Nach Herbert (Am. J. Clin. Nutr.
1994; 59 (suppl.): 1213S-22S) lässt
sich der Übergang
vom normalen Vitamin B12-Status bis zum Vitamin B12-Mangel in vier Stadien
unterteilen. Das erste Stadium ist meist durch eine erniedrigte
Vitamin B12-Konzentration im Serum gekennzeichnet. Im zweiten Stadium
ist bereits eine Depletion mit einer beginnenden Reduzierung der
Vitamin B12-Zellspeicher erkennbar, und im dritten Stadium liegt
bereits ein biochemischer Vitamin B12-Mangel mit gravierenden Funktionsstörungen wie
beispielsweise einer mangelhaften Erythropoese vor. Das vierte Stadium
stellt einen klinisch manifesten Vitamin B12-Mangel dar, in dem
Anämie
und Nervenschädigungen
vorliegen können.
Je nach Dauer des Mangelzustandes können Schädigungen auftreten, die nicht
mehr reversibel sind.
Ein Vitamin B12-Mangel führt beim
Menschen zur perniziösen
Anämie,
einer Form der megaloblastären
Anämie.
Weiterhin kann es zur Bildung einer funikulären Myelose, einer schweren
Degeneration bestimmter Rückenmarksbezirke
kommen. Die hämatologischen
Symptome eines Vitamin B12-Mangels gleichen dem eines Folsäuremangels.
Der Mangel an Folsäure ist,
nach dem Mangel an Vitamin B12, der am meisten verbreitete Vitaminmangel.
Ursachen für
einen Folsäuremangel
können
beispielsweise eine Mangelernährung,
eine Malabsorption, ein erhöhter
Bedarf z.B. während
einer Schwangerschaft oder Laktation, eine erhöhte Ausscheidung, z.B. während einer
Langzeithämodialyse
oder Medikamenten-induzierte Störungen
sein.
Eine Schlüsselrolle spielt Tetrahydrofolsäure beispielsweise
als Coenzym in der Thymidylatsynthese. Da hierbei auch Vitamin B12
als Coenzym beteiligt ist, kann auch in Folge eines Vitamin B12-Mangels
ein funktioneller Folsäuremangel
auftreten.
Im menschlichen Körper sind die Möglichkeiten
für Speicherung
der Folsäure
begrenzt. Die Folsäurespeicher
der Leber reichen zur Aufrechterhaltung eines normalen Folsäurespiegels
im Serum nur etwa für
3 bis 4 Wochen aus.
Ein Folsäuremangel führt bei Menschen zur megaloblastären Anämie. Durch
die enge Verknüpfung des
Folsäurestoffwechsels
mit dem Vitamin B12-Stoffwechsel
kann die Ursache der Anämie
allerdings nicht nur im primären
Folsäuremangel,
sondern auch in einem durch einen Cobalaminmangel verursachten sekundären Folsäuremangel
liegen. Weiterhin besteht bei einem Folsäuremangel während einer Schwangerschaft die
Gefahr einer Fehlgeburt bzw. einer Missbildung des Embryos.
Weiterhin können sich als Folge eines Folsäuremangels
Metaboliten des Folsäurestoffwechsels
im Organismus akkumulieren. Beispielsweise reichert sich bei einem
Folsäuremangel
Homocystein im Organismus an, da es nicht zu Methionin methyliert
werden kann. Folsäure
kann somit als ein Indikator der Methylierung von Homocystein betrachtet
werden. Auch bei einem Vitamin B12-Mangel ist die Methylierung von
Homocystein zu Methionin eingeschränkt. In beiden Fällen erfolgt
eine pathologische Anreicherung von Homocystein im Blut, es kommt
zu einer Homocysteinämie.
Eine Homocysteinämie
stellt eine Prädisposition
für verschiedene
Erkrankungen dar. So werden beispielsweise arteriosklerotische cardiovaskuläre Erkrankungen,
venöse Thrombosen,
Schädigungen
des Endothels, sowie ein erhöhtes
Schlaganfallrisiko mit einer Homocysteinämie in Zusammenhang gebracht.
Weiterhin stellt die Homocysteinämie
bei Schwangeren einen Risikofaktor für Neuralrohrdefekte und Präeklampsien
dar. Auch Störungen
des Blutgerinnungssystems sowie die periphere arterielle Verschlusskrankheit
werden durch eine Hyperhomocysteinämie begünstigt.
Homocystein kann auch durch einen
Vitamin B6-abhängigen
Stoffwechselweg zu Cystein abgebaut werden. Somit sind auch ausreichende
Vitamin B6-Spiegel notwendig, um normale Homocysteinspiegel zu erhalten.
Vitamin B6 besitzt im Eiweißstoffwechsel
eine wesentliche Bedeutung. Bei Mangelerscheinungen kann es zu verschiedenen
Gesundheitsstörungen
kommen, beispielsweise zu Hautveränderungen und Störungen des
Immun- und Nervensystems.
Eine Bestimmung des Vitamin B12-,
Vitamin B6- bzw. Folsäurestatus
erfolgt gegenwärtig,
anhand verschiedener biochemischer Parameter. Vitamin B6 kann beispielsweise
mittels enzymatischer Assays oder HPLC-Analysen bestimmt werden. Weit verbreitet
ist auch die Bestimmung der Vitamin B12- bzw. Folsäure-Konzentration
im Serum. Zur Untersuchung eines Folsäure bzw. Vitamin B12-Mangels
kann auch eine Messung der Konzentration von Folsäure bzw.
Vitamin B12 in den Erythrozyten durchgeführt werden. Allerdings sind
diese Messungen in der Handhabung sehr aufwändig.
Eine weitere Möglichkeit ist die Bestimmung
des Blutbildes bzw. ein Markausstrich. Da es aber sowohl bei Cobalamin-
als auch bei Folsäuremangel
zu einer megaloblastären
Anämie
kommt, sind Blutbild und Markausstrich bei einem vorliegenden Folsäuremangel
oder Vitamin B12-Mangel
nicht voneinander zu unterscheiden.
Im Stand der Technik wird zum Nachweis
einer Vitamin B12-Resorptionsstörung und
dem sich daraus ergebenden Vitamin B12-Mangels der sogenannte Schilling-Test
beschrieben. Hierbei handelt es sich um einen Vitamin B12-Resorptionstest,
bei dem die Ausscheidung von oral verabreichtem, radioaktiv markierten
Vitamin B12 im Urin ermittelt wird. Die Durchführung dieses Tests erfordert
allerdings den Einsatz von Radioaktivität, der Test ist sehr aufwendig
und die Ergebnisse sind oft unzuverlässig.
Ein weiterer biochemischer Parameter,
der zur Bestimmung eines Vitamin B12-Mangels verwendet werden kann,
ist die Konzentration von Methylmalonsäure (MMA), die bei einem Mangel
an Vitamin B12, sowohl im Serum als auch im Urin ansteigt. Oft tritt
schon in frühren
Stadien eines Vitamin B12-Mangels eine Erhöhung der MMA-Konzentration
auf, allerdings ist die Konzentration an MMA nicht nur mit einem
Vitamin B12-Mangel korreliert, sondern kann auch andere Ursachen
haben.
Ein weiterer Indikator für einen
Vitamin B12-, B6- und/oder Folsäuremangel
ist ein Anstieg der Homocysteinkonzentration im Serum. Da aber sowohl
bei Vitamin B12-Mangel als auch bei Folsäuremangel eine Anreicherung von
Homocystein im Organismus und somit eine Erhöhung der Serumkonzentration
erfolgt, ist dieser Parameter alleine nicht ausreichend, um den
vorliegenden Mangel zu spezifizieren.
Die enge physiologische Verknüpfung von
Folsäure
und Vitamin B12 sowie Vitamin B6 im Stoffwechsel und die sich daraus
ergebenden ähnlichen
Symptome bei einem Mangelzustand machen eine eindeutige klare Diagnose
sehr schwer. Die aus dem Stand der Technik bekannten Tests zur Bestimmung
des Vitamin B12- bzw. Folsäurestatus
liefern oft unzuverlässige
Ergebnisse und sind meist sehr aufwendig in der Durchführung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
war es aus diesem Grund, ein einfaches Verfahren bereitzustellen,
das eine zuverlässige
Beurteilung des Vitaminstatus von Vitamin B12, Vitamin B6 oder/und
Folsäure,
insbesondere des intrazellulären
Zustandes und zusätzlich
eine Differenzierung zwischen einem Vitamin B12-Mangel und einem
Folsäuremangel
ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zum Nachweis von Vitamin B12-, Vitamin B6- oder/und
Folsäurestörungen,
umfassend die Bestimmung von
- (i) von Holotranscobalamin II (Holo TC II)
- (ii) von Homocystein (tHCY)
- (iii) von Methylmalonsäure
(MMA) und gegebenenfalls
- (iv) von Cystathionin (CYS).
Die Erfindung betrifft somit die
Differenzialdiagnostik von Vitamin B12-, Vitamin B6- oder/und Folsäurestörungen mittels
drei bzw. vier unabhängiger
Messgrößen. Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
somit eine Bewertung des Gesamtzustands der Vitaminversorgung eines
Organismus im Hinblick auf die Vitamine B12, B6 und Folsäure.
Die Messparameter Holotranscobalamin
II, Homocystein, Methylmalonsäure
und gegebenenfalls Cystathionin werden bevorzugt aus einer Probe
bestimmt. Hierbei kann es sich um eine Probe eines Patienten handeln.
Die Bestimmung der drei bzw. vier Messparameter kann aus gleichen
oder verschiedenen Körperflüssigkeiten
erfolgen, beispielsweise aus Blut, Blutfraktionen oder Urin. Bevorzugt
erfolgt die Bestimmung aus Serum.
Der Begriff "Vitamin B12" wird hierin als synonyme Bezeichnung
für Cobalamine
verwendet und umfasst alle Cobalamine, die eine biologische Wirkung
beim Menschen haben, beispielsweise Methylcobalamin oder 5'-Desoxyadenosyl-Cobalamin.
Der Begriff "Folsäure" wird hierin als
eine Sammelbezeichnung für
natürlich
vorkommende oder synthetische Verbindungen verwendet, die einem
Pteridinring, p-Aminobenzoesäure
und ein oder mehrere Glutaminsäureresten
umfassen. Auch biologisch aktive Formen dieser Verbindungen, wie
beispielsweise die Tetrahydrofolsäure, werden vom Begriff "Folsäure" hierin umfasst.
Erfindungsgemäß wurde überraschend festgestellt, dass
durch die Verknüpfung
der drei bzw. vier unabhängigen
Messgrößen eine
schnelle und zuverlässige
Aussage über
den Vitamin B12-, Vitamin B6- oder/und Folsäurestatus beispielsweise von
Patienten erhalten wird. Bevorzugt wird der intrazelluläre Vitamin B12-,
Vitamin B6- oder/und Folsäurestatus
bestimmt.
Im Stand der Technik erfolgte eine
Bestimmung des Vitamin B12-, B6- bzw.
Folsäuremangels
meist aus Serum. Allerdings ist die Aussagekraft von Vitamin B12-Konzentrationen
im Serum aufgrund einer mangelhaften Sensitivität und Spezifität begrenzt.
Normale Serumwerte signalisieren nicht immer eine gute Vitamin B12-Versorgung,
und umgekehrt zeigen niedrige Vitamin B12-Konzentrationen im Serum
nicht immer einen Vitamin B12-Mangel an.
Die Folsäurekonzentration im Plasma
gibt lediglich einen Hinweis auf die momentane Folsäurebilanz zum
Zeitpunkt der Blutentnahme. Die Folsäurekonzentration im Plasma
gibt nicht den Zustand der Folsäurespeicher
im Gewebe wieder, sondern unterliegt großen Schwankungen, bedingt durch
die tägliche
Folsäureaufnahme
und zeitliche Veränderungen
im Folsäurestoffwechsel.
Weder die Vitamin B12-Serumkonzentration
noch die Folsäureserumkonzentration
geben einen verlässlichen
Hinweis auf den intrazellulären
funktionellen Status dieser Vitamine. Der Status des Zell-Vitamin B12 bzw.
der Zellfolsäure,
der für
eine Beurteilung eines Mangelzustandes essenziell ist, ist nicht
notwendigerweise mit den entsprechenden Serumkonzentrationen korreliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht nun
vorteilhafterweise eine Bestimmung des intrazellulären Vitamin
B12, Vitamin B6- und/oder Folsäurezustandes.
Eine Bestimmung der Serumkonzentrationen
von Vitamin B12, Vitamin B6 bzw. Folsäure ist zur Bestimmung des
Vitamin B12-, Vitamin B6- und/oder Folsäurestatus gemäß der vorliegenden
Erfindung nicht notwendigerweise erforderlich, kann aber optional
erfolgen. Hierbei werden die Serumkonzentrationen zusätzlich bestimmt
und als Kontrollwerte verwendet.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren
wird eine frühe
Diagnose eines Vitamin B6-, Folsäure- oder/und
Vitamin B12-Mangels möglich,
wobei beispielsweise die Serumkonzentrationen oder das Blutbild noch
nicht auf einem Mangelzustand hinweisen. Eine derart frühe Diagnose
eines Vitamin B12-Mangels kann beispielsweise deshalb von großer Bedeutung
sein, weil ein Vitamin B12-Mangel neuropsychiatrische Erkrankungen
verursachen kann, da die Vitamin B12-Speicher im Gehirn sehr klein
und schnell erschöpft
sind. Neuropsychiatrische Erkrankungen können bei früher Diagnose durch eine Vitamin
B12-Supplementation rückgängig gemacht
werden, wobei eine Applikation von etwa 1000 μg Vitamin B12/Tag denkbar ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine Klassifizierung
von Vitamin B12-, Vitamin B6- oder/und Folsäurezuständen, insbesondere von Vitamin
B12-, Vitamin B6- oder/und Folsäuremängeln. Durch
die Verknüpfung
der vier unabhängigen
Parameter Holotranscobalamin II, Homocystein, Methylmalonsäure und
gegebenenfalls Cystathionin ist durch das erfindungsgemäße Verfahren
eine routinemäßige Differenzierung
zwischen einem normalen Vitamin B12-, Vitamin B6- oder Folsäurestatus
und einem Vitamin B12-, Vitamin B6- oder/und Folsäuremangel
möglich.
Diese Differenzierung ist von großer Bedeutung,
um eine Fehlbehandlung zu vermeiden. Wird beispielsweise ein Vitamin
B12-Mangel mit einer Folsäuresupplementation
behandelt, normalisiert sich zwar das Blutbild, der Vitamin B12-Mangel
bleibt aber nach wie vor bestehen, wodurch die Gefahr von Folgeerkrankungen
wie beispielsweise irreversiblen Nervendegenerationen ebenso bestehen
bleibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
ermittelte Vitamin B12- und Folsäurezustand
in eine der folgenden Gruppen klassifiziert:
- (a)
Vitamin B12- und Folsäuremangel
- (b) Vitamin B12-Mangel
- (c) Folsäuremangel
- (d) kein Mangel und gegebenenfalls
- (e) Vitamin B12- oder Vitamin B6-Mangel
- (f) Vitamin B6- und Folsäuremangel
oder
- (g) Vitamin B6-Mangel.
Die Klassifizierung erfolgt durch
die Bestimmung der Messgrößen Nolotranscobalamin
II, Homocystein, Methylmalonsäure
und gegebenenfalls Cystathionin.
Geeignete Referenzwerte der Messgröße Homocystein
(tHCY) liegen beispielsweise im Bereich von etwa 3 bis 18 μmol/l, bevorzugt
etwa 5 bis 15 μmol/l,
bevorzugt < etwa
15 μmol/l,
besonders bevorzugt < etwa 12 μmol/l, insbesondere
etwa 10 μmol/l.
Die Messgröße tHCY
gibt einen Hinweis auf die Homocystein-Konzentration im Serum. Als
Grenzwert kann bei der Messung jeder beliebige Wert innerhalb des
Referenzbereichs verwendet werden, beispielsweise 12, 13, 14, 15,
16 oder 17 μmol/l.
Bevorzugt wird als Grenzwert etwa 15 μmol/l eingesetzt.
Die Referenzwerte der Messgröße Holotranscobalain
(Holo TCII) liegen bevorzugt im Bereich von etwa 20 bis 170 pmol/l,
bevorzugt etwa 30 bis 160 pmol/l, besonders bevorzugt > etwa 50 pmol/l, insbesondere > etwa 30 pmol/l. Die
Messgröße Holo
TC II gibt einen Hinweis auf die Homocystein-Konzentration in den
Zellen. Als Grenzwert kann bei der Messung jeder beliebige Wert
innerhalb des Referenzbereichs verwendet werden, beispielsweise
28, 29, 30, 31 oder 32 pmol/l. Bevorzugt wird als Grenzwert der
Messung 30 pmol/l verwendet.
Geeignete Referenzwerte der Messgröße Methylmalonsäure (MMA)
liegen im Bereich von etwa 60 bis 280 mmol/l, bevorzugt etwa 70
bis 270 mmol/l, insbesondere < etwa
270 mmol/l. Die Messgröße MMA ist
ein Indikator für
B6- und B12-Konzentrationen. Als Grenzwert kann bei der Messung
jeder beliebige Wert innerhalb des Referenzbereichs verwendet werden,
beispielsweise 250, 260, 265, 270, 275 oder 280 mmol/l. Bevorzugt
wird als Grenzwert der Messung 270 mmol/l verwendet.
Die Referenzwerte der Messgrößen Cystathionin
liegen im Bereich von etwa 60 bis 310 nmol/l, bevorzugt etwa 65
bis 300 nmol/l, insbesondere < etwa
300 nmol/l. Die Messgrößen Cystathionin
gibt einen Hinweis auf die B6-Konzentration. Als Grenzwert kann
bei der Messung jeder beliebige Wert innerhalb des Referenzbereichs
verwendet werden, beispielsweise 280, 290, 295, 300, 305 oder 310
mmol/l. Bevorzugt wird als Grenzwert bei der Messung 300 mmol/l
verwendet.
Für
eine Einklassifizierung in einen Vitamin B12-, Vitamin B6- und/oder
Folsäuremangel
ergibt sich damit beispielsweise eine wie in der folgenden Tabelle
1 gezeigte Einteilung.
Die Auswertung der ermittelten Messgrößen kann
bevorzugt computerunterstützt,
beispielsweise mittels einer geeigneten Software erfolgen. Weiterhin
können
die ermittelten Messwerte bevorzugt graphisch in Form von Diagrammen
dargestellt werden, um somit eine leichte Zuordnung der Messbereiche
zu einer Vitamin B12-, Vitamin B6- oder/und Folsäurestörung zu ermöglichen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist es weiterhin möglich,
in Abhängigkeit
der bestimmten Vitamin B12-, Vitamin B6- oder/und Folsäurestörung auf
einfache Weise die für
den jeweiligen Patienten benötigte
Therapie vorzugeben. So wird beispielsweise bei Klassifizierung
in Gruppe (a) eine Vitamin B12- und Folat-Supplementation, bei Klassifizierung
in Gruppe (b) eine Vitamin B12-Supplementation, bei Klassifizierung in
Gruppe (c) eine Folat-Supplementation, bei Klassifizierung in Gruppe
(d) keine Therapie und gegebenenfalls bei Klassifizierung in Gruppe
(e) eine Vitamin B12- und Vitamin B6-Supplementation, bei Klassifizierung
in Gruppe (f) eine Vitamin B6- und Folatsupplementation und bei
Klassifizierung in Gruppe (g) eine Vitamin B6-Supplementation angezeigt.
Die Supplementation der Vitamine
kann durch jede geeignete Applikationsart erfolgen, bevorzugt erfolgt
eine orale Gabe.
Bei Vitamin B12-Mangel erfolgt eine
Gabe von etwa 0,1 bis 3 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis 2 mg, mehr bevorzugt
etwa 0,1 bis 1 mg und insbesondere etwa 1 mg, beispielsweise 0,9
bis 1,1 mg pro Tag. Ein Folatmangel wird beispielsweise mit etwa
0,1 bis 1,5 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis 1,0 mg, insbesondere etwa
0,5 mg, beispielsweise 0,4 bis 0,6 mg pro Tag supplementiert. Wird
ein Vitamin B6-Mangel diagnostiziert, kann eine Vitamin B6-Gabe
mit einer Dosierung von etwa 1 bis 7 mg, bevorzugt etwa 1 bis 5
mg, insbesondere etwa 5 mg, beispielsweise 4,5 bis 5,5 mg erfolgen.
Selbstverständlich kann sowohl eine Verabreichung
von jeglicher Kombination der Vitamine miteinander als auch jegliche
Kombination eines oder mehrerer Vitamine mit weiteren physiologisch
verträglichen
Stoffen wie beispielsweise Trägerstoffen,
Aroma- und Geschmacksstoffen oder anderen pharmazeutisch verwendeten
Substanzen erfolgen.
Neben der Therapie von Vitamin B12-,
Vitamin B6- oder/und Folsäurestörungen erlaubt
das erfindungsgemäße Verfahren
auch die Beobachtung oder/und Überwachung
(Monitoring) des Therapieverlaufs bzw. des Therapieerfolgs, um somit
eine optimale Verwendung von Vitamin B12-, Vitamin B6- bzw. Folsäurepräparaten
(z.B. oralen oder parenteralen Vitamin B12-, Vitamin B6- bzw. Folsäurepräparaten)
am einzelnen Patienten sowie eine bezüglich Dosierung sowie Applikationsdauer
optimale Medikation zu gewährleisten.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur
Bestimmung von Vitamin B12-, B6- oder/und Folsäurestörungen eines Patienten. Das
Verfahren kann weiterhin zur Bestimmung von chronisch nicht entzündlichen (degenerativen)
Erkrankungen, verursacht durch einen Vitamin B12-, B6- oder/und Folsäuremangel
verwendet werden, welche beispielsweise durch einen normalen CRP
(c-reaktives Protein)-Wert gekennzeichnet sind.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren
auch mit weiteren Tests gekoppelt werden, z.B. mit Tests für Eisenfunktionsstörungen (vgl. 9). Beispielsweise können Patientenproben
von Patienten mit Eisenverteilungsstörungen dem erfindungsgemäßen Verfahren
unterzogen werden, um einen möglichen
Vitaminmangel festzustellen. Im Fall eines Vitaminmangels würden die
betreffenden Patienten dann zunächst
keine Erythropietin-Gabe, sondern lediglich eine Vitamingabe erhalten.