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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Einteilung von Nukleinsäuren
durch Auftrennen der Nukleinsäuren
in sequenzspezifische Untergruppen, sowie die Verwendung entsprechender
Adaptoren und Primer sowie entsprechende Kits.
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Nachdem sich die Molekularbiologie
in den letzten zwei Dekaden vorrangig mit einzelnen Genen, ihren
Transkripten und den zugehörigen
Genprodukten beschäftigt
hat, sind in den letzten Jahren zunehmend das Genom sowie das Transkriptom
in ihrer jeweiligen Gesamtheit zum Untersuchungsgegenstand geworden.
Ein Hauptproblem, dem sich entsprechende Untersuchungen stellen
müssen,
besteht in der enormen Komplexität
der jeweiligen Nukleinsäure-Zusammensetzungen.
Beispielsweise hat das humane Genom eine Größe von ca. 3×109 Basenpaaren. Die Größe des humanen Transkriptoms ist
schwieriger abzuschätzen,
da erstens die Zahl aktiver Gene unbekannt ist (Schätzungen
reichen von ca. 20.000 bis 200.000 Gene) und zweitens ein hohes
Maß an
differentiellem Splicing die Zahl verschiedener Nukleinsäuremoleküle deutlich
erhöht.
Nimmt man beispielsweise an, daß das
Humantranskriptom 100.000 Gene enthält, deren Transkripte im Schnitt
in zwei verschiedenen Splice-Varianten existieren und deren Durchschnittsgröße 3000
Basenpaare (bp) beträgt,
so hätte
das Transkriptom eine Komplexität
von 100.000 × 2 × 3000 =
6×108 bp. Hierbei wird eine Analyse noch durch
den Umstand erschwert, daß von
verschiedenen Genen stammende Transkripte oftmals in extrem verschiedenen
Mengen vorliegen; so kann ein housekeeping-Gen mehrere tausend Transkripte
pro Zelle produzieren, während
sehr niedrig exprimierte Gene (z.B. bestimmte Rezeptorgene) im Mittel
lediglich durch ein bis zwei Transkripte pro Zelle repräsentiert
sein können.
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Um zu derart komplexen Nukleinsäure-Zusammensetzungen
experimentellen Zugang zu erhalten, ist es oftmals erforderlich,
die Gesamtheit einer solchen Zusammensetzung in mehrere Untermengen
(Subpools") aufzuteilen.
Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn eine genomische subtraktive
Hybridisierung oder die Auftrennung einzelner Nukleinsäurefragmente über Gelelektrophorese
erfolgen soll und die Ausgangspopulation von Nukleinsäuren hierfür zu komplex
ist. Die wichtigsten Anforderungen an eine solche Aufteilung sind,
daß (1)
die Erzeugung der Subpools weitestgehend nicht-redundant ist (d.h.,
die Schnittmenge verschiedener Subpools sollte so klein wie möglich sein),
und (2) daß die
Gesamtheit aller Subpools möglichst
vollständig ist
(d.h., daß ein
möglichst
großer
Anteil der ursprünglichen
Nukleinsäure-Zusammensetzung
in den erzeugten Subpools enthalten ist.).
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Aus dem Stand der Technik sind verschiedene
Verfahren zur Subpool-Erzeugung bekannt. Beispielsweise beschreiben
Welsh und McClelland (Nucleic Acids Res 1990 Dec 25; 18(24):7213-8)
und Caetano-Anolles et al. (Biotechnology (N Y) 1991 Jun; 9(6):553-7)
die Erzeugung von mittels kurzen Zufallsprimern (arbitrary primers)
gewonnen Mischungen von Amplifikationsprodukten aus genomischer
DNA, welche zum Fingerprinting und damit zur Unterscheidung genomischer
DNA aus verschiedenen Quellen verwendet werden können. Eine Übertragung dieser experimentellen
Strategie auf isolierte mRNA zu Zwecken der vergleichenden Expressionsanalyse wurde
von Welsh et al. (Nucleic Acids Res 1992 Oct 11; 20(19):4965-70)
vorgenommen. In einer von Liang und Pardee vorgeschlagenen Variante
(Science 1992 Aug 14; 257(5072):967-71) wird in einer Amplifikationsreaktion
jeweils ein Zufallsprimer mit einem geankerten oligo(dT)-Primer
kombiniert, so daß jeweils
gezielt das 3'-Ende
der zu einem Subpool gehörigen
Transkripte amplifiziert werden kann. In allen diesen Verfahren
schließt
sich an die Fragmenterzeugung ein Schritt der elektrophoretischen
Auftrennung an, für welchen
gewährleistet
sein muß,
daß die Komplexität der erzeugten
Fragmentmischung (also des jeweiligen Subpools) hinreichend gering
ist, um eine Auftrennung der Fragmente in klar voneinander abgesetzte „Banden" zu erlauben. Ein
Nachteil, der aus dem Einsatz kurzer Zufallsprimer resultiert, ist
jedoch die schlechte Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse,
welche sich unter anderem aus den für eine Durchführung der
PCR ungünstig
niedrigen Annealing-Temperaturen
ergeben (Debouck, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 597-599 (1995)).
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Eine alternative Strategie wurde
von Lisitsyn et al. (Science 1993 Feb 12; 259(5097):946-51) vorgestellt,
nämlich
die Erzeugung genomischer „Repräsentationen" durch Restriktionsvenlau
genomischer DNA mit einer nicht häufig schneidenden Typ II-Restriktionsendonuklease
(beispielsweise BgIII mit einer 6-basigen Erkennungssequenz). Die erhaltenen Fragmente
werden mit Adaptoren versehen und mittels PCR amplifiziert. Hierbei
ist nur derjenige Anteil der erzeugten Fragmente effizient amplifizierbar,
welcher eine Maximalgröße (beispielsweise
rund 1 kb) nicht wesentlich überschreitet.
Je nach Wahl der Restriktionsendonuklease ist es somit möglich, einen größeren oder
kleineren Anteil des jeweiligen Genoms durch amplifizierte Restriktionsfragmente
zu „repräsentieren". Bei einer analogen
Vorgehensweise zur Analyse von mRNA-Zusammensetzungen, welche von
Prashar und Weissman gewählt
wurde (Proc Natl Acad Sci USA 1996 Jan 23; 93(2):659-63;
EP 0 797 685 ), wird doppelsträngige cDNA
ebenfalls mit nicht häufig
schneidenden Typ II-Restriktionsendonukleasen behandelt, und die
erhaltenen Fragmente werden mit Adaptoren versehen und amplifiziert.
Eine solche Vorgehensweise hat jedoch den Nachteil, daß die Erzeugung
mehrerer Subpools nicht in dem Sinne systematisch erfolgen kann,
daß die
beiden oben genannten Forderungen nach Vollständigkeit und Nicht-Redundanz
der Gesamtheit aller Subpools erfüllt werden: Da innerhalb natürlich vorkommender
Nukleinsäurezusammensetzungen wie
genomischer DNA oder mRNA (bzw. die durch Umschreibung erhaltene
doppelsträngige
cDNA) kein systematischer Zusammenhang zwischen der Positionen der
Schnittstelle für
eine Restriktionsendonuklease und den Positionen der Schnittstelle
für eine
andere Restriktionsendonuklease besteht, wird ein Satz von mit verschiedenen
Typ II-Restriktionsendonukleasen erzeugten Subpools bestimmte Sequenzabschnitte
mehrfach enthalten, die somit überrepräsentiert
sind, andererseits aber werden bestimmte Sequenzabschnitte fehlen,
weil sie von keinem der eingesetzten Enzyme erfaßt werden.
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Ein systematischerer Ansatz wird
von Vos et al. (Nucleic Acids Res 1995 Nov 11; 23(21):4407-14) beschrieben.
Hier wird ein Doppeldau genomischer DNA mit einer häufig schneidenden, überhängende Enden
erzeugenden Typ II-Restriktionsendonuklease
und einer weniger häufig
schneidenden, ebenfalls überhängende Enden
erzeugenden Typ II-Restriktionsendonuklease durchgeführt. Auf
diese Weise wird eine große
Zahl von Restriktionsfragmenten erzeugt, so daß ein relativ hoher Anteil
des Genoms repräsentiert
wird. Allerdings ist die Zahl an Fragmenten dadurch wiederum zu
hoch, um eine Auftrennung einzelner Fragmente durch Gelelektrophorese
zu ermöglichen.
Daher wird nach erfolgter Ligation von Adaptern mit zu den erzeugten
Enden komplementären überhängenden
Enden eine Amplifikation durchgeführt, bei welcher „selektive" Primer eingesetzt werden.
Ein solcher selektiver Primer besteht aus drei Abschnitten, nämlich (1)
einem vom doppelsträngigen
Abschnitt des Adapters abgeleiteten Bereich, (2) einem
Bereich, welcher der Sequenz des einzelsträngigen Überhangs des Adapters bzw.
der Fragmente entspricht, sowie (3) eine oder mehrere, am
3'-Ende des Primers
befindliche Basen. Wird ein selektiver Primer für eine Amplifikation eingesetzt,
so können
lediglich diejenigen Fragmente amplifiziert werden, deren erste
bzw. letzte Basen komplementär zu
besagten selektiven Basen des Primers sind. Dieses bereits von der
allelspezifischen Amplifikation (Proc Natl Acad Sci USA 1989 Apr;
86(8):2757-60) bekannte Prinzip basiert auf der Tatsache, daß eine DNA-Polymerase
lediglich perfekt mit der Template-DNA gepaarte 3'-Primertermini als Substrat erkennt und
effizient verlängern
kann. Somit ist es möglich,
aus einer gegebenen, Adapter-flankierten Fragmentpopulation selektiv
klar durch besagte 3'-Basen
des Primers definierte Subpools zu amplifizieren, wobei die Summe
aller Subpools die Gesamtheit aller in der Population vorhandenen
Fragmente umfaßt.
Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß die von Typ II-Restriktionsendonukleasen
erzeugten Enden palindromisch (also auch selbstkomplementär) sind
und somit in der Adapterligation auch Fragment- Fragment-Ligationen erfolgen, was die
Effizienz des Verfahrens mindert. Ein weiterer Nachteil besteht
darin, daß für jedes
verwendete Enzym ein eigener Satz an Adapter- und Primer-Oligonukleotiden
erforderlich. ist, was zu hohen Kosten führt. Letzterer Nachteil ergibt
sich aus der Tatsache, daß bei der
Verwendung „konventioneller" (Typ II-) Restriktionsendonukleasen
die Erkennungssequenz im geschnittenen Produkt mindestens teilweise
eehalten bleibt (beispielsweise bleiben bei der Verwendung von BgIII
5 von 5 Basen erhalten, 4 davon in Form eines einzelsträngigen Überhangs)
und daher Bestandteil der Primersequenz werden muß.
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Ein alternativer Weg zur Subpool-Herstellung
aus Fragmentmischungen wird von Kato (Nucleic Acids Res 1995 Sep
25; 23(18):3685-90) und von Sibson (
EP
0 650 528 ) beschrieben. Doppelsträngige cDNA wird mit Typ IIs-Restriktionsendonukleasen geschnitten,
so daß überhängende Enden
definierter Länge,
aber enzymunabhängiger
Sequenz entstehen. An diese Enden werden Adapter ligiert, wobei
in separaten Reaktionen jeweils ein einzelner aus der Zahl aller
möglichen
Adapter gegebenen Typs ligiert wird. Beispielsweise können 64
verschiedene Adapter mit dem Überhang
X
1X
2X
3N
synthetisiert und in 64 separaten Ligationsreaktionen eingesetzt
werden, wobei X
1-X
3 jeweils
eine determinierte Base (also A, C, G oder T) und N eine degenerierte
Base (also eine Mischung aus A, C, G und T) ist. An die Ligation schließt sich
eine Amplifikation an, bei welcher Primer eingesetzt werden, welche
an den allen Adaptern eines Satzes gemeinsamen Bereich binden können. Somit
werden nur diejenigen Fragmente amplifiziert und zum Bestandteil
eines Subpools, welche in der Ligationsreaktion mit einem Adapter
verbunden worden sind. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die schlechte
Unterscheidungsfähigkeit
von Ligasen zwischen perfekt und nicht perfekt gepaarten überhängenden
Enden (Biotechniques 2000 May; 28(5):958-64), welche zur Ligation
und Amplifikation unerwünschter
Fragmente führt
und dadurch eine hohe Redundanz der erzeugten Subpools zur Folge hat.
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Die Verfahren nach dem Stand der
Technik weisen also einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf:
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- – schlechte
Reproduzierbarkeit
- – redundante
Repräsentation
durch überlappende Subpools
- – geringe
Effizienz durch Fragment-Fragment-Ligation
- – hohe
Kosten durch Enzym-spezifische Adaptoren und Amplifikationsprimer
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Aufgabe des erfindungsgemäßen Verfahrens
war demnach, eine Aufteilung einer Nukleinsäure-Fragmentpopulation in verschiedene
Subpools zu ermöglichen,
bei der die Nachteile des Standes der Technik weitgehend vermieden
werden.
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Daher ist Gegenstand der Erfindung
ein Verfahren (Variante X) zur Einteilung von Nukleinsäuren durch
Auftrennen der Nukleinsäuren
in sequenzspezifische Untergruppen umfassend
-
- a) Bereitstellung einer Probe enthaltend mindestens
eine Nukleinsäure;
- b) Behandeln der Probe mit mindestens einer Typ Ils Restriktionsendonuklease
unter zum Restriktionsverdau der Nukleinsäure/n mit der Restriktionsendonuklease
geeigneten Bedindungen;
- c) Reagieren der Nukleinsäurefragmente
aus (b) mit mindestens einem mindestens teilweise doppelsträngigem Adaptormolekül unter
zur Bildung von mit Adaptormolekül
ligierten Nukleinsäurefragment/en
geeigneten Bedingungen; und
- d) selektive Amplifikation eines bestimmten/bestimmter mit mindestens
einem Adaptor ligierten Nukleinsäurefragments/e
aus (c) durch Verwendung mindestens eines Amplifikationsprimers,
der
aa) ein Oligonukleotid ist,
bb) eine Adaptor-Erkennungssequenz,
die zu dem 5'-Ende
eines der beiden Stränge
eines an ein Nukleinsäurefragment
ligierten Adaptormoleküls
aus (c) komplementär
ist, enthält
und
cc) mindestens ein außerhalb
der Adaptor-Erkennungssequenz 3'-wärts liegendes Nukleotid, die Unterscheidungssequenz,
enthält.
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Ebenso ist Gegenstand der Erfindung
ein Verfahren (Variante A) zur Einteilung von Nukleinsäuren durch
Auftrennen der Nukleinsäuren
in sequenzspezifische Untergruppen umfassend
-
- a) Bereitstellung einer Probe enthaltend mindestens
eine Nukleinsäure;
- b) Behandeln der Probe mit mindestens einer Typ Ils Restriktionsendonuklease,
welche glatte Enden erzeugt, unter zum Restriktionsverdau der Nukleinsäure/n mit
der Restriktionsendonuklease geeigneten Bedindungen;
- c) Reagieren der Nukleinsäurefragmente
aus (b) mit mindestens einem mindestens teilweise doppelsträngigem Adaptormolekül unter
zur Bildung von mit Adaptormolekül
ligierten Nukleinsäurefragment/en
geeigneten Bedingungen; und
- d) selektive Amplifikation eines bestimmten/bestimmter mit mindestens
einem Adaptor ligierten Nukleinsäurefragments/e
aus (c) durch Verwendung mindestens eines Amplifikationsprimers,
der
aa) ein Oligonukleotid ist,
bb) eine Adaptor-Erkennungssequenz,
die zu dem 5'-Ende
eines der beiden Stränge
eines an ein Nukleinsäurefragment
ligierten Adaptormoleküls
aus (c) komplementär
ist, enthält
und
cc) mindestens ein außerhalb
der Adaptor-Erkennungssequenz 3'-wärts liegendes Nukleotid, die Unterscheidungssequenz,
enthält.
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Ebenso ist Gegenstand der Erfindung
ein Verfahren (Variante B) zur Einteilung von Nukleinsäuren durch
Auftrennen der Nukleinsäuren
in sequenzspezifische Untergruppen umfassend
-
- a) Bereitstellung einer Probe enthaltend mindestens
eine Nukleinsäure;
- b) Behandeln der Probe mit mindestens einer Typ Ils Restriktionsendonuklease,
welche überhängende Enden
erzeugt, unter zum Restriktionsverdau der Nukleinsäure/n mit
der Restriktionsendonuklease geeigneten Bedindungen;
- c) Reagieren der Nukleinsäurefragmente
aus (b) mit mindestens einem mindestens teilweise doppelsträngigen Adaptormolekül unter
zur Bildung von mit Adaptormolekül
ligierten Nukleinsäurefragment/en
geeigneten Bedingungen; und
- d) selektive Amplifikation eines bestimmten/bestimmter mit mindestens
einem Adaptor ligierten Nukleinsäurefragments/e
aus (c) durch Verwendung mindestens eines Amplifikationsprimers,
der
aa) ein Oligonukleotid ist,
bb) eine Adaptor-Erkennungssequenz,
die zu dem 5'-Ende
eines der beiden Stränge
eines an ein Nukleinsäurefragment
ligierten Adaptormoleküls
aus (c) komplementär
ist, enthält
und
cc) mindestens ein außerhalb
der Adaptor-Erkennungssequenz 3'-wärts liegendes Nukleotid, die Unterscheidungssequenz,
enthält.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Verfahren (Variante C) zur Einteilung von Nukleinsäuren durch
Auftrennen der Nukleinsäuren
in sequenzspezifische Untergruppen umfassend
-
- a) Bereitstellung einer Probe enthaltend mindestens
eine Nukleinsäure;
- b) Behandeln der Probe mit mindestens einer Typ Ils Restriktionsendonuklease,
welche überhängende Enden
erzeugt, unter zum Restriktionsverdau der Nukleinsäure/n mit
der Restriktionsendonuklease geeigneten Bedindungen sowie Überführen der
erzeugten überhängenden
Enden in glatte Enden;
- c) Reagieren der Nukleinsäurefragmente
aus (b) mit mindestens einem mindestens teilweise doppelsträngigen Adaptormolekül unter
zur Bildung von mit Adaptormolekül
ligierten Nukleinsäurefragment/en
geeigneten Bedingungen; und
- d) selektive Amplifikation eines bestimmten/bestimmter mit mindestens
einem Adaptor ligierten Nukleinsäurefragments/e
aus (c) durch Verwendung mindestens eines Amplifikationsprimers,
der
aa) ein Oligonukleotid ist,
bb) eine Adaptor-Erkennungssequenz,
die zu dem 5'-Ende
eines der beiden Stränge
eines an ein Nukleinsäurefragment
ligierten Adaptormoleküls
aus (c) komplementär
ist, enthält
und
- cc) mindestens ein außerhalb
der Adaptor-Erkennungssequenz 3'-wärts liegendes Nukleotid, die Unterscheidungssequenz,
enthält.
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Die Überführung der überhängenden Enden in glatte Enden
erfolgt bei der Verfahrensvariante C mittels einem Fachmann bekannter
Standardverfahren, vorzugsweise unter Verwendung einer geeigneten
Nuklease oder einer geeigneten DNA-Polymerase und einem Gemisch
der geeigneten Nunkleosidtriphosphate (dNTPs). Als DNA-Polymerase
kann z.B. die DNA-Polymerase I aus E. coli, eine DNA-Polymerase
aus Phagen, bspw. T4-DNA-Polymerase, usw. eingesetzt werden.
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Allen diesen Verfahrensvarianten
(X, A, B und C) ist gemeinsam, dass sie aufgrund der hohen Spezifität der Selektion
(meist durch Polymerase-Reaktion/PCR) eine vollständige und
präzise
Aufteilung der Pools erlauben und somit die Nachteile des Standes
der Technik nicht mehr aufweisen.
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Die Bereitstellung der Probe erfolgt
im allgemeinen durch Isolierung aus Gewebe aber auch vorherige Amplifikation.
Bei den Nukleinsäuremolekülen oder
der Nukleinsäuremischung
aus (1) kann es sich beispielsweise um genomische DNA,
um durch Reverse Transkription von mRNA erhaltene doppelsträngige cDNA,
um Plasmid-DNA, um aus Viren oder Phagen erhaltene DNA oder durch
DNA, welche mittels eines Amplifikationsverfahrens wie etwa der PCR
erhalten wurde, handeln. Entsprechend ist eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem es sich bei der/den Nukleinsäure/n um genomische DNA, um
durch Reverse Transkription von mRNA erhaltene doppelsträngige cDNA,
um Plasmid-DNA, um aus Viren oder Phagen erhaltene DNA oder um DNA,
welche mittels eines Amplifikationsverfahrens, vorzugsweise der
PCR, erhalten wurde, handelt.
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Unter einer Typ Ils-Restriktionsendonuklease
wird ein Enzym verstanden, welches an eine oder mehrere definierte
DNA-Erkennungssequenzen binden und in der Nachbarschaft hiervon
einen kontrollierten Doppelstrangbruch katalysieren kann. In der
Regel ist die Entfernung des in jeden der beiden Stränge eingeführten „Schnitts" von der Erkennungssequenz
durch die Eigenschaften des Enzyms festgelegt und ist unabhängig von
der die Erkennungssequenz flankierenden Sequenz des DNA-Strangs. Beispielsweise
weist das Enzym FokI die Schneidecharakteristik GGATG(9/13) auf,
d.h. FokI erkennt die Sequenz GGATG in einem DNA-Doppelstrang und schneidet
den „oberen" Strang in einer
Entfernung von 9 Nukleotiden, den „unteren" Strang in einer Entfernung von 13 Nukleotiden
von der Erkennungssequenz, so daß ein 5'-überhängendes
Ende einer Länge
von 4 Nukleotiden erzeugt wird. Da die Schnitte außerhalb
der Erkennungssequenz liegen, ist die Sequenz des einzelsträngigen überhängenden
Endes nicht durch die Wahl des Enzyms determiniert, sondern ausschließlich durch
die Sequenz des DNA-Strangs vorgegeben. Ein weiteres Beispiel ist das
Enzym BpmI mit der Schneidecharakteristik CTGGAG(16/14), welches
den Oberstrang in einer Entfernung von 16 Nukleotiden, den Unterstrang
in einer Entfernung von 14 Nukleotiden von der Erkennungssequenz
schneidet. Somit erzeugt diese Typ Ils Retriktionsendonuklease einen
3'-Überhang
von zwei Nukleotiden. Ein anderes Beispiel ist das Enzym MlyI mit
der Schneidecharakteristik GAGTC(5/5), welches Ober- und Unterstrang
in der gleichen Entfernung von je 5 Nukleotiden schneidet und auf
diese Weise glatte Enden erzeugt.
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Die Fragmentierung der Nukleinsäuremoleküle erfolgt,
indem unter geeigneten Salz-, pH- und Temperaturbedingungen mit
einer oder mehreren Typ Ils-Restriktionsendonukleasen
behandelt wird. Im Fall der Fragmentierung mit mehreren verschiedenen
Restriktionsendonukleasen kann die Behandlung gleichzeitig und/oder
sequentiell erfolgen. Eine sequentielle Behandlung wird in der Regel
insbesondere dann vorgenommen, wenn die von den zu verwendenden
Enzymen benötigten
Puffer zu verschieden voneinander sind, um einen effizienten „Doppeldau" bzw. „Mehrfachdau", also eine Fragmentierung mit
mehreren Enzymen gleichzeitig, durchzuführen.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem die Behandlung in Schritt (b) mit mindestens einer weiteren
zusätzlichen
Typ Ils Restriktionsendonuklease erfolgt.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem die Behandlung in Schritt (b) mit den Restriktionsendonukleasen
gleichzeitig oder sequentiell erfolgt.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren
nach Variante A oder Variante C, in dem die Behandlung in Schritt
(b) mit mindestens einer weiteren zusätzlichen Typ Ils Restriktionsendonuklease,
welche glatte Enden erzeugt, erfolgt.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren
nach Variante A, in dem die Typ Ils Restriktionsendonuklease/n in
Schritt (b) ausgewählt
ist aus MlyI, SchI und SspD5I.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren
nach Variante B bzw. Variante C, in dem die Behandlung in Schritt
(b) mit mindestens einer weiteren zusätzlichen Typ Ils Restriktionsendonuklease,
welche überhängende Enden
erzeugt, erfolgt.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren
nach Variante B bzw. Variante C, in dem die Typ Ils Restriktionsendonuklease/n
in Schritt (b) Nukleinsäurefragmente
mit einem 5'-überhängenden Ende erzeugt/erzeugen.
Dabei ist/sind die Typ Ils Restriktionsendonuklease/n in Schritt
(b) vorzugsweise ausgewählt
aus AlwI, BbsI BbvI, BsaI, BsmAI, BspMI, EatI, FokI, NgaI, PleI,
SapI oder SfaNI. Gemäß einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform
der Verfahrensvariante B bzw. C erzeugt bzw erzeugen die Typ Ils
Restriktionsendonuklease(n) ein 3'-überhängendes
Ende. Bevor zugte Typ Ils Enzyme dieser Art sind bspw. AsuHPI, BciVI,
BfiI, BfuI, BmrI, BpmI, BpuEI, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseRI,
BsgI, BspCNI, BsrDI, BstF5I, BtsI, EciI, Eco57I, Eco57MI, GsuI, HphI,
MboII, MmeI, MnlI, RleAI, StsI, TaqII, TspDTI, TspGWI und Tth111II.
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Selbstverständlich könnnen die Typ Ils Restriktionsendonukleasen
im Schritt (b) der Verfahrensvariante B oder C, falls mehrere von
diesen Enzymen eingesetzt werden, auch verschieden hinsichtlich
der Art des erzeugten Überhangs
sein, d.h., daß ein (oder
mehrere) Enzyme(e) einen 3'-Überhang
erzeugt (erzeugen), während
ein anderes (oder mehrere andere) Enzyme) einen 5'-Überhang erzeugt (erzeugen).
Bei der erfindungsgemäßen Verfahrensvariante
C kann (können)
darüber
hinaus auch das (die) weitere(n) als Typ Ils Restriktionsendonuklease(n) eingesetzte(n)
Enzyme) glatte Enden erzeugen. Bevorzugte Mitglieder dieser letzteren
Familie sind vorstehend aufgeführt.
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Adaptoren sind mindestens teilweise
doppelsträngige
DNA-Abschnitte, welche in der Regel durch Hybridisierung zweier
Oligonukleotide hergestellt werden. Obwohl Adaptoren eine praktisch
beliebige Länge
haben können,
sind Längen
zwischen ca. 5 bp und ca. 50 bp bevorzugt. Solche Adaptoren zeichnen sich
häufig
dadurch aus, daß ein
Ende dafür
geeignet ist, an Enden bereitgestellter Nukleinsäurefragmente befestigt zu werden,
während
ihr anderes Ende zu einer solchen Befestigung nicht geeignet ist.
Zeichnen sich die Enden der bereitgestellten Nukleinsäurefragmente
etwa durch einen einzelsträngigen Überhang gegebener
Länge aus,
so kann ein zu befestigender Adaptor ebenfalls ein durch einen komplementären einzelsträngigen Überhang
gleicher Länge
aufweisen, während
das andere Ende meist glatt ist oder sich durch einen nicht komplementären einzelsträngigen Überhang
auszeichnet. Häufig
sind Adaptoren auch derart gestaltet, daß das nicht zu ligierende Ende
ein oder mehrere nicht miteinander hybridisierte Nukleotidpaare
aufweist, so daß eine
Art „Y-Form" resultiert (vgl.
beispielsweise Prashar und Weissman 1996). Ist eine Befestigung
von Adaptoren an mittels Typ Ils-Restriktionsnukleasen gewonnenen überhängenden
Fragmentenden beabsichtigt, so ist die Länge der Einzelstrang-Überhänge bekannt,
die Sequenz sichtigt, so ist die Länge der Einzelstrang-Überhänge bekannt,
die Sequenz der Überhänge aber
meist unbekannt. Daher ist es auch nicht möglich, zu befestigende Adapter
mit einem eindeutig definierten komplementären Einzelstrangüberhang
zu versehen. In solch einem Fall wird zur Durchführung des efindungsgemäßen Verfahrens
oft ein Adapter mit degeneriertem Überhang eingesetzt, bei welchem
eine oder mehrere, bevorzugt alle, Positionen mit einer Mischung
aus allen vier Nukleotiden besetzt sind. Da ein solcher Adapter
einen bestimmten Prozentsatz jeden möglichen Überhangs besitzt, kann er zumindest
zu diesem Prozentsatz an jedem überhängenden
Ende gleicher Länge
befestigt werden. Die Befestigung der Adaptoren erfolgt in der Regel über eine
enzymatische Ligation, wobei die Zucker-Phosphat-Ketten meist sowohl
der beiden „oberen" Stränge miteinander
als auch der beiden „unteren" Stränge kovalent
miteinander verknüpft werden
(in Abhängigkeit
davon, ob phosphorylierte oder unphosphorylierte Adaptoren eingesetzt
werden). Eine Alternative zur enzymatischen Ligation besteht in
der chemischen Ligation unter Einwirkung geeigneter Reagenzien.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem das Adaptonnolekül
aus Schritt (c) eine Länge
zwischen 5 bp und 50 bp, vorzugsweise 10 bp und 30 bp, aufweist.
Dabei bedeutet bp Basenpaar.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren
nach Variante A bzw. Variante C, in dem das Adaptormolekül aus Schritt
(c) an dem Ende, das nicht mit dem platten Ende eines Nukleinsäurefragments
aus Schritt (b) ligiert werden soll, derart ausgestaltet ist, dass
dieses Ende nicht geeignet ist, an glatte Enden ligiert zu werden,
vorzugsweise an diesem Ende ein oder mehrere überhängende Nukleotide und/oder
ein oder mehrere ungepaarte Basenpaare und/oder eine die Ligation
ausschließende
Modifikation (z.B. eine 3'-Aminogruppe)
aufweist.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren
nach Variante B, in dem das Adaptonnolekül aus Schritt (c) an dem Ende,
das nicht mit dem überhängenden
Ende eines Nukleinsäurefragments aus
Schritt (b) ligiert werden soll, derart ausgestaltet ist, dass dieses
Ende nicht geeignet ist, an das überhängende Ende
des Nukleinsäurefragments
ligiert zu werden, vorzugsweise dieses Ende des Adaptormoleküls ein glattes
Ende ist oder eine oder mehrere ungepaarte Basenpaare oder einen
der Länge
des Überhangs
des Nukleinsäurefragments
nicht entsprechend langen Überhang
(bspw. wenn das zu ligierende Ende des Nukleinsäurefragmnets einen Überhang
von drei Nukleotiden, das Adaptorende jedoch einen Überhang
von vier Nukleotiden aufweist) oder einen der Orientierung des Überhangs
des Nukleinsäurefragments
nicht entsprechend orientierten Überhang
(also ein „falsch" orientierter Überhang; bspw.
5'- statt 3'-Überhang oder 3'- statt 5'-Überhang) und/oder eine die
Ligation ausschließende
Modifikation (bspw. eine 3'-Aminogruppe)
aufweist. Zusätzlich oder
alternativ zu dieser Maßnahme
ist das Adaptonnolekül
gemäß Schritt
(c) der erfindungsgemäßen Verfahrensvariante
B derart ausgestaltet, dass eine oder mehrere, vorzugsweise alle,
Positionen im Überhang
an dem zu ligierenden Ende dieses Adaptormoleküls jeweils mit einer Mischung
aller vier Nukleotide besetzt sind.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein efindungsgemäßes Verfahren,
in dem die Bildung von mit Adaptormolekül ligierten Nukleinsäurefragment/en
in Schritt (c) über eine
enzymatische Ligation oder über
eine chemische Ligation erfolgt.
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Die Amplifikation der Nukleinsäurefragmente erfolgt
bevorzugt mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Hierbei kommt
als Amplifikationsprimer mindestens ein Oligonukleotid zur Anwendung,
welches mindestens teilweise komplementär ist zu einem der beiden Adaptor-Stränge (demjenigen Strang,
der mit seinem 5''-Ende mit dem 3''-Ende
eines der beiden Stränge
des Nukleinsäurefragments verbunden
ist), so daß das
verlängerbare
3''-Ende des Amplifikationsprimers
zum Fragmentinneren hin orientiert ist. Weiterhin befindet sich
am 3'-Ende des Amplifikationsprimers,
in Verlängerung
der zum Adaptor-Strang komplementären Regi on, eine mindestens
ein Nukleotid umfassende selektive Sequenz, welche gegebenenfalls
mit einer komplementären, an
den Adaptor angrenzenden Region des Nukleinsäurefragments hybridisieren
kann. Eine Amplifikation findet hierbei lediglich dann statt, wenn
ein Primer mit gegebener selektiver Sequenz an ein Befestigungsprodukt
aus Nukleinsäurefragment
und Adaptor hybridisiert hat, so daß die selektive Sequenz des Primers
eine perfekte Basenpaarung mit der an den Adaptor angrenzenden Region
des Nukleinsäurefragments
eingegangen ist. Anderenfalls, also wenn sich die Bindung des Primers
an den Matrizenstrang durch eine oder mehrere Fehlpaarungen an seinem 3'-Ende, insbesondere
beim letzten Nukleotid des 3'-Endes,
auszeichnet, kann keine Extension durch DNA-Polymerase erfolgen: der jeweilige Matrizenstrang
bleibt unverdoppelt, und mit einem gegebenen selektiven Primer findet
eine Amplifikation nur derjenigen Matrizenstränge statt, welche mit dem Primer zur
Bildung eines mindestens am 3'-Ende des Primers
perfekt basengepaarten Doppelstrangs befähigt sind.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem der Amplifikationsprimer zu demjenigen Strang des Adaptormoleküls aus (c)
komplementär
ist, dessen 5'-Ende
mit einem 3'-Ende
eines Nukleinsäurefragments
ligiert ist. Wird im Schritt (b) der efindungsgemäßen Verfahrensvariante
B eine Typ Ils Restriktionsendonuklease verwendet, die einen 5'-Überhang erzeugt, und ist darüber hinaus
das entsprechende Adaptor-Molekül
derart ausgestaltet, dass eine, mehrere oder alle Positionen im Überhang an
dem zu ligierenden Ende dieses Adaptormoleküls jeweils mit einer Mischung
aller vier Nukleotide besetzt sind, so ist es für eine erfolgreiche Amplifikation besonders
bevorzugt, wenn der Amplifikationsprimer an der entsprechenden Position
bzw. an den entsprechenden Positionen ebenfalls eine Mischung aller Nukleotide
aufweist.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein efindungsgemäßes Verfahren,
in dem die Adaptor-Erkennungssequenz des Amplifikationsprimers zu
mindestens den ersten 3, vorzugsweise zu mindestens den ersten 6
Nukleotiden des 5'-Endes
eines der beiden Stränge
eines an ein Nukleinsäure fragment
ligierten Adaptormoleküls aus
(c) komplementär
ist, insbesondere vollständig einem
der beiden Stränge
eines an ein Nukleinsäurefragment
ligierten Adaptormoleküls
aus (c) komplementär
ist.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem die Unterscheidungssequenz des Amplifikationsprimers 1 bis
8 Nukleotide, vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere 1 bis 3 Nuleotide,
oder vorzugsweise 4 bis 8 Nukleotide, insbesondere 5 bis 6 Nukleotide,
umfaßt.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein efindungsgemäßes Verfahren,
in dem der oder die Amplifikationsprimer in Schritt (d) ausgewählt ist/sind
aus einer Gruppe von Amplifikationsprimem, die so gebildet ist,
dass sich in deren jeweils spezifischen Unterscheidungssequenzen
insgesamt alle in der Unterscheidungssequenz möglichen Kombinationen der 4
natürlichen
Nukleotide finden.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem die selektive Amplifikation in Schritt (d) durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR)
erfolgt.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem das Verfahren zum Display von DNA-Fragment-Subsets, insbesondere
auf einem Träger,
dient, vorzugsweise durch Bindung der DNA-Fragmente über immobilisierbare
Atomgruppen, bspw. Biotin-, Digoxigenin-, Dinitrophenol- oder Aminogruppen.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem das Verfahren zur Erzeugung genomischer Fragment Subsets
dient.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem Schritt (d) mehrfach durchgeführt wird, wobei jeweils in
ihrer Unterscheidungssequenz unterschiedliche Amplifikationsprimer
verwendet werden. Nach Durchführung
aller Schritte (d) sind bei dieser Ausführungsform insgesamt alle Amplifikationsprimer
einer Gruppe von Amplifikationsprimern verwendet worden, wobei die
Gruppe von Amplifikationsprimern derart gebildet ist, dass sich
in deren jeweils spezifischen Unterscheidungssequenzen insgesamt
alle in der Unterscheidungssequenz möglichen Kombinationen der 4
natürlichen
Nukleotide finden. Dabei ist es bevorzugt, dass vor Schritt (d)
die Probe entsprechend der Anzahl der durchzuführenden Schritte (d) aufgeteilt
wird und/oder nach jedem Schritt (d) eine Isolierung von Nukleinsäurefragmenten
stattfindet.
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Entsprechend ist eine bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren,
in dem nach Schritt (d) eine Isolierung von Nukleinsäurefragmenten
stattfindet.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der
Verfahrensvariante A werden in Schritt (b) ein bis vier, vorzugsweise
ein bis zwei, Typ Ils Restriktionsendonukleasen verwendet, die glatte
Enden erzeugen.
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Es ist eine ganz besonders bevorzugte
Ausführungsform
des Verfahren nach Variante A bzw. nach Variante C (bei der die überhängenden
Enden der Restriktionsfragmente in glatte Enden überführt werden), in dem
in
Schritt (c) genau ein Adaptonnolekül definierter Sequenz eingesetzt
wird, das an dem Ende, das nicht mit dem glatten Ende eines Nukleinsäurefragments aus
Schritt (b) ligiert werden soll, derart ausgestaltet ist, dass dieses
Ende nicht geeignet ist, an glatte Enden ligiert zu werden, vorzugsweise
an diesem Ende ein oder mehrere überhängende Nukleotide
und/oder ein oder mehrere ungepaarte Basenpaare und/oder eine die
Ligation ausschließende
Modifikation (z.B. eine 3'-Aminogruppe)
aufweist,
und/oder
die Ligation in Schritt (c) mit den
in Schritt (b) erzeugten Nukleinsäurefragmenten mit glatten Enden über enzymatische
Ligation erfolgt,
und/oder
in Schritt (d) die selektive
Amplifikation über
PCR erfolgt,
und/oder
der Amplifikationsprimer in Schritt
(d) zu demjenigen der Doppelstränge
des Adaptonnoleküls
aus (c) komplementär
ist, dessen 5'-Ende
mit einem 3'-Ende
eines Nukleinsäurefragments
ligiert ist
und/oder
Schritt (d) mehrfach durchgeführt wird,
wobei jeweils in ihrer Unterscheidungssequenz unterschiedliche Amplifikationsprimer
verwendet werden und dass nach Durchführung aller Schritte (d) insgesamt
alle Amplifikationsprimer einer Gruppe von Amplfikationsprimern,
die so gebildet ist, dass sich in deren jeweils spezifischen Unterscheidungssequenzen
insgesamt alle in der Unterscheidungssequenz möglichen Kombinationen der 4
natürlichen
Nukleotide finden, verwendet wurden,
und/oder
vor Schritt
(d) die Probe entsprechend der Anzahl der durchzuführenden
Schritte (d) aufgeteilt wird
und/oder nach jedem Schritt (d)
eine Isolierung von Nukleinsäurefragmenten
stattfindet.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist die Verwendung eines Amplifikationsprimers, der
- aa) ein Oligonukleotid ist,
- bb) eine Adaptor-Erkennungssequenz, die zu dem 5'-Ende eines der Doppelstränge eines
an ein Nukleinsäurefragment
ligierten Adaptormoleküls
aus (c) komplementär
ist, enthält
und
- cc) mindestens ein außerhalb
der Adaptor-Erkennungssequenz 3'-wärts liegendes Nukleotid, die Unterscheidungssequenz,
enthält.
zur
Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist die Verwendung eines mindestens teilweise doppelsträngigem Adaptormoleküles zur
Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist ein Kit bestehend aus
mindestens einem zur Durchführung eines
erfindungsgemäßen Verfahrens
geeigneten Adaptormolekül,
und/oder
mindestens
einem Mittel, bspw. eine DNA-Ligase wie die DNA-Ligase eines Phagen,
insbesondere die T4-DNA-Ligase, zur Befestigung von Adaptormolekülen an Enden
von Nukleinsäurefragmenten
und/oder
mindestens
einem zur Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
geeigneten Ampflifikationsprimer, vorzugsweise allen Amplifikationsprimern einer
Gruppe geeigneter Amplifikationsprimer, die so gebildet ist, dass
sich in deren jeweils spezifischen Unterscheidungssequenzen insgesamt
alle in der Unterscheidungssequenz möglichen Kombinationen der 4
natürlichen
Nukleotide finden,
und/oder
einer oder mehren zur Durchführung eines
erfindungsgemäßen Verfahrens
geeignete Typ Ils Restriktionsendonukleasen.
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Die Figuren zeigen:
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1 zeigt
in einer schematischen Darstellung der erfindungsgemäßen Verfahrensvariante
A deren Anwendung auf genomische DNA unter Verwendung einer glatte
Enden erzeugenden Typ Ils Restriktionsendonuklease. Dabei zeigt
im einzelnen
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- 1 Behandlung der genomischen DNA mit der Restriktionsendonuklease
MlyI [Schneidecharakteristik GAGTC(5/5)],
- 2 Befestigung doppelsträngiger
Adapter an den in (1) erzeugten Enden,
- 3 Hitzedenaturierung und Hybridisierung von gegen einen der
Adapterstränge
gerichteten Amplifikationsprimern mit einer selektiven Base "X" am 3'-Ende,
- 4 Amplifikation der Adapter-flankierten Nukleinsäurefragmente,
wobei in (4a) die selektive Base ein C und in (4b) ein A ist.
-
2 zeigt
in einer schematischen Darstellung der erfindungsgemäßen Verfahrensvariante
A deren Anwendung auf cDNA unter Verwendung einer glatte Enden erzeugenden
Typ Ils Restriktionsendonuklease. Im einzelnen be deutet
-
- 1 Behandlung der cDNA mit der Restriktionsendonuklease
MlyI,
- 2 Befestigung doppelsträngiger
Adapter an den in (1) erzeugten Enden,
- 3 Hitzedenaturierung und Hybridisierung von einem gegen einen
der Adapterstränge
gerichteten Amplifikationsprimer NNNNNNNNNNNNY mit einer selektiven
Base "Y" am 3'-Ende sowie von einem
gegen die oligo(dA)-Region der cDNA gerichteten Amplifikationsprimer
TTTTTTTTTTX mit einer selektiven Base "X" am
3'-Ende,
- 4 Amplifikation der Adapter-flankierten Nukleinsäurefragmente,
wobei in (4a) die selektiven Basen X=G und Y=A und in (4b) X=C und
Y=C sind.
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3 zeigt
in einer schematischen Darstellung der erfindungsgemäßen Verfahrensvariante
B deren Anwendung auf genomische DNA unter Verwendung zweier, unterschiedlich
lange 3'-überhängende Enden
erzeugenden Typ Ils Restriktionsendonukleasen. Es zeigt im einzelnen
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- 1 Behandlung der genomischen DNA mit den Restriktionsendonukleasen
BspCNI [Schneidecharakteristik CTCAG(10/8)] und RleAI [Schneide-charakteristik
CCCACA(12/9)].
- 2 Befestigung zweier verschiedener doppelsträngiger Adapter an den in (1)
erzeugten Enden,
- 3 Hitzedenaturierung und Hybridisierung von gegen die Adapterstränge gerichteten
Amplifikationsprimern mit selektiven Basen "X1X2" bzw. "Y1Y2" am
3'-Ende,
- 4 Amplifikation der Adapter-flankierten Nukleinsäurefragmente,
wobei in (4a) die selektiven Base für X1X2 CA und für Y1Y2 AT sowie in (4b) GT für X1X2 und CC für Y1Y2 sind.
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Im Folgenden wird die Erfindung weiter durch
Ausführungsbeispiele
erläutert,
ohne sie darauf zu beschränken.
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Ausführungsbeispiel 1: Gewinnung
von doppelsträngiger
cDNA
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50 μg Gesamt-RNA aus Rattenhirn
wurden mit Ethanol gefällt
und in 15,5 μl
RNase-freiem Wasser gelöst.
Es wurden 1,5 μl
10 μM cDNA-Primer CP29V
(5'-ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTT-3') zugefügt, 5 min
bei 65°C
inkubiert und auf Eis abgekühlt.
Zur cDNA-Erststrangsynthese wurden 3 μl 100 mM RNase-freies DTT, 6 μl 5× Superscript-Puffer,
1,5 μl RNase-freie
dNTPs, 0,6 μl 40
U/μl RNase-Inhibitor
und 1 μl
2000/μl
Superscript II Reverse Transkriptase gegeben, dann wurde gemischt
und 1h bei 42°C
inkubiert. Die Reaktion wurde auf Eis abgestoppt. Es wurden 48 μl 5× Zweitstrangpuffer,
3,6 μl 10
mM dNTPs, 148,4 μl
Wasser, 1,2 μl 1,5
U/μl RNaseN
und 6 μl
10 U/μl
E.coli DNA-Polymerase I hinzugefügt.
Es wurde gemischt und 2 h bei 22°C
inkubiert. Nach erfolgter Zweitstrangsynthese wurde zur Inaktivierung
der DNA-Polymerase 20 min auf 75°C
erhitzt. Es wurde mit 100 μl
Phenol (mit TE-Puffer pH 8,0 äquilibriert)
und anschließend
mit 100 μl
Chloroform extrahiert. Es wurde 1 μl 20 mg/ml Glycogen hinzugefügt, mit
200 μl 35%
PEG 8000/3,6 mM MgCl2 versetzt und für 15 min
bei 15.000 U/min abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol
gewaschen und getrocknet.
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Ausführungsbeispiel 2: Herstellung
Adaptor-flankierter cDNA-Fragmente
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Das die doppelsträngige cDNA aus Beispiel 1 enthaltende
Pellet wurde auf Eis in 88 μl
Wasser und 10 μl
NEBuffer 2 gelöst.
Es wurden 2 μl
5 U/μl MnlI
zugefügt,
1 h bei 37°C
inkubiert, und auf Eis abgestoppt. Zur Erzeugung glatter Enden wurden
1 μl 3 U/μl T4 DNA-Polymerase
und 1 μl
10 mM dNTPs hinzugefügt;
dann wurde 15 min bei 11 °C
inkubiert. Die Reaktion wurde mit 10 mM EDTA abgestoppt, dann wurde
15 min bei 75°C
denaturiert. Es wurde mit je 100 μl
TE-gesättigtem
Phenol und mit 100 μl
Chloroform extrahiert und nach Zugabe von 1 μl 20 mg/ml Glycogen und 10 μl 3 M Natriumacetat
pH 5,2 mit Ethanol gefällt.
Nach Abzentrifugation wurde das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen
und getrocknet. Zur Resuspension wurde mit 1,2 μl Ligationspuffer, 2 μl 10 mM ATP,
8 μl 0,5 μg/μl Blunt-Linker
(hergestellt durch Annealing von Oligonukleotiden BL25 [5'-GTCTAACGGATACGACTCCTGGAC-3'] und LB20 5'-GGAGTCGTATCCGTTAGAC-3']), 1 μl 10 mM Hexammincobalt(III)chlorid,
6,8 μl Wasser
und 1 μl
1 U/μl T4
DNA-Ligase versetzt. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16°C. Es wurde
mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert, auf 100 μl aufgefüllt und mit
1 μl 20
mg/ml Glycogen und 100 μl
35% PEG 8000/3,6 mM MgCl2 gefällt.
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Ausführungsbeispiel 3: Basen-selektive
Amplifikation Adaptor-flankierter cDNA-Fragmente
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Das die Adapter-flankierten cDNA-Fragmente
aus Beispiel 2 enthaltende Pellet wurde nach der Zentrifugation
mit 70% Ethanol gewaschen und in 20 μl Wasser resuspendiert. Zur
Amplifikation wurde 1 μl resuspendierter
Fragmente mit 2 μl
4μM Oligonukleotidprimer
LB20TG (5'-GGAGTCGTATCCGTTAGACTG-3'), 2 μl 4μM biotinmarkiertem
Oligonukleotid-primer Bio-CP28CC (5'-Biotin-ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTCC-3'), 2 μl 10× PCR-Puffer, 1,5 μl 20 mM MgCl2, 0,4 μl
10 mM dNTPs, 8,9 μl
H2O und 0,2 μl 5U/μl Taq DNA-Polymerase versetzt und in 200 μl-Reaktionsgefäße überführt. Es
wurde ein Temperaturprogramm angewendet, bestehend aus 35 Zyklen
Denaturierung (30s bei 94°C),
Annealing (30s bei 60°C)
und Extension (2 min bei 72°C).
Die Reaktion wurde mittels Elektrophorese durch ein 1,5% Agarosegel überprüft. Zur
Isolierung einzelner Fragmente wurden 5 μl der Reaktion mit 5 μl 95% Formamid/0,1%
Bromphenolblau/0,1% Xylencyanol veemischt, 2 min bei 65°C denaturiert
und mittels einer GATC1500 Direkt-Blotting-Apparatur (Fa. GATC, Konstanz)
gemäß Herstellerangaben
aufgetrennt. Förderbandstart
war 45 min nach Beginn der Elektrophorese, das Förderband wurde mit einer Startgeschwindigkeit
von 16 cm/h und einer Endgeschwindigkeit von 10 cm/h bewegt. Nach
Trocknen der Membran und schonender UV-Fixierung (1/10 der "Auto-Crosslink"-Dosis des Stratalinker,
Fa. Stratagene) wurde zur Visualisierung erhaltener Bandenmuster
nach Herstellerangaben eine auf Streptavidin/alkalische Phosphatase
beruhende Farbentwicklung vorgenommen. Ausgewählte Banden wurden mittels
eines Skalpells aus der noch feuchten Membran ausgeschnitten, in
einen PCR-Ansatz wie oben überführt und
unter Anwendung von 25 Zyklen des obigen Temperaturprogramms reamplifiziert.
Die erhaltenen Produkte wurden kloniert und sequenziert.