DE10222714A1

DE10222714A1 - Kofaktoren, die spezifisch mit dem Glukokortikoidrezeptor interagieren sowie Verfahren zu deren Identifizierung

Info

Publication number: DE10222714A1
Application number: DE10222714A
Authority: DE
Inventors: Martin Goettlicher; Christine Heilbock; Peter Herrlich; Margarethe Litfin; Sandra Schneider
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 2001-05-28
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2003-01-02
Anticipated expiration: 2022-05-24
Also published as: DE10222714B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen genetisch veränderten Glukokortikoid-Rezeptor, der es erlaubt, spezifische Kofaktoren, die an der Interaktion des Glukokortikoid-Rezeptors mit anderen Transkriptionsfaktoren im Zuge der sogenannten Transrepression (Cross-Talk) beteiligt sind, zu identifizieren. Gegenstand der Erfindung sind ferner die identifizierten Kofaktoren sowie deren Einsatz zur Identifizierung von Verbindungen, die die zuvor beschriebenen Wechselwirkungen beeinflussen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Kofaktoren, die spezifisch mit dem Glukokoritkoidrezeptor interagieren sowie Verfahren zu deren Identifizierung und deren Verwendung.
Glukokortikoide zählen zu den Steroidhormonen und sind an entzündungshemmenden und immunsuppressiven Wirkungen in Säugern beteiligt. Nach der passiven Diffusion der lipophilen Steroidhormone durch die Membran der Zielzellen binden Steroide an sogenannte Steroidhormon-Rezeptoren, die zur Familie der nukleären Rezeptoren gehören. Zu diesen ligandenbindenden Transkriptionsfaktoren gehört auch der Glukokortikoid-Rezeptor (GR). Er reguliert auf verschiedene Weise die Expression von Steroidhormon-abhängigen Genen.
So kann er als positiver Regulator der Expression von Glukokortikoid-induzierbaren Genen wirken. Hierbei bindet der GR in Form eines Homodimers selbst als Transkriptionsfaktor an regulatorische DNA-Sequenzen, die als GRE (Glukokortikoid- Responsive-Elements) bezeichnet werden. Bei dieser klassischen, positiven Regulation der Genexpression (Transaktivierung) über Protein-DNA-Wechselwirkung erfolgt die Bindung eines Dimers des Rezeptors über die zentral im Rezeptorprotein lokalisierte DNA-Bindungsdomäne an die GREs.
Außerdem kann der GR als Steroidhormon-abhängiger Repressor der Expression anderer Gene wirken. Dabei wird der Glukokortikoid-Rezeptor selbst zunächst durch die Bindung von Glukokortikoiden (Liganden) in eine Form überführt, die es ihm erlaubt, mit anderen Faktoren, wie z. B. den zuvor erwähnten Kofaktoren, zu interagieren. Hierbei moduliert der GR die Aktivität anderer Transkriptionsfaktoren, wie z. B. AP-1 (Aktivatorprotein 1) oder NF-κB, wodurch diese Transkriptionsfaktoren in ihrer Aktivität gehemmt werden und die entsprechend durch sie kontrollierten Gene reprimiert werden. Dieses Phänomen wird auch als "negative Interferenz", "Repression" von AP-1 durch GR, "Transrepression" oder "Cross-Talk" bezeichnet. Die negative Interferenz kann dabei nicht nur von GR auf AP-1, sondern auch in umgekehrter Richtung von AP-1 auf GR erfolgen (Jonat C. et al., 1990, Cell, 62: 1189-2104).
Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, daß die Interaktion von GR und AP-1 vor allem auf einer Protein-Protein-Wechselwirkung beruht (Herrlich P., 2001, Oncogene, 20: 2465-2475). Diese kann entweder direkt zwischen den beiden Partnern erfolgen oder erfordert die Wechselwirkung mit zusätzlichen Kofaktoren. Dies können Koaktivatoren, Korepressoren oder Faktoren mit stabilisierender Funktion sein. Hierbei beeinflussen die insbesondere die Koaktiviatoren die Transaktivierung. Die Korepressoren sind insbesondere an der Transrepression des Glukokortikoid- Rezeptors beteiligt.
Da die AP-1 Repression durch den Glukokortikoid-Rezeptor eine Zellspezifität zeigt (Shemshedini et al., 1991, Embo J., 10: 3839-3849), ist es sehr wahrscheinlich, daß noch weitere Faktoren, wie z. B. Korepressoren, an dem Prozeß der AP-1- Repression auf Ebene einer Protein-Protein-Wechselwirkung beteiligt sind. Allerdings sind solche Kofaktoren im Sinne von Korepressoren, die spezifisch für den "Cross-Talk" zwischen dem Glukokortikoid-Rezeptor und AP-1 oder NF-κB verantwortlich sind, nicht bekannt.
Eine mit Trip 6 bezeichnete Nukleotidsequenz kodiert für ein Protein, welches als Partnerprotein des AP-1 reprimierenden Thyroidhormon- bzw. Retinsäure-Rezeptors beschrieben ist (Lee et al., Mol. Endocrinol., 1995, Vol. 9 (2): 243-254). Die Interaktion von Trip6 mit dem Glukokortikoid-Rezeptor wird hier jedoch explizit ausgeschlossen.
Wang et al. (Gene 234; 1999: 403-409) und Zhao et al. (Gene Expression, 1999, Vol. 8: 207-217) beschreiben das Protein Trip6 als Koaktivator des Transkriptionsfaktors v-Rel, wobei die Untersuchungen in Hefe und embryonalen Fibroblasten von Hühnern vorgenommen wurden. Über eine Transrepression von Trip6, insbesondere die spezifische Bindung an den Glukokortikoid-Rezeptor von Säugern gibt es in diesen Schriften keine Hinweise.
Krankheiten oder unerwünschte Reaktionen mit Beteiligung des Immunsystems, wie z. B. Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen, Rheuma, Asthma oder T- Zell-Leukämien um nur einige zu nennen, werden bislang u. a. durch die Verabreichung von Glukokortikoiden behandelt. Allgemein werden Glukokortikoide zur Behandlung von Entzündungs- und Immunreaktionen, chronisch entzündlichen Prozessen, einer gestörten Immunsuppression oder der Initiierung von Apoptose und/oder Differenzierung in Krebszellen (Leukämiezellen) eingesetzt. Diese Reaktionen sind vielschichtig und an eine Vielzahl von komplex regulierten stoffwechselphysiologischen Vorgängen in Säugerzellen gekoppelt. Folglich ist die externe Zugabe von Hormonen stets kritisch, da die Störung des Hormongleichgewichts sowohl eine Kurzzeitbehandlung als auch eine Langzeitbehandlung ungeahnte Risiken und Nebenwirkungen für den Patienten mit sich bringt.
Eine Möglichkeit zur spezifischen und weniger mit Nebenwirkungen behafteten Modulation Glukokortikoidreptor-abhängiger Prozesse wäre somit sehr wünschenswert. Die Verfügbarkeit der an der Regulierung der Aktivität Steroidhormon-abhängiger Gene beteiligten Komponenten und insbesondere die Verfügbarkeit von Kofaktoren sind daher von hohem medizinischem Interesse.
Ebenso von großer medizinischer Relevanz ist die Verfügbarkeit von Mitteln mit pharmakologischer Wirkung, durch die das Zusammenspiel der Komponenten der Expressionskontrolle AP-1- oder NF-κB-abhängiger Gene ("Cross-Talk") gezielt moduliert werden kann. Bislang konnten solche "Cross-Talk"-induzierenden Substanzen jedoch nur durch sehr zeitaufwendige "Loss-of-Function"- Versuchsanordnungen identifiziert werden, bei denen ein nahezu quantitativer (> 80%) Verlust der AP-1-Aktivität erforderlich ist. Solche Verfahren sind jedoch unspezifisch und stark störanfällig, da z. B. eine generelle Hemmung der Genexpression oder Zytotoxizität Falsch-Positive Reaktionen liefern würde.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Kofaktoren und hierbei insbesondere Korepressoren oder Faktoren mit stabilisierender Funktion, bereitzustellen, die an der Aktivität von Genen beteiligt sind, die durch den Glukokortikoid-Rezeptor reguliert werden, wie beispielsweise AP-1- oder NF-κBabhängige Gene. Ebenso ist die Bereitstellung von Verbindungen und von Mitteln enthaltend solche Verbindungen, die die Wechselwirkung des Glukokortikoid- Rezeptors mit spezifischen Transkriptionsfaktoren und/oder Kofaktoren beeinflussen, von hoher medizinischer Relevanz.
Diese Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise gelöst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein genetisch veränderter Glukokortikoid- Rezeptor, der es erlaubt spezifische Kofaktoren, die an der Interaktion des Glukokortikoid-Rezeptors mit anderen Transkriptionsfaktoren im Zuge der sogenannten Transrepression beteiligt sind, zu identifizieren. D. h. durch die Herstellung und Verwendung eines gezielt genetisch veränderten Glukokortikoid- Rezeptors der erfindungsgemäßen Art ist die Identifizierung von Kofaktoren, insbesondere Korepressoren oder Faktoren mit stabilisierender Funktion des Cross- Talk möglich.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung den Einsatz der erfindungsgemäß identifizierten Kofaktoren zur Identifizierung von Verbindungen, die ihrerseits wieder die zuvor genannten Wechselwirkungen des Glukokortikoid-Rezeptors und weiterer Proteine beeinflussen. Erfindungsgemäß umfaßt sind somit auch Mittel enthaltend Verbindungen, die an der Wechselwirkung des Glukokortikoid-Rezeptors mit Transkriptionsfaktoren beteiligt sind.
Der erfindungsgemäß genetisch veränderte Glukokortikoid-Rezeptor zeichnet sich dadurch aus, daß er Protein-Protein-Wechselwirkungen eingehen kann und gleichzeitig nicht mit an der Transkriptionsaktivierung beteiligten Kofaktoren (Transaktivatoren) interagiert. D. h. der erfindungsgemäße genetisch veränderte Glukokortikoid-Rezeptor geht für die Transrepression Protein-Protein- Wechselwirkungen ein (Cross-Talk-kompetent) und ist gleichzeitig Transaktivierungs- defizient.
Ein erfindungsgemäß vorteilhafter genetisch veränderter Glukokortikoid-Rezeptor zeichnet sich dadurch aus, daß die ligandenunabhängige Transaktivierungs-Domäne AF-1 im Aminoterminus und/oder die ligandenabhängige Transaktivierungs-Domäne AF-2 im Carboxyterminus des Rezeptors verändert ist. Erfindungsgemäß vorteilhaft ist ein genetisch veränderter Glukokortikoid-Rezeptor kodiert durch eine Nukleotidsequenz, deren Domäne AF-1 deletiert und/oder die im Bereich der Domäne AF-2 in der Helix 12 durch Punktmutation verändert ist. Besonders bevorzugt ist ein genetisch veränderter Glukokortikoid-Rezeptor der zuvor genannten Art, bei dem neben der Deletion der AF-1 Domäne zusätzlich in der Helix 12 der AF- 2-Domäne ein Glutaminsäurerest an Position 755 gegen einen Glutaminrest ausgetauscht ist.
Eine schematische Darstellung des Glukokortikoid-Rezeptors (GR) des Wildtyps und der entsprechenden Mutanten ist in Fig. 1 beschrieben. Die transaktivierende Domäne AF-1 des Glukokortikoid-Rezeptors umfaßt den Bereich von Nukleotid 77 bis 272 in der entsprechenden Nukleotidsequenz. Die Deletion der AF-1 Domäne sollte diesen Bereich mehr oder weniger umfassen, wobei insbesondere wichtig ist, daß die Funktion der AF-1 in der entsprechenden Mutante nicht mehr vorliegt. D. h. die Deletion kann etwa den Bereich von Nukleotid 70 bis 300, bevorzugt etwa von Nukleotid 75 bis 270 und besonders bevorzugt etwa von Nukleotid 77 bis 262 umspannen.
Der zuvor beschriebene genetisch veränderte Glukokortikoid-Rezeptor wird dabei erfindungsgemäß durch gängige molekulargenetische Verfahren hergestellt, wobei die aktivierenden Domänen AF-1 bzw. AF-2 des Glukokortikoid-Rezeptors durch Veränderung, wie z. B. Punktmutationen, Deletionen, Insertion o. ä. in der Nukleotidsequenz verändert wird. Bevorzugt wird ein Glukokortikoid-Rezeptor, der in der transaktivierenden Domäne AF-1 im Aminoterminus und/oder der transaktivierenden Domäne AF-2 im Carboxyterminus des Rezeptors inaktiviert ist. Dies schließt Verfahren ein, bei denen die für den Glukokortikoid-Rezeptor kodierende Nukleotidsequenz in den Domänen AF-1 etwa von Nukleotid 70 bis 300, bevorzugt etwa von Nukleotid 75-270 und besonders bevorzugt von Nukleotid 77-262 deletiert und/oder im Bereich der Domäne AF-2 in der Helix 12 durch Punktmutation verändert wird. In einer bevorzugten Variante wird in der Helix 12 der AF-2-Domäne ein Glutaminsäurerest an Position 755 gegen Glutamin ausgetauscht.
Für die Suche nach interagierenden Proteinen des GR mit Hilfe des Zwei-Hybrid- Systems, ist es erforderlich, die Zellen mit den gewünschten Protein-Protein- Komplexen selektionieren zu können. Dazu wird ein Genkonstrukt hergestellt, das zusätzlich für ein Schlüsselenzym der Tryptophansynthese kodiert, dessen Expression als Auxotrophiemarker benutzt werden kann (Fig. 2A). GR_mH12 _Δ _AF-1 kann in Cos7-Zellen nicht mehr transaktivieren, und zeigt auch als Gal_DBD-Fusionsprotein (GAL_DBC-GR_mH12ΔAF-1) im Hefestamm Y190 keine selbständige Aktivierung des Reportergens nach Hormonzugabe, im Gegensatz zu einem vergleichbaren, die Wildtyp-GR Sequenz enthaltenden Gal-Fusionsprotein (GAL_DBD-GR_wt) (Fig. 2B). Die Repressionskapazität der Mutante ist in Säugetierzellen nicht beeinträchtigt. Aus diesem Grund ist die Gal4-Fusion der Mutante ein erfindungsgemäß geeigneter "Köder" in dem Zwei-Hybrid-System.
Gegenstand der Erfindung ist ein Genkonstrukt enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz kodierend für den genetisch veränderten Glukokortikoid-Rezeptor GR_mH12ΔAF-1 sowie damit operativ verknüpft regulatorische Bereiche eines geeigneten Reportergens, bevorzugt eine DNA-Bindedomäne eines geeigneten Reportergens. In einer bevorzugten Variante des Genkonstrukts handelt es sich bei dem Reportergen um das bakterielle β-Galaktosidase-Gen (lacZ) aus E. coli. Erfindungsgemäß vorteilhaft ist ein Genkonstrukt der zuvor genannten Art enthaltend als vorgeschaltete regulatorische Regionen wenigstens die DNA-Bindedomäne des β-Glaktosidase- Gens aus E. coli, bevorzugt den β-Galaktosidase-Promotor.
Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein Genkonstrukt enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz kodierend für den nicht genetisch veränderten Glukokortikoid- Rezeptor (Wildtyp) sowie damit operativ verknüpft regulatorische Bereiche eines geeigneten Reportergens, bevorzugt eine DNA-Bindedomäne eines geeigneten Reportergens, besonders bevorzugt den Promotor des Galaktosidase-Gens aus E. coli.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zwei-Hybrid-Systeme (Two-Hybrid-Systems) sind aus der Literatur hinlänglich bekannt. Hierbei handelt es sich um eine in-vivo Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen bzw. von Genen, deren Produkte miteinander interagieren. Das Zwei-Hybrid-System beruht auf einem Hefe-Transkriptionsaktivator, der aus zwei Proteindomänen besteht: Der DNA-bindenden Domäne (DNA-BD) sowie der Aktvierungsdomäne (AD), die mit dem RNA-II-Polymerasekomplex interagiert. Beide Proteindomänen sind für die Funktion essentiell. Die Transkriptionsaktivierung funktioniert auch, wenn die beiden Domänen auf zwei verschiedenen Proteinen lokalisiert sind, solange sie in Kontakt gebracht werden. So kann das "Köderprotein" ein Fusionsprotein aus DNA-Bindedomäne mit dem Protein X sein und das "Beuteprotein" ein Fusionsprotein aus der Aktivierungs-Domäne und einem Protein Y. Können beide Proteine X und Y spezifisch miteinander interagieren, werden DNA-BD und AD durch die Wechselwirkung in Kontakt gebracht und die Transkriptionsaktivierung eines Reportergens kann erfolgen.
In einer vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung wird der genetisch veränderte Glukokortikoid-Rezeptor, der mit der DNA-Bindedomäne eines Reportergens fusioniert ist, bevorzugt mit der DNA-Bindedomäne des Gal-4 Transkriptionsfaktorsgens (GAL_DBD-GR_mH12 _Δ _AF-1) in den Hefestamm Y190 transformiert und anschließend durch Kultivierung der Zellen zur Expression gebracht. Da in dem Ansatz neue Kofaktoren des hormonbeladenden Glukokortikoid- Rezeptors identifiziert werden sollen, wird das Zwei-Hybrid-System in Anwesenheit eines für Hefezellen geeigneten Liganden des Glukokortikoid-Rezeptors, wie z. B. Triamcinolon-acetonid (TCA), durchgeführt. Fig. 3 zeigt ein Flußschema der einzelnen Schritte des Zwei-Hybrid-Systems.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Genen kodierend für Kofaktoren, die an der Glukokortikoid-Rezeptor vermittelten Modulation der Aktivität wenigstens eines weiteren Transkriptionsfaktors (Cross-Talk) beteiligt sind, wobei

a) ein Genkonstrukt, bevorzugt (GAL_DBD-GR_mH12 _Δ _AF-1) zusammen mit einer Expressionsgenbank aus eukaryontischen Zellen, bevorzugt HeLa-Zellen oder CV-1-Zellen in ein gängiges Zwei-Hybrid-System in Hefe, bevorzugt Y190 übertragen und dort exprimiert wird,
b) diejenigen Zellen, die einen spezifischen Protein-Protein-Komplex des Glukokortikoid-Rezeptors mit wenigstens einem weiteren Kofaktor aufweisen, durch Wachstum auf Selektivmedium und das Vorliegen einer spezifischen Reportergenaktivität, bevorzugt β-Galaktosidase-Aktivität, selektioniert werden und
c) aus diesen Hefezellen die für die Kofaktoren oder Teile davon kodierenden cDNA-Klone der Expressionsgenbank isoliert und charakterisiert werden.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung dient das Verfahren somit zur Identifizierung von Kofaktoren, die am Cross-Talk des Glukokortikoid-Rezeptors beteiligt sind, bevorzugt von Korepressoren oder anderen Faktoren mit stabilisierender Funktion.
Die Reduzierung der Anzahl "Falsch-Positiver Proteine" als potentielle Kofaktoren aus dem 2-Hybrid-System kann dadurch erfolgen, daß ein weiterer genetisch veränderter Glukokortikoid-Rezeptor in einem weiteren Zwei-Hybrid-System eingesetzt wird, der keine Transaktivierung und auch keine Transrepression zeigt. Diejenigen Proteine, die an diesen mutierten Rezeptor binden, sind für den Cross- Talk des Glukokortikoid-Rezeptors (Transrepression) unspezifische Kofaktoren und können bei weiteren Untersuchungen vernachlässigt werden. D. h. diejenigen Proteine, die durch diesen Rezeptor nicht gebunden werden, sind für die weiteren Untersuchungen im Sinne der vorliegenden Erfindung von Interesse.
Die in diesem Zusammenhang verwendete GR-Mutante trägt eine Punktmutation in der DBD, wodurch ein koordinierendes Cystein des zweiten Zinkfingers gegen Tryptophan ausgetauscht wurde. Zusätzlich wurde an der Position 479 Arginin gegen Glutamin ausgetauscht (Fig. 1 D). Diese Mutante zeigt in Säugerzellen keine Transaktivierung und keine Transrepression.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kofaktor, der spezifisch mit dem Glukokortikoid-Rezeptor eine Protein-Protein-Wechselwirkung eingeht, wobei er im Bereich stromabwärts der N-terminalen Transaktivierungsfunktion AF-1 und dem Carboxyende des Rezeptors bindet. In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Kofaktor umfaßt, der im Bereich zwischen der N-terminalen Transaktiverungsfunktion AF-1 und der DNA-Bindedomäne des Rezeptors bindet. Ferner zeichnet sich der erfindungsgemäße Kofaktor dadurch aus, daß er ein für den Cross-Talk des Glukokoritikoid-Rezeptors notwendiger Kofaktor ist. Im weiteren ist der erfindungsgemäße Kofaktor auch mit Klon #198, Genbankplasmid #198 oder humanem #198 bezeichnet.
In einer bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Kofaktor umfaßt, der spezifisch mit dem Glukokortikoid-Rezeptor im Bereich zwischen der Transaktivierungsfunktion AF-1 und der DNA-Bindedomäne des Rezeptors interagiert. Erfindungsgemäß umfaßt ist ferner ein Kofaktor, der mit dem Glukokortikoid-Rezeptor im Bereich von Nukleotid 1 bis 550, bevorzugt 200 bis 500 und besonders bevorzugt 262 bis 481 der GR-kodierenden Nukleotidsequenz interagiert. Diese genaue Sequenz des natürlicherweise vorkommenden, genetisch unveränderten Glukokortikoid-Rezeptors ist unter der Datenbank-Nummer (Accession-No.) M10901 beschrieben.
In einer vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Kofaktor umfaßt, der spezifisch mit dem Glukokoritikoid-Rezeptor interagiert, kodiert durch eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus:

a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder
b) einer Nukleotidsequenz, die mindestens 75%ige Identität mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz aufweist oder
c) einer mit a) und b) hybridisierenden Nukleotidsequenz oder
d) einer zu a), b) oder c) komplementären Nukleotidsequenz.

Unter hybridisierenden Nukleotidsequenzen im Sinne der Erfindung sind Oligo- oder Polynukleotide zu verstehen, die unter Standard-Hybridisierungsbedingungen an die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz des Kofaktors binden. Der Begriff Standard- Hybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente und weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Bedingungen sind unter anderem bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,) beschrieben. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten Standard- Hybridisierungsbedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Protein beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Der Begriff des funktionellen Äquivalents bezieht sich auch auf das durch die entsprechende Nukleotidsequenz kodierte Protein. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktionelles Äquivalent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der des Referenzproteins (hier des Kofaktors #198) bis zu einem bestimmten Prozentsatz homolog ist. Der Prozentsatz liegt bei mindestens 75%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90-95% und insbesondere bei 99,9%.
Der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren der zuvor erläuterten Art im Zwei- Hybrid-System isolierte cDNA-Klon wurde sequenziert und die vollständige DNA- Sequenz von #198 mit Hilfe von zwei genspezifischen Primern aus HeLa-PolyA⁺- RNA mittels reverser Transkription mit anschließender Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden komplett sequenziert um eventuell entstandene Punktmutationen auszuschließen.
Für das den erfindungsgemäßen Kofaktor #198 kodierende Gen konnten verschiedene Splicevarianten identifiziert werden. Das Gen #198 bildet somit eine Proteinfamilie mit mindestens 3 verschiedenen Varianten, die möglicherweise eine Zellspezifität aufweisen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch spezifische Antikörper gegen den erfindungsgemäßen Kofaktor #198 bzw. die durch das Gen #198 kodierten Proteinfamilie. Diese Antikörper können beispielsweise zur Identifizierung der Kofaktoren in anderen Zellsystemen oder Modellorganismen genutzt werden oder der biochemischen Charakterisierung des Kofaktors dienen.
Dabei konnte u. a. gezeigt werden, daß der erfindungsgemäße Kofaktor #198 ein nukleäres Protein ist.
Ferner wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Untersuchungen vorgenommen, die zeigen, daß der erfindungsgemäß identifizierte Kofaktor tatsächlich (in-vitro) mit dem Glukokortikoid-Rezeptor interagiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Wechselwirkung des Glukokortikoid-Rezeptors mit anderen Transkriptionsfaktoren und/oder Kofaktoren (bevorzugt Korepressoren oder Faktoren mit stabilisierender Funktion) spezifisch beeinflussen. Hierbei werden die potentiell beteiligten Proteine in einem Versuchsansatz vorgelegt, anschließend diesem Ansatz potentielle Wirkstoffe zugegeben und abschließend die Interaktion des Rezeptors mit dem erfindungsgemäß identifizierten Kofaktor #198 gemessen.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden wenigstens der Glukokortikoid-Rezeptor und der Kofaktor sowie ein Reportergen mit vorgeschaltetem (natürlichen oder rekombinanten) Promotor mit potentiellen Wirkstoffen zusammengegeben und die Modulation der Interaktion der beiden Proteinpartner durch die eingesetzten Wirkstoffe als Änderung der Expression des Reportergens, an das der Protein-Protein-Komplex bindet, gemessen.
In einer erfindungsgemäß vorteilhaften Variante des beschriebenen Verfahrens können bakteriell exprimierte, in-vitro translatierte und/oder aus Organextrakten (partiell) gereinigte natürliche oder synthetische Glukokortikoid-Rezeptor- und #198- Kofaktor-Proteine in-vitro in Gegenwart potentieller Verbindungen mit modulierender Wirkung der Cross-Talk-Interaktion gemischt werden. In einer weiteren Variante dieses erfindungsgemäßen Verfahrens kann einer der Proteinpartner an eine Matrix immobilisiert und die Immobilisierung des zweiten Partnerproteins nach geeigneten Waschschritten zum Beispiel durch Autoradiographie oder Immunoblotting dargestellt werden.
Die potentiellen Wirkstoffe können aus chemischen Substanzbibliotheken oder Proteinbibliotheken selektiert werden, wobei einzelne Verbindungen, 2-mehrere Verbindungen als Substanzgemisch oder die gesamte Substanzbibliothek in das zuvor genannte Screeningverfahren eingesetzt werden kann.
In einer weiteren erfindungsgemäß vorteilhaften Variante des zuvor benannten Screeningverfahrens kann die Protein-Protein-Interaktion indirekt in zellulären Systemen als eine Steigerung der Expression geeigneter als Transgen eingebrachter Reportergene nachgewiesen werden. Die Herstellung geeigneter Konstrukte erfolgt nach gängiger Laborpraxis und wird daher nicht näher ausgeführt.
Prinzipiell ist es denkbar, daß einer der beiden Proteinpartner, also der Rezeptor oder der Kofaktor, über seine eigene oder über eine heterologe DNA-Bindedomäne an den Promotor des Reportergens bindet. Der jeweils andere Partner würde mit seiner eigenen oder einer durch gentechnische Methoden operativ verknüpften (fusionierten) Transaktivierungsdomäne (z. B. vom dem viralen VP16-Protein) an den DNA-gebundenen Partner binden. Bei der Interaktion des Rezeptors mit dem Kofaktor wird die Transaktivierungsdomäne in die Nähe des Promotors des Reportergens gebracht und dessen Transkription induziert. In einem solchen Versuchsansatz läßt sich dann die Modulation der Interaktion des Glukokortikoid- Rezeptors und des Kofaktors #198 durch die Anwesenheit potentieller Wirkstoffe als Änderung der Expression des Reportergens messen.
Bei den durch das zuvor erläuterte Verfahren identifizierten Verbindungen handelt es sich um potentiell pharmakologisch relevante Verbindungen oder sogenannte Modulatoren des Cross-Talk des Glukokortikoid-Rezeptors. Unter solchen Verbindungen sind erfindungsgemäß z. B. Liganden des Glukokortikoid-Rezeptors zu verstehen, die beispielsweise verglichen mit dem natürlichen Cortison selektiv die Interaktion des Rezeptors mit dem Kofaktor #198 beeinflussen (d. h. begünstigen oder vermindern) im Vergleich zu der Interaktion des Glukokortikoid-Rezeptors mit Koaktivatoren im Verlauf der Transaktivierung. Erfindungsgemäß umfaßt sind auch Verbindungen, die nicht an der Bindestelle des physiologischen Hormons, sondern außerhalb dieser Bindestelle an einer sogenannten allosterischen Bindestelle binden. Ferner sind unter den erfindungsgemäß vorteilhaften Verbindungen, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert werden auch Peptide oder davon abgeleitete Substanzen zu verstehen.
Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäß identifizierten Verbindungen mit Modulatoreigenschaften um niedermolekulare Substanzen, Peptide und peptidomimetische Agenzien. Vorteilhafte Varianten für erfindungsgemäß peptidomimetische Agenzien sind Verbindungen, die die Interaktion des Glukokortikoid-Rezeptors mit Koaktivatoren verhindern, aber gleichzeitig die Interaktion mit dem Kofaktors #198 zulassen und umgekehrt. Dies kann durch die Blockierung der Interaktionsoberflächen der Koaktivatoren durch die erfindungsgemäß peptidomimetischen Agenzien erfolgen.
Durch die erfindungsgemäße Bereitstellung von genau charakterisierten Mutanten des Glukokortikoid-Rezeptors und des erfindungsgemäßen Kofaktors sowie durch die Bereitstellung der Nukleotidsequenzen dieser Proteine, ermöglicht es die vorliegende Erfindung, Bindungsstudien der spezifischen Faktoren untereinander vorzunehmen und die Identifizierung der konkreten Bindestellen in den einzelnen Proteinen zu untersuchen, zu lokalisieren und ggf. zu verändern. Die hierzu erforderlichen Vorgehensweisen sind gängige Laborpraxis und werden daher nicht näher erläutert.
Diese Kenntnisse erlauben die Identifizierung von potentiell therapeutisch nutzbaren Angriffspunkten für Verbindungen (bzw. Mittel oder Pharmaka) an den Glukokortikoid-Rezeptor und seine Cross-Talk-Partner ebenso wie die gezielte Veränderung dieser Angriffspunkte. Die Identifizierung von Verbindungen, die den Cross-Talk beeinflussen und die detaillierten Kenntnisse über die Bindestellen erlauben in einer Weiterbildung der vorliegenden Erfindung die Herstellung von Mitteln mit hohem therapeutischen Potential hinsichtlich Krankheiten, die bisher mit Glukokortikoiden behandelt werden müssen. Diese auf den Erkenntnissen der vorliegenden Erfindung basierenden Mittel weisen erheblich weniger Nebenwirkungen auf als herkömmliche Medikamente, da die erfindungsgemäßen Verbindungen und Mittel wesentlich spezifischer wirken.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Mittel mit entzündungshemmender und/oder immunsuppressiver Wirkung enthaltend wenigstens eine Verbindung, die die Wechselwirkung des Glukokortikoid-Rezeptors mit anderen Transkriptionsfaktoren und/oder Kofaktoren spezifisch beeinflußt sowie ggf. zusätzliche Stoffe, die zur Darreichung für den Patienten erforderlich sind.
Durch die erfindungsgemäße Bereitstellung des mit dem Glukokortikoid-Rezeptor und AP-1 wechselwirkenden Kofaktors #198 ist auch die Herstellung von Modellorganismen möglich, die sich zum weiteren Studium medizinisch relevanter Prozesse, wie die Hemmung von Entzündung- und Immunreaktionen, die Hemmung chronisch entzündlicher Prozesse, Immunsuppression und/oder die Auslösung von Zelltod und/oder Differenzierung von Leukämiezellen eignen. Bei diesen "Krankheitsmodellen" oder in-vitro Modellsystemen kann das Gen des erfindungsgemäßen Kofaktors #198 oder das in der jeweiligen Spezies homologe Gen gezielt mutiert, inaktiviert und/oder überexprimiert werden. Gleiches gilt natürlich auch für gezielt veränderte Mutanten des erfindungsgemäßen Kofaktors oder seiner Homologe.
Als Modellsysteme könne alle in-vitro kultivierbaren Zellen verwendet werden. Erfindungsgemäß vorteilhafte Modellsysteme sind Zellen oder Zellinien von Säugern, insbesondere murine oder humane Zellinien, in denen die zuvor genannten Gene zur transienten Expression oder Integration in das Genom (Knockout) übertragen werden und die den Vorteil aufweisen, daß sie über alle eventuell zusätzlich erforderlichen zellulären Komponenten verfügen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung eines genetisch veränderten Glukokortikoid-Rezeptors der erfindungsgemäßen Art zur Identifizierung von Kofaktoren, die an der Glukokortikoid-Rezeptor vermittelten Modulation der Aktivität wenigstens eines weiteren Transkriptionsfaktors beteiligt sind (Transrepression). Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des Kofaktors gemäß SEQ ID NO. 1 oder dessen Allele zur Herstellung von Mitteln mit entzündungshemmenden und/oder immunsuppressiven Wirkungen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung, wirken sich aber nicht limitierend auf die Erfindung aus.

Allgemeine Methoden

Medien und Kultivierungsbedingungen für Mikroorganismen und Säugetierzellen, DNA- und RNA-Isolierung, DNA-Restriktionsansätze, Klonierung, Mutagenese, PCR, DNA-Sequenzierung, Transformation von Zellen, Proteinbestimmung, Proteinaufreinigung, Immunoblotting (Western-Blot) Präparation von Zellextrakten, Bestimmung von Enzymaktivitäten sind gängige Labormethoden und u. a. in Sambrook et al. (1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Verwendete Bakterien und Hefestämme E. coli BL21 (DE3) pLysS: Bakterienstamm zur Expression von Fusionsproteinen
Genotyp: F^-; ompT; hsdS_B; (r_B ^-; m_B ^-); dcm; gal; (DE3); pLysS (Cm^r)
KC8: Bakterienstamm für die Isolierung von Genbankplasmiden aus Hefe
Genotyp: hsdR; leuB600; trpC9830; pyrF::Tn5; hisB463; lacDX74; strA; galU,K
Y187: Hefestamm für die Retransformation isolierter Genbankplasmide;
Genotyp: MATa; ura3-52; his3-200; ade2-101; trp1-901; leu2-3,112; gal4D; met-; ga180D; URA3::GAL1_UAS-GAL1_TATA-lacZ
Y190: Hefestamm verwendet für den Two-Hybrid Screen
Genotyp: MATa; ura3-52; his3-200; ade2-101; trp1-901; leu2-3, 112; gal4D; ga180D; cyh^r2; LYS2::GAL1_UAS-HIS3_TATA-HIS3; URA3::GAL1_UAS-GAL1_TATA-lacZ

Genkonstrukte und Plasmide

a) Expressionsplasmide

RSV-GR:
Enthält die cDNA des humanen GR (Accession-No. M10901) im Expressionsvektor RSV (Heck, S. et al., 1994, Embo J., 13: 4087-4095).
RSV-GR_mH12:
Enthält die cDNA des humanen GR mit einer Punktmutation in der Helix 12 (E755Q) im Expressionsvektor RSV.
RSV-GRB_mH12 _Δ _AF-1:
Enthält die cDNA des humanen GR mit einer Punktmutation in der Helix12 (E755Q) und einer zusätzlichen kompletten Deletion der AF-1 im Expressionsvektor RSV.
RSV-GR_mDBD:
Enthält die cDNA des humanen GR mit den Punktmutationen C476W/R479Q; der die entsprechende Mutationen tragende Teilbereich wurde als EcoRI/ClaI-Fragment aus phGR-C476W/R479Q (Heck, S. et al., 1994, Embo J., 13: 4087-4095) in RSV-GR kloniert.
pcDNA3.1-#198:
Enthält die cDNA des humanen #198; diese cDNA wurde aus HeLa-cDNA unter Verwendung der #198_forw und #198_rev Primer amplifiziert und als EcoRI/XhoI- Fragment in pcDNA3.1⁺ (Fa. Invitrogene, Germany) kloniert.
pcDNA3.1-HA-#198:
Enthält die cDNA des humanen #198 als EcoRI(blunt)/XhoI Fragment aus pcDNA3.1-#198 in pcDNA3.1-HA (pcDNA3.1 der Firma Invitrogene mit einem Hämagglutinin-Rest, der über PCR amplifiziert wurde), der ebenfalls EcoRI(blunt)/XhoI restringiert ist.
pcDNA3.1-HA-GR:
Enthält die cDNA des humanen GR als BamHI (blunt)/XbaI aus RSV-GR in pcDNA3.1-HA (geschnitten EcoRI (blunt)/XbaI). Zur in vitro-Translation muß die RNA-Polymerase T7 verwendet werden.
Antisense-#198:
Enthält die zu der kodierenden cDNA des Two-Hybrid-Isolats #198 komplementäre Sequenz; die cDNA des Two-Hybrid-Isolats #198 wurde hierzu als EcoRI/XhoI Fragment in pcDNA3.1-kloniert. b) Hefeplasmide Gal_DBD-GR_wt:
Enthält die cDNA des humanen GR ab der Aminosäure 262 fusioniert an die Gal_DBD im Vektor pRS414 (Fa. Clonetec, Germany); das Plasmid wurde in drei Schritten hergestellt:
Eine Gal_DBD-Fusion der Aminosäuren 262 bis 510 des humanen GR wurde über EcoRV/PstI aus pAS1-CYH2-GR_262-270 (Göttlicher, M. et al., 1996, Steroids, 61: 257-62) in pRS414 (Fa. Clonetec; geschnitten mit XhoI (blunt)/PstI) umkloniert;
Der Terminator der Alkoholdehydrogenase wurde aus dem Vektor pAS1-CYH2 als PstI/SphI (blunt) Fragment in die oben beschriebene Vektorvorstufe in die Schnittstellen PstI/SpeI (blunt) eingefügt;
Die Ligandenbindedomäne des humanen GR wurde als ClaI/XbaI (blunt) aus RSV- GR über die Schnittstellen ClaI/PstI (blunt) eingefügt.
pAS1-GR_mH12 _Δ _AF-1:
Als Ausgangsvektor diente die Zwischenstufe des Gal_DBD-GR_wt. Die Punktmutation enthaltende Ligandenbindedomäne wurde als ClaI/XbaI (blunt) Fragment in die Schnittstellen ClaI/PstI (blunt) aus RSV-GRmH12 eingefügt.
pAS1-GR_mDBD:
Als Ausgangsvektor diente die Zwischenstufe des Gal_DBD-GR_wt. Die Punktmutationen in der DNA-Bindedomäne wurde als ClaI/PflMI (blunt) Fragment in die Schnittstellen ClaI/PstI (blunt) aus GR4(15) (Heck, S. et al., 1994, Embo J., 13: 4087-95) eingefügt. c) Plasmide für die Produktion von GST-Fusionsproteinen pGEX-4T-3:
Ausgangsvektor für die Expression von GST-Fusionsproteinen (Promega, Mannheim), in Bakterien exprimiert liefert er die Glutathion-S-Transferase. pGEX-#198:
Enthält die cDNA des Two-Hybrid-Isolats #198 fusioniert an GST; die cDNA wurde als EcoRI/XhoI Fragment in pGEX-4T-3 kloniert. d) Plasmide für die Produktion von HIS-Fusionsproteinen pET28a:
Ausgangsvektor für die Expression von HIS-Fusionsproteinen (Novagen, Schwalbach).
pET28a-#198:
Enthält die cDNA des Two-Hybrid-Isolats #198 als EcoRI(blunt)/XhoI Fragment in pET28a (geschnitten HindIII(blunt)/XhoI). e) Reporter -517/+63 Coll-Luc:
Enthält den Bereich -517 bis +63 des menschlichen Kollagenase I-Promotors kloniert in die Luziferase-Kassette des Plasmids pXP₂ (Schneikert et al., 1996, J. Biol. Chem., 271: 23907-13).
pHCwt Luc:
Enthält den Bereich -237 bis +125 des MMTV-LTR (Mouse Memory Tumor Virus- Long-Terminal-Repeat; Schneikert et al., 1996, J. Biol. Chem., 271: 23907-13) kloniert in die Luziferase-Kassette des Plasmids pXP₂ (Heck et al., 1997, Embo J., 16: 4698-4707).
Ubi-Renilla:
Enthält die cDNA der Renilla-Luziferase kloniert hinter den Ubiquitinc-Promotor. Oligonukleotide zur Verwendung in PCR #198_forw: 5'-AGAATTCCAGGCCATGTCGGGG-3'
#198_rev: 5'-GACTCAGCAGTCAGTGGTGACGGTGGC-3'
P#198_rev: 5'-ACTCGAGAGGCCTGAGAGGCTCC-3'
N-Term_rev: 5'-ACTCGAGACTGGCCAAAGTACTCCCC-3'

Durchführung des Zwei-Hybrid-Systems zur Identifizierung neuer Kofaktoren des Glukokortikoid-Rezeptors, die an der Transrepression beteiligt sind

Das Screening im Zwei-Hybrid-System wird dem Genkonstrukt Gal-GR_mH12 _Δ _AF-1 in dem dualen Reporterstamm der Hefe Y190 durchgeführt. Wird das GR_mH12 _Δ _AF-1 Konstrukt im Stamm Y190 exprimiert, so läßt sich durch Zugabe von 25 mM 3'Aminotriazol (3'AT) die Aktivität des durch die hohe Basalaktivität des Reporters entstandenen HIS3-Genproduktes inhibieren. Der Screen wird in Anwesenheit von 100 µM Triamcinolon-acetonid durchgeführt, so daß der Rezeptor homonbeladen vorliegt. Die Fig. 3 zeigt ein Flußdiagramm der einzelnen Schritte des Zwei-Hybrid- Systems.

Verfahren zur Identifizierung von Kofaktoren des Glukokortikoid-Rezeptors, die an der Transrepression beteiligt sind

Als Genbank wurde die kommerzielle humane HeLa MATCHMAKER™ cDNA- Genbank verwendet mit 6.10⁶ unabhängigen Klonen und einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 1,5 kb (0,4-2,0 kb), die als Selektionsmarker ein Schlüsselenzym zur Leucinbiosynthese kodiert. Die MATCHMAKER-Genbank (in DH10B) wurde expandiert und die daraus gewonnene DNA in den GR_mH12 _Δ _AF-1-Stamm von Y190 transformiert.
Um sicherzustellen, daß die gesamte Genbank im durchgeführten Zwei-Hybrid- System repräsentiert wurde, ist es wichtig eine ausreichend hohe Anzahl primärer Transformanten nach der Genbanktransformation zu erhalten. Hierbei gilt folgende Faustregel: Eine HeLa Zelle enthält ca. 1 pg mRNA (entspricht 10⁶ Moleküle mRNA) die von 15 000 individuellen Genen transkribiert wurde. Um alle Genprodukte nach der Transformation zu repräsentieren, müssen mindestens 45 000 unabhängige Transformanten erhalten werden, die für alle Transkripte der 15 000 Gene in 3 möglichen Leserahmen kodieren. Um auch schwächer exprimierte Gene zu erhalten, wird diese Zahl noch mit dem Faktor 10-100 multipliziert. Die nach der Genbanktransformation erhaltenen 2,5.10⁶ primären Transformanten sind demnach ausreichend, um die Genbank zu repräsentieren.
Die primären Transformanten wurden auf Selektionsplatten ohne Histidin, Leucin (Auxotrophiemarker des Genbankplasmids) und Tryptophan (Auxotrophiemarker des "Köder"-Plasmids) mit 25 mM 3'AT und 100 µM Triamcinolonacetonid ausplattiert. Nach vier bis sieben Tagen wurden die sichtbaren Klone gepickt (400 Klone) und zweimal auf Selektionsplatten durch Ausstreichen auf Einzelkolonien gereinigt. Hierdurch werden Kolonien eliminiert, die sich von den Histidinvorräten der durch die Selektion abgestorbenen Hefen ernähren, aber das HIS3-Reportergen nicht aktivieren konnten. Zusätzlich können bei der Transformation zwei Genbankplasmide aufgenommen werden und durch den anschließenden Verlust eines Plasmides zu inhomogenen Kolonien führen. Dies wird bei der Aufreinigung über Einzelkolonien verhindert.

Test der Aktivität des Reportergens lacZ

Alle Kolonien wurden bereits auf die Aktivität des ersten Reportergens vorselektioniert (Histidinprototrophie), und mußten anschließend auf die Aktivität des zweiten Reporters überprüft werden. Da die beiden Reporter unterschiedliche Promotorkontexte enthalten, lassen sich bei diesem Schritt bereits viele "falsch positive Klone" eliminieren.
Die 400 Klone wurden zur Überprüfung des zweiten Reportergens β-Galaktosidase auf Selektionsplatten ohne Leucin und Tryptophan ausgestrichen und in An- oder Abwesenheit des Hormons TAC auf β-Galaktosidaseaktivität im "Filterlift" getestet. 150 der 400 getesteten Kolonien zeigten eine deutlich sichtbare Blaufärbung.

Analyse von Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe von GST-Fusionsproteinen In-vitro-Transkription/Translation

Um radioaktiv markierte Proteine für GST-Fusionsprotein-Interaktionstests zu erhalten, wurde die entsprechende cDNA in vitro transkribiert und die entstandene mRNA in Anwesenheit von L-[³⁵S]-Methionin in vitro translatiert. Diese Reaktionen wurden in einem Schritt mit Hilfe des TNT™ Coupled Reticulocyte Lysate System (Promega, Madison, WI, USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
Die in vitro translatierten Glukokortikoidrezeptor-Proteine wurde im Anschluß an die TNT-Reaktion durch Inkubation mit Dexamethason (10^-7) für 15 min bei RT und 15 min auf Eis in einen aktiven, mit Hormon beladenen Zustand gebracht.

GST-Fusionsprotein-Interaktionstest

Die Interaktion zweier Proteine wurde mit Hilfe von GST-Fusionsproteinen und in vitro translatierten Proteinen untersucht. Hierbei macht man sich die Affinität von GST-Fusionsproteinen zu immobilisiertem Glutathion zunutze. 10 µg gereinigtes GST-Fusionsprotein wurden an 20 µl Glutathion-Agarose (1 : 1 in PBS ohne Kalzium und Magnesium) in einem Mindestvolumen von 800 µl PBS (mit 1 mM DTT) für 20 min bei RT und 1 h bei 4°C unter Rotieren gebunden. Anschließend wurde die mit Fusionsprotein beladene Glutathion-Agarose mit 5 µl des entprechenden in vitro translatierten, ³⁵S-markierten Proteins in einem Gesamtvolumen von 200 µl PD- Puffer gemischt. Unter Rotieren für 15 min bei RT und 1 h bei 4°C wurde eine potentielle Interaktion der beiden Partnerproteine ermöglicht. Daraufhin wurde die Glutathion-Agarose durch wiederholtes Zentifugieren (1 min. 6000 g) dreimal mit eiskaltem PD-Puffer gewaschen. Alle Proben wurden während dieser Zeit auf Eis gehalten. Die an das Glutathion gebundenen Proteine wurden schließlich durch Zugabe von Elektrophorese-Probenpuffer (nach Lämmli) sowie Mischen und Erhitzen für 5 min bei 95°C von der Glutathion-Agarose eluiert. Die Analyse der Proteine erfolgte durch Auftrennung mittels einer SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) mit anschließender Autoradiographie bei -80°C.
PD-Puffer: 40 mM HEPES-KOH pH7,9; 100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 0,2% Triton X-100; 1 M DTT; 1 mM PMSF

Messung der β-Galaktosidaseaktivität

a) aus Flüssigkulturen (qantitativ)

Einzelkolonien der entsprechenden Hefestämme wurden über Nacht in 3 ml des entsprechenden Selektionsmediums unter Schütteln bei 30°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 1,4 ml in ein Eppendorfgefäß überführt und abzentrifugiert (10 000 g, 10 s). Die Hefen wurden in 750 µl Reaktionspuffer resuspendiert und 25 µl Chloroform zugegeben. Nach starkem Vortexen wurden die Suspensionen bei 30°C bis zu einer deutlichen Gelbfärbung inkubiert. Die Reaktionen wurden dann mit 400 µl einer 1 M Na₂CO₃-Lösung abgestoppt, zentrifugiert und die Gelbfärbung des klaren Überstandes bei 420 nm gemessen. Gleichzeitig wurde die OD₆₀₀ der verwendeten Kulturen bestimmt und die Enzymaktivität nach folgender Formel berechnet:

β-Galaktosidase Units = (1000 × OD₄₂₀)/(t × V × OD₆₀₀)

wobei
t = Zeit nach Start bis zum Abstoppen der Reaktion (min)
V = eingesetztes Kulturvolumen (ml) entspricht.
Reaktionspuffer:
0,1 M NaPO_i, pH 7,5
1 mM MgCl₂
45 mM β-Mercaptoethanol
40 µg/ml SDS
1 mg/ml ONPG
ONPG:
o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid in NaPO_i;
NaPO_i: 0,1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7,5

b) durch "Filterlifts" (qualitativ)

Ein steriler Whatmann-Filter (∅75 mm) wurde direkt auf die Hefeplatte aufgelegt und leicht angedrückt. Nach Markierung der Orientierung wurde der Filter abgezogen und mit der Kolonieseite nach oben für 10 s in flüssigen Stickstoff getaucht. Anschließend wurden die Filter mit der Kolonieseite nach oben auf einen zweiten Filter aufgelegt, der mit 2-3 ml des Reaktionspuffers getränkt, im Deckel einer Petrischale vorbereitet wurde. Die Filterlifts wurden mit Deckel bei 30°C bis zur Entwicklung einer deutlichen Blaufärbung inkubiert und anschließend unter dem Abzug getrocknet.
Reaktionspuffer:
0,1 M NaPO_i, pH 7,5
1 mM MgCl₂
45 mM β-Mercaptoethanol
0,3 mg/ml X-Gal X-Gal:
5-Bromo-4-Chloro-3-Indosyl-β-Galaktopyranosid in N,N- Dimethylformamid (DMF)
NaPO_i: 0,1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7,5

Isolierung der Genbank-cDNA, die für den erfindungsgemäßen Kofaktor kodiert sowie deren Retransformation

Die Genbankplasmide aus 150 Klonen wurden isoliert und zusammen mit GRm_H12ΔAF-1 in Y187 transformiert. Der Stamm Y187 ist kein dualer Reporterstamm, er enthält also nur das β-Galaktosidase-Reportergen. Durch diese Retransformation in einen unabhängigen Hefestamm muß sich die bereits beobachtete Interaktion des Genprodukts mit GRm_H12 _Δ _AF-1 nochmals bestätigen. Somit kann ausgeschlossen werden, das die beobachteten Reporteraktivitäten in Y190 nicht durch eine Mutation des Gal4-DBD Konstruktes oder des Hefestamms erfolgten.
Gleichzeitig wurden die Genbankplasmide der 150 Klone zusammen mit einem Plasmid, kodierend für die Gal4-DNA-Bindedomäne, retransformiert um eine nicht- GR-spezifische Interaktion auszuschließen.
Das Genbankplasmid #198 als potentieller Kandidat eines spezifischen Kofaktors (Korepressors) des Glukokortikoid-Rezeptors wurde sequenziert (siehe SEQ ID No. 1).

Isolieren eines Genbankolasmids

Der betreffende Hefestamm wurde in 5 ml Selektionsmedium oder YPD bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 angezogen und durch Zentrifugation bei 2500 g (4°C, 10 min) geerntet. Für den Aufschluß wurden die Zellen in Plasmid-Rescue-Puffer aufgenommen. Diese Suspension wurde mit vorbehandelten Glasperlen bis ca. 3 mm unter den Flüssigkeitsspiegel aufgefüllt und 200 µl PCI zugesetzt. Die Ansätze wurden 3mal 1 min stark gevortext, und dazwischen 1 min auf Eis inkubiert. Um Zelltrümmer und Glasperlen abzutrennen wurde 10 min bei 500 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und 20 min bei 13000 g und 4°C zentrifugiert. Nach anschließender Chloroformextraktion wurde die in der wässrigen Lösung enthaltene DNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M NaAc pH 4,8 und 2,5 Volumen Ethanol bei -20°C gefällt. Die so erhaltene DNA wurde in KC8 Bakterien elektroporiert, und die einzelnen Plasmide anschließend nach Aminosäureselektion aus den KC8 Bakterien isoliert. Für die Isolierung des Genbankplasmids wurden die KC8 Bakterien auf Agarplatten ohne Leucin, für das Angelprotein auf Platten ohne Tryptophan selektioniert.
Plasmid-Rescue-Puffer:
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
100 mM NaCl
1 mM EDTA, pH 8,0
2% Triton-X100
1% SDS
PCI: Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25 : 24 : 1)

Messung der Firefly- und Renillaluziferaseaktivität

Die Zellen wurden 24-48 h nach der Transfektion zweimal mit PBS (ohne Ca/Mg) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von 200-400 µl Lysispuffer (5 × passive lysis buffer, Promega) für 5-10 min bei 4°C lysiert. 100 µl wurden zur Bestimmung der Fireflyaktivität verwendet. Die Messung der Enzymaktivität erfolgte in einem Luminometer (Berthold, Wildbad) unter Zugabe von autoinjizierter Luziferinreaktionsfösung (100 µl pro Ansatz, Endkonzentration Luziferin 40 µM) und Reaktionspuffer (350 µl pro Ansatz).
Luziferinstocklösung:
1 mM Luziferin (0,28 mg/ml) in GlyGly-Puffer
Luziferinreaktionslösung:
1 : 5 Verdünnung der Stocklösung in GlyGly
GlyGly-Puffer:
25 mM GlyGly; 15 mM MgSO₄; 4 mM EGTA; pH 7, 8
Reaktionspuffer:
1 mM DTT; 2 mM ATP in GlyGly
Zur Bestimmung der Renilla-Luziferaseaktivität wurden 10 µl des Lysats mit 390 µl Coelenterazinpuffer und 100 µl 5 × Substratlösung versetzt (Endkonzentration 25 nM Coelenterazin). Nach Mischen wurde die Lumineszenz in einem Luminometer (Berthold, Wildbad) gemessen (ohne Injektion der Reaktionslösungen).
Coelenterazinpuffer:
0,1 mM KP_i; 0,5 M NaCl; 1 mM EDTA; pH 7,6
5 × Coelenterazinsubstratlösung:
1 µl Stammlösung in 8 ml Coelenterazinpuffer (125 nM)
Coelenterazin-Stammlösung:
1 mM Coelenterazin in 90% Methanol, 10% HCl konz. Antisense-#198-RNA erhöht das Transaktivierungspotential und erniedrigt das Transrepressionspotential des Glukokortikoid-Rezeptors Um die Bedeutung des #198-Proteins für Transaktivierung oder AP-1 Repression durch den GR zu untersuchen, wurde die Proteinmenge von #198 in der Zelle verändert.
Zunächst wurde die #198 Proteinmenge durch Überexpression erhöht und nachfolgend der Einfluß auf Transaktivierung und Transrepression des GR getestet. Die Überexpression des gesamten Proteins könnte zu einer Verbesserung der AP-1 Repression durch den GR führen, falls #198 nur in limitierenden Mengen in der Zelle vorliegt. Desweiteren könnte durch die Überexpression eines Teilbereiches von #198, der mit GR interagiert, die Interaktion des GR mit dem endogenen #198- Protein gestört werden und somit das Proteinfragment eine "dominant negative" Funktion ausüben. Für die Überexpression in HeLa-Zellen wurden das gesamte #198-Protein verwendet. Als Kontrolle wurde der zugehörige Leervektor (pcDNA3.1- HA) ebenfalls in HeLa-Zellen überexprimiert.
Die Überexpression des gesamten #198-Proteins zeigte keinen Effekt auf die beiden GR-Funktionen (Daten nicht gezeigt). #198 liegt somit nicht in limitierender Menge in der Zelle vor.
Ist #198 an der AP-1 Repression beteiligt, so sollte die Erniedrigung der endogenen Proteinmenge von #198 durch Expression einer "antisense" RNA zu einer Verschlechterung der Transrepression führen.
Zu diesem Zweck wurde die DNA-Sequenz des Klons #198 in der umgekehrten Orientierung in einen Expressionsvektor kloniert, was zur Transkription einer mRNA führte, die der kodierenden Sequenz komplementär ist. Diese sog. "antisense"-RNA hybridisiert mit dem endogenen #198-Transkript. Solche RNA-RNA-Hybride werden von dem Enzym RNAseH erkannt und abgebaut. Dadurch verringert sich die exprimierte Proteinmenge in der Zelle. HeLa-Zellen wurden mit dem "antisense"- #198-Konstrukt transfiziert und anschließend die AP-1 Repression und die Transaktivierung durch den GR mit Hilfe geeigneter Reportergene gemessen. Fig. 4 zeigt das Ergebnis eines solchen "antisense"-Experiments.
Zur Messung der AP-1 Repression wurde ein (-517/+63-Coll-Luc)-Kollagenasel- Luziferase-Reporter verwendet. Die Luziferaseaktivitäten wurde mit Hilfe der Renilla- Luziferase normalisiert und anschließend das Verhältnis zwischen den reprimierten (TPA+Dex) und den induzierten (TPA) Luziferaseaktivitäten gebildet. Die so erhaltenen relativen Luziferaseaktivitäten wurden in einem Balkendiagramm aufgetragen.
Die Repression des AP-1 Reportergens ist im Vergleich zur Leervektorkontrolle im Falle der mit dem "antisense"-Konstrukt transfizierten Zellen deutlich reduziert (um 47,5%) (Fig. 4A). Die TPA-induzierten Werte der "antisense"-Transfektion und der Leervektorkontrolle waren vergleichbar hoch und wurden durch das "antisense"- Konstrukt nicht beeinflußt. Die Transaktivierung durch den GR wurde mit Hilfe eines MMTV-Reportergens (pHCwt Luc) analysiert. Das Transaktivierungspotential des GR wurde durch die Expression des "antisense"-Konstruktes verdoppelt (Fig. 4B). Die basale Aktivität des Reporters wurde durch die "antisense"-RNA nicht beeinflußt. Dies zeigt, daß #198 ein negativ regulierender Faktor ist, der an der Transaktivierung und insbesondere an der AP-1 Repression durch den GR beteiligt ist.

Herstellung eines Antiserums gegen den Kofaktors #198

Zu diesem Zweck wurde die cDNA des Klons #198 in einen bakteriellen Expressionsvektor kloniert, der für ein Histidin-Peptid kodiert (pET28a, pET28a- #198). Somit war es möglich das rekombinante His-Fusionsprotein im Bakterienstamm BL21 zu exprimieren und mit Hilfe einer Nickel-Chelat-Säule aufzureinigen. Das unter denaturierenden Bedingungen hergestellte rekombinante Protein wurde von der Firma Genosys (Pempisford, UK) in zwei Kaninchen (Kaninchen-Nr. 354 und 355) injiziert. Vor der ersten Injektion wurde beiden Kaninchen Blut abgenommen, Serum daraus gewonnen und als Präimmunserum aufbewahrt. Zur Immunisierung wurde jeweils 1 mg des rekombinanten Proteins eingesetzt. Die Immunisierung wurde in zweiwöchigem Abstand wiederholt. Nach der sechsten Injektion wurde das gesamte Blut zur Gewinnung des #198-Antiserums verwendet.

Der erfindungsgemäße Kofaktor #198 interagiert mit dem Glukokortikoid-Rezeptor in vitro

Die beobachtete Zwei-Hybrid Interaktion sollte durch einen zweiten, von Hefezellen unabhängigen Ansatz bestätigt werden. Eine Möglichkeit besteht darin, die Interaktion in vitro mit Hilfe von GST-Fusionsproteinen nachzuweisen. Hierzu wird eines der interagierenden Proteine als Fusion mit dem Protein Glutathion-S- Transferase (GST) aus Schistosoma japonicum in löslicher Form in Bakterien exprimiert. Die Affinität von GST zu Glutathion ermöglicht die einfache Aufreinigung durch eine Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Glutathion.
Diese Affinität macht man sich auch beim in-vitro-Interaktionstest zunutze. Während ein Protein als GST-Fusion vorliegt, wird das potentielle Partnerprotein in Anwesenheit von 355-Methionin in vitro translatiert. Beide Komponenten werden gemischt und das GST-Fusionsprotein anschließend mit Hilfe von an Agarose immobilisiertem Glutathion präzipitiert. Interagieren die zwei Proteine, so kann das radioaktive Protein präzipitiert und nach der SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durch Autoradiographie detektiert werden.
Fig. 5 zeigt das Autoradiogramm des in vitro-Interaktionstests von GR mit #198. Hierbei wurde #198 als GST-Fusion eingesetzt und GR in Anwesenheit von ³⁵S- Methionin in vitro translatiert. In Spur 1 wurde 10% der in den einzelnen Reaktionen eingesetzten Menge aufgetragen (Input). Das radioaktive GR-Signal kann nur beim Ansatz mit GST-#198 im Präzipitat nachgewiesen werden, nicht jedoch im Kontrollansatz, in dem nur die Glutathion-S-Transferase (GST) eingesetzt wurde. Dies zeigt eindeutig die Interaktion von GR mit #198 in vitro.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Schematische Darstellung der Glukokortikoid-Rezeptors (GR) des Wildtyps und der entsprechenden Mutanten. A) Aufbau des Wildtyp- Glukokortikoid-Rezeptors (wt). Er enthält eine ligandenunabhängige Transaktivierungsdomäne (AF1) im N-Terminus, eine DNA- Bindedomäne (DBD) und eine Ligandenbindedomäne (LBD), die mit der ligandenabhängigen Transaktivierungsfunktion (AF2) überlappt. Die Ziffern stehen für die jeweiligen Aminosäurepositionen. B) GR_mH12 enthält eine Punktmutationin der Helix 12 an Position 755, wobei Glutaminsäure (E) gegen Glutamin (Q) ausgetauscht ist. C) GR_mH12 _Δ _AF-1 enthält zusätzlich zur Punktmutation in der Helix 12 eine komplette Deletion der AF1. D) GR_mDBD trägt eine Mutation in einem der Zink-bindenden Cysteinreste im zweiten Zinkfinger der DBD (C476 W) sowie eine weitere Punktmutation innerhalb der DBD (R479Q).
Fig. 2 Schematische Darstellung des verwendeten Two-Hybridkonstrukts und seine Transaktivierungskapazität nach Hormonzugabe. (A) Schematische Darstellung des verwendeten Two-Hybridkonstrukts. Das Fusionsprotein besteht aus der Gal4_DBD und GR_mH12 _Δ _AF-1 ab der Aminosäure 262 bis 777. Die DNA-Bindedomäne (DBD) und die Ligandenbindedomäne (LBD) mit enthaltener Aktivierungsfunktion 2 (AF-2) sind zusätzlich markiert. Das Fusionsprotein trägt zusätzlich ein Epitop des Hämagglutinin aus Hämophilus influenzae (HA). (B) Der Hefestamm Y190 wurde mit jeweils 1,0 µg eines Expressionsplasmids kodierend für Gal4_DBD-GR_wt bzw. für Gäl4_DBD-GRm_H12 _Δ _AF-1 transformiert. Die Reportergenaktivität nach verschiedenen Mengen des Hormons TAC wurde mit Hilfe eines β-Galaktosidasetests aus Suspensionskulturen bestimmt. Aufgetragen wurde die β- Galaktosidaseaktivität (Units) aus Mittelwerten dreier unabhängiger Experimente mit Standardabweichung.
Fig. 3 Flußschema der einzelnen Schritte des Zwei-Hybrid-Systems. In dem Flußdiagramm sind die einzelnen Schritte des Zwei-Hybrid-Systems für interagierende Proteine der GR-Mutante mH12ΔAF-1 dargestellt. Die Angaben auf der rechten Seite der Abbildung beziehen sich auf die Anzahl der bei den einzelnen Schritten analysierten Klone. TAC: Triamcinolonazetonid.
Fig. 4 Die Expression eines "antisense"-Konstruktes von #198 beeinflußt die AP-1 Repression und die Transaktivierung durch den GR. (A) Transrepression: 5.10⁵ logarithmisch wachsende HeLa-Zellen wurden mit Hilfe von DEAE-Dextran mit jeweils 1 µg eines (-517/+63-Coll-Luc)- Kollagenase-Luziferasereporters und eines #198-"antisense"- Konstruktes transfiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen für 16 Stunden mit 60 ng/ml TPA (grau), mit 60 ng/ml TPA und 10^-7 M Dexamethason gleichzeitig (weiß) oder nicht behandelt (schwarz). Als Kontrolle wurden Zellen mit dem Leervektor (pcDNA3.1-) zusammen mit dem Reportergen transfiziert und genau wie die "antisense"- transfizierten Zellen behandelt. Die Luziferaseaktivität im reprimierten Zustand wurde durch die Luziferaseaktivität nach TPA-Induktion dividiert und die relativen Luziferaseaktivitäten in dem Schaubild aufgetragen (Renilla normalisiert).
(B) Transaktivierung: 5.10⁵ logarithmisch wachsende HeLa-Zellen wurden mit Hilfe von DEAE-Dextran mit jeweils 1 µg eines pHCwt- Luziferasereporters und eines #198-"antisense"-Konstruktes transfiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen für 16 Stunden mit 10^-7M Dexamethason (weiß) oder nicht behandelt (schwarz). Als Kontrolle wurden Zellen mit dem Leervektor (pcDNA3.1-) zusammen mit dem Reportergen transfiziert und genau wie die "antisense"-transfizierten Zellen behandelt. Das Schaubild zeigt die Renilla-normalisierten Enzymaktivitäten. In A und B sind die Mittelwerte dreier unabhängiger Experimente und die sich daraus ergebenden Standardabweichungen gezeigt.
Fig. 5 #198 interagiert mit dem Glukokortikoidrezeptor in vitro. Ein in Anwesenheit von 355-Methionin in vitro translatiertes GR-Protein wird durch ein an Glutathion-Agarose immobilisiertes GST-#198 Fusionsprotein (GST-T6) spezifisch präzipitiert. Als Kontrolle dient das an Glutathionbeads gekoppelte GST-Protein. In Spur 1 wurde 10% der in den einzelnen Präzipitationen eingesetzten Menge des in vitro translatierten Materials aufgetragen (Input). In Spur 2 und 3 wurden 30% im Bezug auf den Input geladen. Der Pfeil markiert die erwartete Größe des in vitro translatierten Proteins.

Claims

1. Genetisch veränderter Glukokortikoid-Rezeptor, dadurch gekennzeichnet, daß er bei der Transrepression Protein-Protein-Wechselwirkungen eingeht und gleichzeitig Transaktivierungsdefizient ist.

2. Genetisch veränderter Glukokortikoid-Rezeptor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ligandenunabhängige Transaktivierungs-Domäne AF-1 im Aminoterminus und/oder die ligandenabhängige Transaktivierungs-Domäne AF-2 im Carboxyterminus des Rezeptors verändert ist.

3. Genetisch veränderter Glukokortikoid-Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende Nukleotidsequenz in der Domäne AF-1 etwa von Nukleotid 70 bis 300, bevorzugt etwa von Nukleotid 75-270 und bevorzugt von Nukleotid 77-262 deletiert und/oder in der Domäne AF-2 in der Helix 12 durch Punktmutation verändert ist.

4. Genetisch veränderter Glukokortikoid-Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der Helix 12 der AF-2-Domäne ein Glutaminsäurerest an Position 755 gegen Glutamin ausgetauscht ist.

5. Genkonstrukt enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz kodierend für einen genetisch veränderten Glukokortikoid-Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, sowie damit operativ verknüpft regulatorische Bereiche eines geeigneten Reportergens, bevorzugt eine DNA-Bindedomäne eines geeigneten Reportergens.

6. Genkonstrukt gemäß Anspruch 5, enthaltend als vorgeschaltete regulatorische Region die DNA-Bindesomäne des β-Glaktosidase-Gens aus E. coli, bevorzugt den β-Glaktosidase-Promotor.

7. Verfahren zur Identifizierung von Genen kodierend für Kofaktoren, die an der Glukokortikoid-Rezeptor vermittelten Modulation der Aktivität wenigstens eines weiteren Transkriptionsfaktors (Cross-Talk) beteiligt sind, wobei

a) ein Genkonstrukt gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 zusammen mit einer Expressionsgenbank aus eukaryontischen Zellen in ein gängiges Zwei-Hybrid- System in Hefe übertragen und dort exprimiert wird,

b) diejenigen Zellen, die einen spezifischen Protein-Protein-Komplex des Glukokortikoid-Rezeptors mit wenigstens einem weiteren Kofaktor aufweisen, durch Wachstum auf Selektivmedium und das Vorliegen einer spezifischen Reportergenaktivität, bevorzugt β-Galaktosidase-Aktivität, selektioniert werden und

c) aus diesen Hefezellen die für die Kofaktoren oder Teile davon kodierenden cDNA-Klone der Expressionsgenbank isoliert und charakterisiert werden.

8. Kofaktor, der bei der Transrepression spezifisch mit dem Glukokortikoid-Rezeptor eine Protein-Protein-Wechselwirkung eingeht, wobei er im Bereich stromabwärts der N-terminalen Transaktivierungsfunktion AF1 und dem Carboxyende des Rezeptors bindet.

9. Kofaktor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er im Bereich zwischen der N-terminalen Transaktivierungsfunktion AF1 und der DNA- Bindedomäne des Rezeptors bindet.

10. Kofaktor gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Korepressor des Glukokoritikoid-Rezeptors ist.

11. Kofaktor gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß er mit dem Glukokortikoid-Rezeptor im Bereich von Nukleotid 1 bis 550, bevorzugt 200 bis 500 und besonders bevorzugt 262 bis 481 der Rezeptor-kodierenden Nukleotidsequenz interagiert.

12. Kofaktor gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, kodiert durch eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus:

a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder

b) einer Nukleotidsequenz, die mindestens 75%ige Identität mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz aufweist oder

c) einer mit a) und b) hybridisierenden Nukleotidsequenz oder

d) einer zu a), b) oder c) komplementären Nukleotidsequenz.

13. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Wechselwirkung des Giukokortikoid-Rezeptors mit anderen Transkriptionsfaktoren und/oder Kofaktoren spezifisch beeinflussen, wobei

a) wenigstens ein Glukokortikoid-Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und/oder ein Genkonstrukt gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 und ein Kofaktor gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12 mit

b) potentiellen Wirkstoffen zusammengegeben werden und

c) die Modulation der Interaktion der Proteinpartner aus a) durch die in b) eingesetzten Wirkstoffe als Änderung der Expression eines Reportergens an das der Protein-Protein-Komplex bindet gemessen wird.

14. Verbindung zur Modulation der Interaktion des Glukokortikoid-Rezeptors mit einem Kofaktor, dadurch gekennzeichnet, daß sie anstelle des physiologischen Hormons an den Rezeptort oder außerhalb der Bindestellen des physiologischen Hormons an einer allosterischen Bindestelle binden.

15. Verbindung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um niedermolekulare Substanzen, Peptide oder peptidomimetische Agenzien handelt.

16. Mittel mit entzündunghemmender und/oder immunsuppressiver Wirkung enthaltend wenigstens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, die die Wechselwirkung des Glukokortikoid-Rezeptors mit anderen Transkriptionsfaktoren und/oder Kofaktoren spezifisch beeinflußt und gemäß einem Verfahren nach Anspruch 13 identifiziert wird sowie zusätzliche zur Darreichung am Patienten erforderliche Stoffe.

17. Verwendung eines genetisch veränderten Glukokortikoid-Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Identifizierung von Kofaktoren, die an der Glukokortikoid-Rezeptor vermittelten Modulation der Aktivität wenigstens eines weiteren Transkriptionsfaktors beteiligt sind.

18. Verwendung des Kofaktors gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12 zur Herstellung von Mitteln mit entzündungshemmenden und/oder immunsuppressiven Wirkungen.