DE102020202358A1

DE102020202358A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines qPCR-Verfahrens

Info

Publication number: DE102020202358A1
Application number: DE102020202358.1A
Authority: DE
Inventors: Christoph Faigle; Torsten Sachse
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2021-08-26
Anticipated expiration: 2040-02-26
Also published as: CN115103916A; WO2021170439A1; EP4110946A1; DE102020202358B4; US20230096593A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, mit folgenden Schritten:- Zyklisches Ausführen (S12; S22, S24, S26, S28) von qPCR-Zyklen;- Messen (S12, S29) der Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten;- Bestimmen einer Reaktionseffizienz (ri) für jeden Zyklus;- Korrigieren (S13, S31) des Intensitätswerts jedes Zyklus abhängig von der für den betreffenden Zyklus bestimmten Reaktionseffizienz (ri), um eine korrigierte qPCR-Kurve (S14, S31) zu erhalten;- Betreiben (S16, S33) des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Verlauf der korrigierten qPCR-Kurve.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft die Anwendung eines Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens (PCR-Verfahrens), insbesondere zur Detektion des Vorliegens eines Erregers. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Auswertung von qPCR-Messungen.
Technischer Hintergrund
Zur Detektion von DNA-Strangabschnitten in einer zu untersuchenden Substanz, wie beispielsweise einem Serum oder dergleichen, werden in automatisierten Systemen PCR-Verfahren durchgeführt. Die PCR-Systeme ermöglichen es, bestimmte zu detektierende DNA-Strangabschnitte, die z.B. einem Erreger zuzuordnen sind, zu amplifizieren und zu detektieren. Ein PCR-Verfahren umfasst generell eine zyklische Anwendung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation. Insbesondere wird beim PCR-Prozess ein DNA-Doppelstrang in Einzelstränge aufgespalten und diese jeweils durch Anlagerung von Nukleotiden wieder vervollständigt, um die DNA-Strangabschnitte in jedem Zyklus zu vervielfältigen.
Das qPCR-Verfahren ermöglicht die Erregerlast, nachgewiesen mit diesem Prozess zu quantifizieren. Dazu sind die Nukleotide zumindest teilweise mit Fluoreszenzmolekülen versehen, die bei Anbinden an den Einzelstrang des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts eine Fluoreszenzeigenschaft aktivieren.
Nach dem Aufbau der Doppelstränge kann nach jedem Zyklus ein Intensitätswert einer Fluoreszenz ermittelt werden, der von der Anzahl der erzeugten DNA-Strangabschnitte abhängt.
Im Laufe der Amplifikation kann dann aus den ermittelten Intensitätswerten eine qPCR-Kurve ermittelt werden, die bei Vorliegen des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz einen sigmoidförmigen Verlauf hat. Die gemessenen qPCR-Kurven können in der Realität mit Artefakten behaftet sein, so dass in der Regel mehrere parallele Messungen durchgeführt werden, um durch eine Mittelwertbildung der Messwerte eine genauere Auswertung der qPCR-Kurven zu ermöglichen.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß sind ein Verfahren zum Durchführen eines qPCR-Verfahrens gemäß Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung und ein qPCR-System gemäß den nebengeordneten Ansprüchen vorgesehen.
Weitere Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Gemäß einem ersten Aspekt ist ein Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren vorgesehen, mit folgenden Sch ritten:

- Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen
- Messen der Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten;
- Bestimmen einer Reaktionseffizienz für jeden Zyklus;
- Korrigieren des Intensitätswerts jedes Zyklus abhängig von der für den betreffenden Zyklus bestimmten Reaktionseffizienz, um eine korrigierte qPCR-Kurve zu erhalten;
- Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Verlauf der korrigierten qPCR-Kurve.

Das qPCR-Verfahren weist eine zyklische Wiederholung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation auf. Bei der Denaturierung wird bei einer hohen Temperatur die gesamte doppelsträngige DNA in der zu untersuchenden Substanz in zwei Einzelstränge aufgespalten. In dem Schritt des Annealing wird an die Einzelstränge einer der Substanz zugegebenen Primer angebunden, die den Startpunkt der Amplifizierung der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte vorgeben. Bei dem Schritt der Elongation wird ein zweiter komplementärer DNA-Strangabschnitt aus freien Nukleotiden auf den mit dem Primer versehenen Einzelsträngen aufgebaut. Nach jedem dieser Zyklen hat sich also idealerweise die DNA-Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte verdoppelt.
Durch die Anwendung des qPCR-Verfahrens werden in die zu detektierenden DNA-Strangabschnitte Fluoreszenzmoleküle als Marker eingebaut, so dass über eine Messung der Intensität der Fluoreszenz nach jedem Elongationsschritt ein zeitlicher Verlauf der Intensitätswerte ermittelt werden kann. Die so erhaltene qPCR-Kurve weist dabei drei distinkte Phasen auf, nämlich eine Baseline, in der die Intensität der Fluoreszenz des von eingebauten Markern emittierten Fluoreszenzlichts noch nicht von der Hintergrund-Fluoreszenz zu unterscheiden ist, einer exponentiellen Phase, in der die Fluoreszenzintensität über die Baseline ansteigt, also sichtbar wird, wobei durch die Verdoppelung der DNA-Stränge in jedem Zyklus das Fluoreszenzsignal proportional zur Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte exponentiell ansteigt, und einer Plateau-Phase, in der die Reagenzien, d. h. der Primer und die freien Nukleotide, nicht mehr in den benötigten Konzentrationen vorhanden sind und keine weitere Verdoppelung stattfindet.
Für den Nachweis eines vorgegebenen zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, der beispielsweise einem Erreger entsprechen kann, ist hierbei der sogenannte ct (cycle threshold)-Wert maßgeblich. Der ct-Wert bestimmt den Beginn der exponentiellen Phase und wird durch Überschreiten eines spezifischen Grenzwerts, der für den jeweils zu detektierenden DNA-Strangabschnitt festgelegt ist und der für alle Proben für den zu detektierenden DNA-Strangabschnitt identisch ist, ermittelt oder rechnerisch durch die zweite Ableitung der qPCR-Kurve in der exponentiellen Phase ermittelt und dem Intensitätswert des steilsten Anstiegs der qPCR-Kurve entspricht. Ist der Zielwert bekannt, kann durch Rückrechnung die Anfangskonzentration des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz bestimmt werden.
In der Realität sind die qPCR-Kurven sehr ungenau und erheblichen Schwankungen unterworfen. Es kann einerseits ein Baseline-Drift auftreten, mit der das Ansteigen der Hintergrundfluoreszenz über die Messzyklen bezeichnet wird. Das heißt, dass, selbst wenn keine Amplifikation stattfindet, das Fluoreszenzsignal ansteigt. Weitere Einflussfaktoren, die sich negativ auf die Genauigkeit der qPCR-Kurve auswirken, können beispielsweise aus thermischem Rauschen, Schwankungen bzw. Zumesstoleranzen in der Reagenzkonzentration, Lufteinschlüsse und Artefakten im Fluoreszenzvolumen resultieren.
In herkömmlichen qPCR-Systemen findet einerseits eine softwarebasierte Korrektur der qPCR-Kurven statt, andererseits kann vorgesehen sein, eine Probe unter gleichen Bedingungen mehrfach zu messen und die resultierenden qPCR-Kurven durch Mittelwertbildung zu glätten. Dies erfordert jedoch einen erhöhten Aufwand.
Eine Idee des obigen Verfahrens besteht darin, eine Reaktionseffizienz in jedem Schritt des PCR-Verfahrens zu berücksichtigen, so dass eine Auswertung der qPCR-Kurve verbessert werden kann. Die Reaktionseffizienz bestimmt sich maßgeblich durch die in der jeweiligen Reaktionskammer befindlichen Reaktionsflüssigkeit, so dass ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Lumineszenz und dem erfassten Intensitätswert und der Menge des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts besteht. Im Unterschied zu herkömmlichen PCR-Verfahren ist vorgesehen, nach jedem Reaktionszyklus der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation ein Bild der Reaktionskammer aufzunehmen und daraus einen Blasenvolumenquotienten zu ermitteln, der einen Volumenanteil einer Luftblase in der Reaktionskammer angibt, die nicht zur Reaktion mit dem zu detektierenden DNA-Strangabschnitt beiträgt. Dadurch werden die DNA-Strangabschnitte nicht in jedem PCR-Zyklus verdoppelt, wie es für den Idealfall der Fall wäre, sondern nur mit einem Faktor zwischen 1 und 2 vervielfältigt. Die Reaktionseffizienz dieser Amplifizierung entspricht dem über 1 hinausgehenden Anteil dieses Faktors der Amplifizierung.
Entsprechend obigem Verfahren wird die Reaktionseffizienz also nach jedem Zyklus ermittelt, und der jeweils ermittelten Intensitätswert wird mit der Reaktionseffizienz korrigiert. Auf diese Weise erhält man eine auf eine Reaktionseffizienz von 1 idealisierte qPCR-Kurve, die in vereinfachter Weise in einem nachfolgenden Schritt ausgewertet werden kann.
Im Stand der Technik werden die qPCR-Kurven dadurch generiert, dass gemittelte Intensitätswerte pro Zyklus zu einer Kurve kombiniert werden, die nach der Messung an eine sigmoidale Kurve gefittet wird, um die korrigierte qPCR-Kurve auszuwerten, insbesondere um daraus den CT-Wert zu erhalten. Dabei wird die Reaktionseffizienz in der Standardberechnung als immer gleich, insbesondere als eine Verdopplung (Reaktionseffizient = 1), angenommen. Da reale Reaktionseffizienten kleiner 1 sind, ist die so ermittelte sigmoidale Kurve fehlerhaft.
Weiterhin kann das PCR-Verfahren durch Leiten einer Reaktionsflüssigkeit in eine Reaktionskammer, insbesondere in jedem Zyklus, durchgeführt werden, wobei die Reaktionseffizienz abhängig von einer Fläche einer oder mehrerer Blasen, insbesondere Luftblasen, in der Reaktionskammer, insbesondere der Reaktionskammer für einen Elongationsprozess des PCR-Prozesses, bestimmt wird.
Die Reaktionseffizienz wird insbesondere durch Blasen in der Reaktionskammer beeinträchtigt, da die Menge des Reaktionsgemischs dadurch reduziert wird. Da die Anzahl und Größe von Blasen in der Reaktionskammer von Zyklus zu Zyklus variieren können, kann die dadurch bewirkte Reduzierung der Reaktionseffizienz ebenfalls variieren. Unter der Annahme, dass die Blasenbildung in der Reaktionskammer der maßgebliche Effekt zur Reduzierung der Reaktionseffizienz ist, kann ein Blasenvolumenquotient definiert werden, der das Blasenvolumen als Anteil des Gesamtvolumens der Reaktionskammer angibt und entsprechend proportional die Reaktionseffizienz reduziert.
Es kann vorgesehen sein, dass ein Bild der Reaktionskammer mithilfe einer Kamera aufgenommen wird, wobei die Fläche der einen oder den mehreren Blasen mithilfe von auf das Bild der Reaktionskammer angewendeten Mustererkennungsverfahren bestimmt wird.
Die Blasendetektion kann durch bekannte Verfahren, wie Thresholding (z. B. Otsu's Method), Kantenerkennung, Hough-Transformation, datenbasierte Verfahren basierend auf neuronalen Netzen und dergleichen durchgeführt werden.
Da die Geometrie der Reaktionskammer bekannt ist, kann durch Auswertung eines Kamerabildes der Reaktionskammer anhand der Blasenausdehnung eine Abschätzung des verdrängten Volumens der Reaktionsflüssigkeit in jedem Zyklus durchgeführt werden.
Insbesondere kann die Reaktionseffizienz mithilfe der Helligkeit eines oder mehrerer Pixel des Bildes, die der Reaktionsflüssigkeit entsprechen, und des Anteils der Fläche der einen oder mehreren Blasen an der gesamten Fläche der Reaktionskammer bestimmt werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann die Reaktionseffizienz abhängig von einer Fläche einer oder mehrerer Blasen in der Reaktionskammer für mindestens zwei der PCR-Teilprozessschritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation bestimmt werden.
Zur Bestimmung des Intensitätswertes des verbleibenden Reaktionsvolumens kann vorgesehen sein, nur die Helligkeit derjenigen Pixel auszuwählen, die sicher nicht zu einer Blase oder zu einer Halo (Randbereich) einer Blase gehört. Alternativ kann der Mittelwert der Helligkeit der Reaktionskammer verwendet werden, wobei die Helligkeit unter Berücksichtigung eines Blasenvolumens, das in der Regel keine Fluoreszenz aufweist, mithilfe des Blasenvolumenquotienten bestimmt werden kann. Die Ermittlung, welche der Pixel zu einem Blasenvolumen gehören, welche zur Halo und welche zur Reaktionsflüssigkeit, kann mithilfe datenbasierter Verfahren für eine sogenannte semantische Segmentierung durchgeführt werden. Bei der semantischen Segmentierung wird jedem Pixel eines Bildes eine Klasse aus einer Anzahl von vorgegebenen Klassen zugeordnet. Mit einem solchen Klassifikator lässt sich ein Kamerabild der Reaktionskammer in einfacher Weise auswerten.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, die Blasenbildung in den verschiedenen Schritten des PCR-Verfahrens, nämlich der Denaturierung des Annealing und der Elongation, separat zu betrachten. Dadurch können unterschiedliche Blasengrößen in den einzelnen Reaktionsschritten eines PCR-Zyklusses berücksichtigt werden, wobei die jeweiligen Blasengrößen für jeden der Prozessschritte eine Reduzierung der Reaktionseffizienz bewirkt. So können in jedem PCR-Zyklus Kamerabilder ausgewertet werden, d.h. am Ende der Denaturierung, am Ende des Annealing, zu Beginn der Elongation und am Ende der Elongation eine Fluoreszenzmessung durchgeführt werden. Die ersten drei Werte sollten bei gleichem Blasenvolumen dieselbe Helligkeit aufweisen und sich von dem Intensitätswert des vierten Werts nur dann unterscheiden, wenn zusätzliche Fluoreszenz entsteht.
Es kann nun für jeden Prozessschritt innerhalb eines PCR-Zyklusses das verdrängte Blasenvolumen berücksichtigt werden, wobei der Quotient der Intensitätswerte von aufeinander folgenden Prozessschritten proportional zur Veränderung des Reaktionsvolumens in der entsprechenden Kammer ist. Unter der Annahme, dass die denaturierten und elongierten DNA-Strangabschnitte, die nicht amplifiziert werden, sich nach der Elongation wieder zu den ursprünglichen Doppelsträngen zusammenfügen, ergibt sich nach Ende eines PCR-Zyklusses ein von den Helligkeitsquotienten zwischen den einzelnen Prozessschritten abhängiger Wert der Reaktionseffizienz. Dieser kann dann bei der Korrektur der aufgezeichneten qPCR-Kurve verwendet werden.
Weiterhin kann mithilfe der korrigierten qPCR-Kurve basierend auf einem Klassifikationsverfahren bestimmt werden, ob ein zu detektierenden DNA-Strangabschnitt vorhanden ist oder nicht.
Gemäß einer Ausführungsform kann das qPCR-Verfahren betrieben werden, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts,

- signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist,
- der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt wird.

Figurenliste
Ausführungsformen werden nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Zyklus eines PCR-Verfahrens;
2 ein System zur Durchführung eines PCR-Verfahrens;
3 eine schematische Darstellung einer typischen qPCR-Kurve mit einem Intensitätswerteverlauf;
4 ein gemessener Verlauf einer qPCR-Kurve;
5a und 5b ideale Verläufe der qPCR-Kurve für den Fall einer nicht nachweisbaren Substanz bzw. einer nachweisbaren Substanz; und
6 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung;
7 eine fotografische Aufnahme einer Reaktionskammer mit einer Blase;
8 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines weiteren Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung.

Beschreibung von Ausführungsformen
1 zeigt eine schematische Darstellung eines an sich bekannten PCR-Verfahrens mit den Schritten der Denaturierung des Annealing und der Elongation.
In dem Schritt des Annealing S1 wird bei einer hohen Temperatur von beispielsweise über 90°C die doppelsträngige DNA in einer Substanz in zwei Einzelstränge aufgebrochen. In einem nachfolgenden Annealing-Schritt S2 wird an die Einzelstränge an einer bestimmten DNA-Position, die einen Beginn eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts markiert, ein sogenannter Primer angebunden. Dieser Primer stellt den Startpunkt einer Amplifizierung des DNA-Strangabschnitts dar. In einem Elongationsschritt S3 wird beginnend an der von dem Primer markierten Position aus der Substanz zugesetzten freien Nukleotiden der komplementäre DNA- Strangabschnitts an den Einzelsträngen aufgebaut, so dass am Ende des Elongationsschrittes die zuvor aufgespaltenen Einzelstränge zu vollständigen Doppelsträngen ergänzt worden sind.
Durch Versehen der freien Nukleotide bzw. des Primers mit Fluoreszenzmolekülen, die nur in dem an den DNA-Strangabschnitt gebundenen Zustand Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, ist es möglich, durch Ermitteln einer Intensität einer Fluoreszenz im Anschluss an den Elongationsschritt S3 einen Intensitätswert durch eine geeignete Messung zu erhalten. Der gemessenen Intensität des Fluoreszenzlichts wird ein Intensitätswert zugeordnet.
Das Verfahren der Schritte S1 bis S3 wird zyklisch ausgeführt und die Intensitätswerte aufgezeichnet, um einen Intensitätswerteverlauf als eine qPCR-Kurve zu erhalten.
In 2 ist ein System 10 zur Durchführung eines PCR-Verfahrens dargestellt. Das System weist drei Reaktionskammern, die Denaturierung-Kammer 11, die Annealing-Kammer 12, und die Elongations-Kammer 13 für die Durchführung der Denaturierung, des Annealing bzw. der Elongation auf, die jeweils mit einem optischen System verbunden ist, um einen Intensitätswert zu erfassen. Das optische System umfasst eine jeweilige Kamera 14, 15, 16, die mit einer Steuereinheit 20 verbunden sind, in der die Kamerabilder ausgewertet werden. Dazu können die Reaktionskammern 11, 12, 13 zumindest einseitig mit einer transparenten Fläche abgeschlossen sein, auf die die jeweilige Kamera 14, 15, 16 gerichtet ist. Die Kameras dienen dazu, ein Kamerabild der jeweiligen Reaktionskammer zu erfassen und der Steuereinheit 20 bereitzustellen. Die Kameras 14, 15, 16 sind geeignet, ein Fluoreszenzlicht des PCR-Verfahrens zu erkennen. Die Steuereinheit 20 ist ausgebildet, eine Bildverarbeitung der aufgezeichneten Kamerabilder durchzuführen und daraus entsprechend einem der nachfolgend beschriebenen Verfahren einen Intensitätswert zu ermitteln.
Der Intensitätswerteverlauf hat im Idealfall einen Verlauf, der in 3 dargestellt ist. 3 zeigt einen Verlauf einer normalisierten Intensität über dem Zyklusindex z. Dieser Verlauf unterteilt sich in drei Abschnitte, nämlich einen Baseline-Abschnitt B, in dem die Fluoreszenz der eingebauten Fluoreszenzmoleküle noch nicht von einer Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden ist, einen exponentiellen Abschnitt E, in dem die Intensitätswerte sichtbar sind und exponentiell ansteigen, und in einem Plateau-Abschnitt P, in dem sich der Anstieg der Intensitätswerte abflacht, da die verwendeten Reagenzien (Lösung mit Nukleotiden) aufgebraucht sind und keine weitere Anbindung an aufgebrochenen Einzelsträngen stattfindet.
In 4 ist beispielhaft ein bei einer realen Messung erhaltener Verlauf der Intensitätswerte als qPCR-Kurve dargestellt. Man erkennt starke Schwankungen, die sich aus einer Hintergrundfluoreszenz, thermisches Rauschen, Schwankungen in den Reagenzkonzentrationen sowie Bläschen und Artefakte im Fluoreszenzvolumen ergeben können. Man erkennt, dass die Bestimmung des Baseline-Abschnitts, des exponentiellen Abschnitts und des Plateau-Abschnitts der qPCR-Kurve nicht ohne weiteres möglich ist.
5a und 5b zeigen ideale Verläufe einer qPCR-Kurve ohne Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts bzw. mit Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts.
In 6 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens dargestellt, das in der Steuereinheit ausgeführt wird. Das Verfahren kann in einer Datenverarbeitungseinrichtung als Hardware und/oder Software implementiert sein.
Im Schritt S11 wird ein PCR-Messverfahren gestartet.
In Schritt S12 werden die Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation wie oben beschrieben durchgeführt und am Ende des Elongationsschrittes in jedem Zyklus ein Intensitätswert ermittelt. Dies erfolgt durch Aufnahmen der Elongations-Kammer 13 mithilfe der Kamera 16. Zur Bestimmung des Intensitätswertes kann eine Blasenbildung in der Reaktionskammer für die Elongation berücksichtigt werden. In 7 ist beispielhaft eine fotografische Aufnahme einer Reaktionskammer mit einer Luftblase in der Reaktionsflüssigkeit gezeigt.
Mithilfe von an sich bekannten Verfahren kann das Vorliegen einer Blase in der Reaktionskammer bestimmt werden. Derartige Verfahren können Thresholding (Otsu's Method), Kantenerkennung, Hough-Transformation sowie Erkennung mithilfe von datenbasierten Maschine-Learning-Verfahren, wie beispielsweise unter Nutzung von tiefen neuronalen Netzen und dergleichen, vorgenommen werden. Anhand der erkannten Blase kann die Blasenfläche der Abbildung bestimmt werden, d.h. die Fläche, die durch die Blase und die Halo der Blase eingenommen wird. Aus dem Verhältnis der Blasenfläche und der gesamten Fläche der Reaktionskammer kann ein Blasenvolumenquotient ermittelt werden, der den Anteil des Volumens in der Reaktionskammer angibt, der durch die Blase belegt wird und damit einen entsprechenden Teil der Reaktionsflüssigkeit verdrängt. Ein erfasster Intensitätswert ergibt sich daher nur aus der verbleibenden Reaktionsflüssigkeit und kann entsprechend dem Volumen V_b der Blase um den Faktor 1 - V_b reduziert werden, da die Helligkeit der Fluoreszenz in der Reaktionskammer nur von der verbleibenden Reaktionsflüssigkeit bewirkt wird.
Ein alternativer Ansatz kann darin bestehen, nur die Helligkeit von einem oder mehreren Pixel der Abbildung der Reaktionskammer auszuwählen und Pixel, die Teil einer Blase oder einer dazugehörigen Halo sind, zu vernachlässigen. Die Helligkeiten von Pixeln, die der Reaktionsflüssigkeit zuzuordnen sind, können gemittelt werden, um einen entsprechenden Intensitätswert zum Erstellen der qPCR-Kurve zu erhalten. Um für die Mittelung relevante Pixel auszuwählen, können Klassifikationsverfahren, insbesondere unter Nutzung von Machine-Learning-Verfahren, verwendet werden. Dabei kann mithilfe der Machine-Learning-Verfahren eine sogenannte semantische Segmentierung durchgeführt werden. Bei der semantischen Segmentierung wird jedem Pixel eines Kamerabildes eine von mehreren Klassen zugeordnet.
Hierfür kann ein datenbasiertes Verfahren mit einem Klassifikationsmodell verwendet werden, welches mit pixelweise gelabelten Daten trainiert worden ist. Für diesen konkreten Anwendungsfall sind mehrere n-näre Klassifizierungen denkbar:

1. Binäre Klassifikation: Jedem Pixel wird die Klasse „Teil einer Blase“ oder „nicht Teil einer Blase“ zugeordnet. Die Grauwertermittlung findet dann nur über die Piel der Klasse „nicht Teil einer Blase“ statt, die im Reaktionsvolumen liegen. Dieses Verfahren setzt somit voraus, dass Position, Größe und Orientierung der Reaktionskammer bekannt und relativ zur Kamera unveränderlich sind.
2. Ternäre Klassifikation: Diese Variante ergänzt die Variante 1 mit der zusätzlichen Klasse „nicht Teil des Reaktionsvolumens“. Dadurch setzt dieses Verfahren nicht länger voraus, dass Position, Größe und Orientierung der Reaktionskammer bekannt und relativ zur Kamera unveränderlich sind.
3. Ternäre Klassifikation, zweite Variante: Diese Variante ergänzt die Variante 1 mit der zusätzlichen Klasse „Teil des Halos einer Blase“. Es kann sich als sinnvoll herausstellen, die Pixel im Halo einer Blase separat auszuwerten, da das Halo auch einen Teil des eigentlichen Reaktionsvolumens überstrahlen kann. Dieses Verfahren setzt somit auch voraus, dass Position, Größe und Orientierung der Reaktionskammer bekannt und relativ zur Kamera unveränderlich sind.
4. Quarternäre Klassifikation: Diese Variante entspricht einer Kombination der Varianten 2 und 3. Hiermit können also sowohl Pixel in Halos separat ausgewertet werden als auch Veränderungen in der relativen Orientierung der Reaktionskammer zur Kamera festgestellt und kompensiert werden.
5. Binäre Klassifikation. Bei dieser Variante wird jedem Pixel wird die Klasse „Teil des Randes einer Blase“ oder „nicht Teil des Randes einer Blase“ zugeordnet. Dies entspricht einer Kantenerkennung (Edge Detection). Die Grauwertermittlung findet dann nur über die Piel statt, die völlig von Pixeln der Klasse „Teil des Randes einer Blase“ umgeben sind. Dies setzt somit voraus, dass Position, Größe und Orientierung der Reaktionskammer bekannt und relativ zur Kamera unveränderlich sind.

Die so erhaltenen Intensitätswerte können in Schritt S13 korrigiert werden, indem eine Reaktionseffizienz berücksichtigt wird. Beim Stand der Technik wird die Reaktionseffizienz als konstant, insbesondere im Idealfall als 1 angenommen. Für reale Systeme ist jedoch davon auszugehen, dass die Reaktionseffizienz in jedem Zyklus variiert, so dass die Intensitätswerte und die daraus ermittelte qPCR-Kurve fehlerhaft sind.
Es wird hierin davon ausgegangen, dass das durch Blasen in der Reaktionskammer verdrängte Reaktionsgemisch nicht zur Amplifikation beitragen kann, da es sich in Kanälen oder anderen Kammern, jedoch nicht in der Reaktionskammer befindet. Somit verschlechtert sich die Reaktionseffizienz.
Die Anzahl der DNA-Strangabschnitte pro Zyklus bei gleichbleibendem Reaktionsvolumen wird wie folgt definiert: $n_{i + 1} = n_{i} (1 + η)$
wobei n_i der Anzahl der DNA-Strangabschnitte im Zyklus i entspricht und η der chemischen Reaktionseffizienz zwischen 0 und 1. η wird im einfachsten Fall als 1 angenommen. In einer besonderen Ausführung kann dieser Faktor ebenso durch eine experimentelle Reihe bestimmt werden und so genauer angenähert werden.
Wird nun das verdrängte Blasenvolumen V_B,i als Quotient zwischen der von der Blase eingenommenen Fläche zur Gesamtfläche der Reaktionskammer als Blasenvolumenquotient angegeben, ergibt sich: $n_{i + 1} = n_{i} (1 + η (1 - V_{B, i}))$
Die tatsächliche Anzahl der neuen DNA-Strangabschnitte liegt damit bei Vorliegen einer Blase unterhalb der angenommenen Anzahl von kopierten DNA-Strangabschnitten. Für jeden Zyklusschritt lässt sich nun eine Reaktionseffizienz berechnen: $r_{i} = \frac{n_{i + 1}}{n_{i}}$
In Schritt S14 wird die so ermittelte Reaktionseffizienz in dem Zyklus als Skalierungsfaktor genutzt und die qPCR-Kurve mithilfe der korrigierten Intensitätswerte n_actual,i aus den gemessenen Intensitätswerten n_curve,i aufgebaut: $n_{a c t u a l, i} = \frac{n_{c u r v e, i}}{r_{i}}$
In Schritt S15 wird überprüft, ob das Messverfahren abgebrochen werden soll. Dies kann beispielsweise nach Erreichen eines Abbruchkriteriums, wie z.B. einer vorgegebenen Anzahl von Messzyklen, der Fall sein. Ist dies nicht der Fall (Alternative: Nein), so wird das Verfahren in Schritt S12 fortgesetzt, anderenfalls wird das Verfahren mit Schritt S16 beendet und eine Auswertung der korrigierten qPCR-Kurve vorgenommen.
Die Auswertung in Schritt S16 kann durch Klassifikation der korrigierten qPCR-Kurve mithilfe eines vorgegebenen Klassifikationsmodells erfolgen. Dadurch kann das bestimmt werden, ob die korrigierte qPCR-Kurve ein Vorhandensein oder ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt, d. h. angibt, ob der zu detektierenden DNA-Strangabschnitt in der Substanz enthalten ist oder nicht.
In 8 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines weiteren Verfahrens dargestellt, das in der Steuereinheit ausgeführt wird. Das Verfahren kann in einer Datenverarbeitungseinrichtung als Hardware und/oder Software implementiert sein.
In Schritt S21 wird das qPCR-Verfahren gestartet.
In Schritt S22 wird der Schritt S1 der Denaturierung in der entsprechenden Denaturierungsreaktionskammer durchgeführt.
In Schritt S23 wird am Ende der Denaturierung eine Helligkeit h_D des Fluoreszenzlichtes durch die entsprechende Kamera 14 der Denaturierungs-Kammer 11 aufgenommen.
In Schritt S24 wird der Annealing-Prozess des Schritts S2 gestartet.
In Schritt S25 wird am Ende des Annealing-Prozesses eine Helligkeit h_A des Fluoreszenzlichtes durch die entsprechende Kamera 15 der Annealing-Kammer 12 aufgenommen.
In Schritt S26 wird die Reaktionsflüssigkeit in die Elongations-Kammer 13 geleitet.
In Schritt S27 wird zu Beginn des Elongationsprozesses eine Helligkeit h_E,A des Fluoreszenzlichtes durch die entsprechende Kamera 16 der Elongations-Kammer 13 aufgenommen.
In Schritt S28 wird der Elongationsprozess gestartet.
In Schritt S29 wird am Ende des Elongationsschrittes eine Helligkeit h_e,e,i des Fluoreszenzlichtes durch die entsprechende Kamera 16 der Elongations-Kammer 13 aufgenommen.
Theoretisch haben die Werte h_d,i, h_a,i, h_e,a,i dieselbe Helligkeit, da keine Amplifikation stattfindet und unterscheiden sich von dem Helligkeitswert h_e,e,i nur, wenn zusätzliche Fluoreszenz durch die Amplifikation des Elongationsprozess entsteht.
Im Folgenden wird in Schritt S30 eine Gesamtreaktionseffizienz berechnet.
Durch Blasenbildung unterschiedlicher Blasengröße können jedoch die Helligkeiten in den verschiedenen Reaktionskammern 11, 12, 13 variieren. Diese Variation kann als Indikator verwendet werden, ob und in welcher Größe sich Blasen gebildet haben. Durch die Blasenbildung wird die Reaktionsflüssigkeit verdrängt und somit die Effizienz der einzelnen Teilschritte verringert, da die Reaktionsflüssigkeit nicht in ihrer Gesamtheit für die Umwandlung zur Verfügung steht. Somit können Blasenvolumenquotienten q als Quotienten der Helligkeiten zwischen den einzelnen Teilschritten wie folgt ermittelt werden: $q_{d, i + 1} = \frac{h_{d, i + 1}}{h_{e, e, i}}$
$q_{a, i} = \frac{h_{a, i}}{h_{d, i}}$
$q_{e, i} = \frac{h_{e, a, i}}{h_{a, i}}$
$η = \frac{h_{e, e, i}}{h_{e, a, i}}$
Falls einer der Quotienten q größer als 1 sein sollte, wird er auf 1 festgelegt, da die im vorherigen Schritt nicht bearbeitete Reaktionsflüssigkeit nicht im nächsten Teilschritt weiter prozessiert werden kann.
Somit ergibt sich für jeden Teilschritt die Menge an bearbeiteten DNA-Strangabschnitten (n_d,i für die Zahl der DNA-Strangabschnitte nach der Denaturierung im i-ten Zyklus, n_a,i für die Zahl der DNA-Strangabschnitte nach dem Annealing im i-ten Zyklus, n_e,i für die Zahl der DNA-Strangabschnitte nach der Elongation im i-ten Zyklus) $n_{d, i} = n_{i} \cdot q_{d, i}$
$n_{a, i} = n_{i} \cdot q_{a, i}$
$n_{e, i} = n_{i} \cdot q_{e, i}$
Die Zahl an DNA-Strangabschnitten, die als zu Anfang des letzten Teilschritts für die Elongation und Fluoreszenzeinbau zur Verfügung steht, entspricht somit $n_{e, a, i} = n_{i} \cdot q_{d, i} \cdot q_{a, i} \cdot q_{e, i}$
Unter der Annahme, dass sich denaturierte und elongierte DNA-Strangabschnitte, die nicht amplifiziert werden, wieder zu den ursprünglichen Doppelsträngen zusammenfügen, ergibt sich nach dem PCR-Zyklus, d. h. am Ende der Elongationsphase, als insgesamt in der Reaktionsflüssigkeit vorhandene Menge an DNA-Strangabschnitten $n_{i + 1} = n_{i} (1 + η \cdot q_{d, i} \cdot q_{a, i} \cdot q_{e, i})$
Die tatsächliche Anzahl der neuen DNA-Strangabschnitte liegt also im Fall des Vorliegens einer Blase in der Reaktionskammer unterhalb der theoretisch angenommenen Anzahl von DNA-Strangabschnitten.
Für jeden Zyklusschritt lässt sich nun eine Gesamtreaktionseffizienz berechnen $r_{i} = \frac{n_{i + 1}}{n_{i}}$
Diese Reaktionseffizienz kann wie in dem Ausführungsbeispiel der 6 als Skalierungsfaktor für den gemessenen Intensitätswert am Ende der Elongationsphase genutzt werden.
In Schritt S31 wird die so ermittelte Reaktionseffizienz in dem Zyklus als Skalierungsfaktor genutzt und die qPCR-Kurve mithilfe der korrigierten Intensitätswerte n_actual,i aus den gemessenen Intensitätswerten n_curve,i aufgebaut: $n_{a c t u a l, i} = \frac{n_{c u r v e, i}}{r_{i}}$
In Schritt S32 wird überprüft, ob das Messverfahren abgebrochen werden soll. Dies kann beispielsweise nach Erreichen eines Abbruchkriteriums, wie z.B. einer vorgegebenen Anzahl von Messzyklen, der Fall sein. Ist dies nicht der Fall (Alternative: Nein), so wird das Verfahren in Schritt S22 fortgesetzt, anderenfalls wird das Verfahren mit Schritt S33 beendet und eine Auswertung der korrigierten qPCR-Kurve vorgenommen.
Die Auswertung in Schritt S33 kann durch Klassifikation der korrigierten qPCR-Kurve mithilfe eines vorgegebenen Klassifikationsmodells erfolgen. Dadurch kann das bestimmt werden, ob die korrigierte qPCR-Kurve ein Vorhandensein oder ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt, d. h. angibt, ob der zu detektierenden DNA-Strangabschnitt in der Substanz enthalten ist oder nicht.

Claims

Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, mit folgenden Schritten: - Zyklisches Ausführen (S12; S22, S24, S26, S28) von qPCR-Zyklen; - Messen (S12, S29) der Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten; - Bestimmen einer Reaktionseffizienz (r_i) für jeden Zyklus; - Korrigieren (S13, S31) des Intensitätswerts jedes Zyklus abhängig von der für den betreffenden Zyklus bestimmten Reaktionseffizienz (r_i), um eine korrigierte qPCR-Kurve (S14, S31) zu erhalten; - Betreiben (S16, S33) des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Verlauf der korrigierten qPCR-Kurve.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das PCR-Verfahren durch Leiten einer Reaktionsflüssigkeit in eine Reaktionskammer (11, 12, 13), insbesondere in jedem Zyklus, durchgeführt wird, wobei die Reaktionseffizienz (r_i) abhängig von einer Fläche einer oder mehrerer Blasen in der Reaktionskammer (11, 12, 13), insbesondere der Reaktionskammer (13) für einen Elongationsprozess des PCR-Prozesses, bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein Bild der Reaktionskammer (11, 12, 13) mithilfe einer Kamera (14, 15, 16) aufgenommen wird, wobei die Fläche der einen oder den mehreren Blasen mithilfe von auf das Bild der Reaktionskammer (11, 12, 13) angewendeten Mustererkennungsverfahren bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Reaktionseffizienz (r_i) mithilfe der Helligkeit eines oder mehrerer Pixel des Bildes, die der Reaktionsflüssigkeit entsprechen, und des Anteils der Fläche der einen oder mehreren Blasen an der gesamten Fläche der Reaktionskammer (11, 12, 13) bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Reaktionseffizienz (r_i) abhängig von einer Fläche einer oder mehrerer Blasen in der Reaktionskammer (11, 12, 13) für mindestens zwei der PCR-Teilprozessschritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mithilfe der korrigierten qPCR-Kurve basierend auf einem Klassifikationsverfahren bestimmt wird, ob ein zu detektierenden DNA-Strangabschnitt vorhanden ist oder nicht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das qPCR-Verfahren betrieben wird, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, - signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, - der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt wird.
Vorrichtung zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, wobei die Vorrichtung ausgebildet ist, folgende Schritte auszuführen: - Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen; - Messen der Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten; - Bestimmen einer Reaktionseffizienz (r_i) für jeden Zyklus; - Korrigieren des Intensitätswerts jedes Zyklus abhängig von der für den betreffenden Zyklus bestimmten Reaktionseffizienz (r_i), um eine korrigierte qPCR-Kurve zu erhalten; - Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Verlauf der korrigierten qPCR-Kurve.
Computerprogramm, welches dazu eingerichtet ist, alle Schritte eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 auszuführen.
Elektronisches Speichermedium, auf welchem ein Computerprogramm nach Anspruch 9 gespeichert ist.