DE10049589A1 - Verfahren zur Mutationsanalyse - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Sequenzunterschieden zwischen Nukleinsäuremolekülen einer ersten und einer zweiten Gruppe mit den folgenden Schritten: DOLLAR A (aa) Bildung von Heterohybriden; DOLLAR A (bb) gegebenenfalls Abtrennung von Homohybriden; DOLLAR A (cc) exonukleolytische Verkürzung von Nukleinsäuremolekülen der ersten Gruppe eines Heterohybrids mit Hilfe der doppelstrangspezifischen Exonuklease; DOLLAR A (dd) Unterscheidung derjenigen Heterohybride, die an dem 3'-Terminus des Nukleinsäuremoleküls der ersten Gruppe eine ein- oder mehrbasige Fehlpaarung aufweisen, den fehlgepaarten Heterohybriden, von den dort perfekt gepaarten Heterohybriden.

Description

Zusammenfassung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifikation von Mutationen bzw. von Sequenzunterschieden zwischen verschiedenen miteinander verglichenen Nukleinsäuren unbekannter Sequenz. Dabei werden in heterohybriden Doppelsträngen, deren beide Stränge potentiell nicht vollständig komplementär zueinander sind, Fehlpaarungen detektiert. Dies geschieht durch Verkürzung eines der beiden Stränge, so daß teilweise einzelsträngige Heterohybride entstehen, deren letzte Base oder Basen des doppelsträngigen Bereichs terminale Fehlpaarungen bilden. Heterohybride mit derartigen terminalen Fehlpaarungen werden unter Ausnutzung der Fähigkeit vieler Polymerasen detektiert und isoliert, gegen die Verlängerung von fehlgepaarten 3'-Termini entlang eines 5'-Überhangs als Matrize zu diskriminieren.

Stand der Technik

Der Übergang von klassischer Genetik zu Molekulargenetik hat nicht nur die Natur der kleinsten Vererbungseinheit, das Gen, aufgeklärt, sondern konnte gleichzeitig die Grundlage von zwischen verschiedenen Individuen unterschiedlicher Merkmalsausprägung identifizieren. Es stellte sich heraus, daß bereits lediglich ein einziges Basenpaar betreffende Unterschiede in Genen einer Länge von vielen tausend Basenpaaren dramatische Auswirkungen für den jeweiligen Organismus haben können, da solche Sequenzunterschiede zum Austausch einer für die Funktion des vom jeweiligen Gen codierten Proteins wichtigen Aminosäure oder sogar zu einem Kettenabbruch während der Proteinsynthese führen kann. Daher überrascht es nicht, daß genetische Polymorphismen, die sich ursächlich auf Sequenzunterschiede genomischer DNA zurückführen lassen, von höchstem Interesse für das Verständnis (und damit die potentielle Bekämpfung) zahlreicher Krankheiten sind. Aber auch in der Züchtung von Nutzpflanzen und -tieren, der Nutzung wie der Bekämpfung von Mikroorganismen und vielen anderen Bereichen der modernen Biologie ist die Kenntnis genetischer Polymorphismen von höchstem Interesse. Es sind daher in den letzten Jahren etliche verschiedene experimentelle Ansätze beschrieben worden, um Sequenzunterschiede aufzuspüren. Grundsätzlich lassen sich die bisher verfolgten Ansätze in zwei Kategorien einteilen: (1) diejenigen Verfahren, welche eine Detektion von Sequenzunterschieden in bekannten Nukleinsäureabschnitten ermöglichen, und (2) diejenigen Verfahren, welche ein screening unbekannter Nukleinsäuren bis hin zum screening ganzer Genome auf Sequenzunterschiede hin zulassen.

Das klassische Verfahren zur Erkennung von Sequenzunterschieden in bekannten Nukleinsäuren ist die Sequenzierung, welche heute so gut wie ausschließlich nach dem Kettenabbruchprinzip nach Sanger durchgeführt wird, die aber trotz neuerer instrumenteller Fortschritte (beispielsweise Kapillarsequenzierautomaten, welche die parallele Sequenzierung von 96 Proben erlauben) nur einen sehr geringen Durchsatz ermöglicht. Kostengünstiger ist das ohne Sequenzierung auskommende Verfahren der single strand conformation polymorphism-Detektion (SSCP, vgl. Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989 Apr; 86 (8): 2766-70), welches die Abhängigkeit der Konformation und damit der Mobilität eines Nukleinsäure-Einzelstrangs in einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel von seiner Sequenz ausnutzt. Allerdings ist der Durchsatz auch dieses Verfahrens durch die Notwendigkeit begrenzt, für jede der zu untersuchenden Nukleinsäureproben eine eigene Gelspur zur Verfügung zu stellen, und die zu untersuchenden Fragmente dürfen eine bestimmte Größe nicht überschreiten (etwa 100-200 bp). Höheren Durchsatz erlaubt die Methode des oligonucleotide ligation assay (OLA; Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990 Nov; 87 (22): 8923-7), bei welchem zwei aneinandergrenzende Oligonukleotide an ein einzelsträngiges, auf eine Mutation an einer bestimmten Position hin zu untersuchendes Nukleinsäuremolekül hybridisiert werden. Sind die einander gegenüberliegenden terminalen Basen der Oligonukleotide komplementär zur jeweiligen Base des Nukleinsäuremoleküls, so können beide Oligonukleotide mittels einer Ligase miteinander verbunden werden. Im Falle einer durch die zu detektierende Mutation hervorgerufenen Fehlpaarung findet hingegen keine Ligation statt. Eine Variante des OLA-Verfahrens, ligase chain reaction (LCR; Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 1994 Feb; 3 (4): S51-64) ermöglicht eine Amplifikation derartiger Ligationsereignisse, was eine Detektion von Mutationen in Nukleinsäuren niedriger Konzentration (etwa einzelner Loci innerhalb genomischer DNA) zuläßt. Als Nachteil von OLA ist jedoch anzuführen, daß für jede auf eine Mutation hin zu überprüfende Position ein eigener Satz aus zwei Oligonukleotiden bereitzustellen ist, wodurch hohe Kosten entstehen können. Schließlich wurde eine Methode beschrieben, bei welcher von einem an sich bekannten Nukleinsäuremolekül eine Sanger-Sequenzierungsreaktion durchgeführt wird und die Produkte der Primerverlängerung mit einem Gegenstrang hybridisiert werden, welcher auf Mutationen hin untersucht werden soll (WO 00/11222). Im Fall einer terminalen Fehlpaarung, welche durch einen Sequenzunterschied verursacht wird, kann das terminale fehlgepaarte Abbruchnukleotid mittels einer proofreading-Polymerase entfernt und durch ein markiertes Abbruchnukleotid ersetzt werden, so daß eine Detektion möglich wird. Da zur Durchführung dieses Verfahrens mehrere Schritte erforderlich sind, um jeweils ein einziges Paar zweier einander entsprechender Nukleinsäuremoleküle auf Sequenzunterschiede hin zu überprüfen, ist auch dieses Verfahren mit hohen Kosten verbunden.

Die wohl älteste Methode zum Auffinden von Sequenzunterschieden in unbekannten Nukleinsäuren, welche in genomischem Maßstab eingesetzt werden kann, ist die Detektion von restriction fragment length polymorphisms (RFLP, de Martinville et al., Am. J. Hum. Genet. 1982 Mar; 34 (2): 216-26), die auf dem Auftreten bzw. der Eliminierung von Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme durch Sequenzveränderungen basiert und beispielsweise zur Identifikation von Transposon-Insertionsstellen eingesetzt werden kann. Dabei können aber natürlich ausschließlich Sequenzunterschiede detektiert werden, die Erkennungsstellen des jeweiligen Enzyms betreffen, so daß in jedem RFLP-Experiment jeweils nur ein kleiner Teil aller möglichen Sequenzunterschiede erkannt werden kann. Ein neueres Prinzip zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen aus zwei verschiedenen Proben stammenden Nukleinsäuremolekülen basiert auf der Erzeugung von heterohybriden Doppelsträngen, wobei je ein aus der ersten Probe und ein aus der zweiten Probe stammender, weitgehend hierzu komplementärer Strang miteinander hybridisiert werden. Sequenzunterschiede zwischen beiden Strängen, beispielsweise einzelne Basenaustausche (single nucleotide polymorphisms, SNPs), führen zu doppelstrang-internen Fehlpaarungen, da hier zueinander nicht komplementäre Basen einander gegenüberstehen. Derartige interne Fehlpaarungen lassen sich chemisch (chemical mismatch cleavage, Grompe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989 Aug; 86 (15): 5888-92) oder enzymatisch (Burdon und Lees, Biosci. Rep. 1985 Aug; 5 (8): 627-32; Biswas und Hsieh, J. Biol. Chem. 1996 Mar 1; 271 (9): 5040-8) erkennen, so daß Sequenzunterschiede detektiert werden können. Einer weiten Verbreitung dieser Fehlpaarungs-Erkennungsmethoden stehen jedoch die nicht zufriedenstellende Effizienz und Spezifität der Verfahren entgegen; so werden unterschiedliche Fehlpaarungen beispielsweise mit verschiedener Effizienz erkannt (vgl. etwa Youil et al., Genomics 1996 Mar 15; 32 (3): 431-5; WO 99/42595 [siehe hier insbesondere Fig. 4]).

Gemäß dem oben Gesagten besteht unverändert großer Bedarf an einem Verfahren, welches die zuverlässige Detektion von Sequenzunterschieden in Mischungen unbekannter Nukleinsäuremoleküle erlaubt. Gegenüber dem Stand der Technik weist das erfindungsgemäße Verfahren daher folgende Vorteile auf:

• - Detektion von Sequenzunterschieden in bekannten wie in unbekannten Nukleinsäuren
• - einsetzbar auch mit komplexen Mischungen von Nukleinsäuren, beispielsweise cDNA, genomische DNA oder Repräsentationen hiervon
• - zuverlässige Erkennung von Sequenzunterschieden, dabei sehr geringer Hintergrund durch falsch-positive Ereignisse
• - sehr hoher Durchsatz erzielbar durch Identifikation der Sequenzunterschiede repräsentierenden Nukleinsäuremoleküle mittels Hybridisierung mit komplexen Nukleinsäure-Anordnungen

Im folgenden wird ein Verfahren zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen Nukleinsäuren verschiedener Herkunft vorgestellt, bestehend aus folgenden Schritten:

1a. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft,
2a. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft,
3a. Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
4a. Gegebenenfalls Abtrennung der entstandenen Homohybride aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft untereinander und aus Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft untereinander zur Isolation der Heterohybride, bestehend aus einem Strang erster Herkunft und einem Strang zweiter Herkunft,
5a. Selektive Verkürzung des Strangs erster Herkunft in den Heterohybriden, so daß eine Mischung von Heterohybriden mit unterschiedlich langen 5'-Überhängen entsteht,
6a. Unterscheidung derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch eine ein- oder mehrbasige Fehlpaarung auszeichnet, von denjenigen Heterohybriden, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte Basenpaarung auszeichnet.

In einer zweiten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen Nukleinsäuren verschiedener Herkunft vorgestellt, bestehend aus den folgenden Schritten:
1b. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft,
2b. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft,
3b. Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
4b. Gegebenenfalls Abtrennung der entstandenen Homohybride aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft untereinander und aus Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft untereinander zur Isolation der Heterohybride, bestehend aus einem Strang erster Herkunft und einem Strang zweiter Herkunft,
5b. Selektive Verkürzung des Strangs erster Herkunft in den Heterohybriden, so daß eine Mischung von Heterohybriden mit unterschiedlich langen 5'-Überhängen entsteht,
6b. Auffüllen derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte terminale Basenpaarung auszeichnet,
7b. Trennung der aufgefüllten Heterohybride von nicht aufgefüllten Heterohybriden,
8b. Identifikation der nicht aufgefüllten Heterohybride

In einer dritten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen Nukleinsäuren verschiedener Herkunft vorgestellt, bestehend aus den folgenden Schritten:

1c. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft,
2c. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft,
3c. Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
4c. Gegebenenfalls Abtrennung der entstandenen Homohybride aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft untereinander und aus Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft untereinander zur Isolation der Heterohybride, bestehend aus einem Strang erster Herkunft und einem Strang zweiter Herkunft,
5c. Selektive Verkürzung des Strangs erster Herkunft in den Heterohybriden, so daß eine Mischung von Heterohybriden mit unterschiedlich langen 5'-Überhängen entsteht,
6c. Auffüllen derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte terminale Basenpaarung auszeichnet,
7c. Entfernung der terminalen fehlgepaarten Base oder Basen der unaufgefüllt gebliebenen Heterohybride,
8c. Auffüllung der unaufgefüllt gebliebenen Heterohybride,
9c. Trennung der in Schritt (6c) aufgefüllten Heterohybride von den in Schritt ( 8c) aufgefüllten Heterohybriden,
10c. Identifikation der in Schritt (8c) aufgefüllten Heterohybride

In einer vierten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen Nukleinsäuren verschiedener Herkunft vorgestellt, bestehend aus den folgenden Schritten:

1d. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft,
2d. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft,
3d. Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
4d. Gegebenenfalls Abtrennung der entstandenen Homohybride aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft untereinander und aus Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft untereinander zur Isolation der Heterohybride, bestehend aus einem Strang erster Herkunft und einem Strang zweiter Herkunft,
5d. Selektive Verkürzung des Strangs erster Herkunft in den Heterohybriden, so daß eine Mischung von Heterohybriden mit unterschiedlich langen 5'-Überhängen entsteht,
6d. Auffüllen derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte terminale Basenpaarung auszeichnet,
7d. Isolation der unaufgefüllt gebliebenen Heterohybride über Hybridisierung mit einem immobilisierten oder immobilisierbaren Oligonukleotid, welches mindestens teilweise komplementär zum einzelsträngigen Linkerstrang des 5'-Überhangs besagter Heterohybride ist,
8d. Identifikation der in Schritt (7d) isolierten Heterohybride.

In einer fünften Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen Nukleinsäuren verschiedener Herkunft vorgestellt, bestehend aus den folgenden Schritten:

1e. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft,
2e. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft,
3e. Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
4e. Gegebenenfalls Abtrennung der entstandenen Homohybride aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft untereinander und aus Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft untereinander zur Isolation der Heterohybride, bestehend aus einem Strang erster Herkunft und einem Strang zweiter Herkunft,
5e. Selektive Verkürzung des Strangs erster Herkunft in den Heterohybriden, so daß eine Mischung von Heterohybriden mit unterschiedlich langen 5'-Überhängen entsteht,
6e. Extension derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte terminale Basenpaarung auszeichnet, um ein zum Kettenabbruch führendes Nukleotid,
7e. Entfernung der terminalen fehlgepaarten Base oder Basen der unverlängert gebliebenen Heterohybride,
8e. Auffüllung der unverlängert gebliebenen Heterohybride,
9e. Trennung der in Schritt ( 6e) mit einem Abbruchnukleotid verlängerten Heterohybride von den in Schritt (8e) aufgefüllten Heterohybriden,
10e. Identifikation der in Schritt (7d) aufgefüllten Heterohybride.

In einer sechsten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen Nukleinsäuren verschiedener Herkunft vorgestellt, bestehend aus den folgenden Schritten:
1f. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft,
2f. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft,
3f. Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
4f. Gegebenenfalls Abtrennung der entstandenen Homohybride aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft untereinander und aus Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft untereinander zur Isolation der Heterohybride, bestehend aus einem Strang erster Herkunft und einem Strang zweiter Herkunft,
5f. Selektive Verkürzung des Strangs erster Herkunft in den Heterohybriden, so daß eine Mischung von Heterohybriden mit unterschiedlich langen 5'-Überhängen entsteht,
6f. Extension derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte terminale Basenpaarung auszeichnet, um ein zum Kettenabbruch führendes Nukleotid, welches eine immobilisierbare Atomgruppe trägt,
7f. Trennung der in Schritt (6f) verlängerten Heterohybride von unverlängert gebliebenen Heterohybriden durch Immobilisierung der verlängerten Heterohybride,
8f. Identifikation der in Schritt (6f) unverlängert gebliebenen Heterohybride.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Heterohybriden, bestehend aus den folgenden Schritten:

1g. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft,
2g. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft, und wobei die Linker aus Schritt (1g) mindestens teilweise zu den Linkern aus Schritt (2g) sequenzidentisch sind, aber an ihrem vom Nukleinsäuremolekül fortweisenden Ende kürzer sind als diese,
3g. Hybridisierung der Nukleinsäuremoleküle aus Schritt (1g) und Schritt (2g) in einzelsträngiger Form zu Heterohybriden, an deren Enden sich ein von den Enden der Linker aus Schritt (2g) stammender einzelsträngiger Überhang von mindestens einer Base Länge bildet,
4g. Gegebenenfalls Abtrennung der entstandenen Homohybride aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft untereinander und aus Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft untereinander zur Isolation der Heterohybride, bestehend aus einem Strang erster Herkunft und einem Strang zweiter Herkunft,
5g. Behandlung der Heterohybride aus Schritt (3g) mit einer Exonuklease, welche zurückversetzte 3'-Enden als Substrat akzeptiert, überhängende 3'-Enden aber nicht als Substrat akzeptiert, so daß Heterohybride entstehen, bei denen der aus Schritt (1g) stammende Strang in unterschiedlich starkem Maß verkürzt ist, und welche einen einzelsträngigen 5'-Überhang aufweisen, welcher von einem Teilbereich des aus Schritt ( 2g) stammenden Nukleinsäuremoleküls gebildet wird,
6g. weitere Verarbeitung der Heterohybride aus Schritt (5g) gemäß den Schritten (6a), (6b)-(8b ), (6c)-(10c), (6 d)-(8d), (6e)-(10 e), oder (6f-8f).

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Heterohybriden, bestehend aus den folgenden Schritten:

1h. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft, wobei der mit seinem 5'-Ende vom Nukleinsäuremolekül fortweisende Linkerstrang eine immobilisierbare Gruppe trägt,
2h. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft, wobei die Sequenz der Linker aus (2h) verschieden ist von der Sequenz der Linker aus (1h),
3h. Erzeugung von Verkürzungsprodukten aus den in (1h) bereitgestellten Nukleinsäuremolekülen, gefolgt von der Isolation der immobilisierbaren verkürzten Nukleinsäuremoleküle,
4h. Vermischung der isolierten verkürzten Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft aus (3h) mit den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, gefolgt von Strangtrennung und anschließender Hybridisierung,
5h. Unterscheidung derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch eine ein- oder mehrbasige Fehlpaarung auszeichnet, von denjenigen Heterohybriden, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte Basenpaarung auszeichnet.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung von Homohybriden von Heterohybriden, bestehend aus den folgenden Schritten:

1i. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft, wobei die Linker eine Erkennungsstelle für eine erste Restriktionsendonuklease tragen,
2i. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft, und wobei die Linker teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie die Linker aus (1i), dabei aber eine zweite Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease tragen, so daß bei Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen aus (1i) und aus ( 2i) in den Heterohybriden keine der beiden besagten Erkennungsstellen mehr in doppelsträngiger Form vorhanden sind,
3i. Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
4i. Behandlung der in (3i) entstandenen Mischung aus Homohybriden und Heterohybriden mit den beiden Restriktionsendonukleasen aus (1i) und (2 i), so daß die Linker von den entstandenen Homohybriden verkürzt oder abgetrennt werden, mit den Heterohybriden aber in unverkürzter Form verbunden bleiben,
5i. Trennung derjenigen Moleküle, welche von den Linkersequenzen aus (1i) und (2i) flankiert sind, von denjenigen Molekülen, deren Linker in (4i) verkürzt oder abgetrennt worden sind.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein alternatives Verfahren zur Abtrennung von Homohybriden von Heterohybriden, bestehend aus den folgenden Schritten:

1j. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft, wobei die Linker mit einer immobilisierbaren Gruppe versehen sind und eine erste maskierte Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease tragen,
2j. Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches oder welche mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft, und wobei die Linker teilweise die gleiche Sequenz aufweisen wie die Linker aus (1 j), mit einer immobilisierbaren Gruppe versehen sind und eine maskierte Erkennungsstelle für besagte Restriktionsendonuklease tragen, so daß bei Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen aus (1j) und aus (2j) in den Heterohybriden eine Erkennungsstellen für besagte Restriktionsendonuklease entsteht, und wobei die die Nukleinsäuremoleküls zweiter Herkunft flankierenden Linker gegen exonukleolytischen Abbau resistente Gruppen enthalten,
3j. Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
4j. Behandlung der in (3 j) entstandenen Mischung aus Homohybriden und Heterohybriden mit der Restriktionsendonuklease aus (1j), so daß die Linker von den entstandenen Heterohybriden verkürzt oder abgetrennt werden, mit den Homohybriden aber in unverkürzter Form verbunden bleiben,
5j. Immobilisierung der immobilisierbaren Gruppen, so daß die diese Gruppen enthaltenden Homohybride und Linkerfragmente von den in (4j) erhaltenen, um einen Teil ihrer Linker oder um ihre vollständigen Linker verkürzten Heterohybride abgetrennt werden.

Bei den Nukleinsäuremolekülen erster bzw. zweiter Herkunft der Schritte (1a-j) bzw. (2a-j) handelt es sich vorzugsweise um genomische DNA, mRNA oder cDNA, welche aus beliebigen biologischen Proben gewonnen wurde. Hierbei bedeutet "biologische Probe" aus einem oder aus mehreren Individuen gewonnenes Material. Beispielsweise kann es sich bei besagten Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft um genomische DNA handeln, die aus einer Tumor-Biopsie eines Patienten gewonnen wurde, während es sich bei den unten näher beschriebenen Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft um genomische DNA des gleichen Patienten handeln kann, welche aus nicht erkranktem Gewebe stammt. Es ist ebenfalls möglich, zur Durchführung von "genotyping"-Experimenten Nukleinsäuremoleküle aus mehreren, beispielsweise einigen hundert oder einigen tausend, Angehörigen einer in Hinblick auf mindestens ein Merkmal genetisch definierten Gruppe von Individuen zu gewinnen und mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens mit aus einer genetisch hiervon unterschiedenen oder unterscheidbaren Gruppe von Individuen gewonnenen Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft zu vergleichen. Auf diese Weise lassen sich etwa genetisch charakterisierte, aber noch nicht molekularbiologisch identifizierte Loci für bestimmte Krankheits-Prädispositionen auffinden, sofern geeignete Gruppen von Individuen zur Verfügung stehen. Für derartige Zwecke gut geeignete Volksgruppen sind etwa die nordamerikanischen "Amish People" oder auch die Bevölkerung Islands, da in beiden Fällen einerseits keine starke Durchmischung der jeweiligen Volksgruppe mit anderen Volksgruppen stattgefunden hat und andererseits gute Aufzeichnungen über das Auftreten bestimmter Krankheiten sowie weit zurückreichende Familienstammbäume angelegt worden sind, so daß Prädispositionsloci genetisch gut erfaßbar sind.

Ein weiterer Einsatzbereich des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Analyse genomischer DNA von durch Mutagenese veränderten Organismen. Das beispielsweise in der Pflanzenzüchtung oft verwendete Verfahren der Transposonmutagenese, welches das Auffinden des interessierenden, durch Insertion veränderten Locus etwa mittels RFLP- Techniken ermöglicht, birgt den Nachteil, daß für viele Organismen keine geeigneten Transposons und/oder keine geeigneten Transformationstechniken zur Verfügung stehen. Außerdem werden häufig sog. "hot spots" beobachtet, welche durch eine Abweichung der Insertionsloci-Verteilung von einer reinen Zufallsverteilung zustande kommen. Chemische Mutagenese hingegen, beispielsweise mittels Einwirkung von EMS (Ethylmethansulfonat; vgl. Sega, Mutat. Res. 1984 Sep-Nov; 134 (2-3): 113-42), erzeugt eine sehr gleichmäßige Verteilung von Mutationen in den behandelten Genomen, hier ist jedoch nach dem Stand der Technik ein sehr hoher Aufwand erforderlich, um erzeugte und für den jeweils interessierenden genetischen Effekt verantwortliche Punktmutationen zu identifizieren. Da das erfindungsgemäße Verfahren jedoch eine Identifikationen von Punktmutationen im Maßstab ganzer Genome oder Repräsentationen hiervon (s. u.) zuläßt, ist genomische DNA aus einem chemischen Mutageneseprogramm stammender Organismen gut für eine Analyse geeignet. Andererseits sind mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens selbstverständlich auch durch Transposon-Aktivität hervorgerufene wie auch beliebige andere Sequenzveränderungen identifizierbar.

Eine weitere mögliche Quelle von Nukleinsäuremolekülen erster bzw. zweiter Herkunft sind Bakterienstämme der gleichen oder nahe verwandter Arten, aber unterschiedlicher Eigenschaften. Von großer wirtschaftlicher Bedeutung sind etwa Produktionsstämme, die in der Biotechnologie zur großtechnischen Gewinnung bestimmter Verbindungen, etwa Aminosäuren, eingesetzt werden. Zwischen der Produktivität der mittels klassischer Verfahren erhaltenen Produktionsstämme und der zugehörigen Wildtypen bestehen oft sehr große Unterschiede, deren molekulare Ursache aber meist nicht bekannt ist. Ein weiterer Anwendungsbereich des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Identifikation der genomischen Unterschiede zwischen verwandten Stämmen von Mikroorganismen unterschiedlicher Stoffwechselaktivität, welche nachfolgend weitere Stamm-Optimierung und damit Senkung von Produktionskosten erlaubt. Ebenfalls von großem Interesse ist die Aufklärung der molekularen Unterschiede zwischen infektiösen und nicht-infektiösen Mikroorganismen, insbesondere in Hinblick auf die dringend erforderliche Entwicklung neuer Antibiotika.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, die aus den Proben gewonnenen Moleküle, gegebenenfalls in fragmentierter Form, mit terminalen bekannten Sequenzen zu versehen, welche eine Amplifikation oder auch eine Abtrennung über die Hybridisierung an einen immobilisierten oder immobilisierbaren Gegenstrang ohne vorherige Kenntnis der Sequenz der eingesetzten Nukleinsäuremoleküle ermöglichen. Beispielsweise kann genomische DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen geschnitten werden, und an den erhaltenen Fragmenten können mittels einer Ligase doppelsträngige Linker befestigt werden, wie von Mueller und Wold (Science 1989 Nov 10; 246 (4931): 780-6) beschrieben. Dabei können die beiden ein Fragment flankierenden Linkersequenzen identisch oder voneinander verschieden sein. Jedenfalls ist nun eine Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion möglich, indem Primer eingesetzt werden, die mit den bekannten flankierenden Sequenzen hybridisieren können. Eine Alternative zur Polymerasekettenreaktion besteht darin, die Promotorsequenz einer RNA-Polymerase, beispielsweise T7-RNA-Polymerase, in eine oder beide der angefügten terminalen Sequenzen einzuführen und eine Amplifikation in Form einer in-vitro-Transkription durchzuführen. Sofern gewünscht, können beide Enden eines Nukleinsäuremoleküls gezielt mit verschiedenen Sequenzen versehen werden. Im einfachsten Falle geschieht dies durch Schneiden der Ausgangs-Nukleinsäuren mit mindestens zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen, welche unterscheidbare Enden generieren, beispielsweise ein überhängendes und ein glattes Ende oder ein 3'-überhängendes Ende und ein 5'- überhängendes Ende. Es werden dann für das jeweilige Ende spezifische und voneinander verschiedene Linker angefügt. Durch anschließende Amplifikation mit Primern, die an die verschiedenen Linker hybridisieren können, lassen sich unter Ausnutzung des bekannten PCR-Suppressionseffekts (Luk'ianov et al., Bioorg. Khim. 1996 Sep; 22 (9): 686-90) gezielt die von verschiedenen terminalen Sequenzen flankierten Nukleinsäurefragmente amplifizieren. Dies führt gleichzeitig zur Reduktion der Komplexität der eingesetzten Ausgangs- Nukleinsäuren, welche beispielsweise im Falle genomischer DNA höherer Organismen erwünscht sein kann. Bevorzugt erfolgt eine derartige Reduktion der Komplexität durch Erzeugung von "Repräsentationen" (Lisitsyn et al., Science 1993 Feb 12; 259 (5097): 946-51), also der Gewinnung von durch eindeutige Kriterien definierten Teilmengen aus der Gesamtheit der vorliegenden und zu analysierenden Ausgangs-Nukleinsäuren. Solche Repräsentationen können beispielsweise erzeugt werden, indem genomische DNA mit weniger häufig schneidenden Restriktionsendonukleasen mit einer Erkennungssequenz, welche sechs, acht oder mehr Basen umfaßt, geschnitten wird, gefolgt von einer Größenselektionierung beispielsweise all derjenigen Fragmente, deren Länge 1 kb nicht überschreitet. Eine weitere Möglichkeit zur Erzeugung von Repräsentationen besteht im Einsatz einer weniger häufig schneidenden Restriktionsendonuklease in Kombination mit einer häufiger schneidenden Restriktionsendonuklease, gefolgt von der Gewinnung von Fragmenten mit verschiedenen Enden. Falls gewünscht, kann weiterhin eine Größenselektionierung der gewonnenen Fragmente auf dem Fachmann geläufige Weise erfolgen. Bevorzugterweise werden Repräsentationen jedoch derart hergestellt, daß ein Satz nicht überlappender Fragmentpopulationen erzeugt wird, welche in ihrer Gesamtheit wiederum alle oder wenigstens weitgehend alle in den Ausgangs-Nukleinsäuren enthaltenen Sequenzbereiche umfassen. Hierfür ist die von Lisitsyn et al. beschriebene Vorgehensweise nicht geeignet, da sie zu einem Verlust eines großen Anteils der Ausgangs-Sequenzen führt. Dies ergibt sich aus dem Einsatz nicht häufig schneidender Restriktionsendonukleasen, gefolgt von einer Größenselektionierung durch Amplifikation hinreichend kleiner Fragmente. Statt dessen ist bevorzugt, die Ausgangs-Nukleinsäuren mit Hilfe einer hinreichend häufig schneidenden Restriktionsendonuklease zu fragmentieren, um Fragmente im Größenbereich von einigen hundert Basenpaaren zu erzeugen. Diese Fragmentkollektion umfaßt nun zunächst noch die gesamte Komplexität der Ausgangs-Nukleinsäuren. Um die gewünschte Reduktion durch Aufteilung in verschiedene nicht überlappende Fraktionen vorzunehmen, ist die Befestigung von Linkermolekülen bevorzugt, gefolgt von einer PCR-Amplifikation mittels Primern, die mit einem Strang der befestigten Linkermoleküle hybridisieren können. Würde nun eine Restriktionsendonuklease eingesetzt, die innerhalb ihrer Erkennungsstelle schneidet, und würden diese Primer, wie aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. beispielsweise US-A 5,876,932), an ihrem 3'-Ende zusätzlich noch eine oder mehrere "selektive" Basen aufweisen, die mit den ersten bzw. letzten Basen des linkerflankierten Nukleinsäurefragments nur dann hybridisieren und im Zuge der Amplifikation verlängert werden können, wenn sie mit diesen identisch sind, so ließe sich mit einem Primer mit gegebener Extension wie beabsichtigt nur ein definierter Bruchteil aller linkerflankierten Nukleinsäuremoleküle amplifizieren. Da jedoch die Enden der auf oben beschriebene Weise erzeugten Nukleinsäurefragmente nicht voneinander unterscheidbar wären und sich somit nicht gezielt von zwei Linkermolekülen verschiedener Sequenz flankieren ließen, würden über den beschriebenen Einsatz von verlängerten Primern jeweils nur diejenigen Fragmente amplifiziert, deren erste (und gegebenenfalls zweite, etc.) Base eines Strangs identisch ist mit der ersten (und gegebenenfalls zweiten, etc.) Base des Gegenstrangs, so daß ein derart erzeugter Satz von Repräsentationen nicht vollständig sein könnte. Daher ist bevorzugt, daß die Erzeugung von Repräsentationen über den Einsatz von häufig schneidenden, Überhänge produzierenden Typ IIS-Restriktionsendonukleasen erfolgt, welche außerhalb ihrer Erkennungsstelle schneiden und einen Überhang definierter Länge und Position relativ zur Erkennungsstelle, aber nicht determinierter Sequenz erzeugen. In einem darauffolgenden Schritt werden an den erzeugten Fragmenten Linkermoleküle befestigt. Hierfür wird ein Satz von Linkern bereitgestellt, der alle möglichen Überhänge des durch die jeweilige Restriktionsendonuklease vorgegebenen Typs (also 5'-Überhänge oder 3'-Überhänge einer definierten Länge) enthält, wobei sich die Sequenz der Linker voneinander so unterscheidet, daß die Sequenz des doppelsträngigen Bereichs eines Linkers keine Hybridisierung eines Linkerstrangs mit einem Strang eines anderen Linkers erlaubt. Dies resultiert in einer eindeutigen Zuordenbarkeit eines Linkerüberhangs und damit eines Fragmentüberhangs, an dem besagter Linker befestigt werden kann, zu der restlichen Linkersequenz. Die Befestigung der Linker an den Fragmentenden erfolgt hierfür unter Bedingungen, die eine Befestigung nicht vollständig zueinander komplementärer Überhänge unterdrücken (Shaw-Smith et al., Biotechniques 2000 May; 28 (5): 958-64). Somit ist es möglich, einen Satz von Nukleinsäuremolekülen zu erzeugen, deren flankierende Linkersequenz am einen Ende in keinem festen Zusammenhang steht zur flankierenden Linkersequenz am gegenüberliegenden Ende. Durch Amplifikation der so erhaltenen Kollektion Linker-flankierter Nukleinsäurefragmente mit einem PCR-Primer, welcher komplementär zu einem Strang eines aus der obigen Gruppe ausgewählten Linker ist, wird eine aus von diesem Linker auf beiden Seiten flankierten Fragmenten bestehende bestimmte Repräsentation der Nukleinsäurefragmente erhalten. Werden zur Amplifikation hingegen zwei verschiedene PCR-Primer eingesetzt, welche komplementär zu je einem Strang zweier verschiedener aus obiger Gruppe ausgewählter Linker sind, wird eine aus von diesen beiden Linkersequenzen flankierten Fragmenten bestehende andere Repräsentation erhalten, während die Amplifikation von Fragmenten, welche auf beiden Seiten von identischen Linkersequenzen flankiert werden, durch den PCR-Suppressionseffekt unterdrückt wird.

Eine weitere Möglichkeit, genomische Repräsentationen zu erzeugen, besteht in der Gewinnung Chromosomen-spezifischer Nukleinsäuren, wie sie beispielsweise mittels Fluß- Karyotypie möglich ist (Harris et al., Hum. Genet. 1985; 70 (1): 59-65). Dieser Ansatz bietet sich beispielsweise dann an, wenn die bestimmten Krankheitsprädispositionen zugrunde liegenden Loci bisher lediglich mittels genetischer Verfahren grob kartiert wurden, ohne daß der entsprechende Locus molekular identifiziert werden konnte. Beispielsweise ist seit langem eine Prädisposition für die Erkrankung an Depressionen einem Bereich auf Chromosom 18 zugeschrieben worden (Berrettini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994 Jun 21; 91 (13): 5918-21); das relevante Gen konnte aber bisher nicht identifiziert werden.

Jedenfalls werden die Nukleinsäuremoleküle der ersten und der zweiten Herkunft in der Regel auf gleiche Weise erzeugt, beispielsweise durch Behandlung genomischer DNA mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen, gefolgt von der Befestigung geeigneter Linkermoleküle.

Zur selektiven Verkürzung des Strangs erster Herkunft in den Heterohybriden ist es erforderlich, daß beide Stränge vom zur Verkürzung eingesetzten Agens unterschieden werden können. Dies kann leicht durch entsprechende Ausgestaltung der Linker aus (1a-g), (1i-j), (2a-g ) bzw. (2i-j) geschehen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (1a-f) und in Schritt (2a-f ) Linkerstränge unterschiedlicher Länge eingesetzt, so daß die zu Beginn eingesetzten und im Zuge der Hybridisierung in Schritt (3a-f) rekonstituierten Homohybride aus Strängen gleicher Herkunft 3'-überhängende Enden aufweisen, die entstandenen Heterohybride aber Enden aufweisen, bei denen an beiden Enden die die Nukleinsäuremoleküle zweiter Herkunft flankierenden Linkerstränge überstehen und somit sowohl einen 5'-Überhang als auch einen 3'-Überhang bilden. Wird nun eine Verkürzung mittels einer Exonuklease wie beispielsweise Exonuklease III vorgenommen, welche lediglich zurückversetzte 3'-Enden, nicht aber vorspringende 3'- Enden als Substrat erkennt, so findet ein exonukleolytischer Abbau lediglich der zurückversetzte 3'-Enden bildenden Stränge erster Herkunft statt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die mit ihrem 3'-Ende vom Nukleinsäuremolekül fortweisenden Linkerstränge mindestens eine gegen exonukleolytischen Abbau beständige Atomgruppe, insbesondere ein α-Thionukleotid, so daß in den gebildeten Heterohybriden lediglich der Strang erster Herkunft einer exonukleolytischen Verkürzung zugänglich wäre. Dieselbe Wirkung wäre im übrigen erzielbar, indem die Stränge zweiter Herkunft α- Thionukleotid enthielten oder sogar vollständig hieraus synthetisiert würden. Jedenfalls ist bevorzugt, daß in einer Kollektion in Form von Heterohybriden vorliegender unterschiedlich stark verkürzter Varianten eines gegebenen Nukleinsäuremoleküls weitgehend sämtliche möglichen Verkürzungen in möglichst weitgehend identischer Kopienzahl vorhanden sind. Dementsprechend enthielte beispielsweise die Kollektion der verkürzten Varianten eines gegebenen Nukleinsäuremoleküls einer Länge von 100 bp alle an ihrem 3'-Ende verkürzten Moleküle einer Länge von 1 bp bis 99 bp, wobei Moleküle, deren Verkürzung bis in den an ihrem 5'-Ende liegenden Linkerstrang reicht, unberücksichtigt gelassen werden können. Jedenfalls ist wichtig, daß in einer Mischung von Heterohybriden aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft und Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft möglichst jede Nukleotidposition der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft durch Heterohybrid-Moleküle repräsentiert wird, bei denen der Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich (also die letzte Base des doppelsträngigen Bereichs) an eben dieser Nukleotidposition liegt. Hierbei fallen in der Regel das 5'-Ende der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft und das 3'-Ende der verkürzten Nukleinsäuremoleküle zweiter Herkunft auf die gleiche, beispielsweise durch die Schnittstelle einer Restriktionsendonuklease definierte Position. Um eine gleichmäßige Verteilung aller möglichen Verkürzungsvarianten einer Heterohybrid-Spezies mittels exonukleolytischem Abbau zu erzielen, werden die Reaktionsbedingungen, insbesondere Reaktionsdauer, Temperatur und Menge an eingesetzter Exonuklease, so gewählt, daß kein vollständiger Strangabbau erfolgt, sondern eine Population unterschiedlich stark verkürzter Moleküle erzeugt wird. Ein solches Vorgehen ist etwa aus der Deletionsklonierung zur Sequenzierung langer Nukleinsäuren mittels Exonuklease III oder Bal 31 bekannt (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, 1994). Wird eine besonders gleichmäßige Verteilung aller möglicher Längen der aus einer Molekülspezies erzeugten verkürzten Nukleinsäuremoleküle gewünscht, so können auch parallel mehrere Verkürzungsreaktionen derart durchgeführt werden, daß sich der mittlere Verkürzungsgrad zwischen den Reaktionen unterscheidet, gefolgt von einer anschließenden Vereinigung der erhaltenen Verkürzungsprodukte. Da weiterhin in einen Nukleinsäurestrang inkorporierte α- Thionukleotide für eine Anzahl weitverbreiteter Exonukleasen kein Substrat darstellen (Schreiber et al., Nucleic Acids Res. 1985 Nov 11; 13 (21): 7663-72), besteht eine Alternative zur Erzeugung einer geeigneten Größenverteilung der Verkürzungsvarianten im Einbau derartiger Nukleotide im Unterschuß zu ihren gewöhnlichen Nukleotidanaloga (King und Goodbourn, Nucleic Acids Res. 1992 Mar 11; 20 (5): 1039-44), gefolgt von einem "vollständigen" exonukleolytischen Strangabbau, der in Abbaurichtung gesehen jeweils am ersten inkorporierten Thionukleotid eines Strangs angehalten wird. Ebenfalls denkbar wäre es im übrigen, einen partiellen endonukleolytischen Abbau vorzunehmen, indem der Strang zweiter Herkunft gegen besagte Endonukleolyse geschützt ist. Beispielsweise erzeugt RNase H in Heterohybriden aus einem DNA-Strang und einem RNA-Strang Einzelstrangbrüche ausschließlich im RNA-Strang. DNase I hingegen erzeugt in Gegenwart von Mg²⁺ Einzelstrangbrüche in DNA-Doppelsträngen, wobei der jeweilige Strang zweiter Herkunft gegen DNase-induzierte Strangbrüche geschützt werden könnte, indem er ausschließlich aus Thionukleotiden synthetisiert würde, die von einer Vielzahl von DNA-Polymerasen problemlos als Substrat akzeptiert werden. Ein derartiger Schutz eines der beiden Stränge wäre selbstverständlich nicht erforderlich, wenn die Erzeugung von Verkürzungsprodukten wie in Schritt (3h) beschrieben aus den Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft vor der Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen erster und zweiter Herkunft erfolgt.

Im übrigen wäre es natürlich ebenfalls möglich, gemäß Schritt (1h-5h) zunächst eine Verkürzung der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft durchzuführen und dann die Verkürzungsprodukte mit den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft zu hybridisieren, gefolgt von einer Unterscheidung derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch eine ein- oder mehrbasige Fehlpaarung auszeichnet, von denjenigen Heterohybriden, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte Basenpaarung auszeichnet. Dabei könnte anstelle einer Verkürzung auch eine Strangneusynthese durch Verlängerung eines an einen Linkerstrang hybridisierten Oligonukleotidprimers stattfinden, vorausgesetzt, auf die Längenverteilung der Syntheseprodukte trifft das über die Längenverteilung der Verkürzungsprodukte oben Gesagte zu. Erreichbar wäre eine derartige Längenverteilung nicht bis zum Matrizenende synthetisierter Stränge etwa durch ein geeignetes Einstellen der Nukleotidkonzentration und der für die Synthese zur Verfügung gestellten Zeit oder auch durch eine Zugabe von aus der Nukleinsäuresequenzierung bekannten Nukleotiden, welche zu einem Kettenabbruch führen.

Zur Hybridisierung der in Schritt (1a-f) und Schritt (2a-f) hergestellten Nukleinsäuremoleküle in Schritt (3a-f) werden die in der Regel doppelsträngig vorliegenden Nukleinsäuremoleküle denaturiert und vermischt, wobei diese Reihenfolge selbstverständlich auch umgekehrt werden kann, und dann geeigneten Hybridisierungsbedingungen unterworfen. Die geeigneten Hybridisierungsbedingungen (beispielsweise Temperatur, Nukleinsäure-Konzentration, Salzgehalt, ggf. Formamid-Gehalt etc.) richten sich unter anderem nach der erwarteten Länge der Heterohybride sowie nach der Komplexität der Nukleinsäuremischung. Bei sehr hoher Komplexität (beispielsweise bei genomischer DNA bzw. bei Repräsentationen genomischer DNA höherer Organismen) ist für einen weitgehend vollständigen Ablauf der Hybridisierung eine längere Hybridisierungszeit bei höherer Nukleinsäurekonzentration erforderlich als bei kleiner Komplexität (beispielsweise bei aus einem oder wenigen genomischen Klonen oder cDNA-Klonen stammender DNA). Da sich bei besagter Hybridisierung jedoch auch Homohybride aus jeweils zwei Strängen gleicher Herkunft bilden, kann für eine Abtrennung der Homohybride von den gewünschten Heterohybriden gesorgt werden (Schritt 4a-f). Dies kann geschehen, indem die mit den Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft und die mit den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft verbundenen Linkermoleküle jeweils eine bestimmte Eigenschaft aufweisen, welche eine Unterscheidung nach Herkunft erlaubt, gefolgt von einem Schritt, in dem diejenigen Moleküle selektiert werden, welche an ihrem einen Strang die die erste Herkunft kennzeichnende Eigenschaft und an ihrem zweiten Strang die die zweite Herkunft kennzeichnende Eigenschaft tragen. Ein Beispiel für geeignete Eigenschaften wäre die Markierung eines der Linker mit einer Biotingruppe und des anderen Linkers mit einer Digoxygeningruppe, gefolgt von einer Selektion derjenigen Hybride, welche beide Markierungen tragen. Einfacher durchzuführen und daher bevorzugt wäre aber, sowohl die an den Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft als auch die an den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft befestigen Linker mit "maskierten" Erkennungsstellen für eine Restriktionsendonuklease zu versehen. Derartige maskierte Erkennungsstellen enthielten auf mindestens einem der beiden Stränge mindestens eine Abweichung von der Erkennungssequenz, so daß besagte Restriktionsendonuklease nicht schneiden kann. Eine solche Maskierung kann derart ausgeführt werden, daß die durch Hybridisierung eines Strangs erster Herkunft mit einem Strang zweiter Herkunft entstandenen Heterohybride unmaskierte Erkennungsstellen für das jeweilige Enzym erhalten. Tragen die Linker nun zusätzlich noch distal zur Erkennungsstelle eine immobilisierbare Gruppe, so ist eine Trennung von Homo- und Heterohybriden möglich, indem nach erfolgter Hybridisierung mit besagter Restriktionsendonuklease geschnitten wird. Die Homohybride wären danach unverändert über besagte Gruppe immobilisierbar, während die immobilisierbaren Gruppen von den Heterohybride abgetrennt wären. Ist weiterhin der Strang zweiter Herkunft gegen exonukleolytischen Abbau geschützt, beispielsweise durch ein in den jeweiligen Linker inkorporiertes Thionukleotid, so kann sich eine strangspezifische Verkürzung des Strangs erster Herkunft unmittelbar anschließen (vgl. Fig. 13). Ebenfalls bevorzugt ist eine alternative Vorgehensweise, welche auf dem Verschwinden einer Eigenschaft basiert, welche die an den Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft angefügten Linker ebenso wie die an den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft angefügten Linker besitzen, die jedoch in einem aus einem Strang ersterer Linker und einem Strang letzterer Linker bestehenden "heterohybriden" Linkern nicht mehr existiert. Geeignet ist hier insbesondere die Inkorporation einer oder mehrerer Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen, welche den Schnitt "homohybrider" Linker (und damit ihre teilweise oder vollständige Abtrennung vom flankierten Nukleinsäurefragment), nicht jedoch den Schnitt "heterohybrider" Linker zulassen. Beispielsweise kann der an die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft angefügte Linker die Sequenz AGCGCT, also eine Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease HaeII, enthalten, während der an die Nukleinsäuremoleküle zweiter Herkunft angefügte Linker die Sequenz GGCGCC, also eine alternative Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease HaeII, trägt. Die Linker der durch die Hybridisierung in Schritt (3a-f) entstandenen Homohybride lassen sich nun durch HaeII schneiden und somit abtrennen, während die Linker der gewünschten Heterohybride durch das Auftreten von zwei Fehlpaarungen am Ort der Erkennungsstelle vom Enzym nicht geschnitten werden können und somit an den Nukleinsäurefragmenten befestigt bleiben. Wurde weiterhin zur Erzeugung der Nukleinsäurefragmente eine Restriktionsendonuklease eingesetzt, welche die Erkennungssequenz GCGC besitzt (also beispielsweise das Enzym HinP1I), so ist außerdem sichergestellt, daß obiger Restriktionsverdau keines der Fragmente intern, also zwischen den angefügten Linkern, schneidet. Falls gewünscht, könnte nun über eine an den Linkern durch obigen Restriktionsverdau abtrennbare immobilisierbare Gruppe eine Trennung geschnittener Homohybride von ungeschnittenen Heterohybriden vorgenommen werden. Eine weitere Möglichkeit zur Abtrennung von Homohybriden besteht im übrigen nach der Verkürzung der Nukleinsäurestränge erster Herkunft, indem die Heterohybride mit einem immobilisierten oder immobilisierbaren Oligonukleotid hybridisiert werden, welches mindestens teilweise komplementär ist zu demjenigen an den Nukleinsäuren zweiter Herkunft befestigten Linkerstrang, welcher mit seinem 5'-Ende vom Nukleinsäuremolekül fortweist (vgl. Fig. 11). Nach Bindung des Hybridisierungsprodukts an die jeweilige zur Immobilisierung geeignete Oberfläche, beispielsweise Streptavidin-beschichtete magnetische Partikel, sofern besagtes zur Hybridisierung eingesetztes Oligonukleotid eine Biotin-Gruppe trägt, werden die ungebunden gebliebenen Homohybride fortgewaschen. Anschließend werden die immobilisierten Heterohybride wieder freigesetzt, bevorzugt unter milden denaturierenden Bedingungen, welche eine Trennung des Heterohybrids von besagtem Oligonukleotid zulassen, ohne daß die Stränge erster und zweiter Herkunft voneinander getrennt werden.

Die in Schritt (5a) beschriebene Unterscheidung derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch eine ein- oder mehrbasige Fehlpaarung auszeichnet, von denjenigen Heterohybriden, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte Basenpaarung auszeichnet, nutzt die bekannte Fähigkeit von Polymerasen aus, bevorzugt perfekt gepaarte 3'-Enden eines partiellen Doppelstrangs zu verlängern, 3'-Enden hingegen, welche sich durch eine terminale Fehlpaarung auszeichnen, nur mit sehr geringer Effizienz als Substrat zur Verlängerung zu akzeptieren. Unter einem partiellen Doppelstrang ist hier ein Hybrid zweier mindestens teilweise zueinander komplementärer Nukleinsäuren zu verstehen, welches sich durch einen einzelsträngigen 5'-Überhang auszeichnet. Perfekte Basenpaarung des zurückversetzten 3'-Endes vorausgesetzt, kann eine Polymerase einen solchen partiellen Doppelstrang zu einem vollständigen Doppelstrang ergänzen, indem von besagtem zurückversetztem 3'-Ende ausgehend und unter Nutzung des einzelsträngigen 5'-Überhangs als Matrize eine Polymerisation von in der Lösung befindlichen Nukleotidbausteinen katalysiert wird. Als Polymerase kann hier jede DNA- oder RNA-Polymerase zum Einsatz kommen, die zu einer Verlängerung von zurückversetzten 3'-Enden in der Lage ist und gegen die Verlängerung fehlgepaarter Termini diskriminiert, nicht jedoch Polymerasen, welche mittels einer Exonuklease-Aktivität terminale Fehlpaarungen abbauen können ("proofreading- Polymerasen"). Beispiele für geeignete Polymerasen sind etwa genetisch modifizierte T7 DNA Polymerase ("Δ28 T7 DNA Polymerase"), Taq Polymerase oder auch Reverse Transkriptase. Nicht geeignet hingegen sind native T7 DNA Polymerase oder Pfu Polymerase.

Das in Schritt (6b), (6c) sowie (6d) stattfindende Auffüllen derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte terminale Basenpaarung auszeichnet, erfolgt unter Bedingungen, welche eine möglichst gute enzymatische Unterscheidung zwischen perfekt gepaarten 3'-Enden und Fehlpaarungen ermöglicht, so daß ausschließlich oder zumindest weitgehend ausschließlich terminal perfekt gepaarte Heterohybride zum vollständigen Doppelstrang ergänzt werden. Hierbei ist es möglich, Nukleotidbausteine zur Verfügung zu stellen, welche mit Markierungsgruppen versehen sind. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens nutzt die Fähigkeit vieler Polymerasen, Biotin-modifizierte Nukleotide in einen Strang zu inkorporieren, was eine leichte Trennung aufgefüllter Heterohybride von unaufgefüllt gebliebenen Heterohybriden durch Bindung an immobilisiertes Streptavidin erlaubt. Auch Paare aus Hapten und Antikörper, beispielsweise Digoxygenin-modifizierte Nukleotide und immobilisierte Digoxygenin-Antikörper, können zum Einsatz kommen.

Die Extension derjenigen Heterohybride, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte terminale Basenpaarung auszeichnet, um ein zum Kettenabbruch führendes Nukleotid in Schritt (6e-f) findet gemäß dem zu Schritt (6b-d) gesagten statt, allerdings wird hier mindestens ein nicht weiter verlängerbares Nukleotid zur Inkorporation eingesetzt. Bevorzugt wäre hier der Einsatz einer Mischung aller vier auch zu Sequenzierungszwecken verwendeten Nukleotid-Didesoxyanaloga ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP, denkbar wäre aber natürlich auch die Kombination etwa nur eines dieser Didesoxyanaloga gemeinsam mit den übrigen drei nativen Nukleotiden. Falls gewünscht, könnte das zu inkorporierende Abbruchnukleotid wie unter Schritt (6b-d) beschrieben eine immobilisierbare Atomgruppe wie etwa Biotin tragen.

Die Trennung der aufgefüllten Heterohybride von nicht aufgefüllten Heterohybriden in Schritt (7b), der separat aufgefüllten Heterohybride in Schritt (9c), der mit einem Abbruchnukleotid verlängerten Heterohybride von aufgefüllten Heterohybriden in Schritt (8e) oder der mit einem Abbruchnukleotid verlängerten Heterohybride von unverlängert gebliebenen Heterohybriden in Schritt ( 7f) kann erfolgen, indem wie beschrieben zur Auffüllung bzw. Extension Biotin-modifizierte Nukleotide bzw. Abbruchnukleotide eingesetzt werden und die Auffüllungs- bzw. Extensions-Produkte anschließend an eine Streptavidin-beschichteten Festphase gebunden werden. Eine Alternative hierzu besteht beispielsweise in der Hybridisierung der nicht aufgefüllten Heterohybride in Schritt (7d), deren einzelsträngiger Bereich auf die Sequenz eines der in Schritt (2a-f) eingesetzten Linker-Stränge endet, mit einem hierzu komplementären immobilisierten oder immobilisierbaren Oligonukleotid. Ebenfalls möglich wäre die Behandlung der in Schritt (6e) mit einem Abbruchnukleotid verlängerten Heterohybride nach erfolgter Auffüllung im Schritt (8e) mit einer selektiv Einzelstränge abbauenden Exonuklease, beispielsweise Mung-Bean-Nuklease, gefolgt von einer Amplifikation unter Einsatz von gegen die in (2e) eingesetzten Linkersequenzen gerichteten PCR-Primern. In diesem Fall wären lediglich die in Schritt (8 e) aufgefüllten Heterohybride amplifizierbar, während die in (6e) verlängerten Heterohybride nur noch jeweils eine Primerbindungsstelle aufwiesen und somit nicht mehr amplifizierbar wären.

In den Schritten (8b), (10c), (8d), (10e) und (8f) werden diejenigen Heterohybride identifiziert, welche jeweils einen Sequenzunterschied zwischen den in Schritt (1a-f) und den in Schritt (2a-f) bereitgestellten Nukleinsäuremolekülen erster und zweiter Herkunft repräsentieren. Die Identifikation kann durch dem Fachmann geläufige Weise über Sequenzierung, gelelektrophoretische Untersuchung etc. erfolgen, welchen gegebenenfalls noch Schritte der Amplifikation und/oder Markierung vorangehen können. Besonders bevorzugt ist jedoch eine Identifikation über Hybridisierung eines oder beider Stränge besagter Heterohybride, welche zu diesem Zweck zunächst markiert und ggf. zuvor amplifiziert werden, mit einer Anordnung zur Hybridisierung befähigter Nukleinsäuren. Bei dieser Anordnung kann es sich beispielsweise um eine genomische oder cDNA-Bank oder eine andere Kollektion von Nukleinsäuremolekülen handeln, welche in sortierter Form vorliegt, d. h. bei welcher unterschiedliche Sorten von Nukleinsäuremolekülen voneinander getrennt vorliegen und separat adressiert werden können. Bevorzugterweise handelt es sich um einen Array von auf einem festen oder halbfesten Träger befestigten Nukleinsäuren, beispielsweise einen Microarray oder eine auf eine Membran aufgetragene Sammlung von Klonen. Hierbei kann für jede einzelne Position der Anordnung die Identität der sich dort befindlichen Nukleinsäuremoleküle bekannt sein. Alternativ ist es aber auch möglich, eine Anordnung unbekannter Nukleinsäuremoleküle zur Hybridisierung einzusetzen, sofern nach erfolgter Hybridisierung Zugriff auf die Identität der hybridisierten, auf dem Träger befindlichen Nukleinsäuremoleküle besteht. Beispielsweise kann eine in Form transformierter Bakterien vorliegende Plasmid-Genbank auf einem Nährboden ausgestrichen werden, die Bakterien können wachsen gelassen werden, bis eine geeignete Koloniegröße erreicht ist, und über einen Kolonieabklatsch kann Zellmaterial auf Membranfilter übertragen werden. Nach entsprechender Vorbereitung der so erhaltenen Koloniefilter (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987) kann hybridisiert werden. Nach Identifikation derjenigen Klone, welche mit den aus obigen Heterohybriden hergestellten Sonden hybridisiert haben, können die zugehörigen Bakterienkolonien auf dem Nährboden identifiziert und die in ihnen enthaltenen Plasmide gewonnen und sequenziert werden. Ein anderer Typ von Nukleinsäure­ array kann durch Festphasen-Amplifikation einzelner Moleküle mittels PCR und immobilisierte Primer erzeugt werden, wodurch regelrechte "klonale Inseln" jeweils identischer, von einem Ausgangsmolekül durch Amplifikation abgeleiteter Nukleinsäuremoleküle entstehen (vgl. WO 98/44151). Kann selektiv einer der beiden Molekültermini von der Oberfläche gelöst werden, beispielsweise über eine in einen der Amplifikationsprimer eingefügte Erkennungsstelle einer Restriktionsendonuklease, so wird eine Zufallsanordnung einzelsträngiger und somit hybridisierungsfähiger DNA-"Klone" erzeugt. Ist weiterhin der andere Molekülterminus regioselektiv von der Oberfläche ablösbar, beispielsweise durch regioselektive Photolyse eines Spacers zwischen Oberfläche und Nukleinsäuremolekül mittels eines Lasers, so können gezielt diejenigen Moleküle isoliert und nachfolgend durch Sequenzierung identifiziert werden, welche mit den aus besagten Heterohybriden gewonnenen Sonden hybridisiert haben. Noch eine andere Möglichkeit zur Identifikation folgt der von Brenner et al. (US-A 5,846,719) vorgestellten Strategie, in-vitro- Klone in Form mit jeweils einer Spezies von Nukleinsäuremolekül beschichteter Mikropartikel (sog. beads) zu erzeugen. Derartige in-vitro-Klone sind in einzelsträngiger Form selbstverständlich auch zur Hybridisierung geeignet, wobei die Hybridisierung vor oder nach der sequenzspezifischen Beladung der Mikropartikel erfolgen kann. Wurde für die Sondenmarkierung eine Fluoreszenzmarkierung gewählt, so können diejenigen Mikropartikel, die ein gewünschtes Hybridisierungssignal zeigen, mittels einer Zell-Sortierapparatur (cell sorter) mit hohem Durchsatz von denjenigen Partikeln getrennt werden, welche unbeladen geblieben sind oder zumindest nicht das gewünschte Hybridisierungssignal zeigen. Anschließend kann eine Rückgewinnung und Analyse der an die Partikel gebundenen Nukleinsäuremoleküle, beispielsweise mittels PCR, erfolgen.

In einer Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation von Sequenzunterschieden, die in zwei verschiedenen Individuengruppe unterschiedlich häufig vertreten sind, wird folgendermaßen vorgegangen (vgl. Fig. 12): Die aus den jeweiligen Individuen einer Gruppe isolierten Nukleinsäuremoleküle werden zu Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft aus der einen Gruppe bzw. zu Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft aus der anderen Gruppe vereinigt. Weiterhin werden als "Referenz" Nukleinsäuremoleküle einer zweiten Herkunft bereitgestellt, die beispielsweise aus einem keiner der beiden obigen Gruppen angehörigen Individuum oder auch einer Zellkultur gewonnen wird. Gemäß einer der oben näher erläuterten Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Verfahren dann in parallelen Ansätzen durchgeführt, wobei in einem der Ansätze die aus der einen Gruppe gewonnenen Nukleinsäuren und im anderen Ansatz die aus der anderen Gruppe gewonnenen Nukleinsäuren jeweils als Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft eingesetzt werden. Als Nukleinsäuren zweiter Herkunft dienen in beiden Ansätzen die Referenz- Nukleinsäuremoleküle. Es werden dann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens Nukleinsäuremoleküle isoliert, welche im jeweiligen Ansatz Sequenzunterschiede zu den bereitgestellten Referenz-Nukleinsäuremolekülen aufweisen. Dabei wird bevorzugterweise derart vorgegangen, daß besagte isolierte Nukleinsäuremoleküle in beiden Ansätzen voneinander unterscheidbare Markierungen erhalten. So könnten beispielsweise bei Durchführung des Verfahrens gemäß der oben beschriebenen zweiten Ausführungsform die in Schritt ( 6b) erhaltenen nicht aufgefüllten Heterohybride, welche einen Sequenzunterschied zwischen dem jeweiligen Nukleinsäuremolekül erster Herkunft und dem Referenz- Nukleinsäuremolekül zweiter Herkunft repräsentieren, im Fall der ersten Individuengruppe mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 und im Fall der zweiten Individuengruppe mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert werden. Es würde dann eine Anordnung von Referenz- Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt, etwa in Form eines Arrays auf einer festen Oberfläche, welcher auf konventionelle Weise durch Ablage von Nukleinsäure-Klonen in einer regelmäßigen Anordnung oder durch einer Zufallsanordnung folgende Oberflächen- Amplifikation stattfinden kann, oder in Form von mit jeweils identischen Nukleinsäuremolekülen beladenen Partikeln. Jedenfalls soll die Anordnung die bereits oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen, daß jeweils identische und zur Hybridisierung befähigte Nukleinsäuremoleküle an einem Ort lokalisiert sind. Dabei kann Ort sowohl einen Bereich auf einer meist planaren Oberfläche als auch die Oberfläche eines Partikels bedeuten. Jedenfalls würden die wie oben beschriebenen, voneinander unterscheidbar markierten Nukleinsäuremoleküle, welche jeweils Sequenzunterschieden zwischen erster Herkunft und Referenz bzw. zweiter Herkunft und Referenz repräsentieren, mit besagter Anordnung hybridisiert. Nach erfolgter Auswertung sind vier verschiedene Situationen unterscheidbar: (1) ein Fragment aus der ersten Gruppe ist sequenzidentisch sowohl mit dem entsprechenden Fragment aus der zweiten Gruppe als auch mit dem jeweiligen Referenz-Fragment. Es werden keine Heterohybride entstehen, deren doppelsträngiger Bereich in einer Fehlpaarung endet, daher werden keine dieses Fragment repräsentierenden Sondenmoleküle erhalten. Nach Hybridisierung wird von den zu diesem Fragment gehörigen Orten der Anordnung kein Hybridisierungssignal erhalten. (2) ein Fragment aus der ersten Gruppe weist einen Sequenzunterschied gegenüber dem jeweiligen Referenz-Fragment auf, während das entsprechende Fragment aus der zweiten Gruppe mit dem jeweiligen Referenz-Fragment sequenzidentisch ist. Es werden daher lediglich Sondenmoleküle erhalten, die eine einen Sequenzunterschied zwischen Referenz und erster Gruppe kennzeichnende Markierung tragen, im obigen Beispiel also eine Cy3-Markierung. Nach Hybridisierung wird von den zu diesem Fragment gehörigen Orten der Anordung ausschließlich ein von dieser (Cy3-)- Markierung stammendes Signal erhalten. ( 3) ein Fragment aus der zweiten Gruppe weist einen Sequenzunterschied gegenüber dem jeweiligen Referenz-Fragment auf, während das entsprechende Fragment aus der ersten Gruppe mit dem jeweiligen Referenz-Fragment sequenzidentisch ist. Es werden daher lediglich Sondenmoleküle erhalten, die eine einen Sequenzunterschied zwischen Referenz und zweiter Gruppe kennzeichnende Markierung tragen, im obigen Beispiel also eine Cy5-Markierung. Nach Hybridisierung wird von den zu diesem Fragment gehörigen Orten der Anordung ausschließlich ein von dieser (Cy5-)- Markierung stammendes Signal erhalten. ( 4) Die Fragmente aus der ersten und der zweiten Gruppe weisen einen Sequenzunterschied gegenüber dem jeweiligen Referenz-Fragment auf. Es werden daher sowohl Sondenmoleküle erhalten, welche einen Sequenzunterschied zwischen Referenz und erster Gruppe kennzeichnende Markierung tragen, als auch Sondenmoleküle, die einen Sequenzunterschied zwischen Referenz und zweiter Gruppe kennzeichnende Markierung tragen. Nach Hybridisierung wird von den zu diesem Fragment gehörigen Orten der Anordung daher ein von beiden Markierungen stammendes Signal erhalten. Zur Identifikation derjenigen Fragmente, welche sich durch einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Gruppe auszeichnen, werden daher an denjenigen Orten befindliche Nukleinsäuremoleküle identifiziert, welche sich durch ein nur oder überwiegend von einer der beiden Sondenpräparationen erhaltenes Hybridisierungssignal auszeichnen. Diese Isolation kann wie oben beschrieben erfolgen, indem im Fall eines geordneten Arrays auf die jeweiligen Klone zurückgegriffen wird, im Fall einer durch Oberflächen-Amplifikation erzeugten Zufallsanordnung interessierende Nukleinsäuremoleküle photolytisch von der Oberfläche freigesetzt werden, oder im Fall von mit Nukleinsäuren beladenen Partikeln mittels einer Sortierapparatur die relevanten Partikel aussortiert werden. Während die oben beschriebene Klassifizierung lediglich Fälle unterscheidet, in denen die Nukleinsäuremoleküle aus der ersten und aus der zweiten Gruppe unter sich jeweils identisch sind, ist natürlich ebenso denkbar, daß Sequenzunterschiede innerhalb einer Gruppe existieren. Dies wird beispielsweise meist dann der Fall sein, wenn aus verschiedenen, nicht-klonalen Individuen Nukleinsäuremoleküle gewonnen und miteinander vereinigt werden. So kann ein bestimmtes Allel eines gegebenen Gens innerhalb einer Gruppe beispielsweise alle relativen Häufigkeiten zwischen 0% und 100% einnehmen. Unterscheidet sich die relative Häufigkeit dieses Allels zwischen den beiden Individuengruppen, so werden vom entsprechenden Fragment abgeleitete, die erste bzw. die zweite Gruppe repräsentierenden Sondenmoleküle in unterschiedlicher Menge erhalten, die Hybridisierung führt also an den entsprechenden Orten der Anordnung zu Mischsignalen. Daher erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur die Identifikation von Sequenzunterschieden, die in einer ersten Individuengruppe vorkommen und in einer zweiten Individuengruppe nicht vorkommen, sondern außerdem die Identifikation von Sequenzunterschieden, die in verschiedenen Individuengruppen in unterschiedlicher Häufigkeit vorkommen.

In Schritt (9c-d) werden die aufgefüllten Heterohybride aus Schritt (7c-d) identifiziert; hierfür gilt sinngemäß das über Schritt (7b) bzw. Schritt (7e) gesagte.

Im folgenden wird die Erfindung durch die Abbildungen näher beschrieben. Es zeigt:

Fig. 1 die Herstellung von Heterohybriden, welche eine selektive Verkürzung nur eines Strangs ermöglichen,

Fig. 2 die Herstellung von Heterohybriden mit einem verkürzten Strang,

Fig. 3 die Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist,

Fig. 4 eine alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist,

Fig. 5 eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist,

Fig. 6 eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist,

Fig. 7 eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist,

Fig. 8 eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist,

Fig. 9 eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist,

Fig. 10 die restriktionsendonukleolytische Linkerentfernung von Homohybriden,

Fig. 11 die restriktionsendonukleolytische Linkerentfernung von Homohybriden, gefolgt von der Isolation eines einen Sequenzunterschied repräsentierenden Heterohybrids und der Herstellung einer Hybridisierungssonde,

Fig. 12 die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen aus zwei verschiedenen Proben stammenden Nukleinsäuren unter Verwendung von Referenz-Nukleinsäuren.

Fig. 1 zeigt die Herstellung von Heterohybriden, welche eine selektive Verkürzung nur eines Strangs ermöglichen. Dabei zeigt im einzelnen:
1 Herstellung von Heterohybriden aus Nukleinsäuremolekülen erster (Linker durch offene Rechtecke gekennzeichnet) und zweiter (Linker durch schraffierte Rechtecke gekennzeichnet) Herkunft, welche sich durch unterschiedlich lange flankierende Linker auszeichnen. Eine Sequenzvariation (SNF) der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft gegenüber den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft ist durch einen Punkt gekennzeichnet.
2 Exonukleolytische Verkürzung derjenigen Stränge, welche sich durch ein zurückversetztes 3'-Ende auszeichnen. "Exo" bezeichnet die einwirkende Exonuklease. Es sind hier lediglich Heterohybrid-Doppelstränge (jeweils eine mögliche Verkürzungsvariante aus einer Mischung von Verkürzungsvarianten) dargestellt.

Fig. 2 zeigt die Herstellung einer Mischung von Heterohybriden mit jeweils einem verkürzten Strang, wobei im einzelnen:
1 Herstellung von Heterohybriden aus Nukleinsäuremolekülen erster und zweiter Herkunft, welche sich durch unterschiedlich lange flankierende Linker auszeichnen,
2 selektiv exonukleolytische Verkürzung derjenigen Stränge, welche sich durch ein zurückversetztes 3'-Ende auszeichnen. Aus der erhaltenen Kollektion unterschiedlich stark verkürzter Molekülvarianten sind drei Verkürzungsvarianten dargestellt. Bei der mittleren hiervon fällt die letzte Base des doppelsträngigen Bereichs mit der Position des in Fig. 1 genannten Sequenzunterschieds zusammen, so daß eine terminale Fehlpaarung vorliegt.

Fig. 3 zeigt die Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist. Die Mischung besteht hier exemplarisch aus je zwei Fragmenten, wovon das kürzere zwischen erster und zweiter Herkunft sequenzidentisch ist, während das längere zwischen erster und zweiter Herkunft einen Sequenzunterschied aufweist. Im einzelnen zeigt:
1 die Gewinnung von Heterohybriden aus Strängen der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft und zweiter Herkunft,
2 die selektive exonukleolytische Verkürzung der Stränge erster Herkunft in den Heterohybriden aus 1, ermöglicht durch Schutz des jeweiligen Gegenstrangs zweiter Herkunft gegen exonukleolytischen Abbau. Für jedes der beiden Fragmente ist lediglich eines aus der erhaltenen Mischung von unterschiedlich stark verkürzten Verkürzungsprodukten gezeigt, wobei für das längere der beiden Fragmente dasjenige Verkürzungsprodukt dargestellt ist, dessen letztes Nukleotid des doppelsträngigen Bereichs den Sequenzunterschied zwischen Molekülen erster und zweiter Herkunft repräsentiert (Punkt). Dieses Verkürzungsprodukt zeichnet sich daher durch eine Fehlpaarung am Ende des doppelsträngigen Bereichs aus,
3 Auffüllung derjenigen Heterohybride, welche keine Fehlpaarung am Ende des doppelsträngigen Bereichs aufweisen, unter Zugabe Biotin-modifizierter Nukleotidbausteine. Biotin-Gruppen werden durch "B" dargestellt,
4 Abtrennung biotinhaltiger Heterohybride von unverlängert gebliebenen, nicht biotinhaltigen Heterohybriden, welche Sequenzunterschiede enthaltende Fragmente repräsentieren.

Fig. 4 zeigt eine alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist. Im einzelnen zeigt:
1 die Gewinnung von Heterohybriden aus Strängen der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft und zweiter Herkunft,
2 die selektive exonukleolytische Verkürzung der Stränge erster Herkunft in den Heterohybriden aus 1,
3 Auffüllung derjenigen Heterohybride, welche keine Fehlpaarung am Ende des doppelsträngigen Bereichs aufweisen,
4 Entfernung der fehlgepaarten terminalen Base oder Basen in unaufgefüllt gebliebenen Heterohybriden, gefolgt von einer Auffüllung unter Zugabe biotinmodifizierter Nukleotidbausteine,
5 Isolation biotinhaltiger, in 4 aufgefüllter Heterohybride, welche Sequenzunterschiede enthaltende Fragmente repräsentieren, unter Abtrennung in 3 aufgefüllter, nicht biotinhaltiger Heterohybride.

Fig. 5 zeigt eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist. Im einzelnen zeigt:
1 die Gewinnung von Heterohybriden aus Strängen der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft und zweiter Herkunft;
2 die selektive exonukleolytische Verkürzung der Stränge erster Herkunft in den Heterohybriden aus 1,
3 Auffüllung derjenigen Heterohybride, welche keine Fehlpaarung am Ende des doppelsträngigen Bereichs aufweisen,
4 Isolation unaufgefüllt gebliebener Heterohybride, welche Sequenzunterschiede enthaltende Fragmente repräsentieren, durch Hybridisierung mit einem immobilisierten oder immobilisierbaren Oligonukleotid, welches komplementär zum unaufgefüllt gebliebenen einzelsträngigen Linkerabschnitt des Nukleinsäuremoleküls zweiter Herkunft ist.

Fig. 6 zeigt eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist. Im einzelnen zeigt:
1 die Gewinnung von Heterohybriden aus Strängen der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft und zweiter Herkunft,
2 die selektive exonukleolytische Verkürzung der Stränge erster Herkunft in den Heterohybriden aus 1,
3 Verlängerung derjenigen Heterohybride, welche keine Fehlpaarung am Ende des doppelsträngigen Bereichs aufweisen, um ein zum Kettenabbruch führendes Nukleotid,
4 Entfernung der fehlgepaarten terminalen Base oder Basen in unverlängert gebliebenen Heterohybriden, gefolgt von einer Auffüllung unter Zugabe biotinmodifizierter Nukleotidbausteine,
5 Isolation biotinhaltiger, in 4 aufgefüllter Heterohybride, welche Sequenzunterschiede enthaltende Fragmente repräsentieren, unter Abtrennung der in 3 verlängerten, nicht biotinhaltiger Heterohybride.

Fig. 7 zeigt eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist. Im einzelnen zeigt:
1 die Gewinnung von Heterohybriden aus Strängen der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft und zweiter Herkunft;
2 die selektive exonukleolytische Verkürzung der Stränge erster Herkunft in den Heterohybriden aus 1,
3 Verlängerung derjenigen Heterohybride, welche keine Fehlpaarung am Ende des doppelsträngigen Bereichs aufweisen, um ein zum Kettenabbruch führendes Nukleotid,
4 Entfernung der fehlgepaarten terminalen Base oder Basen in unverlängert gebliebenen Heterohybriden, gefolgt von einer Auffüllung,
5 Abtrennung unaufgefüllt gebliebener Heterohybride, welche keine Sequenzunterschiede enthaltende Fragmente repräsentieren, durch Hybridisierung mit einem immobilisierten oder immobilisierbaren Oligonukleotid, das komplementär zum unaufgefüllt gebliebenen einzelsträngigen Linkerabschnitt des Nukleinsäuremoleküls zweiter Herkunft ist.

Fig. 8 zeigt eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist. Im einzelnen zeigt:
1 die Gewinnung von Heterohybriden aus Strängen der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft und zweiter Herkunft,
2 die selektive exonukleolytische Verkürzung der Stränge erster Herkunft in den Heterohybriden aus 1,
3 Verlängerung derjenigen Heterohybride, welche keine Fehlpaarung am Ende des doppelsträngigen Bereichs aufweisen, um ein mit Biotin gekoppeltes, zum Kettenabbruch führendes Nukleotid,
4 Abtrennung in 3 verlängerter, biotinhaltiger Heterohybride.

Fig. 9 zeigt eine weitere alternative Isolation eines Fragments aus einer Mischung von Nukleinsäuremolekülen, welches einen Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Herkunft aufweist. Im einzelnen zeigt:
1 die Gewinnung von Heterohybriden aus Strängen der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft und zweiter Herkunft,
2 die selektive exonukleolytische Verkürzung der Stränge erster Herkunft in den Heterohybriden aus 1,
3 Verlängerung derjenigen Heterohybride, welche keine Fehlpaarung am Ende des doppelsträngigen Bereichs aufweisen, um ein zum Kettenabbruch führendes Nukleotid,
4 Entfernung der fehlgepaarten terminalen Base oder Basen in unaufgefüllt gebliebenen Heterohybriden, gefolgt von einer Verlängerung mittels biotinmodifizierter, zu einem Kettenabbruch führender Nukleotidbausteine,
5 Isolation biotinhaltiger, in 4 verlängerter Heterohybride, welche Sequenzunterschiede enthaltende Fragmente repräsentieren, unter Abtrennung in 3 verlängerter, nicht biotinhaltiger Heterohybride.

Fig. 10 zeigt die restriktionsendonukleolytische Linkerentfernung von Homohybriden. Linker wurden an mittels der Restriktionsendonuklease HinP1I (Erkennungssequenz GCGC) erzeugte Nukleinsäurefragmente (grau) ligiert. Linker der Fragmente erster Herkunft (offene Rechtecke) enthalten eine erste Erkennungsstelle AGCGCT für die Restriktionsendonuklease HaeII, Linker der Fragmente zweiter Herkunft (schraffiert) eine alternative Erkennungsstelle GGCGCC für die selbe Restriktionsendonuklease. Im einzelnen zeigt:
1 die Vermischung und Denaturierung der von Linkern flankierten Nukleinsäurefragmente erster und zweiter Herkunft, gefolgt von einer Rehybridisierung zueinander mindestens teilweise komplementärer Stränge zu Homo- wie zu Heterohybriden,
2 die Behandlung der erhaltenen Mischung aus Homo- und Heterohybriden mit der Restriktionsendonuklease HaeII, so daß die Linker der in Schritt 1 durch "Reannealing" entstandenen Homohybride abgetrennt werden, die entstandenen Heterohybride hingegen von Linkern flankiert bleiben. Da die Erkennungsstelle der zur ursprünglichen Fragmenterzeugung eingesetzten Restriktionsendonuklease Bestandteil der in Schritt 2 genutzten Erkennungsstellen ist, werden unerwünschte, fragmentinterne Schnitte in Schritt 2 vermieden. Die durch HaeII erzeugten 3'-überhängenden Enden sind kein Substrat für Exonuklease III ("Exo"), während die 3'- zurückversetzten Enden der Heterohybride einer strangspezifischen Verkürzung gemäß Fig. 1 zugänglich sind. Es sind beide Enden eines Heterohybrids gezeigt; lediglich eines davon ist exonukleolytisch verkürzbar.

Fig. 11 zeigt die restriktionsendonukleolytische Linkerentfernung von Homohybriden, gefolgt von der Isolation eines eine Sequenzvariation repräsentierenden Heterohybrids und der Herstellung einer Hybridisierungssonde. Im einzelnen zeigt:
1 die Vermischung und Denaturierung der von Linkern flankierten Nukleinsäurefragmente erster und zweiter Herkunft, gefolgt von einer Rehybridisierung zueinander mindestens teilweise komplementärer Stränge zu Homo- wie zu Heterohybriden,
2 die Behandlung der erhaltenen Mischung aus Homo- und Heterohybriden mit einer Restriktionsendonuklease mit zwei alternativen Erkennungsstellen (als schwarze bzw. punktierte Rechtecke gezeigt), so daß die Linker der in Schritt 1 durch "Reannealing" entstandenen Homohybride abgetrennt werden, die entstandenen Heterohybride hingegen von Linkern flankiert bleiben,
3 exonukleolytische Verkürzung der Heterohybrid-Stränge erster Herkunft. Es ist exemplarisch lediglich ein Verkürzungsprodukt gezeigt, dessen letzte Base des doppelsträngigen Bereichs sich an der Position einer Sequenzvariation befindet,
4 Auffüllung aller Verkürzungsprodukte, deren letzte Base des doppelsträngigen Bereichs keine Fehlpaarung ausbildet, gefolgt von Festphasen-Immobilisierung der unaufgefüllt gebliebenen Verkürzungsprodukte durch Hybridisierung mit einem immobilisierten Oligonukleotid (entsprechend Schritten 3 und 4 aus Fig. 5),
5 Fortwaschen aller nicht immobilisierten Nukleinsäuren,
6 Denaturierende Ablösung der immobilisierten Stränge,
7 lineare Amplifikation der eine Sequenzvariation repräsentierenden Nukleinsäuremoleküle zweiter Herkunft (entsprechend den "langen" Fragmenten aus Fig. 3 bis 9) in Gegenwart von markierten Nukleotidbausteinen, so daß eine Sequenzvariation repräsentierende Hybridisierungssonden entstehen. Markierte Sondenmoleküle sind durch einen Stern gekennzeichnet.

Fig. 12 zeigt eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation von Sequenzunterschieden zwischen aus zwei verschiedenen Proben stammenden Nukleinsäuren unter Verwendung von Referenz-Nukleinsäuren. Es ist ein bestimmtes, von Linker-Molekülen flankiertes Nukleinsäurefragment gezeigt, welches aus der ersten Probe stammend durch kurze schraffierte Linker, aus der zweiten Probe stammend durch kurze punktierte Linker und aus der Referenz-Probe stammend durch als offene Rechtecke dargestellte lange Linker gekennzeichnet wird. Die Position eines Sequenzunterschieds (SNP) zwischen dem aus der ersten Probe stammenden Fragment und den aus der zweiten Probe bzw. der Referenzprobe stammenden Fragmenten ist durch einen Punkt gekennzeichnet. Die zur beschriebenen Umsetzung mit Fragmenten aus der ersten Probe verwendeten, aus der Referenz-Probe stammenden Fragmente sind mit einer Markierungsgruppe versehen, welche durch einen Stern symbolisiert wird. Die zur beschriebenen Umsetzung mit Fragmenten aus der zweiten Probe verwendeten, aus der Referenz-Probe stammenden Fragmente sind mit einer von der ersten Markierungsgruppe unterscheidbaren Markierungsgruppe versehen, welche durch "#" symbolisiert wird. Dabei zeigt im einzelnen:
1 Herstellung von Heterohybriden aus Nukleinsäuremolekülen aus der ersten Probe und aus der Referenz-Probe bzw. aus der zweiten Probe und der Referenz-Probe, welche sich durch unterschiedlich lange flankierende Linker auszeichnen,
2 Exonukleolytische Verkürzung derjenigen Stränge, welche sich durch ein zurückversetztes 3'-Ende auszeichnen, so daß Heterohybride mit einzelsträngigen, in ihrer Länge variierenden 5'-Überhängen entstehen,
3 Auffüllen derjenigen partiell einzelsträngigen Heterohybride, deren Übergang von doppelsträngigem Bereich zu einzelsträngigem Bereich sich durch perfekte Basenpaarung auszeichnet, in Gegenwart Biotin-modifizierter Nukleotidbausteine (durch "B" symbolisiert),
4 Abtrennung der in 3 aufgefüllten biotinylierten Heterohybride durch Immobilisierung an eine Streptavidin-beschichtete Oberfläche,
5 Gewinnung der an in 4 unaufgefüllt gebliebenen Stränge hybridisierten markierten Referenz-Fragmentstränge durch vollständigen exonukleolytischen Abbau des bereits verkürzten Strangs,
6 Vereinigung der in 5 durch Hybridisierung von Strängen aus der ersten Probe mit Strängen der Referenz-Probe sowie von Strängen aus der zweiten Probe mit Strängen der Referenz-Probe erhaltenen markierten Referenz- Fragmentstränge,
7 Hybridisierung der markierten Referenz-Fragmentstränge aus 6 mit einer an Partikel gebundenen Anordnung von Nukleinsäuremolekülen, oder alternativ
8 Hybridisierung der markierten Referenz-Fragmentstränge aus 6 mit einer an eine planare Oberfläche gebundenen Anordnung von Nukleinsäuremolekülen,
9 Schritte 1-7 oder alternativ Schritte 1-6, gefolgt von Schritt 8; anschließend Detektion der erhaltenen Hybridisierungsignale. Dabei bedeutet 10: kein Signal, da kein Sequenzunterschied zwischen erster und zweiter Probe und Referenzprobe; 11: Signal zeigt einen Sequenzunterschied zwischen erster Probe und Referenzprobe an; 12: Signal zeigt einen Sequenzunterschied zwischen zweiter Probe und Referenzprobe an; 13: Signal zeigt Sequenzunterschiede sowohl zwischen erster Probe und Referenzprobe als auch zwischen zweiter Probe und Referenzprobe an.

Fig. 13 zeigt die restriktionsendonukleolytische Linkerentfernung von Heterohybriden. Biotinylierte Linker wurden an mittels der Restriktionsendonuklease DpnI (Erkennungssequenz GATC) erzeugte Nukleinsäurefragmente ligiert. Die Linker enthalten maskierte Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonuklease BamHI (Erkennungssequenz GGATCC). Die an den Nukleinsäurefragmenten zweiter Herkunft befestigten Linker enthalten weiterhin proximal zu besagter Erkennungssequenz ein Thionukleotid (durch "S" gekennzeichnet). Im einzelnen zeigt:
1 die Vermischung und Denaturierung der von Linkern flankierten Nukleinsäuremoleküle erster und zweiter Herkunft, gefolgt von einer Rehybridisierung zueinander mindestens teilweise komplementärer Stränge zu Homo- wie zu Heterohybriden,
2 die Behandlung der erhaltenen Mischung aus Homo- und Heterohybriden mit der Restriktionsendonuklease BamHI, so daß die Linker der in Schritt 1 entstandenen Heterohybride teilweise abgetrennt werden, die entstandenen Homohybride hingegen von Linkern flankiert bleiben,
3 Abtrennung der biotinylierten Homohybride durch Immobilisierung an eine Streptavidin-beschichtete feste Phase. Lediglich der Fragmentstrang erster Herkunft kann exonukleolytisch verkürzt werden, während die Verkürzung des Strangs zweiter Herkunft lediglich bis zum Thionukleotid des Linkers erfolgt. Dargestellt sind hier beide Enden eines Moleküls.

Claims (1)

1. Verfahren zum Nachweis von Sequenzvariationen zwischen zwei Nukleinsäuren unterschiedlicher Herkunft, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

   • - Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer ersten Herkunft,
   • - Bereitstellung mindestens eines von Linkern bekannter Sequenz flankierten Nukleinsäuremoleküls einer zweiten Herkunft, welches mindestens teilweise die gleiche Sequenz aufweist wie das oder die Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft,
   • - Hybridisierung des oder der Nukleinsäuremoleküle erster Herkunft mit dem oder den Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft, so daß Doppelstränge entstehen,
   • - gegebenenfalls Abtrennung der entstandenen Homohybride aus Nukleinsäuremolekülen erster Herkunft untereinander und aus Nukleinsäuremolekülen zweiter Herkunft untereinander von Heterohybriden aus einem Strang erster Herkunft und einem Strang zweiter Herkunft,
   • - selektive Verkürzung des Strangs erster Herkunft in den Heterohybriden, so daß eine Mischung von Heterohybriden mit unterschiedlich langen 5'-Überhängen entsteht,
   • - Unterscheidung derjenigen Heterohybride, deren Überhang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch eine ein- oder mehrbasige Fehlpaarung auszeichnet, von denjenigen Heterohybriden, deren Übergang vom doppelsträngigen Bereich zum einzelsträngigen Bereich sich durch perfekte Basenpaarung auszeichnet.