligoalkylmercaptophenoxy-Derivate;
4-Oligoalkylaminphenyl- oder
4-Oligoalkylaminyphenoxy-Derivate; (Oligoalkylbenzyl)-phenyl- oder 4-Oligoalkylbenzyl)-phenoxy-Derivate
sowie 4-Oligoalkoxybenzyl)-phenyl-
oder 4-Oligoalkoxybenzyl)-phenoxy-Derivate;
Trityl-Derivate; Benzyloxyaryl- oder Benzyloxyalkyl-Derivate; Xanthen-3-yl-oxyalkyl-Derivate; (4-Alkylphenyl)-
oder ω-(4-Alkylphenoxy)-alkansäure-Derivate; Oligoalkyl-Phenoxyalkyl-
oder Oligoalkoxyphenoxyalkyl-Derivate; Carbamat-Derivate; Amine;
Trialkylsilyl- oder Dialkyl-alkoxysilyl-Derivate; Alkyl- oder Aryl-Derivate und/oder
Kombinationen davon; weitere mögliche
Strukturen werden in der
EP 1 214
350 beschrieben, die in den Offenbarungsgehalt der Erfindung
mit aufgenommen sind.
Nach einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Peptid ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
- a) ein Peptid umfassend die Aminosäuresequenz ITTCHDVL,
ITTCHDAL und/oder LNITTCHD,
- b) ein Peptid umfassend eine Aminosäuresequenz, die eine ausreichende
Homologie aufweist, um zu einer Aminosäuresequenz gemäß a) funktionsanalog
zu sein,
- c) ein Peptid gemäß einer
Aminosäuresequenz
a) oder b), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen,
Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und
funktionsanalog zu einer Aminosäuresequenz
gemäß a) oder
b) ist.
In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung ist das Peptid, was eine ausreichende Homologie aufweist,
um zu einer der folgenden Aminosäuren
ITTCHDVL, ITTCHDAL und/oder LNITTCHD funktionsanalog zu sein, zu
diesen zumindest 40 homolog.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
sind diese Aminosäuresequenzen
mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders
bevorzugt 90 %, homolog zu einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
ITTCHDVL, ITTCHDAL und/oder LNITTCHD.
In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung besteht das Peptid im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz
ITTCHDVL, ITTCHDAL und/oder LNITTCHD. Insbesondere besteht das Peptid
aus Abwandlungen dieser Sequenzen, die nach der WO99/62933 und der WO02/38592
gewonnen wurden, wobei diese Peptide selbstverständlich Autoantikörper im
Sinne der Erfindung binden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das Peptid als therapeutischer Wirkstoff eingesetzt
oder verwendet. Die Verwendung als therapeutischer Wirkstoff meint
im Sinne der Erfindung die Anwendung des Peptides auf dem gesamten
Gebiet der Medizin.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das Peptid von spezifischen Antikörpern von
Patienten mit einer Kälteallergie
gebunden, insbesondere von Autoantikörpern. Bei einem definierten,
dem Fachmann bekannten Mengenverhältnis von Peptid und Autoantikörper kommt
es zur Ausbildung von Autoantikörper-Peptid-Komplexen, die beispielsweise
ausfallen, oder spezifisches Reaktionsverhalten dergestalt zeigen, dass
sie zur Eliminierung der Autoantikörper genutzt werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist insbesondere das Peptid immobilisiert. Im Sinne
der Erfindung werden unter Immobilisierung verschiedene Verfahren
und Techniken zum Fixieren der Peptide auf bestimmten Trägern beispielsweise
gemäß der WO99/56126
oder der WO02/26292 verstanden. Die Immobilisierung kann beispielsweise
der Stabilisierung der Peptide dienen, wodurch diese insbesondere
bei Lagerung oder bei einmaligem Batch-Ansatz durch biologische,
chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Aktivität nicht
reduziert oder nachteilig modifiziert werden. Durch die Immobilisierung
der Peptide ist ein wiederholter Einsatz unter technischen oder
klinischen Routine-Bedingungen möglich;
weiterhin kann eine Probe – bevorzugt
Blutbestandteile – mit
mindestens einem der erfindungsgemäßen Peptide kontinuierlich umgesetzt
werden. Dies kann insbesondere durch verschiedene Immobilisierungstechniken
erreicht werden, wobei die Bindung der Peptide an andere Peptide
oder Moleküle
bzw. an einen Träger
so erfolgt, dass die dreidimensionale Struktur, insbesondere an
dem Zentrum, das die Wechselwirkung mit den Autoantikörpern vermittelt,
der entsprechenden Moleküle,
insbesondere der Peptide, nicht verändert wird. Vorteilhafterweise
geht die Spezifität
zu den Autoantikörpern
der Patienten durch die Immobilisierung nicht verloren. Im Sinne
der Erfindung können drei
grundsätzliche
Methoden zur Immobilisierung verwendet werden:
- (i)
Quervernetzung: Bei der Quervernetzung werden die Peptide miteinander
fixiert, ohne dass ihre Aktivität
nachteilig beeinflusst wird. Sie sind vorteilhafterweise durch die
Quervernetzung nicht mehr löslich.
- (ii) Bindung an einen Träger:
Die Bindung an einen Träger
erfolgt zum Beispiel durch Adsorption, Ionenbindung oder kovalente
Bindung. Dies kann auch innerhalb von mikrobiellen Zellen bzw. Liposomen
oder anderen membranhaltigen geschlossenen bzw. offenen Strukturen
erfolgen. Die Peptide werden durch die Fixierung vorteilhafterweise nicht
in ihrer Aktivität
beeinflusst. Die Peptide können
mit Vorteil zum Beispiel in der Klinik in Diagnose oder Therapie
trägergebunden
mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.
- (iii) Einschluss: Der Einschluss erfolgt im Sinne der Erfindung
insbesondere an eine semipermeable Membran in Form von Gelen, Fibrillen
oder Fasern. Gekapselte Peptide sind durch eine semipermeable Membran
so durch die umgebende Probenlösung
getrennt, dass sie vorteilhafterweise noch mit den Autoantikörpern oder
mit Fragmenten dieser interagieren können. Für die Immobilisierung stehen
verschiedene Verfahren zur Verfügung,
wie beispielsweise die Adsorption an einen inerten oder elektrisch
geladenen anorganischen oder organischen Träger. Solche Träger können beispielsweise
poröse
Gele, Aluminiumoxid, Betonid, Agarose, Stärke, Nylon oder Polyacrylamid
sein. Die Immobilisierung erfolgt hierbei durch physikalische Bin dungskräfte, oft
unter Beteiligung von hydrophoben Wechselwirkungen und ionischen
Bindungen. Derartige Methoden sind vorteilhafterweise einfach zu
handhaben und sie beeinflussen die Konformation der Peptide nur in
geringem Umfang. Durch elektrostatische Bindungskräfte zwischen
den geladenen Gruppen der Peptide und dem Träger kann die Bindung vorteilhafterweise
verbessert werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Ionenaustauschern,
insbesondere Sephadex.
Ein weiteres Verfahren ist die kovalente
Bindung an Trägermaterialien.
Die Träger
können
dazu reaktive Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten homöopolare
Bindungen eingehen. Geeignete Gruppen in Peptiden sind Carboxy-,
Hydroxy- und Sulfidgruppen und insbesondere die endständigen Aminogruppen
von Lysinen. Aromatische Gruppen bieten die Möglichkeit für Diazo-Kopplungen. Die Oberfläche von
mikroskopischen porösen Glaspartikeln
kann durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit
Peptiden umgesetzt werden. Hydroxy-Gruppen natürlicher Polymere können zum
Beispiel mit Bromzyan aktiviert und anschließend mit Peptiden gekoppelt
werden. Mit Polyacrylamid-Harzen können zahlreiche Peptide vorteilhafterweise
direkte kovalente Bindungen eingehen. Bei dem Einschluss in dreidimensionale
Netzwerke werden die Peptide in ionotrophe Gele oder andere dem Fachmann
bekannte Strukturen eingeschlossen. Die Poren der Matrix sind insbesondere
so beschaffen, dass die Peptide zurückgehalten werden und eine
Interaktion mit den Ziel-Molekülen
möglich
ist. Bei der Quervernetzung werden die Peptide durch Vernetzung
mit bifunktionellen Agenzien in polymere Aggregate umgewandelt.
Derartige Strukturen sind gelatinös und leicht verformbar und
insbesondere für
den Einsatz in verschiedenen Reaktoren geeignet. Durch Zugabe anderer
inaktiver Komponenten, wie zum Beispiel Gelatine, bei der Vernetzung
können
die mechanischen und Bindungseigenschaften vorteilhafterweise verbessert
werden. Bei der Mikroverkapselung wird der Reaktionsraum der Peptide
mit Hilfe von Membranen eingegrenzt. Die Mikroverkapselung kann
zum Beispiel als Grenzflächen-Polymerisation durchgeführt werden.
Durch die Immobilisierung bei der Mikroverkapselung werden die Peptide
unlöslich und
dadurch wieder verwendbar. Im Sinne der Erfindung sind immobilisierte
Peptide alle Peptide, die sich in einem Zustand befinden, der ihre
Wiederverwendung erlaubt. Die Einschränkung der Beweglichkeit und
der Löslichkeit
der Peptide auf chemischem, biologischem oder physikalischem Wege
führt vorteilhafterweise
zu niedrigen Verfahrenskosten, insbesondere bei der Eliminierung
von Autoantikörpern aus
Blutbestandteilen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Peptid an eine Festphase gebunden. Die Bindung
des Peptides an die Festphase kann über einen Spacer erfolgen.
Als Spacer können
alle chemischen Verbindungen eingesetzt werden, die für die Funktion
des Spacers die geeigneten strukturellen und funktionellen Voraussetzungen
aufweisen, solange sie nicht das Bindeverhalten derart modifizieren,
dass eine Bindung des Autoantikörpers mit
dem Peptid nachteilhafterweise beeinträchtigt wird.
Die Erfindung betrifft auch Erkennungsmoleküle, die
gegen die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, die
erfindungs gemäßen Vektoren,
die erfindungsgemäßen Wirtszellen
und/oder gegen die erfindungsgemäßen Peptide
gerichtet sind. Bevorzugt sind die Erkennungsmoleküle Antikörper, Antisense-Konstrukte
und/oder Chelatoren. Die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle können Antikörper sein,
die gegen die Autoantikörper
gerichtet sind, die beispielsweise die Kälteallergie, insbesondere das Raynaud-Syndrom,
induzieren.
Die Erfindung betrifft auch eine
pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, die
Vektoren, die Wirtszellen, die Peptide und/oder die Erkennungsmoleküle gegebenenfalls
mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere als
Arzneimittel eingesetzt werden. Hierzu ist es beispielsweise möglich, die
Peptide durch Zyklisierung oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren
so zu modifizieren, dass sie durch körpereigene peptidabbauende
Strukturen, wie zum Beispiel Serumproteasen, nicht zerstört werden
können.
Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide oder Erkennungsmoleküle ist es
möglich,
die Autoantikörper
in oder ex vivo zu neutralisieren. Bei einer in vivo Neutralisation
werden die Arzneimittel dem Patienten direkt verabreicht, bei einer
ex vivo Neutralisation wird beispielsweise das Blut über eine
Schleife – zum
Beispiel in Form eines Schlauch-Kreislaufes – aus dem Körper geleitet, folgend mit
dem Arzneimittel in Kontakt gebracht und nach der erfolgten Neutralisation
der Autoantikörper wieder
in den Organismus, insbesondere dem Patienten, zurückgeführt. Im
Sinne der Erfindung gelten als Arzneimittel sowohl solche pharma zeutischen
Zusammensetzungen, die für
die therapeutischen und prophylaktischen Zwecke verwendet werden
als auch solche pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als Diagnostikum
eingesetzt werden können.
Arzneimittel oder pharmazeutische
Zusammensetzungen, die vorliegend synonym verwendet werden, sind
erfindungsgemäß Stoffe
und Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung
am oder im menschlichen Körper
Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder
krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern oder zu verhüten. Medizinische
Hilfsstoffe sind erfindungsgemäß solche
Stoffe, die zur Produktion als aktive Ingredienzien von Arzneimitteln
eingesetzt werden. Pharmazeutisch-technische Hilfsstoffe dienen
der geeigneten Formulierung des Arzneimittels oder der pharmazeutischen
Zusammensetzung und können
sogar, sofern sie nur während
des Herstellungsverfahrens benötigt werden,
anschließend
entfernt werden oder können als
pharmazeutisch verträgliche
Träger
Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Beispiele für pharmazeutisch
verträgliche
Träger
sind nachstehend aufgeführt.
Die Arzneimittelformulierung oder Formulierung der pharmazeutischen
Zusammensetzung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem
pharmazeutisch verträglichen
Träger
und/oder Verdünnungsmittel.
Beispiele für
geeignete pharmazeutisch verträgliche
Träger
sind dem Fachmann bekannt und umfassen zum Beispiel Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösungen,
Wasser, Emulsionen wie zum Beispiel Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten
von Detergenzien, sterile Lösungen,
etc. Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche
Träger
umfassen, können
mittels bekannter konven tioneller Methoden formuliert werden. Diese
Arzneimittel oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können einem
Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden, beispielsweise
in einem Bereich von 1 μg
bis 10 g an Peptiden pro Tag und Patient. Bevorzugt werden dabei
Dosen von 1 mg bis 1 g. Bevorzugt wird eine Verabreichung von möglichst
wenigen und niedrigen Dosen und weiter bevorzugt eine einmalige
Dosis. Die Verabreichung kann auf verschiedenen Wegen erfolgen,
beispielsweise intravenös,
intraperitoneal, intrarektal, intragastrointestinal, intranodal,
intramuskulär,
lokal, beispielsweise in den Tumor, aber auch subkutan, intradermal
oder auf der Haut oder über
die Schleimhäute.
Die Verabreichung von Nukleinsäuren,
die für
das erfindungsgemäße Peptid
codieren, kann auch in Form von Gen-Therapie geschehen, beispielsweise über virale
Vektoren. Die Art der Dosierung und des Verabreichungsweges kann
vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt
werden. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung
von verschiedenen Faktoren abhängig
ist, wie zum Beispiel der Größe, der
Körperoberfläche, dem
Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten,
aber auch von dem speziellen Mittel, welches verabreicht wird, der
Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die
möglicherweise
parallel verabreicht werden. Weiterhin ist dem Fachmann bekannt,
dass er die Konzentration der Autoantikörper mit den erfindungsgemäßen Peptiden
zunächst
diagnostizieren kann, um die notwendige Konzentration des Arzneimittels zu
bestimmen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen
oder das Arzneimittel umfassen insbesondere eine pharmakologische
Substanz, die ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide oder Erkennungsmoleküle oder/und
diese codierende Nukleinsäuremoleküle in einer
geeigneten Lösung
oder Verabreichungsform enthält.
Diese können
entweder alleine mit den entsprechenden unter Arzneimitteln oder pharmazeutischen
Zusammensetzungen beschriebenen Hilfsstoffen oder in Kombination
mit einem oder mehreren Adjuvantien, beispielsweise QS-21, GPI-0100
oder andere Saponine, Wasser-Öl
Emulsionen wie beispielsweise Montanide, Adjuvantien, Polylysin,
Polyargininverbindungen, DNA-Verbindungen wie beispielsweise CpG,
Detox, bakterielle Vakzine wie beispielsweise Thyphusvakzine oder BCG-Vakzine,
Salze wie beispielsweise Kalziumphosphate und/oder einem anderen
geeigneten Stoff zur Wirkungsverstärkung verabreicht werden; vorzugsweise
immunstimulatorische Moleküle,
wie Interleukine, beispielsweise IL-2, IL-12, IL-4 und/oder Wachstumsfaktoren,
beispielsweise GM-CSF. Diese werden in bekannten Methoden mit den
erfindungsgemäßen Peptiden
oder Erkennungsmolekülen
gemischt und in einer geeigneten Formulierung und Dosierung verabreicht.
Formulierungen, Dosierungen und geeignete Komponenten sind dem Fachmann bekannt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung oder
das Arzneimittel kann selbstverständlich auch eine Kombination
von zwei oder mehreren der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
oder Arzneimittel sein, sowie eine Kombination mit anderen Arzneimitteln,
wie beispielsweise Antikörpertherapien,
Chemotherapien oder Radiotherapien, die auf eine geeignete Weise
zeitlich gemeinsam oder getrennt verabreicht bzw. angewandt werden.
Die Herstellung der Arznei mittel oder pharmazeutischen Zusammensetzungen
erfolgt nach an sich bekannten Methoden.
Die Erfindung betrifft auch einen
Kit umfassend das Nucleinsäuremolekül, den Vektor,
die Wirtszelle, das Peptid und/oder das Erkennungsmolekül, gegebenenfalls
mit einer Anleitung oder Information zur pharmazeutischen Bereitstellung
bzw. zum therapeutischen Behandlungsverfahren. Die Information kann
beispielsweise ein Beipackzettel sein oder ein anderes Medium, was
dem Anwender Informationen darüber
gibt, in welchem therapeutischen Verfahren die genannten Substanzen
einzusetzen sind. Der Beipackzettel enthält insbesondere detaillierte
und/oder wesentliche Informationen über das Heilverfahren. Selbstverständlich ist
es nicht zwingend erforderlich, dass die Information einen Beipackzettel
darstellt, es ist möglich,
dass diese Information beispielsweise über das Internet mitgeteilt wird.
Die Erfindung betrifft auch eine
Vorrichtung zur Chromatographie, die die erfindungsgemäßen Peptide
umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Peptide innerhalb des Chromatographiesystems an eine Festphase
gebunden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann insbesondere
dazu verwendet werden, die Autoantikörper aus Flüssigkeiten eines Patienten
zu eliminieren bzw. die Autoantikörper zu neutralisieren. Dieses Verfahren
ist dem Fachmann unter dem Begriff der Immunadsorption und der Apheresetherapie
bekannt. Mit Hilfe der Immunadsorption werden Immunglobuline aus
dem Blut des Patienten entfernt. Vorteilhafterweise kann diese Immunadsorptionsbehandlung
stationär
und ambulant durchgeführt
werden. Es kann vorgesehen sein, dass die Vorrichtung, insbesondere
der so genannte Adsorber, Bestandteil eines extrakorporalen Blutkreislaufes
ist. Hierbei wird dem Patienten aus einem größeren Körpergefäß, insbesondere einer Armvene,
kontinuierlich bzw. diskontinuierlich Blut entnommen und mittels
Filtration oder Zentrifugation in einzelne Bestandteile, wie beispielsweise
die zellulären
und die humoralen Bestandteile, separiert. Ein wesentlicher Bestandteil des
Blutes, das hierdurch gewonnen wird, ist insbesondere Blutplasma.
Das Blutplasma kann vorteilhafterweise durch die erfindungsgemäße Vorrichtung geleitet
und nach Adsorption der Autoantikörper zusammen mit den zuvor
separierten Blutbestandteilen, insbesondere den zellulären Bestandteilen,
dem Patienten zurückgegeben
werden, insbesondere durch eine andere Arm- bzw. Beinvene. Es kann
weiterhin vorgesehen sein, dass die Peptide an einer Sepharose-Matrix
immobilisiert sind. Diese Matrix kann in einen Behälter gegeben
werden, der ein Volumen von 10 bis 400 ml aufweist. Das Blutplasma
des Patienten kann dann über
diese Matrix geleitet werden, wobei die Autoantikörper binden
und so aus dem Blutplasma eliminiert werden können. Dem Fachmann sind verschiedene
Möglichkeiten
bekannt, derartige festphasenfixierte Peptide bereitzustellen, beispielsweise
in Form von (i) regenerationsfähigen
Adsorptionssäulen,
in Form von (ii) Doppelsäulen
als auch in Form von (iii) Einmalsäulen. Die verschiedenen Spül- und Elutionslösungen,
die eine hohe Effizienz der Behandlung ermöglichen, können durch den Fachmann problemlos
durch Routineversuche ermittelt werden. Durch die Bereitstellung
der erfindungsgemäßen Lehre,
insbesondere der erfindungsgemäßen Peptide,
sind dem Fachmann verschiedene Möglichkeiten
offenbart, diese in vivo, ex vivo und in vitro, zur Prophylaxe,
Diagnose, Therapie als auch zur Nachbehandlung von Kälte-induzierten,
Autoantikörper-vermittelten
Krankheiten einzusetzen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren
zur Behandlung einer Kälteallergie
durch eine Bindung und/oder eine Entfernung von Autoantikörpern mittels
von an eine Festphase gebundene erfindungsgemäße Peptide.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die Autoantikörper
gegen PAR-1, PAR-2 und/oder PAR-3 gerichtet.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der
erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, der erfindungsgemäßen Wirtszellen,
des erfindungsgemäßen Vektors,
der erfindungsgemäßen Peptide,
der erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, der
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung, des erfindungsgemäßen Kits als auch der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zur Prophylaxe, Diagnose, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung
von Durchblutungsstörungen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der
erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, der erfindungsgemäßen Wirtszellen,
des erfindungsgemäßen Vektors,
der erfindungsgemäßen Peptide,
der erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, der
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung, des erfindungsgemäßen Kits als auch der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Durchblutungsstörungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die Durchblutungsstörungen eine Akrozyanose, eine
Kältehämagglutinationskrankheit, ein
Hyperviskositätssyndrom,
ein Ischämiesyndrom, eine
Akrotrophoneurose, eine Sklerodermie, ein Kälteerythem, eine Kältepurpura,
eine Kälteurtikaria, eine
Kryopathie und/oder eine Kryoglobulinämie. Eine Akrozyanose im Sinne
der Erfindung ist jede Verfärbung
der Akren bei allgemeiner Zyanose infolge örtlicher, venös-kapillärer vasomotorischer
Störungen,
die verstärkt
bei Kälte
und Nässe
und mit Neigung zu Erfrierungen auftreten. Erfindungsgemäß ist die
Akrozyanose insbesondere A. anaesthetica, A.e frigore und/oder A.
juvenile. Eine Kältehämagglutinationskrankheit
im Sinne der Erfindung ist eine erworbene Krankheit, die auf der
Bildung von Kältehämagglutin
beruht. Sie kann beispielsweise eine Hämolyse zur Folge haben, insbesondere
wenn die Umgebungstemperatur auf unter 20°C fällt. Das Hyperviskositätssyndrom
ist erfindungsgemäß eine Krankheit,
bei der durch erhöhte
Viskosität
das Fließvermögen des
Blutes herabgesetzt wird. Das Ischämiesyndrom wird im Sinne der
Erfindung in das akrale und das intermittierende Ischämiesyndrom
unterschieden. Es werden hierunter im Sinne der Erfindung alle funktionellen,
organischen und gemischt-funktionell organischen Durchblutungsstörungen der
Hände und Füße verstanden.
Im engeren Sinne kann es sich beispielsweise auch um das Raynaud-Syndrom
handeln. Die Akrotrophoneurose bedeutet die Störung der Durchblutung der Gewebsernährung an
den Glied maßen,
insbesondere an den Gliedmaßenenden.
Sklerodermie im Sinne der Erfindung ist ein Oberbegriff für chronisch
verlaufende Krankheiten mit bindegewebiger Verhärtung entweder umschriebener
Hautareale oder bei generalisiertem Befall der Haut unter Beteiligung
innerer Organe. Im Sinne der Erfindung werden zum einen die diffuse
oder progressive und zirkumskripte Sklerodermie unterschieden. Das
Kälteerythem
ist beispielsweise ein akuter Gewebsschaden durch eine Kälteeinwirkung,
insbesondere infolge von Mangeldurchblutung, aber auch infolge eines
direkten thermischen Angriffs. Hierbei kann es beispielsweise zu
diskontinuierlichen Nervendegenerationen, Muskel- und Fettgewebsnekrosen
als auch zu Knochenschäden
kommen. Die Kältepurpura
ist im Sinne der Erfindung eine kleine Blutung im Bereich der Haarfollikel
infolge einer Kälteeinwirkung.
Unter Kälteurtikaria
wird die Quaddelbildung verstanden, nachdem ein Hautareal mit einem kalten
Gegenstand, mit kaltem Wasser oder mit kaltem Wind in Kontakt gekommen
ist. Eine Kryopathie ist im Sinne der Erfindung eine örtliche
oder ein allgemeiner Krankheitszustand nach echter Kälteschädigung bzw.
eine Krankheit mit Auftreten von Kälteglobolinen, bei konstitutioneller
Kälteunverträglichkeit.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Durchblutungsstörung eine Kälteallergie.
Besonders bevorzugt ist die Kälteallergie
ein Raynaud-Syndrom. Erfindungsgemäß wird zwischen dem Primär- und dem Sekundär-Raynaud-Syndrom unterschieden.
Primär
ist die Krankheit eine funktionelle Störung der kleinen versorgenden
Gefäße der Akren
ohne erkennbare Grund erkrankungen. Charakteristisch ist beispielsweise
der beidseitige Befall – auch
Symmetrie – der
Hände bzw.
der Zehen. Die Beschwerden der primären Krankheit lassen im Alter nach.
Diese Krankheit kommt bei 20 % der Raynaud-Patienten vor. Die sekundäre Krankheit
ist häufig ein
ungleicher Befall beider Hände
oder Füße als Ausdruck
einer anderen zugrunde liegenden Erkrankung, teils ohne organische
Gefäßerkrankungen,
wie zum Beispiel Nervenschädigungen,
bei bestimmten Medikamenten wie zum Beispiel Migränemitteln. Häufig ist
die Krankheit mit einer organischen Gefäßerkrankung, vor allem einer
Gefäßentzündung im Rahmen
einer Bindegewebserkrankung, einer so genannten Kollagenose, verbunden.
Beim Fortschreiten der Erkrankung kann es zu Wachstumsstörungen der
Nägel sowie
Absterben der Fingerkuppen (verhärtendes
Phänomen)
kommen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der
erfindungsgemäßen Peptide
sowie Nucleinsäuren
oder Wirtszellen, der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung,
des erfindungsgemäßen Kits
und/oder der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zum Screenen von Arzneimitteln. Das Screenen von Arzneimitteln kann
beispielsweise die Identifizierung von Substanzen, insbesondere
Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten und/oder Lipiden umfassen, die
mit den Peptiden und demgemäß mit den
Loops, insbesondere dem zweiten Loop von PAR-1, PAR-2 und/oder PAR-3
wechselwirken. Eine Wechselwirkung kann beispielsweise eine Bindung an
diese Peptide sein oder aber auch eine Aktivierung bzw. eine Inhibierung
von oder durch Peptide. Ein Arzneimittel könnte demgemäß beispielsweise eine Struktur
sein, die im Körper
eines Patienten an die Peptide, und dementsprechend an die Loops
bindet und so mit den Autoantikörpern
um eine Bindungsstelle konkurriert. Durch die Offenbarung der erfindungsgemäßen Lehre,
insbesondere über
die Offenbarung des Zusammenhangs von Krankheit und dem Bindungsort
der Autoantikörper,
kann der Fachmann verschiedene Arzneimittel screenen. Das Screenen
von Arzneimitteln aufgrund von offenbarten Targets gehört zum allgemeinen
Wissen des Fachmanns und erfolgt durch Routineversuche; es sei auf
die entsprechenden Standardwerke der Molekularbiologie und Pharmakologie
verwiesen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren
zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit durch eine Bindung und/oder
Entfernung von Autoantikörpern mittels
von an eine Festphase gebundenen erfindungsgemäßen Peptiden. Durch die an
die Festphase gebundenen Peptide werden die Autoantikörper gebunden,
komplexiert und/oder an der Festphase neutralisiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden mit den genannten erfindungsgemäßen Stoffen
und Erzeugnissen sowie den Vorrichtungen, insbesondere der Chromotographievorrichtung
und den Peptiden gegen PAR-1, PAR-2 und/oder PAR-3 gerichtete Autoantikörper detektiert, gebunden,
komplexiert und/oder neutralisiert. Beispielsweise können die
Peptide dazu eingesetzt werden, mit einem ELISA oder einem anderen
einem Fachmann bekannten immunologischen Detektionsverfahren, Autoantikörper in
Seren von Patienten nachzuweisen. Für die Detektion kann es beispielsweise
vorteilhaft sein, dass die Autoantikörper durch biotinylierte bzw.
anderweitig gekoppelte Peptide gebunden und durch Streptavidin-gekoppelte
Träger, wie
zum Beispiel Magnetpartikel oder -platten, separiert werden. Ein
solches Verfahren ist in der
DE
102 56 897.9 beschrieben und in den Offenbarungsgehalt der
Anmeldung mit aufgenommen. Die separierten Autoantikörper werden
insbesondere durch IgG-Subtyp-spezifische markierte Antikörper detektiert.
Im Falle des Raynaud-Syndroms werden die Antikörper insbesondere mit IgG
1-Subtyp-spezifischen markierten Antikörpern detektiert.