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Die vorliegende Erfindung ist auf
ein Verfahren zur enzymatischen Razemisierung von 5-tert.-Butylhydantoin
sowie die Herstellung von enantiomerenangereichertem tert.-Leucin gerichtet.
Insbesondere wird dieses enzymatisch über die sogenannte Hydantoinaseroute
unter Verwendung einer enzymatischen in-situ Razemisierung gewonnen.
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Optisch aktives tert.-Leucin ist
eine in der organischen Synthese zur Herstellung von z.B. bioaktiven Wirkstoffen
häufig
eingesetzte Verbindung. Sie kommt auch in chiralen Auxiliaren z.B.
in Form der Aminoalkohole (Evans-Reagenzien)
vor.
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Die enzymatische Hydrolyse von 5-substituierten
Hydantoinen zu N-Carbamoyl-aminosäuren und deren Weiterreaktion
zu den entsprechenden enantiomerenangereicherten Aminosäuren ist
eine Standardmethode in der organischen Chemie ("Enzyme Catalysis
in Organic Synthesis", Eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1
st and
2
nd Ed.). Die Enantiodifferenzierung kann
dabei entweder auf der Stufe der Hydantoinhydrolyse durch Hydantoinasen
erfolgen oder aber wahlweise bei der Spaltung der N-Carbamoyl-aminosäuren mittels
enantioselektiver Carbamoylasen. Da die Enzyme nur jeweils eine
optische Antipode der entsprechenden Verbindung umsetzen, wird versucht,
die andere im Gemisch (in-situ) zu razemisieren, um den vollständigen Umsatz
des razemischen leicht herstellbaren Hydantoins in die korrespondierende
enantiomerenangereicherte Aminosäure
zu gewährleisten.
Die Razemisierung kann dabei entweder auf der Stufe der Hydantoine
mittels chemischer (Base, Säure,
erhöhte
Temp.) oder enzymatischer Verfahren erfolgen oder aber auf der Stufe
der N-Carbamoylaminosäuren
mittels z.B. Acetylaminosäurerazemasen
(
DE10050124 ) vonstatten
gehen. Letztere Variante funktioniert erfolgreich naturgemäß nur bei
Einsatz von enantioselektiven Carbamoylasen. Das nachfolgende Schema
veranschaulicht diesen Sachverhalt. Schema
1:
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Für
aromatische Substrate ist die Geschwindigkeit der chemischen Razemisierung
der Hydantoine, wie in Tabelle 1 gezeigt, ausreichend hoch um hohe
Raum-Zeit-Ausbeuten für
die Herstellung von Aminosäuren
nach dem Hydantoinaseverfahren zu gewährleisten. Für aliphatische Hydantoine
wie Isobutyl-, Methyl- und Isopropylhydantoin stellt die Razemisierung
jedoch einen erheblichen Engpass bei der Synthese aliphatischer
Aminosäuren
dar.
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Tabelle 1: Razemisierungskonstanten
von Hydantoinen bei 40°C,
pH 8.5 bestimmt durch Anfangsraten gem. einer Reaktion erster Ordnung
(–krac= ln([a]/[a0])
aus: Hydrolysis and Formation of Hydantoins (Chpt. B 2.4). Syldatk,
C. and Pietzsch, M. In: Enzyme catalysis in organic synthesis (Eds.:
K. Drauz & H.
Waldmann), VCH, 1st and 2nd Ed.).
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Dieses Problem zeigt sich beispielsweise
bei der in
EP759475 beschriebenen
Herstellung von enantiomerenangereichertem tert-Butylhydantoin mittels
des Hydantoinaseverfahrens. Hier wurden zur vollständigen Umsetzung
von 32mM tert.-Butylhydantoin mit 1,5kU R-Hydantoinase 8 Tage bei pH 8,5 und 4
Tage bei pH 9,5 benötigt.
Tatsächlich
ist die geringe Raum-Zeit-Ausbeute durch die nur langsame chemische
Razemisierung von tert-Butylhydantoin
(k
rac= 0.009h
–1 bei
50°C und
pH 8.5) bedingt.
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Aus dem Stand der Technik sind Hydantoinrazemasen
aus Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, Mikrobacterium, Agrobacterium
und Arthrobacter bekannt (Lit.:
JP04271784 ;
EP1188826 ; Cloning and characterization
of genes from Agrobacterium sp. IP I-671 involved in hydantoin degradation.
Hils, M.; Muench, P.; Altenbuchner, J.; Syldatk, C.; Mattes, R.
Applied Microbiology and Biotechnology (2001), 57(5–6), 680–688; A
new racemase for 5-monosubstituted hydantoins. Pietzsch, Markus;
Syldatk, Christoph; Wagner, Fritz. Ann. N. Y. Acad. Sci. (1992)
, 672 (Enzyme Engineering XI) , 478–83.
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Von den Razemasen aus Arthrobacter
aurescens DSM 3745, Pseudomonas sp. NS671 und Microbacterium liquefaciens
ist bekannt, dass diese Enzyme aliphatische Hydantoine wie beispielsweise
Isopropylhydantoin oder Isobutylhydantoin razemisieren. Die Razemisierung
5-tert.-Butylhydantoin wurde bisher jedoch in keinem Fall gezeigt
(Enantioseparation of 5-monosubstituted hydantoins by capillary
gas chromatography – investigation
of chemical and enzymic racemization. Lickefett, Holger; Krohn,
Karsten; Koenig, Wilfried A.; Gehrcke, Barbel; Syldatk, Christoph.
Tetrahedron: Asymmetry (1993), 4(6), 1129–35; Purification and characterization
of the hydantoin racemase of Pseudomonas sp. strain NS671 expressed
in Escherichia coli. Watabe, Ken; Ishikawa, Takahiro; Mukohara,
Yukuo; Nakamura, Hiroaki. J. Bacteriol. (1992), 174(24), 7989–95;
EP1188826 ). Dies mag daran
liegen, dass der Fachmann nicht damit gerechnet hatte, ein derart
sterisch anspruchsvolles und unnatürliches Substrat mittels Hydantoinrazemasen
umsetzen zu können.
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Darüber hinaus weiß man, dass
die Razemase aus Arthrobacter aurescens DSM 3747 aromatische Hydantoine
wie Indolylmethylhydantoin oder Benzylhydantoin bevorzugt, wohingegen
aliphatische Hydantoine wie Methylthioethylhydantoin vergleichsweise
schwach oder im Fall von Isopropylhydantoin überhaupt nicht umgesetzt werden
(A new racemase for 5-monosubstituted
hydantoins. Pietzsch, Markus; Syldatk, Christoph; Wagner, Fritz.
Ann. N. Y. Acad. Sci. (1992), 672(Enzyme Engineering XI), 478–83.).
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
war zum einen die Angabe eines weiteren Verfahrens zur Razemisierung
von 5-tert.- Butylhydantoin
anzugeben, dass es in technischen Dimensionen gestattet, unter ökonomischen
und ökologischen
Gesichtspunkten vorteilhaft die jeweiligen optischen Antipoden dieses
Hydantoins ineinander umzuwandeln. Zum anderen sollte diese Erfindung
vorteilhaft in einem weiteren enzymatischen Verfahren zur Herstellung
von enantiomerenangereichertem tert.-Leucin einsetzbar sein.
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Diese Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Anspruch
1 schützt
ein erfindungsgemäßes Razemisierungsverfahren.
Ansprüche
2 bis 4 richten sich auf bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ansprüche
5 und 6 umfassen das Verfahren zur Herstellung des enantiomerenangereicherten tert.-Leucins.
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Dadurch, dass in einem Verfahren
zur Razemisierung von 5-tert.-Butylhydantoin,
die Razemisierung in Gegenwart eines Peptids mit Hydantoinrazemaseaktivität erfolgt,
erhält
der Fachmann völlig überraschend, keinesfalls
vorhersehbar und erfindungsgemäß besonders
vorteilhaft eine Möglichkeit
zur Lösung
der gestellten Aufgabe. Mit den Aussagen des Standes der Technik
weist dieser den Fachmann von der Erfindung weg, weshalb die Ausführungsart
der enzymatischen Hydantoinrazemisierung des betrachteten Substrats
mitnichten nahe lag.
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Prinzipiell können alle dem Fachmann zur
Verfügung
stehenden Peptide mit Hydantoinrazemaseaktivität (Razemasen) in dem gegenständlichen
Verfahren eingesetzt werden. Bekannt sind zur Zeit Razemasen aus
den Organismen der Gattung Arthrobacter, Agrobacterium, Microbacterium
oder Pseudomonas (Lit. s. oben), weshalb der Einsatz eines Peptids
mit Hydantoinrazemaseaktivität,
welches durch ein entsprechendes Gen aus diesen Organismen codiert
ist, besonders bevorzugt ist. Gegebenfalls durch dem Fachmann bekannte
Mutageneseverfahren (Eigen, M. und Gardiner, W., Evolutionary molecular
engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 1984, 56,
967–978;
Chen, K. und Arnold, F., Enzyme engineering for nonaqueous solvents:
random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar
organic media. Bio/Technology 1991, 9, 1073–1077; Horwitz, M. und Loeb,
L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci
USA 83, 1986, 7405–7409;
Dube, D. und L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion Of Random
Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry
1989, 28, 5703–5707;
Stemmer, P.C., Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling,
Nature 1994, 370, 389–391
und Stemmer, P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:
In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci
USA 91, 1994, 10747–10751)
verbesserte Razemasen können
ebenfalls im gegenständlichen
Verfahren eingesetzt werden, sofern sie diesen Organismen entstammen.
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Ganz besonders bevorzugt ist die
Ausführungsform,
bei der ein solches Gen aus dem Organismus Arthrobacter aurescens,
insbesondere DSM 3747 stammt.
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Es sei darauf hingewiesen, dass prinzipiell
auch eine enzymatische Razemisierung in Gegenwart von freien Peptiden
der entsprechenden Aktivität
erfolgen kann. Das Peptid kann dabei jedoch auch in ganzen Wildtypzelle
oder in ganzen rekombinanten Zellen, insbesondere ganzen rekombinanten
E. coli-Zellen, vorliegen.
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Zur Erzeugung der rekombinanten Ausführungsarten
sind dem Fachmann die grundlegenden molekularbiologischen Methoden
bekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular
cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York) sowie Gensequenzen unterschiedlicher Hydantoinrazemasen
z.B. aus Pseudomonas, Mikrobacterium, Agrobacterium und Arthrobacter welche
u.a. über
die GenBank Datenbank des National Center for Biotechnology Information
zugänglich
(z.B. PSEHYUEA, SPAC1F7, E03936, AF146701, SPCC576, AF335479, SCBAC17A6,
AP003010, P848R, AI827874).
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Als Mikroorganismen für rekombinante
Ausführungsformen können im
Prinzip alle dem Fachmann für diesen
Zweck in Frage kommende Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula
polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten,
wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen,
Insektenzellen herangezogen werden. Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen
Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue,
NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10– oder
HB101.
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Im Hinblick auf das oben in der Literatur
beschriebene Substratspektrum der Razemase aus Arthrobacter aurescens
DSM 3747 wurde nun überraschenderweise
gefunden, dass rekombinante E.coli Zellen, welche die Razemase aus
Arthrobacter aurescens DSM 3747, im Gegensatz zum isolierten Enzym
nicht nur Isopropylhydantoin sondern auch weitere aliphatische Hydantoine
wie das sterisch sehr anspruchsvolle tert-Butylhydantoin razemisieren,
was in 1 (Konzentrationsverlauf
von D- ([D]) und L-tert-Butylhydantoin
([L]) mit und ohne Razemase gem. Beispiel 2.) gezeigt wird.
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In einer weiteren Ausgestaltung beschäftigt sich
die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zur Herstellung von
enantiomerenangereichertem tert.-Leucin, bei dem man dieses in Gegenwart
von Peptiden mit einer Hydantoinaseaktivität, einer Carbamoylaseaktivität und einer
Hydantoinrazemaseaktivität
herstellt, wobei die Razemisierung von 5-tert.-Butylhydantoin nach
dem eben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erfolgen soll.
Vorteilhaft an dieser Art der Verfahrensvariante ist, dass man als
Edukt (R)-, (S)- oder (R,S)-5-tert-Butylhydantoin oder (R)-, (S)-
oder (R, S)-Carbamoyl-tert.-Leucin einsetzen kann. Man ist daher sehr
unabhängig
in der Wahl des jeweiligen Ausgangsstoffs.
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Ein erfindungsgemäßes bevorzugtes Verfahren zur
Herstellung von enantiomerenangereichertem tert-Leucin z.B. unter
Anwendung rekombinanter E.coli Zellen zur enzymatischen Razemisierung
lässt sich
dabei auf unterschiedliche Weise realisieren. Als Edukt kann sowohl
(S)-tert.-Butylhydantoin,
(R)-tert.-Butylhydantoin oder eine beliebige Mischung beider Enantiomere
verwendet werden, wobei das Hydantoin enantioselektiv oder auch
unselektiv in die entsprechende N-Carbamoylaminosäure umgesetzt
werden kann. Die entstandene N-Carbamoylaminosäure wiederum kann dann entweder
enzymatisch oder im Falle des Einsatzes ausreichend selektiver Hydantoinasen
chemisch nach gängigen
Verfahren (EP759475) in die Aminosäure umgesetzt werden. Ebenso
kann (R,S)-N-Carbamoyl-tert.-Leucin, (S) -N-Carbamoyl-tert.-Leucin oder auch (R)-N-Carbamoyl-tert.-Leucin als Ausgangsstoff
eingesetzt werden. Die Verwendung dieser Verbindungen ist besonders
dann bevorzugt, wenn die Hydantoinasereaktion mit geringer Enantioselektivität in Gegenwart
einer Razemase und einer enantioselektiven Carbamoylase katalysiert
wird.
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Für
die Anwendung kann das betrachtete Polypeptid in freier Form als
homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestelltes
Enzym verwendet werden. Weiterhin kann das Polypeptid auch als Bestandteil
eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung
mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse
des Wirtsorganismus.
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Möglich
ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form
(Sharma B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte
Biomaterialien-Techniken
und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836–852). Vorteilhafterweise erfolgt
die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick,
J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly
Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009–5010; Mori,
T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipicoated glycoside hydrolases
as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic
solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971–1974; Otamiri, M.; Adlercreutz,
P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin
and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active
form in toluene, Biocatalysis 6, 291– 305). Ganz besonders bevorzugt ist
die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie
Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG)
oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki,
S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex
catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11,
375–378).
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Äußerst bevorzugt
ist die Immobilisierung an Eupergit® ,
insbesondere Eupergit C® und Eupergit 250L® (Röhm) (als Übersicht,
siehe: E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym.
2000, 10, 157). Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung an
Ni-NTA in Kombination mit dem durch Anhängen eines His-Tags (Hexa-Histidin)
veränderten
Polypeptid (Petty, K.J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography
In: Ausubel, F.M. et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology,
Vol. 2, New York: John Wiley and Sons).
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Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls
denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound
cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew.
Chem. Int. Ed. 39, 380–383).
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Durch diese Maßnahmen kann es gelingen, aus
Polypeptiden, welche durch organische Solventien instabil werden,
solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln
bzw. ganz in Organik arbeiten können.
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Im Hinblick auf die Möglichkeit
alle bei der Synthese eingesetzten Enzyme, also die Hydantoinase,
ggf. die Carbamoylase und die Hydantoinrazemase nebeneinander verwenden
zu können,
sei neben der getrennten Anwendung auch auf die vorteilhafte Variante
des Einsatzes eines Ganzzellkatalysators, der alle beteiligten Enzyme
produzieren kann, hingewiesen. Derartige Katalysatoren sind bereits
bekannt (
EP1216304 ).
Deren Einsatz im gegenständlichen
Verfahren erfolgt in äquivalenter
Art und Weise.
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Vorzugsweise wird ein Organismus,
wie in der
DE10155928 genannt,
als Wirtsorganismus eingesetzt. Der Vorteil eines derartigen Organismus
ist die gleichzeitige Expression aller beteiligten Enzyme, womit
nur noch ein rec-Organismus für
die Gesamtreaktion angezogen werden muss.
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Um die Expression der Enzyme im Hinblick
auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten abzustimmen, können die
entsprechenden codierenden Nukleinsäuresequenzen in unterschiedliche
Plasmide mit unterschiedlichen Kopienzahlen kloniert und/oder unterschiedlich
starke Promotoren für
eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen
verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise
eine Akkumulation einer ggf. inhibierend wirkenden Zwischenverbindung
nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit
ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (Gellissen,
G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo,
R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996), Recombinant Hansenula
polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate
oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 46, 46–54;
Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.;
Strasser, A. W.;
DE19920712 ). Die
Herstellung eines derartigen Ganzzellkatalysators beispeilsweise
in E.coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Bacillus sp.
oder Hansenula polymorpha ist dem Fachmann hinlänglich bekannt (Sambrook, J.; Fritsch,
E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual,
2
nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York; Balbas, P. und Bolivar, F. (1990), Design and construction
of expression plasmid vectors in E.coli, Methods Enzymol. 185, 14–37; Rodriguez,
R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular
cloning vectors and their uses, 205–225, Butterworth, Stoneham).
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Die beschriebenen erfindungsgemäßen enzymatischen
Verfahren werden vorzugsweise unter dem Fachmann für diese
Reaktionen bekannten Bedingungen durchgeführt. Vorteilhafterweise wird
das Edukt in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie beispielsweise Wasser, welches mit weiteren wasserlöslichen
oder nicht wasserlöslichen
organischen Lösungsmitteln
versetzt sein kann, bei pH-Werten zwischen 6,0 und 11, bevorzugt
zwischen 7 und 10, und einer Temperatur zwischen 10°C und 100°C, bevorzugt
zwischen 30°C
und 70°C, besonders
bevorzugt zwischen 40°C
und 60°C
mit den entsprechenden Polypeptiden umgesetzt.
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Durch die nun mögliche enzymatische Beschleunigung
der Razemisierung von 5-tert.-Butylhydantoin ergeben sich deutliche
Vorteile bei der Herstellung von enantiomerenangereichertem tert-Leucin,
was so aus dem Stand der Technik nicht herleitbar war.
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Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten,
enantiomer angereicherten) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung
das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen
in >50 mol-% verstanden.
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Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen
gelten als von der Offenbarung mitumfaßt.
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Der Organismus DSM3747 wurde durch
die Rütgerswerke
Aktiengesellschaft am 28.05.86 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig hinterlegt.
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Beispiele
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Beispiel 1: Herstellung
von rekombinanten Zellen mit Razemaseaktivität
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Chemisch kompetente E.coli JM109
(z.B. von Promega) wurden mit dem Plasmid pOM21 (siehe 2) transformiert. Die genaue
Konstruktion von pOM21 ist in WO 0058449 beschrieben.
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Rekombinante E.coli JM109 (pOM21)
wurden in mit Rhamnose (2g/l) supplementiertem LB-Medium (5g/l Hefeextrakt,
10g/l Trypton, 10g/l NaCl) für
18 Stunden bei 30°C
inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10min, 100008)
pelletiert und direkt in Biotransformationsversuchen eingesetzt
(siehe Beispiel 2).
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Beispiel 2: Enzymatische
Razemisierung von tert-Butylhydantoin
und Isopropylhydantoin
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Aktives Zellpellet (aus Beispiel
1) wurde mit einer 35mM Lösung
von L-tert-Butylhydantoin bzw. L-Isopropylhydantoin in 100mM Tris,
pH8.5 durch Zugabe eines entsprechenden Volumens so resuspendiert,
dass sich für
die Reaktionslösung
eine optische Dichte von 20 (gemessen bei 600nm) ergibt. Dieser
Reaktionslösung
wurden 1500 Units D-Hydantoinase
2 von Roche zugesetzt und bei 40°C
inkubiert. Nach entsprechenden Zeiten wurde die Lösung mit
0.5% TFA versetzt und sofort zentrifugiert (10 min, 100008). Das
gebildete N-Carbamoyl-D-tert-Leucin bzw. N-Carbamoyl-D-Valin wurde im Überstand
mittels HPLC (210nm) unter Verwendung einer C-18 Säule (XTerra-MS18,
Waters) analysiert. Aufgrund der hohen Enantioselektivität und Aktivität der D-Hydantoinase
entspricht das gebildete N-Carbamoyl-D-tert-Leucin
dem durch die Razemisierung gebildeten L-tert-Butylhydantoin.
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Eine Kontrolle ohne enzymatische
Razemisierung wurde durchgeführt
indem die entsprechende Hydantoinlösung ohne Zellen unter ansonsten
identischen Bedingungen inkubiert und analysiert wurde.
