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Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft die Anwendung eines Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens (PCR-Verfahrens), insbesondere zur Detektion des Vorliegens eines Erregers. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Auswertung von qPCR-Messungen.
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Technischer Hintergrund
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Zur Detektion von DNA-Strangabschnitten in einer zu untersuchenden Substanz, wie beispielsweise einem Serum oder dergleichen, werden in automatisierten Systemen PCR-Verfahren durchgeführt. Die PCR-Systeme ermöglichen es, bestimmte zu detektierende DNA-Strangabschnitte, die z.B. einem Erreger zuzuordnen sind, zu amplifizieren und zu detektieren. Ein PCR-Verfahren umfasst generell eine zyklische Anwendung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation. Insbesondere wird beim PCR-Prozess ein DNA-Doppelstrang in Einzelstränge aufgespalten und diese jeweils durch Anlagerung von Nukleotiden wieder vervollständigt, um die DNA-Strangabschnitte in jedem Zyklus zu vervielfältigen.
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Das qPCR-Verfahren ermöglicht die Erregerlast, nachgewiesen mit diesem Prozess, zu quantifizieren. Dazu sind die Nukleotide zumindest teilweise mit Fluoreszenzmolekülen versehen, die bei Anbinden an den Einzelstrang des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts eine Fluoreszenzeigenschaft aktivieren.
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Nach dem Aufbau der Doppelstränge kann nach jedem Zyklus ein Intensitätswert einer Fluoreszenz ermittelt werden, der von der Anzahl der erzeugten DNA-Strangabschnitte abhängt.
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Im Laufe der Amplifikation kann dann aus den ermittelten Intensitätswerten eine qPCR-Kurve ermittelt werden, die bei Vorliegen des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz einen sigmoidförmigen Verlauf hat. Die gemessenen qPCR-Kurven können in der Realität mit Artefakten behaftet sein, so dass in der Regel mehrere parallele Messungen durchgeführt werden, um durch eine Mittelwertbildung der Messwerte eine genauere Auswertung der qPCR-Kurven zu ermöglichen.
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Insbesondere ist es wünschenswert, anhand einer gemessenen qPCR-Kurve zu erkennen, ob eine Amplifikation von DNA-Strangabschnitten stattgefunden hat, und wenn ja, eine Abschätzung über eine Anfangskonzentration des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts vorzunehmen.
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Offenbarung der Erfindung
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Erfindungsgemäß sind ein Verfahren zum Durchführen eines qPCR-Verfahrens gemäß Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung und ein qPCR-System gemäß den nebengeordneten Ansprüchen vorgesehen.
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Weitere Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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Gemäß einem ersten Aspekt ist ein Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren vorgesehen, mit folgenden Sch ritten:
- - Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen
- - Messen eines Intensitätswertes nach oder während jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten;
- - Erstellen einer Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion abhängig von den Intensitätswerten;
- - Feststellen eines Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts abhängig von dem Vorliegen eines oder mehrerer Merkmale der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion;
- - Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Vorhandensein oder Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts.
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Das qPCR-Verfahren weist eine zyklische Wiederholung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation auf. Bei der Denaturierung wird bei einer hohen Temperatur die gesamte doppelsträngige DNA in der zu untersuchenden Substanz in zwei Einzelstränge aufgespalten. In dem Schritt des Annealing wird an die Einzelstränge einer der zugegebenen Primer angebunden, die den Startpunkt der Amplifizierung der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte vorgeben. Bei dem Schritt der Elongation wird ein zweiter komplementärer DNA-Strangabschnitt aus freien Nukleotiden auf den mit dem Primer versehenen Einzelsträngen aufgebaut. Nach jedem dieser Zyklen hat sich also idealerweise die DNA-Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte verdoppelt.
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Durch die Anwendung des qPCR-Verfahrens werden in die zu detektierenden DNA-Strangabschnitte Fluoreszenzmoleküle als Marker eingebaut, so dass über eine Messung der Intensität der Fluoreszenz nach jedem Elongationsschritt ein zeitlicher Verlauf der Intensitätswerte ermittelt werden kann. Die so erhaltene qPCR-Kurve weist dabei drei distinkte Phasen auf, nämlich eine Baseline, in der die Intensität der Fluoreszenz des von eingebauten Markern emittierten Fluoreszenzlichts noch nicht von der Hintergrund-Fluoreszenz zu unterscheiden ist, einer exponentiellen Phase, in der die Fluoreszenzintensität über die Baseline ansteigt, also sichtbar wird, wobei durch die Verdoppelung der DNA-Stränge in jedem Zyklus das Fluoreszenzsignal proportional zur Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte exponentiell ansteigt, und einer Plateau-Phase, in der die Reagenzien, d. h. der Primer und die freien Nukleotide, nicht mehr in den benötigten Konzentrationen vorhanden sind und keine weitere Verdoppelung stattfindet.
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Für den Nachweis eines vorgegebenen zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, der beispielsweise einem Erreger entsprechen kann, ist hierbei der sogenannte ct (cycle threshold)-Wert maßgeblich. Der ct-Wert bestimmt den Beginn der exponentiellen Phase und wird durch Überschreiten eines spezifischen Grenzwerts, der für den jeweils zu detektierenden DNA-Strangabschnitt festgelegt ist und der für alle Proben für den zu detektierenden DNA-Strangabschnitt identisch ist, ermittelt oder rechnerisch durch die zweite Ableitung der qPCR-Kurve in der exponentiellen Phase ermittelt und dem Intensitätswert des steilsten Anstiegs der qPCR-Kurve entspricht. Ist der Zielwert bekannt, kann durch Rückrechnung die Anfangskonzentration des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz bestimmt werden.
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In der Realität sind die qPCR-Kurven sehr ungenau und erheblichen Schwankungen unterworfen. Es kann ein Baseline-Drift auftreten, mit der das Ansteigen der Hintergrundfluoreszenz über die Messzyklen bezeichnet wird. Das heißt, dass, selbst wenn keine Amplifikation stattfindet, das Fluoreszenzsignal ansteigt. Weitere Einflussfaktoren, die sich negativ auf die Genauigkeit der qPCR-Kurve auswirken, können beispielsweise aus thermischem Rauschen, Schwankungen in der Reagenzkonzentration, Lufteinschlüsse und Artefakten im Fluoreszenzvolumen resultieren.
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In herkömmlichen qPCR-Systemen findet einerseits eine softwarebasierte Korrektur der qPCR-Kurven statt, andererseits kann vorgesehen sein, eine Probe unter gleichen Bedingungen mehrfach zu messen und die resultierenden qPCR-Kurven durch Mittelwertbildung geglättet. Dies erfordert jedoch einen erhöhten Aufwand.
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Eine Idee des obigen Verfahrens besteht darin, mithilfe einer Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion das Vorliegen eines sigmoiden oder linearen Verlaufs der qPCR-Kurve festzustellen. Die Verwendung der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion kann auch bei stark rauschbehafteten qPCR-Kurven zuverlässig vorhersagen, ob eine Amplifikation, d. h. eine Vervielfältigung, des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts aufgetreten ist oder ob die qPCR-Kurve lediglich aufgrund einer Baseline-Drift ansteigt.
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Die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion zeigt an, mit welcher Häufigkeit ein Intensitätswert vorkommt. Dazu wird für die einzelnen Stützpunkte der qPCR-Kurve, d. h. für jeden Intensitätswert der gemessenen qPCR-Kurve, eine Gauß-Verteilung um den gemessenen Intensitätswert angenommen. Aufgrund der sigmoiden Form einer Vorhandenseins-qPCR-Kurve, d.h. einer qPCR-Kurve, bei der ein DNA-Strangabschnitt vervielfältigt worden ist, weist die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion sowohl im Bereich der Baseline als auch in der Plateauphase mehrere Zyklen mit ähnlichen Intensitätswerten auf. Daher wird die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion einer Vorhandenseins-qPCR-Kurve zwei Maxima mit einem dazwischenliegenden Minimum aufweisen.
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Bei einer Nicht-Amplifikation, woraus sich eine Nichtvorhandenseins-qPCR-Kurve ergibt, d.h. einer qPCR Kurve, bei der kein DNA-Strangabschnitt vervielfältigt worden ist, wird der Verlauf der qPCR-Kurve lediglich durch das Ansteigen der Baseline bestimmt. Dies führt zu dem Ausbilden nur eines Maximums in der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion.
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Insbesondere kann auf einen sigmoiden Verlauf der qPCR-Kurve geschlossen werden, wenn das Maximum bei niedrigen Intensitätswerten höher ist als bei hohen Intensitätswerten, ein Verhältnis des zwischen den Maxima liegenden Minimum zu dem ersten Maximums einen vorbestimmten Schwellenwert unterschreitet und die Breite des Peaks um das zweite Maximum relativ groß ist.
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Das obige Verfahren ermöglicht es in zuverlässiger Weise, zu erkennen, ob eine Amplifikation stattgefunden hat.
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Wird erkannt, dass die qPCR-Kurve eher einem sigmoiden Verlauf anstatt einem linearen Verlauf entspricht, so kann eine Sigmoid-Funktion an die qPCR-Kurve gefittet werden und die Parameter der Sigmoidfunktion zur Bestimmung eines ct-Werts verwendet werden. Dies ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung eines ct-Werts auch bei sehr rauschbehafteten qPCR-Kurven im Amplifikationsfall.
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Weiterhin kann die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion abhängig von modifizierten Intensitätswerten erstellt werden, wobei die modifizierten Intensitätswerte von den Intensitätswerten abhängen oder diesen entsprechen, die um einen Anteil der Fluoreszenz einer Baseline-Drift des PCR-Verfahrens korrigiert ist.
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Insbesondere kann der Anteil der Fluoreszenz der Baseline-Drift ermittelt werden, indem mithilfe eines k-means-Algorithmus die Intensitätswerte, die einem Baseline-Bereich der q-PCR-Kurve zuzuordnen sind, ermittelt werden, wobei die dem Baseline-Bereich zuzuordnenden Intensitätswerte mithilfe einer linearen Interpolation linearisiert werden und wobei und anschließend der Verlauf der linearisierten Intensitätswerte der Baseline-Drift von der gemessenen qPCR-Kurve subtrahiert wird.
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Gemäß einer Ausführungsform können die modifizierten Intensitätswerte ermittelt werden, indem die gemessene qPCR-Kurve mithilfe eines Filters, insbesondere eines Moving-Average-Filters, geglättet wird.
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Es kann vorgesehen sein, dass das Feststellen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts abhängig von dem Vorliegen mindestens eines der folgenden Merkmale der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion durchgeführt wird:
- - das Verhältnis des Funktionswerts der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion des ersten Maximums zum Funktionswert des zweiten Maximums ist größer 1;
- - das Verhältnis des Funktionswerts des zwischen den Maxima liegenden lokalen Minimum zum Funktionswert des ersten Maximums ist kleiner als 0,7, insbesondere kleiner als 0,6, und
- - die Breite des Peaks in der Dichtefunktion um das zweite Maximum größer als ein vorgegebener Referenzwert ist, wobei die Breite des Peaks als die Breite des Peaks nach der sogenannten „half-prominence method“ bestimmt werden kann. Bei dieser Methode wird die zunächst die Hälfte des Zahlenwertes des Maximums bestimmt. Als Halbmittelpunkt wird dann der Punkt bezeichnet, welcher sich auf horizontaler (X-) Höhe gleich mit dem Maximum befindet und auf vertikaler (Y) Höhe den halben Zahlenwert des Maximums besitzt. Dann werden die Schnittpunkte zwischen der Dichtekurve und einer horizontalen Gerade durch den Halbmittelpunkt bestimmt. Der Abstand der beiden dem Halbmittelpunkt nächstliegenden Punkten bestimmt dann die Breite des Peaks als Referenzwert.
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Weiterhin kann das qPCR-Verfahren betrieben werden, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts,
- - signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, und/oder
- - der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt wird.
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Figurenliste
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Ausführungsformen werden nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung eines Zyklus eines PCR-Verfahrens;
- 2 eine schematische Darstellung einer typischen qPCR-Kurve mit einem Intensitätswerteverlauf;
- 3 ein gemessener Verlauf einer qPCR-Kurve;
- 4a und 4b ideale Verläufe der qPCR-Kurve für den Fall einer nicht nachweisbaren Substanz bzw. einer nachweisbaren Substanz; und
- 5 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung;
- 6 die Gauß-Verteilungen der einzelnen modifizierten Intensitätswerte sowie die daraus resultierende Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion für eine gemessene Vorhandenseins-qPCR-Kurve; und
- 7a und 7b zeigen für eine ideale Vorhandenseins-qPCR-Kurve und eine ideale Nichtvorhandenseins-qPCR-Kurve die Ausprägung der entsprechenden Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion.
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Beschreibung von Ausführungsformen
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1 zeigt eine schematische Darstellung eines an sich bekannten PCR-Verfahrens mit den Schritten der Denaturierung des Annealing und der Elongation.
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In dem Schritt des Annealing S1 wird bei einer hohen Temperatur von beispielsweise über 90°C die doppelsträngige DNA in einer Substanz in zwei Einzelstränge aufgebrochen. In einem nachfolgenden Annealing-Schritt S2 wird an die Einzelstränge an einer bestimmten DNA-Position, die einen Beginn eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts markiert, ein sogenannter Primer angebunden. Dieser Primer stellt den Startpunkt einer Amplifizierung des DNA-Strangabschnitts dar. In einem Elongationsschritt S3 wird beginnend an der von dem Primer markierten Position aus der Substanz zugesetzten freien Nukleotiden der komplementäre DNA- Strangabschnitts an den Einzelsträngen aufgebaut, so dass am Ende des Elongationsschrittes die zuvor aufgespaltenen Einzelstränge zu vollständigen Doppelsträngen ergänzt worden sind.
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Durch Versehen der freien Nukleotide bzw. des Primers mit Fluoreszenzmolekülen, die nur in dem an den DNA-Strangabschnitt gebundenen Zustand Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, ist es möglich, durch Ermitteln einer Intensität einer Fluoreszenz im Anschluss an den Elongationsschritt S3 einen Intensitätswert durch eine geeignete Messung zu erhalten. Der gemessenen Intensität des Fluoreszenzlichts wird ein Intensitätswert zugeordnet.
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Das Verfahren der Schritte S1 bis S3 wird zyklisch ausgeführt und die Intensitätswerte aufgezeichnet, um einen Intensitätswerteverlauf als eine qPCR-Kurve zu erhalten.
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Der Intensitätswerteverlauf hat im Idealfall einen Verlauf, der in 2 dargestellt ist. 2 zeigt einen Verlauf einer normalisierten Intensität über dem Zyklusindex Z. Dieser Verlauf unterteilt sich in drei Abschnitte, nämlich einen Baseline-Abschnitt B, in dem die Fluoreszenz der eingebauten Fluoreszenzmoleküle noch nicht von einer Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden ist, einen exponentiellen Abschnitt E, in dem die Intensitätswerte sichtbar sind und exponentiell ansteigen, und in einem Plateau-Abschnitt P, in dem sich der Anstieg der Intensitätswerte abflacht, da die verwendeten Reagenzien (Lösung mit Nukleotiden) aufgebraucht sind und keine weitere Anbindung an aufgebrochenen Einzelsträngen stattfindet.
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In 3 ist beispielhaft ein bei einer realen Messung erhaltener Verlauf der Intensitätswerte als qPCR-Kurve dargestellt. Man erkennt starke Schwankungen, die sich aus einer Hintergrundfluoreszenz, thermisches Rauschen, Schwankungen in den Reagenzkonzentrationen sowie Bläschen und Artefakte im Fluoreszenzvolumen ergeben können. Man erkennt, dass die Bestimmung des Baseline-Abschnitts, des exponentiellen Abschnitts und des Plateau-Abschnitts der qPCR-Kurve nicht ohne weiteres möglich ist.
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4a und 4b zeigen ideale Verläufe einer qPCR-Kurve ohne Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts bzw. mit Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts.
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In 5 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Auswerten einer qPCR-Kurve dargestellt. Das Verfahren kann auf einer Datenverarbeitungseinrichtung ausgeführt werden, die einen qPCR-Prozess auf einem qPCR-System und die von einem qPCR-System mit jedem Zyklus einen Intensitätswert, der die Intensität einer Fluoreszenz einer Substanz angibt, bereitstellt. In der Datenverarbeitungseinrichtung kann das nachfolgend beschriebene Verfahren in Software und/oder Hardware implementiert sein.
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Im Schritt S11 wird eine qPCR-Kurve mit den Intensitätswerten einer qPCR-Messung in einem qPCR-System bereitgestellt. Die Intensitätswertmessung wird üblicherweise durch Erfassung einer Probe mit einer Kamera und Auswertung von Grauwertstufen bzw. Farbstufen und Intensitätswerten vorgenommen.
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In Schritt S12 wird die gemessene qPCR-Kurve mithilfe eines Filters, insbesondere eines Moving-Average-Filters, geglättet, indem für jeden Wert der Mittelwert des Werts und den Werten der unmittelbaren darauf und danach folgend aufgezeichneten Intensitätswerte angenommen wird, wie beispielsweise der vorausgehenden und nachfolgenden zwei bis fünf Nachbarwerten, angenommen.
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In Schritt S13 wird mithilfe eines Clustering-Algorithmus eine Bestimmung von drei Kurvenbereichen, Baseline-Bereich, Exponentialbereich und Plateauphasenbereich, vorgenommen. Dazu werden initial ein Baseline-Zentroid, ein Exponentialbereich-Zentroid und ein Plateaubereich-Zentroid in dem Diagramm der qPCR-Kurve platziert. Die Positionen der initialen Zentroide kann aufgrund der Kenntnis des Verlaufs der Sigmoidfunktion in dessen ungefähre Positionen angeordnet werden. Mit dem Vorwissen, dass sich der Baseline-Bereich bei niedrigen Intensitätswerten, der Exponentialbereich bei mittleren Intensitätswerten und der Plateaubereich bei hohen Intensitätswerten befindet, können der Baseline-Zentroid C1, der Exponentialbereich-Zentroid C2 und der Plateaubereich-Zentroid C3 platziert werden. Anschließend wird jeder Punkt auf der gemessenen qPCR-Kurve dem nächstgelegenen Zentroid zugeordnet und dadurch klassifiziert.
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Der k-Means-Algorithmus sieht eine iterative Anpassung der Zentroidpunkte C vor, indem ein Mittelwert der Messpunkte der qPCR-Kurve, die einem jeweiligen Zentroid zugeordnet sind, gebildet wird.
(S
k: Anzahl der dem jeweiligen Zentroid zugeordneten Messpunkte) Die Messpunkte der qPCR-Kurve können nun erneut den geänderten Zentroidpunkten zugeordnet werden mithilfe der Abstandsermittlung
und mit
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Dieses Verfahren wird iterativ ausgeführt, bis sich keine Änderung der Zuordnung von Punkten zu Clustern mehr ergibt oder eine maximale Zahl von Iterationen erreicht wurde.
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Nachfolgend wird erneut jeder Messpunkt der gemessenen qPCR-Kurve dem jeweils neu ermittelten Zentroidpunkt des Baseline-Zentroids, des Exponentialbereich-Zentroids und des Plateaubereich-Zentroids zugeordnet.
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In Schritt S14 kann aus den Punkten der qPCR-Kurve, die dem Baseline-Bereich, d. h. dem ermittelten Baseline-Zentroidpunkt zugeordnet sind, durch Interpolation eine lineare Kurve der Intensitätswerte erstellt werden. Der Verlauf der linearisierten qPCR-Baseline-Kurve entspricht dem Einfluss des Baseline-Verlaufs auf die gesamte qPCR-Messung. Somit wird die linearisierte qPCR-Baseline-Kurve von der gesamten gemessenen qPCR-Kurve subtrahiert. Damit ist der Baseline-Anstieg aus der qPCR-Kurve eliminiert.
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Im nächsten Schritt S15 wird die verbliebene qPCR-Kurve normiert, so dass die Punkte der qPCR-Kurve als modifizierte Intensitätswerte zwischen 0 und 1 liegen.
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Anschließend wird in Schritt S16 eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion erstellt. Diese zeigt die Wahrscheinlichkeiten des Auftretens von modifizierten Intensitätswerten in der normierten linearisierten qPCR-Kurve an. Dazu wird der modifizierte Intensitätswert für jeden Zyklus mit einer Gaußschen Verteilung um den entsprechenden modifizieren Intensitätswert versehen. Die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion entspricht der Summe aller Gaußschen Verteilungen der modifizierten Intensitätswerte.
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Bei einer erfolgreichen Amplifikation liegen sowohl in dem Baseline-Bereich als auch in dem Plateau-Bereich mehrere Zyklen mit ähnlichen modifizierten Intensitätswerten vor. Dies führt bei der Summierung der Gaußverteilungen zur Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion zu zwei charakteristischen Maxima. Bei einer Nicht-Amplifikation bestimmt dagegen nur die Baseline den Verlauf der qPCR-Kurve, so dass im Wesentlichen keine Ausprägung von zwei Maxima zu erwarten ist.
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Das Diagramm der 6 zeigt beispielhaft die Gauß-Verteilungen der einzelnen modifizierten Intensitätswerte x sowie die daraus resultierende Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion PDF für eine gemessene Vorhandenseins-qPCR-Kurve.
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7a und 7b zeigen für eine ideale Vorhandenseins-qPCR-Kurve und eine ideale Nichtvorhandenseins-qPCR-Kurve (jeweils linke Kurve mit dem modifizierten Intensitätswert F aufgetragen über dem Zyklusindex z) die Ausprägung der entsprechenden Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion (rechte Kurve).
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Durch Rauschen im nicht-amplifizierten Fall können ebenfalls zwei Maxima der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion auftreten. Dennoch können der Amplifikations- und der Nicht-Amplifikationsfall unterschieden werden bei Vorliegen mindestens eines der nachfolgenden Kriterien:
- - Das Maximum der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion für geringe Intensitätswerte ist höher als das Maximum der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion für höhere Intensitätswerte;
- - zwischen den beiden Maxima ist ein ausgeprägtes lokales Minimum.
- - Die Breite des zweiten Maximums ist relativ hoch.
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In Schritt S17 wird überprüft, ob die resultierende Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion auf eine Vorhandenseins-qPCR-Kurve zurückgeht. Dies kann durchgeführt werden, indem überprüft wird, ob das Verhältnis der Höhe (Funktionswert der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion) des ersten Maximums zur Höhe des zweiten Maximums größer 1 ist, das Verhältnis der Höhe des zwischen den Maxima liegenden lokalen Minimum zur Höhe des ersten Maximums kleiner als 0,7, insbesondere kleiner als 0,6 ist, und dass die Breite des Peaks um das zweite Maximum größer als ein Referenzwert, wie z.B. 8 ist.
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Die Breite des Referenzwerts ergibt sich bei der Verwendung der sog. „width half prominence“ Methode bei einer Wahrscheinlichkeitsdichteverteilung, die auf einer normierten Skala von 0 bis 100 aufgetragen ist. Bei dieser Methode wird zunächst die Hälfte des Zahlenwertes des Maximums bestimmt. Als Halbmittelpunkt wird dann der Punkt bezeichnet, welcher sich auf horizontaler (X-) Höhe gleich mit dem Maximum befindet und auf vertikaler (Y) Höhe den halben Zahlenwert des Maximums besitzt. Dann werden die Schnittpunkte zwischen der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion und einer horizontalen Gerade durch den Halbmittelpunkt bestimmt. Der Abstand der beiden dem Halbmittelpunkt nächstliegenden Punkten bestimmt dann die Breite des Peaks. Je nach Verwendung von unterschiedlichen Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen und Methoden zur Auftragung der Dichte kann der Referenzwert verschieden sein.
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Wird in Schritt
S17 festgestellt, dass die resultierende Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion auf eine Vorhandenseins-qPCR-Kurve zurückgeht (Alternative: Ja), kann in Schritt
S18 eine sigmoide Funktion an die qPCR-Kurve gefittet werden gemäß folgender Vorschrift:
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Im nächsten Schritt S19 kann nun der ct-Wert durch das Maximum der zweiten Ableitung der gefitteten sigmoiden Funktion in an sich bekannter Weise bestimmt werden.
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Wird in Schritt S17 festgestellt, dass die resultierende Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion auf eine Vorhandenseins-qPCR-Kurve zurückgeht (Alternative: Nein), kann in Schritt S20 ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden Strangabschnitts signalisiert werden.