DE102020117091A1

DE102020117091A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines Vakzins

Info

Publication number: DE102020117091A1
Application number: DE102020117091.2A
Authority: DE
Inventors: Christoph Grevener; Petra Lawrence
Original assignee: EcoEnterprises GmbH
Current assignee: EcoEnterprises GmbH
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2021-12-30

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzins (1) basierend auf einer Inaktivierung eines Virus (2), umfassend folgende Verfahrensschritte:(a) Herstellen einer das Virus (2) enthaltenden Gewebekulturflüssigkeit (6)(b) Erzeugen eines Films (5) aus der Gewebekulturflüssigkeit (6)(c) Inaktivieren des Virus (2) im Film (5)(d) Gewinnen des Vakzins (1) aus dem Film (5).Der Film (5) aus der Gewebekulturflüssigkeit (6) wird erzeugt, indem die Gewebekulturflüssigkeit mit einer Applikationseinrichtung (24) einer Vorrichtung (3) auf eine Oberfläche (8) einer Folie (4) appliziert wird, wobei eine Schichtdicke (19) des Films mithilfe eines ersten Reglers (34), eines Schichtdickenmessgeräts (35) und einer ersten Dosiereinrichtung (30) geregelt wird. Das im Film (5) enthaltene Virus (2) wird inaktiviert, indem der Film von einem UV-Licht (7) einer Inaktivierungseinrichtung (38) der Vorrichtung (3) mit einer Strahlungsdosis (47) beaufschlagt wird, wobei die Strahlungsdosis (47) mithilfe eines zweiten Reglers (48), einem Strahlungsmessgerät (43) und einer zweiten Dosiereinrichtung (50) geregelt wird. Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung für das Verfahren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzins nach den Ansprüchen 1 bis 10. Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung zur Herstellung des Vakzins nach den Ansprüchen 11 bis 14.
Impfungen gehören zu den wichtigsten und wirksamsten präventiven Maßnahmen, die in der Medizin zur Verfügung stehen. In Bezug auf den Ausbruch des neuen Corona-Virus SARS-CoV-2, auch als Covid-19 bekannt, kommt einer schnellen Impfstoffbereitstellung hohe Priorität zu.
Solange ein Impfstoff nicht zur Verfügung steht, wird die weitere Ausbreitung des Virus erst dann zum Erliegen kommen, wenn sich ca. 60 bis 70 Prozent infiziert und damit eine Grundimmunität gegen dieses Virus entwickelt haben (sog. Herdenimmunität). Der damit verbundene volkswirtschaftliche Schaden und die Zahl möglicher Todesopfer könnten immens sein. Es gilt daher, rasch Impfstoffe bereitzustellen, mit denen nicht nur Menschen mit Risikofaktoren, sondern möglichst große Teile der Bevölkerung in kürzester Zeit immunisiert werden können.
Dementsprechend ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem sich große Impfstoffmengen reproduzierbar, sicher und schnell herstellen lassen. Das Verfahren soll auch für den Laboreinsatz geeignet sein. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den in Anspruch 1 angegebenen Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 10.
Aufgabe dieser Erfindung ist zudem, eine Vorrichtung für das erfindungsgemäße Verfahren vorzuschlagen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung mit den in Anspruch 11 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche 12 bis 14.
Zwar betrifft die Erfindung, aus gegebenem Anlass, primär Verfahren und Vorrichtung für ein Vakzin gegen Covid-19, soll jedoch auch zur Herstellung anderer Vakzine anwendbar sein.
Grundsätzlich lassen sich Impfstoffe in drei große Klassen einteilen: lebendattenuierte Impfstoffe mit Vektorviren, Totimpfstoffe mit Virusproteinen und genbasierte Impfstoffe mit ausgewählten Genen des Virus in Form von mRNA bzw. DNA. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines Totimpfstoffs, insbesondere eines Totimpfstoffs gegen das Corona-Virus SARS-CoV-2.
Totimpfstoffe basieren entweder auf inaktivierten Erregern, auf aufgereinigten Antigenen von Bakterien oder Viren oder auf inaktivierten Toxinen, die von Bakterien ausgeschieden werden. Erfindungsgemäßes Verfahren und entsprechende Vorrichtung zielen darauf ab, den benötigten Impfstoff durch Inaktivierung von SARS-CoV-2-Erregern herzustellen.
Inaktivierte Erreger als Impfantigene präsentieren dem Immunsystem alle denkbaren bakteriellen oder viralen Epitope. Jedoch ist der Erreger durch die Inaktivierung weder in der Lage, sich zu teilen, noch die Erkrankung auszulösen. Wegen der Teilungsunfähigkeit besteht auch kein Restrisiko für ein Revertieren zum Pathogen, wie dies bei Lebendimpfstoffen der Fall sein kann. Voraussetzung für die Konzeption eines derartigen Impfstoffs ist allerdings, dass keine toxischen Komponenten vorhanden sind und dass tatsächlich die gesamte zur Impfstoffproduktion eingesetzte Population des Erregers ohne Verlust der Antigenität wichtiger Strukturen inaktiviert, also abgetötet wurde.
Der Herstellungsprozess gleicht zumindest in den ersten Schritten dem der Herstellung von lebend-attenuierten Impfstoffen. Allerdings wird zusätzlich der extrem wichtige Inaktivierungsschritt angehängt. Hierzu werden vor allem die im Erreger enthaltenen Proteine mit- und untereinander vernetzt, wobei meist Formaldehyd oder ß-Propiolacton als Vernetzungsagenzien dienen. Bei umhüllten Viren hat diese Form der Inaktivierung zur Folge, dass sich vermehrungsrelevante spezifische Oberflächenreaktionen derart verändern, das ein Eindringen des Virus in gesunde Zellen nicht mehr möglich ist. Das genetische Material im Virusinnern - eine Nukleinsäure vom Typ DNA (Desoxyribonukleinsäure) oder, wie bei SARS-CoV-2, vom Typ RNA (Ribonukleinsäure) - bleibt davon zunächst unbeeinflusst.
Es ist bekannt, dass das Corona Virus SARS-CoV-2 über ein Glycoprotein (S) auf der Virusoberfläche - auch Spike-Protein genannt - an den ACE2-Rezeptor der menschlichen Zelle andockt und auf diese Weise in die Zelle gelangt. Somit ist das Spike-Glycoprotein (S) - neben einem Membranprotein (M) sowie einem Nukleokapsidprotein (N) im Virusinneren - als Schlüsselprotein ein zentrales Antigen bei der Impfstoffentwicklung.
Veränderungen dieser Proteine im Zuge der Inaktivierung können eine zu schwache Immunantwort zur Folge haben und dazu führen, dass nicht genügend Antikörper gebildet werden. So ist bei SARS-CoV-2 inzwischen bekannt, dass das Spike-Protein dem Immunsystem in einer ganz bestimmten Konformation angeboten werden muss, damit schützende Antikörper gebildet werden. Um einer zu schwachen Immunantwort entgegenzuwirken wird meist versucht, diese Abschwächung über eine höhere Impfstoffdosierung und Hinzufügen von Adjuvantien zu kompensieren. Das kann jedoch unerwünschte Nebenwirkungen verursachen und dazu führen, dass bei Inaktivierung mit Vernetzungsagenzien häufig kein adäquater Impfstoff hergestellt werden kann.
Erfindungsgemäßes Verfahren basiert nicht auf der Inaktivierungswirkung von Vernetzungsagenzien, sondern auf der von UV-Licht. UV-Licht ist elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen zwischen 100 und 400 Nanometer. Diese lässt sich untergliedern in UV-A-Strahlung (400 - 315 nm), UV-B-Strahlung (315 - 280 nm) und UV-C-Strahlung (280 - 100 nm). Vor allem die kurzwellige UV-C-Strahlung besitzt stark zellschädigende Wirkung, die sich gezielt auch zur Vireninaktivierung nutzen lässt. Die UV-Strahlen brechen durch Resonanzen vor allem die Bindungen der Nukleinsäuren (RNA bzw. DNA) auf und verändern diese derart, dass eine Replikation unmöglich wird. Der Wirkungsmechanismus unterscheidet sich damit grundlegend von der Inaktivierung mit Vernetzungsagenzien.
Verfahren zur Inaktivierung von Bakterien, Viren und anderen Mikroorganismen mittels Bestrahlung sind vom Stand der Technik bekannt. So werden Quecksilberdampflampen, die UV-Licht mit einer charakteristischen Wellenlänge von 253,7 Nanometern emittieren, erfolgreich bei der Desinfektion kontaminierter Oberflächen sowie zur Entkeimung von Trinkwasser oder Atemluft eingesetzt.
Inzwischen ist bekannt, dass eine Wellenlänge von 265 Nanometer eine noch bessere Desinfektionsleistung ermöglicht, wobei dafür spezielle Lichtquellen in Entwicklung sind (Quelle: Fraunhofer-Institut für Optronik, Systemtechnik und Bildauswertung).
Auch andere Formen von Strahlung, wie Gammastrahlen oder auch beschleunigten Elektronen, sind zur Inaktivierung geeignet.
Die Herausforderung bei der Inaktivierung von Impfstoffen mittels Bestrahlung besteht grundsätzlich darin, die Strahlung so zu dosieren, dass alle Virusteilchen zuverlässig abgetötet werden, ohne jedoch deren Antigenität zu beeinträchtigen. Letzteres ist eine gegenläufige Anforderung, die bei reinen Desinfektionsaufgaben mit UV-Licht nicht besteht, so dass eine korrekte Dosierung dort wesentlich einfacher zu realisieren ist.
Aus einer Veröffentlichung des Bundesgesundheitsamtes „Zweites Gutachten über den Stand der Schutzimpfung gegen die spinale Kinderlähmung“, erschienen 1959 im Springer-Verlag, geht auf Seite 126 hervor, dass es - Zitat - „heute technisch möglich ist, mit UV-Bestrahlung einen Impfstoff aus inaktiviertem Virus mit genügend hoher antigener Wirksamkeit herzustellen. Die Probleme liegen an denselben Punkten wie bei der formaldehydinaktivierten Vakzine. Die Schädigung darf nicht zu weit getrieben werden, um nicht die antigene Wirksamkeit zu mindern. Andererseits muss gesichert sein, dass alle Virusteilchen irreversibel inaktiviert sind“.
Bei der veröffentlichten Untersuchung wurde ein Zentrifugalfilm einer Poliomyelitis-Gewebekulturflüssigkeit von 18 bzw. 25 Mikrometer mit UV-C-Licht einer Wellenlänge von 2537 Angström (253,7 Nanometer) bestrahlt. Der Zentrifugalfilm soll - so die Veröffentlichung - eine genaue und gleichmäßige Strahlenexposition der zu inaktivierenden Viren ermöglichen, indem sich die Dicke des Films über Drehzahl, Durchlaufgeschwindigkeit und Impfstoffmenge genau einstellen lässt.
Wegen geringer Eindringtiefen kurzwelliger UV-C-Strahlen beeinflusst die Dicke des Films unmittelbar eine Strahlendosis auf die Virusteilchen und damit die Impfstoffqualität. Ist die Filmdicke zu groß, werden Virusteilchen in tieferliegenden Schichten der Flüssigkeit nicht mit der erforderlichen Dosis beaufschlagt und demzufolge nicht vollständig abgetötet. Wird die Dosis erhöht, so dass genügend Strahlung auch in die tieferen Schichten vordringt, kann die Antigenität oberflächennaher Virusteilchen beeinträchtigt sein. Gleiches Problem besteht, wenn die Filmdicke im Hinblick auf die eingesetzte Strahlendosis zu gering ist.
Diese Dosierungsproblematik hat man bei o.g. Untersuchungen durch einen zusätzlichen Wärmeinaktivierungsschritt nach der UV-Bestrahlung gelöst (37 bis 40 Grad Celsius für 3 bis 20 Tage). Dadurch konnte die UV-Dosis reduziert und ein Nachlassen der antigenen Wirkung durch zu intensive UV-Bestrahlung vermieden werden.
Nach einer weiteren Veröffentlichung „A subcutaneously injected UV-inactivated SARS coronavirus vaccine elicits systemic humoral immunity in mice‟, erschienen in der International Immunology, Band 16, Ausgabe 10, Oktober 2004, Seiten 1423 bis 1430, wurden zudem beim ursprünglichen Virus SARS-CoV-1 erfolgreich Versuche mit UV-Inaktivierung durchgeführt.
Dabei wurden mit 4,75 J/cm² UV-inaktivierte SARS-CoV-Viren mit und ohne Adjuvans (Aluminiumhydroxidgel) subkutan injiziert. Beobachtetet wurde, dass das UV-inaktivierte SARS-CoV-Virion ein hohes Maß an humoraler Immunität hervorrief, was zur Erzeugung von Langzeit-Antikörper-Sekretions- und Gedächtnis-B-Zellen führte. Mit Zugabe der Adjuvans wurde die Serum-IgG-Produktion gesteigert und erreichte ein ähnliches Niveau wie bei hyperimmunisierten Mäusen, obwohl es immer noch nicht ausreichte, Serum-IgA-Antikörper auszulösen. Insbesondere das SARS-CoV-Virion selbst konnte auch ohne Adjuvans eine langfristige Antikörperproduktion induzieren. In Mäusen ausgelöste Anti-SARS-CoV-Antikörper erkannten sowohl die Spike- als auch die Nukleokapsid-Proteine des Virus und konnten das Virus neutralisieren. Darüber hinaus induzierte das UV-inaktivierte Virion bei Restimulation mit inaktiviertem SARS-CoV-Virion eine regionale Lymphknoten-T-Zell-Proliferation und signifikante Niveaus der Zytokinproduktion (IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ und TNF-α) in vitro.
Somit könnte ein ganzes abgetötetes Virion als Antigenkandidat für einen SARS-Impfstoff dienen, um sowohl humorale als auch zelluläre Immunität hervorzurufen. Voraussetzung - so die Veröffentlichung - ist, dass ein nichttoxisches und wirksameres Adjuvans für den menschlichen Gebrauch verfügbar wird.
Obgleich diese Ergebnisse nicht unmittelbar auf SARS-CoV-2 übertragbar sind, könnten auch bei dieser neuen Form des Corona-Virus Potenziale im Hinblick auf eine UV-inaktivierte Vakzine bestehen. Dabei gilt es, wie einleitend erwähnt, eine Veränderung der Schlüsselproteine zu vermeiden. Das betrifft insbesondere das Spike-Protein, das in einer ganz bestimmten Konformation vorliegen muss, um schützende Antikörper zu bilden.
Im Zuge einer Patentrecherche wurde folgender Stand der Technik ermittelt:
In der WO 2005/003340 A2 wird eine UV-Bestrahlung in einem aus einer Lichtquelle und einer äußeren Umhüllung gebildeten Ringspalt vorgeschlagen, durch den die zu inaktivierende Flüssigkeit in direktem Kontakt mit der Lichtquelle hindurchgeleitet wird. Über den Spalt ist eine Filmdicke exakt definiert. Die Bestrahlung erfolgt mit Leuchtstofflampen, die mit einem breitbandigen Wellenlängenspektrum zwischen 275 und 305 Nanometer abstrahlen.
Obwohl die WO 2005/003340 A2 Perspektiven, beispielsweise bei der Blutwäsche, eröffnet, so bleibt doch anzumerken, dass der Spalt in der Flüssigkeit infolge von Reibung ein parabelförmiges Geschwindigkeitssprofil erzeugt, welches eine homogene UV-Beaufschlagung der Virusteilchen beeinträchtigt. Zudem bewirkt der Spalt einen Staudruck, der mit enger werdendem Spalt immer größer wird. Sehr dünne Flüssigkeitsfilme von wenigen Mikrometern Dicke sind damit kaum realisierbar. Das schränkt nutzbare Spektralbereiche und damit die Möglichkeiten bei der Impfstoffherstellung mittels Bestrahlung ein.
Ein Verfahren, bei dem eine Bestrahlung mit beschleunigten Elektronen überwacht wird, geht aus der DE 10 2016 110 672 A1 hervor. Die Überwachung erfolgt anhand von Lumineszenz eines in der Flüssigkeit enthaltenen Leuchtstoffs, wobei elektromagnetische Strahlung, insbesondere UV-Strahlung oder Licht eingesetzt wird. Die Flüssigkeit befindet sich in einem Gefäß aus einem nicht flexiblem Material, einem Behältnis aus flexiblem Material (Folienbeutel) oder wird über eine Vorrichtung mit einer Walze als Film ausgebildet. Die Flüssigkeit wird zwecks Inaktivierung so lange mit beschleunigten Elektronen beaufschlagt, bis ein erfasster Istwert einer die Lumineszenz charakterisierenden physikalischen Größe einem Sollwert entspricht. Der Leuchtstoff ist an dispergierte Partikel aus einem biokompatiblen Basismaterial (Kunststoff) angebunden bzw. darin eingebettet.
Diese für eine Bestrahlung mit beschleunigten Elektronen vorgesehene Überwachung ist auf eine Inaktivierung mit UV-Strahlung nicht übertragbar. Für UV-Licht wird ein neues Verfahren benötigt, mit dem eine Bestrahlung ohne Umweg über eine zweite Strahlenquelle direkt gemessen und geregelt werden kann. Das setzt eine regelbare Strahlenquelle voraus.
Zudem darf eine Gleichmäßigkeit der Bestrahlung mit UV-Licht nicht durch hydrodynamische Effekte im Flüssigkeitsfilm beeinflusst sein. Demzufolge wird nach einer anderen Möglichkeit der Filmerzeugung gesucht, wobei eine konstante Filmdicke gewährleistet sein muss.
Erfindungsgemäße Lösung lässt sich grob in vier Verfahrensschritte untergliedern:

(a) Herstellen einer das Virus enthaltenden Gewebekulturflüssigkeit
(b) Erzeugen eines Films aus der Gewebekulturflüssigkeit
(c) Inaktivieren des Virus im Film
(d) Gewinnen des Vakzins aus dem Film

Zunächst wird eine aufgereinigte Gewebekulturflüssigkeit aus konzentriertem Virus hergestellt. Das kann beispielsweise durch Amplifizierung von Viren in Vero-E6-Zellen und nachfolgende Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation erfolgen (Schritt a).
Die Gewebekulturflüssigkeit wird anschließend in einen Vorratsbehälter einer Applikationseinrichtung gefüllt. Die Applikationseinrichtung ist Bestandteil einer hermetisch gekapselten Vorrichtung, die vorzugsweise von einer Einhausung unter Unterdruck umgeben ist, so dass kein infektiöses Material nach außen gelangen kann.
In der Vorrichtung ist ein Trägermaterial angeordnet. Das Trägermaterial besteht aus einer Folie, vorzugsweise einer Kunststofffolie, und wird der Vorrichtung über eine Zuführeinrichtung als Blatt- oder Rollenware zugeführt. Mittels der Applikationseinrichtung wird die Gewebekulturflüssigkeit aus dem Vorratsbehälter auf die Folie mit einer geregelten Schichtdicke als dünner Film aufgetragen (Schritt b).
Durch Applikation der Gewebekulturflüssigkeit auf eine Folie lassen sich mit ausgewählten Applikationsverfahren sehr dünne hydrostatische Filme herstellen. Da der Film - anders als in der WO 2005/003340 A2 - relativ zum bewegten Trägermaterial ruht, treten in der Flüssigkeit keine hydrodynamischen Effekte und daher bei der Bestrahlung auch keine inhomogenen Dosierungsverteilungen auf. Demzufolge werden alle im Film enthaltenen Virusteilchen mit der gleichen Strahlungsdosis beaufschlagt.
In einer besonders vorteilhaften Ausführung besteht diese Folie aus einem transparenten Kunststoff mit hoher UV-Transmission, beispielsweise FEP (fluorinated ethylene propylene) oder PMMA (polymethyl methacrylate).
Zur Verbesserung einer Benetzung wird die Folie vor der Applikation der Gewebekulturflüssigkeit vorbehandelt. Das kann mithilfe einer Plasma-, Corona- bzw. Flamm-Vorbehandlung oder auch durch Auftragen einer UV-durchlässigen Vorbeschichtung erfolgen. Die Vorbehandlung kann mit einer Vorbehandlungseinrichtung in die Vorrichtung integriert sein oder auch in vorgelagerten Prozessen bei einem Folienzulieferer erfolgen. Eine Vorbehandlung wird am besten unmittelbar vor der Applikation der Gewebekulturflüssigkeit, d.h. innerhalb der Vorrichtung, durchgeführt. Eine Applikation der Vorbeschichtung findet demgegenüber vorzugsweise im Zuge einer Folienherstellung statt. Dabei können die gleichen Beschichtungsverfahren zum Einsatz kommen wie bei der Applikation der Gewebekulturflüssigkeit. Gießverfahren sind für die Vorbeschichtung besonders gut geeignet, v.a., wenn diese aus einer dünnen Gelatineschicht besteht. Auf diese Weise wurde in der Vergangenheit silberbasiertes Fotopapier für die Analogfotographie hergestellt.
Aufgrund der geringen Eindringtiefe von UV-C-Licht liegt eine Soll-Schichtdicke des applizierten Films vorzugsweise zwischen 5 und 25 Mikrometer, in Sonderfällen und bei Einsatz von UV-B-Strahlung können auch höhere Schichtdicken von 50 Mikrometer und mehr zur Anwendung kommen. An einem Regler lässt sich die Soll-Schichtdicke einschließlich einer Schichtdickentoleranz genau einstellen. Werden vom Regler Soll-/Ist-Abweichungen festgestellt, regelt der Regler die Schichtdicke über einen Regelkreis nach, bis die Soll-/Ist-Abweichung innerhalb der eingestellten Toleranz liegt. Dazu wird eine Ist-Schichtdicke des applizierten Films gemessen und mit der eingestellten Soll-Schichtdicke verglichen. Sofern sich die Ist-Schichtdicke nicht direkt messen lässt, kann diese auch indirekt über eine vergleichende Dickenmessung der Folie vor und nach der Applikation bestimmen. Die Messung erfolgt jeweils mithilfe eines Sensors für transparente Materialien. Je nach zu messender Dicke eignet sich dafür eine chromatisch-konfokale oder interferometrische Sensortechnologie.
Ist die gemessene Schichtdicke zu gering, führt eine Dosiereinrichtung entsprechend mehr Gewebekulturflüssigkeit zu, wodurch sich die Schichtdicke erhöht. Eine Dosiermenge wird vom Regler so weit erhöht, bis die Soll-/Ist-Abweichung der Schichtdicke innerhalb der eingestellten Schichtdickentoleranz liegt. Ist die Ist-Schichtdicke jedoch zu hoch, wird die Dosiermenge vom Regler entsprechend reduziert.
Mögliche Verfahren zum Applizieren des Films sind Aufrollen, Aufrakeln, Aufsprühen oder Aufgießen. Der Folienvorschub ist dabei jeweils konstant. Diese Verfahren sind vom Stand der Technik bekannt und werden i.d.R. für hochviskose Beschichtungsstoffe aus der Farben- und Lackindustrie eingesetzt. Da es sich bei der wässrigen Gewebekulturflüssigkeit jedoch um ein niedrigviskoses Medium handelt, sind diese Verfahren nicht ohne weiteres anwendbar. Es sind Modifikationen erforderlich, um eine Viskosität ähnlich der von Farben und Lacken zu erreichen. Um dem zu entgehen, werden erfindungsgemäß Beschichtungsverfahren bevorzugt, die für niedrigviskose wässrige Medien besser geeignet sind. Prädestiniert sind Verfahren, die zur Applikation wässriger Tinten bestimmt sind. Das sind in erster Linie Druckverfahren.
Vom Stand der Technik ist eine Vielzahl verschiedener Druckverfahren bekannt. Für den vorgesehenen Einsatzzweck sind jedoch nicht alle Druckverfahren gleichermaßen gut geeignet. Favorisiert werden Druckverfahren, die auf dem CIJ-Prinzip (Continuous Ink Jet, Tintenstrahldrucker) oder auf dem DOD-Prinzip (Drop on Demand, Tintendrucker) basieren und meist zeilenweise mit schrittweise getaktetem Vorschub arbeiten. Bei diesen Druckverfahren kommen spezielle Tinten zum Einsatz, die hauptsächlich aus Wasser bestehen und demzufolge ein Viskositätsverhalten aufweisen, das weitgehend dem der zu applizierenden Gewebekulturflüssigkeit entspricht. Die Tinte wird durch feine Düsen eines Druckkopfes getrieben und bildet dabei Tröpfchen, deren Volumen sich präzise dosieren lässt.
Inzwischen sind Druckköpfe bekannt, mit denen sich Schichtdicken bis 50 Mikrometer bei 35 Meter pro Minute und Tropfengrößen von 13 bis 225 Pictoliter erzeugen lassen. Damit sind bis zu 2,477 Milliliter Beschichtungsstoff pro Sekunde applizierbar.
Im Hinblick auf eine proteinschonende Verarbeitung sind DOD-Drucker, bei denen die Tröpfchen mithilfe von Heizelemente gebildet werden (sog. „Bubble Jet-Drucker“), weniger gut geeignet. Als Applikationseinrichtung kommen daher bevorzugt Drucker mit einer Dosiereinrichtung zum Einsatz, bei der die Tröpfchen mithilfe eines Piezo-Elements erzeugt werden.
Da es im vorliegenden Anwendungsfall nicht auf ein pixelfreies Druckbild ankommt, lässt sich ein Düsendurchmesser optimal auf eine schonende Applikation der Virusteilchen abstimmen (Größe SARS-CoV-2 max. 160 Nanometer). Tröpfchen-Volumen und Schichtdicke werden vom Regler über den oben beschriebenen Regelkreis geregelt, indem das Piezzo-Element mit einer Strahlfrequenz von bis zu 23 kHz oder höher betätigt wird. Dabei wird aus dem Vorratsbehälter Gewebekulturflüssigkeit entnommen und über das Piezzo-Element der Düse zugeführt. Der Gewebekulturflüssigkeit können biokompatible Applikations-Hilfsstoffe beigefügt sein, die später wieder herausgereinigt werden. Damit lässt sich eine Viskosität exakt einstellen.
Nach der Applikation erfolgt der extrem wichtige Inaktivierungsschritt (Schritt c). Dabei wird der Film in einer Inaktivierungszone mit UV-C- und/oder UV-B-Licht geeigneter Lichtquellen definiert bestrahlt. Die Inaktivierungszone ist für einen Personenschutz gegen austretende Strahlung abgeschirmt. Optimale Kombinationen aus Strahlungsleistung, Bestrahlungszeit und Wellenlänge lassen sich über Laborversuche ermitteln. Die Bestrahlung kann sowohl mit als auch ohne Relativbewegung (Vorschub) des Films zur Lichtquelle erfolgen. Bei einer Vorrichtung für die industrielle Impfstoffproduktion, bei der aus Produktivitätsgründen vorzugsweise Rollenware zum Einsatz kommt, wird vorzugsweise mit dem gleichen Vorschub gearbeitet wie in der Applikationseinrichtung. Demzufolge erstreckt sich die Inaktivierungszone je nach Vorschub, Strahlungsleistung und erforderlicher Bestrahlungszeit über eine mehr oder weniger große Länge. Aus Platzgründen wird die Inaktivierung im Labor dagegen bevorzugt stationär, d.h. ohne Folienvorschub durchgeführt und es kommt Blattware zum Einsatz.
Als Lichtquellen können herkömmliche Quecksilberdampflampen eingesetzt werden. Quecksilberleuchten senden Licht bei 254 Nanometern aus und liegen damit unterhalb der optimalen Wellenlänge von 265 Nanometern. Auch sonst haben Quecksilberdampflampen Nachteile. Seit etwa fünf Jahren kann UV-C-Strahlung auch mit speziellen LEDs erzeugt werden (aus dem Englischen „Light Emitting Diodes“) - ohne die bekannten Nachteile der Quecksilberdampflampen.
LEDs senden Strahlung nur in einem sehr schmalen Energiebereich um eine zentrale Wellenlänge aus, deren Position durch die Zusammensetzung des Halbleitermaterials und das Design (z.B. die Anzahl der Atomlagen in den Einzelschichten) gezielt eingestellt werden kann. Es können schmalbandige Emission ohne störende Nebenpeaks und ohne unerwünschte Ozonbildung erzeugt werden. Durch die fehlende Wärmestrahlung in Emissionsrichtung können auch wärmeempfindliche biologische Substanzen behandelt werden. Darüber hinaus zeichnen sich UV-LEDs durch einfache Regulierbarkeit der Strahlungsintensität, einfache Erzeugung kurzer Pulse, maßgeschneiderte Abstrahlcharakteristik und hohe Lebensdauer aus. Eine Vorwärmzeit ist nicht erforderlich. Folglich sind UV-LEDs prädestiniert für den vorliegenden Anwendungsfall.
In einer besonders bevorzugten Ausführung der Vorrichtung kommen daher für die Bestrahlung des Films regelbare UV-LEDs zur Anwendung, deren Wellenlänge über die Zusammensetzung des Halbleitermaterials und das Design präzise auf die Resonanz der Nukleinsäure abgestimmt ist. Auf diese Weise werden die empfindlichen Schlüsselproteine geschont.
Die UV-LEDs sind in der Inaktivierungszone derart zur Folie angeordnet, dass der Film flächig und gleichmäßig mit der emittierten UV-Strahlung beaufschlagt wird. Die Strahlung wird auf einer gegenüberliegenden Seite der Folie mit einem Strahlungsmessgerät aus Lichtsensoren, beispielsweise Fotodioden oder CCD-Chips, gemessen. Mit den Sensoren wird eine Strahlungsdosis erfasst, die durch Flüssigkeitsfilm, Folie, Vorbehandlung und ggf. Vorbeschichtung hindurchgetreten ist. Daraus ergibt sich die Strahlungsdosis, die auf den Film mit den Virusteilchen eingewirkt hat, indem zur gemessenen Strahlungsdosis diejenige Dosis hinzuaddiert wird, die von Folie, Vorbehandlung und ggf. Vorbeschichtung absorbiert wurde.
Die von Folie, Vorbehandlung und ggf. Vorbeschichtung absorbierte Dosis kann bestimmt werden, indem vor der Applikation des Films eine Transmissionsmessung der Folie durchgeführt wird. Zu diesem Zweck weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Transmissionsmesseinrichtung mit einer UV-Lichtquelle und einem Strahlungsmessgerät auf.
Anhand der gemessenen Strahlungswerte und durch Vergleich mit einem eingestellten Sollwert wird die Bestrahlung mithilfe eines weiteren Reglers geregelt. Werden vom Regler Soll-/Ist-Abweichungen festgestellt, die eine am Regler eingestellte Strahlungstoleranz überschreiten, regelt der Regler die von den LEDs emittierte Strahlung entsprechend nach. In einer besonders bevorzugten Ausführung erfolgt dies über eine Pulsweitenmodulation. Dabei wird vom Regler eine elektrische Stromzufuhr der LEDs abhängig von der festgestellten Soll-/Ist-Abweichungen mithilfe einer weiteren Dosiereinrichtung getriggert. Infolge der Pulse wechseln sich Ein- und Ausschaltphasen der Stromzufuhr und damit Hell- und Dunkelphasen ab. Ist die gemessene Dosis zu groß, werden die Einschaltphasen verkürzt und die Ausschaltphasen entsprechend verlängert. Ist die gemessene Dosis dagegen zu klein, werden die Einschaltphasen verlängert und die Ausschaltphasen verkürzt.
Wird bei der Inaktivierung mit Vorschub gearbeitet, wird eine Pulsweite und Periodendauer der Stromzufuhr über den zweiten Regler derart geregelt, dass Hell- und Dunkelphasen nicht immer auf die gleichen Stellen der Folie treffen. Das kann durch vorschubabhängige Phasenverschiebungen zwischen den Ein- und Ausschaltphasen auf in Vorschubrichtung aufeinanderfolgender LEDs sowie durch hohe Schaltfrequenzen der Stromzufuhr über 100 Hertz erreicht werden.
Prinzipiell ließe sich die Bestrahlung auch über den Vorschub und/oder eine Variation des Abstandes der LEDs zur Filmoberfläche regulieren. Eine Veränderung des Vorschubs ist aufgrund von Abhängigkeiten zur vorgelagerten Applikationseinrichtung nur eingeschränkt möglich. Eine Variation des LED-Abstands würde den baulichen Aufwand der Vorrichtung erhöhen. Eine Pulsweitenmodulation ist bei weitem der einfachste Weg und wird dementsprechend bevorzugt.
LEDs haben bekanntlich eine punktförmige Abstrahlcharakteristik. Eine Möglichkeit zur Erreichung einer vollflächigen Bestrahlung des Flüssigkeitsfilms besteht darin, die LEDs reihenweise versetzt zueinander anzuordnen und zwar derart, dass sich Lichtspots benachbarter LEDs an ihren Rändern überlappen. Eine Gleichmäßigkeit der Bestrahlung lässt sich mit einer Optik bestehend aus einer Linse und/oder einem Reflektor und/oder einem Diffusor weiter verbessern. Eine andere Möglichkeit besteht in einer Reversierbewegung der LEDs quer zum Vorschub.
Aus dem inaktivierten Flüssigkeitsfilm wird in einem weiteren Schritt das Vakzin gewonnen. Im Hinblick auf eine subkutane Verabreichung müssen der Flüssigkeitsfilm bzw. die darin enthaltenen Virusteilchen zunächst in eine injizierbare Form überführt und dazu von der Folie getrennt werden (Schritt d).
Im einfachsten Fall erfolgt das mithilfe eines Abstreifers. Deutlich effizienter ist jedoch der Einsatz von Düsen oder Schallschwingern, über die sich Folie bei Raumtemperatur oder auch unter Wärmeeinwirkung mit einer isotonischen Kochsalzlösung beaufschlagen lässt. Dabei wird der Film von der Flüssigkeit aufgenommen, so dass sich die Virusteilchen in der Flüssigkeit anreichern. Über eine Titer-Bestimmung kann festgestellt werden, wie weit eine Anreicherung fortgeschritten ist.
Sofern Schallschwinger zum Einsatz kommen, werden Frequenzen bevorzugt, die die empfindlichen Schlüsselproteine nicht schädigen. Geeignete Frequenzen lassen sich über Versuche ermitteln. In der Regel sind das Frequenzen unterhalb des Ultraschallbereichs.
Zur Herstellung von kleinen Impfstoffmengen im Labor wird die Folie in Streifen geschnitten und beispielsweise in Reagenzgläsern mit isotonischer Kochsalzlösung geschüttelt.
Erforderlichenfalls folgen ein zusätzlicher Wärmeinaktivierungsschritt (bei Kombination von UV- und Wärmeinaktivierung - siehe einleitende Erläuterung) sowie eine Aufreinigung. Durch Aufreinigung werden unerwünschte Bestandteile, die sich von der Folie gelöst haben, wieder herausgereinigt. Das können insbesondere lösliche Bestandteile aus einer Folienvorbeschichtung oder auch Applikationshilfsstoffe sein, sofern diese nicht in den Impfstoff gelangen dürfen.
Dem kann sich ein Hinzufügen von Adjuvantien anschließen, bevor mit der Lösung schließlich Phiolen bzw. Spritzen befüllt werden. Das Adjuvans kann auch bereits der o.g. Kochsalzlösung hinzugefügt sein bzw. diese ersetzen.
Unter einem Adjuvans versteht man eine Substanz, die bei einer Immunisierung dem eigentlichen Antigen beigefügt wird, um die humorale und/oder zellvermittelte Immunantwort zu verstärken. Der Zusatz zielt darauf ab, eine Verweilzeit der Antigene im Körper zu erhöhen, um dadurch eine Immunreaktion zu verstärken. Gerade bei Totimpfstoffen kann häufig erst durch Einsatz solcher Wirkungsverstärker eine adäquate Immunantwort des Körpers hervorgerufen werden.
Nicht immer ist es von Vorteil, wenn ein Impfstoff in flüssiger Form vorliegt. Durch ein Lyophilisieren ist das Vakzin stabiler als in flüssiger Form und kann unter Kühlung transportiert und gelagert werden, üblicherweise bei Temperaturen von weniger als 4 Grad Celsius, bis es für eine Anwendung rekonstituiert wird. Wird das Vakzin auf diese Weise stabilisiert, können keine aluminiumhaltigen Adjuvantien verwendet werden, da Kälte das Adjuvans sowie das absorbierte Antigen beeinträchtigen kann.
In einer besonders vorteilhaften Verfahrensvariante dient die Folie nicht nur als Trägermaterial, sondern wird vor Beaufschlagen mit der Kochsalzlösung zerteilt und zu Röhrchen geformt. Die Röhrchen werden anschließend jeweils mit einer Längsnaht gefügt und an einem Ende mit einem Boden verschlossen. Auf diese Weise entstehen Phiolen bzw. Ampullen, die mit isotonischer Kochsalzlösung und/oder dem Adjuvans befüllt und nach Anbringen von Verschlusskappen zur fertigen Vakzin aufgeschüttelt werden. In ähnlicher Weise lassen sich auch Fertigspritzen herstellen.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile sind eine schnelle Entwicklung und Herstellung großer Impfstoffmengen in kürzester Zeit als auch eine universelle und v.a. schnelle Einsetzbarkeit bei neuen Erregern, für die es noch keine Impfstoffe gibt.
Da das Virus bei der Inaktivierung als Ganzes erhalten bleibt, lassen sich impfstoffinduzierte Immunreaktionen aus bereits bekannten Immunreaktionen Infizierter ableiten - ein unschätzbarer Vorteil gegenüber Impfstoffentwicklungen, bei denen häufig nicht rechtzeitig genug abgeklärt werden kann, ob das Vakzin einen Krankheitsverlauf nicht gar verschlimmert. Zudem bleiben die Schlüsselproteine erhalten. Das ist offenbar besonders wichtig für den Erfolg einer Impfstoffentwicklung gegen SARS-CoV-2, denn bei diesem Erreger ist inzwischen bekannt, dass das Spike-Protein dem Immunsystem in einer ganz bestimmten Konformation angeboten werden muss, damit schützende Antikörper gebildet werden. Gegenüber chemisch inaktivierten Totimpfstoffen lässt das zudem geringere Impfstoffdosierungen und damit bessere Impfstoffverträglichkeiten erwarten. Das kann unter Umständen dazu beitragen, dass die Herstellung eines Impfstoffs überhaupt erst möglich ist.
Zudem vereinfacht sich die Gewährleistung einer einwandfreien Impfstoffqualität. Qualitätsbestimmende Regelparameter wie Schichtdicke und Strahlungsdosis lassen sich mithilfe der beschriebenen Regelkreise fortlaufend überwachen und mithilfe eines Datenloggers dokumentieren.
Anwendungsmöglichkeiten eröffnen sich bei allen bekannten und neuen Viruserkrankungen. Auch Anwendungen bei durch Bakteriophagen oder Bakterien verursachten Erkrankungen sind denkbar.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand von Zeichnungen näher erläutert. Jedoch soll die vorliegende Erfindung nicht ausschließlich auf die Einzelheiten dieser Zeichnungen beschränkt sein.
Dabei zeigt

1 schematisch in einer Seitenansicht ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 3
2 schematisch ein Ausführungsbeispiel der Aufbereitungseinrichtung 52
2.1 schematisch einen Ablauf einer Phiolenherstellung mit der Aufbereitungseinrichtung 52
3 schematisch ein weiteres Ausführungsbeispiel der Aufbereitungseinrichtung 52
4 schematisch eine Ausführungsvariante der Vorrichtung 3.

1 zeigt schematisch in einer Seitenansicht ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 3. Die hier gezeigte Ausführung ist v.a. für eine industrielle Impfstoffherstellung bestimmt.
Wie 1 zeigt, nimmt die Vorrichtung 3 eine Folie 4 auf, welche mithilfe der Vorrichtung mit einem Film 5 aus einer Gewebekulturflüssigkeit 6 mit konzentrierten Virus 2 beschichtet wird. Durch eine Beaufschlagung mit einem von der Vorrichtung erzeugten UV-Licht 7 wird das im Film 5 enthaltene Virus 2 inaktiviert. Dabei ist es, wie dargestellt, von Vorteil, wenn eine Oberseite der Folie mit einer Oberfläche 8 flächig in einer Horizontalen angeordnet ist.
Um Umgebungskontaminationen durch die infektiöse Gewebekulturflüssigkeit zu vermeiden, ist die Vorrichtung zumindest teilweise von einer Einhausung 9 umgeben. Ein von der Einhausung umschlossener Bereich steht unter einem Unterdruck p, wobei der Unterdruck durch Absaugen von Luft mithilfe einer Absaugeinrichtung 10 erzeugt wird. Die Absaugeinrichtung ist mit einer Filtereinrichtung 11 verbunden und filtert infektiöse Partikel bzw. Aerosole aus der abgesaugten Luft heraus.
Im hier dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Folie eine Rollenware und wird der Vorrichtung mit einem Vorschub V zugeführt. Die Rollenware befindet sich auf einer Folienhaspel 12, die in einer Zuführeinrichtung 13 aufgenommen ist. Eine Vorschubeinheit 14 erzeugt den Vorschub und bewirkt mit einer Zugspannung σ, dass die Oberfläche 8 der Folie geglättet wird. Eine bevorzugte Dicke der Folie liegt bei max. 1,5 Millimeter.
Zur Verbesserung einer Benetzung der Folienoberfläche mit der Gewebekulturflüssigkeit wird die Oberfläche 8 zunächst mittels einer Plasma- oder einer Corona- oder einer Flamm-Vorbehandlung 15a vorbehandelt und/oder mit einer Vorbeschichtung 15b vorbeschichtet. Die Vorrichtung enthält zu diesem Zweck eine Vorbehandlungseinrichtung 16.
Alternativ wird die Vorbeschichtung 15b in einem hier nicht dargestellten Vorprozess außerhalb der Vorrichtung aufgetragen. Dieser Vorprozess kann beispielsweise in einen Herstellprozess der Folie bei einem Zulieferer integriert sein.
Bei Bedarf kann die Folie auch beidseitig vorbehandelt werden.
Im Hinblick auf eine erfindungsgemäße Überwachung der Bestrahlung muss eine Transmission 17 der Folie für das verwendete UV-Licht 7 bekannt sein. Das gilt analog für eine Transmission von Vorbehandlung bzw. Vorbeschichtung, denn nur mit bekannter Transmission können Dämpfungseinflüsse des UV-Lichts durch Folie, Vorbehandlung und Vorbeschichtung beim erfindungsgemäßen Regeln einer Strahlungsdosis berücksichtigt werden. Die Transmission 17 wird mithilfe einer Transmissionsmesseinrichtung 18 bestehend aus einer UV-Lichtquelle 18a und einem Strahlungsmessgerät 18b gemessen. UV-Lichtquelle 18a und Strahlungsmessgerät 18b sind, wie in 1 dargestellt, auf einander gegenüberliegenden Seiten der Folie angeordnet. Vom Strahlungsmessgerät 18b wird erfasst, welche von der UV-Lichtquelle 18a emittierten Wellenlängen durch die Folie hindurchdringen und welcher Energieanteil durch Absorption und/oder Reflexion verloren geht.
Im Anschluss an die Transmissionsmessung wird der Film 5 aus der Gewebekulturflüssigkeit 6 auf die Oberfläche 8 der Folie aufgetragen. Eine bevorzugte Film- bzw. Schichtdicke 19 liegt dabei vorzugsweise zwischen 5 und 25 Mikrometer, in Sonderfällen und bei Einsatz von UV-B-Licht können auch höhere Schichtdicken von 50 Mikrometer und mehr zur Anwendung kommen.
Die Gewebekulturflüssigkeit wird mithilfe eines Bioreaktors (Fermenters) 20 hergestellt, durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation in einer Zentrifuge 21 aufgereinigt und - als Anhaltswert für eine Virenkonzentration - auf einen Titer untersucht. Erforderlichenfalls wird der Gewebekulturflüssigkeit ein Applikationshilfsstoff 22 zugesetzt, um beispielsweise eine Viskosität einzustellen.
Die Gewebekulturflüssigkeit wird anschließend einem Vorratsbehälter 23 einer Applikationseinrichtung 24 zwecks Erzeugung des Films 5 auf der Folie 4 zugeführt. Dies kann, wie einleitend ausgeführt, auf unterschiedliche Weise erfolgen. Im hier gezeigten Ausführungsbeispiel besteht die Applikationseinrichtung aus einem Drucker 25, der vorzugsweise nach einem CIJ- oder DOD-Prinzip arbeitet und bei dem der Vorratsbehälter aus einer auswechselbaren Druckerpatrone 26 besteht. Alternativ kann die Applikationseinrichtung aus einem hier nicht dargestellten Walzencoater, einem Rakel, einem Gieß- oder Sprühkopf o.ä. bestehen.
Der hier gezeigte Drucker 25 besteht aus einer Reversiereinheit 27, die einen Druckkopf 28 mit Düse 29 und Dosiereinrichtung 30 entlang einer Druckzeile 31 quer zur Folie abwechselnd vor und zurück bewegt, wobei die Dosiereinrichtung in diesem Ausführungsbeispiel aus einem getakteten Piezzo-Element 32 besteht.
Anstelle der hier gezeigten Reversiereinheit kann auch ein unbeweglicher Druckkopf mit mehreren Düsen zum Einsatz kommen. Bei einer solchen Ausführungsvariante weist der Druckkopf über eine Gesamtbreite der Folie Düsen auf, mit denen die Oberfläche 8 zeilenweise gleichzeitig bedruckt wird. Mithilfe des Piezo-Elements wird die Gewebekulturflüssigkeit durch die Düse(n) gedrückt und bildet dabei ein Tröpfchenvolumen 33, das auf die Oberfläche 8 übertragen wird. Durch Aneinanderreihung von Tröpfchenvolumen entlang der Druckeile 31 entsteht nach und nach der Film 5. Nach dem Drucken der Zeile 31 wird die Folie mit der Vorschubeinheit 14 um die gedruckte Zeile weitertransportiert.
Über eine Taktfrequenz f, mit der ein erster Regler 34 das Piezzo-Element 32 ansteuert, lassen sich das Tröpfchenvolumen 33 und dadurch die Schichtdicke 19 des gedruckten Films präzise regeln. Der Regler 34 erhält dazu von einem Schichtdickenmessgerät 35 fortlaufend Informationen über die gemessene Schichtdicke 19. Die gemessene Schichtdicke wird vom Regler 34 mit einer am Regler eingestellten Soll-Schichtdicke 36 verglichen. Wird beim Vergleich eine Abweichung festgestellt, die eine am Regler eingestellte Schichtdickentoleranz Δ_d überschreitet, nimmt der Regler 34 eine Korrektur des Tröpfchenvolumens vor. Dies geschieht, indem der Regler eine Höhe der Taktfrequenz f derart nachregelt, dass die Toleranz Δ_d eingehalten wird. Soll-Schichtdicke 36 und Toleranz Δ_d lassen sich über Versuche ermitteln.
Nach der Applikationseinrichtung wird die Folie zwecks einer Beaufschlagung des Films mit dem UV-Licht 7 einer Inaktivierungszone 37 zugeführt. Die Inaktivierungszone ist hier als Durchlaufeinrichtung ausgeführt und erstreckt sich entsprechend Vorschub V und erforderlicher Bestrahlungszeit t über eine bestimmte Länge L. Bestrahlungszeit t und Länge L lassen sich über Versuche ermitteln. Eine Ausführungsvariante, bei der die Folie stationär bestrahlt wird, geht aus 4 hervor.
In der Inaktivierungszone ist eine Inaktivierungseinrichtung 38 bestehend aus mindestens einer Leuchtdiode 39 angeordnet. Vorzugsweise besteht die Inaktivierungseinrichtung jedoch aus einer Aneinanderreihung mehrerer Leuchtdioden (UV-LEDs), die sich in Folienbreite über die gesamte Inaktivierungszone erstrecken. Mit einer zueinander versetzten Anbringung der UV-LEDs lässt sich in der Inaktivierungszone eine besonders gleichmäßige Strahlungsverteilung erreichen. Eine von den UV-LEDs emittierte Strahlung 40 ist dabei auf den Film 5 an der Oberfläche 8 gerichtet.
In der vorliegenden Figur erfolgt eine Beaufschlagung der Folie mit Strahlung lediglich von einer Seite. Es sind auch Ausführungsvarianten denkbar, bei der auf einer Folienrückseite 45 ebenfalls UV-LEDs angeordnet sind.
Eine Gleichmäßigkeit der Strahlung kann mithilfe einer Optik 41 bestehend aus einem Diffusor und/oder einer Streulinse und/oder einem Reflektor zusätzlich verbessert sein. Nachteilig ist, dass dadurch je nach verwendeter Wellenlänge und konstruktiver Ausführung ein Teil der emittierten Strahlung 40 geschluckt wird. Das gilt insbesondere bei sehr kurzen Wellenlängen. Um das zu vermeiden, kann der Diffusor auch durch eine zweite Reversiereinheit 42, mit der die Leuchtdiode 39 quer zur Folie abwechselnd vor und zurück bewegt wird, ersetzt sein. Auch sind Ausführungen denkbar, bei denen die Leuchtdiode in die erste Reversiereinheit 27 integriert ist.
Vorzugsweise kommen in der Inaktivierungseinrichtung Leuchtdioden zum Einsatz, die einzelne Wellenlängen zwischen 250 und 300 Nanometer oder ein eng begrenztes Spektrum verschiedener Wellenlängen zwischen 250 und 300 Nanometer emittieren. Die Wellenlängen sind so gewählt, dass v.a. die Nukleinsäuren in Resonanz geraten, während die Schlüsselproteine geschont werden. Nach neuen Erkenntnissen ist das v.a. bei einer Wellenlänge um 265 Nanometer der Fall.
Die von der Leuchtdiode emittierte Strahlung 40 durchdringt nacheinander Film 5, Vorbeschichtung 15b, Vorbehandlung 15a sowie Folie 4 und wird mit einem Strahlungsmessgerät 43 bestehend aus einer Aneinanderreihung von Strahlungssensoren 44 auf der Folienrückseite 45 gemessen.
In einer hier nicht gezeigten Ausführungsvariante sind beidseitig der Folie UV-LEDs und Strahlungssensoren angeordnet.
In einer weiteren, hier ebenfalls nicht gezeigten Ausführungsvariante durchdringt die von der Leuchtdiode emittierte Strahlung 40 lediglich den Film 5 und wird von einer metallischen Beschichtung der Folienoberfläche reflektiert. Mit den Strahlungssensoren 44, die auf der gleichen Seite der Folie angeordnet sind wie die Leuchtdiode, wird dann die reflektierte Strahlung gemessen.
Eine gemessene Strahlungsdosis 46 und die Transmission 17 geben indirekt Aufschluss darüber, welche Strahlungsdosis 47 während eines Durchlaufs durch die Inaktivierungszone tatsächlich auf das Virus 2 eingewirkt hat. Ein zweiter Regler 48 vergleicht die gemessene Strahlungsdosis 46 mit einem Sollwert 49, wobei ein Einfluss der gemessenen Transmission 17 berücksichtigt wird. Über die Transmission wird eine Schichtdickenschwankung automatisch mitberücksichtigt. Wird vom Regler 48 unter Berücksichtigung der Transmission eine Abweichung der Strahlungsdosis vom Sollwert festgestellt, die eine vorgegebene Strahlungstoleranz Δ_s überschreitet, regelt der Regler 48 die emittierte Strahlung 40 und damit die Strahlungsdosis 47 nach. Sollwert 49 und Toleranz Δ_s lassen sich lassen sich über Versuche ermitteln und am Regler 48 einstellen.
Erfindungsgemäß erfolgt eine Nachregelung der Strahlung 40 mittels einer Pulsweitenmodulation. Dabei wird mithilfe einer zweiten Dosiereinrichtung 50 eine elektrische Stromzufuhr 51 mit einer Pulsweite t1 und einer Periodendauer T getriggert, d.h. die Stromzufuhr zur Leuchtdiode 39 wird vom Regler 48 über die Dosiereinrichtung 50 abwechselnd ein- und ausgeschaltet. Infolge der getriggerten Stromzufuhr wechseln sich Ein- und Ausschaltphasen bzw. Hell- und Dunkelphasen des UV-Lichts ab. Wird der Sollwert 49 der Strahlungsdosis um mehr als die am Regler 48 eingestellte Toleranz Δ_s überschritten, werden die Einschaltphasen der Stromzufuhr durch den Regler verkürzt und die Ausschaltphasen entsprechend verlängert. Wird der Sollwert der Strahlungsdosis dagegen um mehr als die eingestellte Toleranz unterschritten, werden die Einschaltphasen verlängert und die Ausschaltphasen verkürzt. Mittels dieser Pulsweitenmodulation und in Verbindung mit der oben beschriebenen Schichtdickenregelung lassen sich alle im Film enthaltenen Virusteilchen zuverlässig inaktivieren, ohne die Antigenität der Schlüsselproteine zu beeinträchtigen.
Das inaktivierte Virus 2 bildet die Basis für das Vakzin 1 und wird mithilfe der Aufbereitungseinrichtung 52 aus dem Film 5 gewonnen. Eine Bereitstellung erfolgt mittels einer Phiole 53 oder einer Fertigspritze 54. Die Aufbereitungseinrichtung 52 und eine Möglichkeit zur Herstellung der Phiole aus der Folie 4 wird anhand der 2, 2.1 und 3 beschrieben.
Eine Vorrichtungssteuerung 55 und ein Datenlogger 56 steuern und dokumentieren einen Gesamtablauf der Herstellung und bilden zugleich eine interaktive Schnittstelle zur Bedienung der Vorrichtung. In einer besonders bevorzugten Ausführung ist die Vorrichtungssteuerung programmierbar. Auf diese Weise lassen sich im Zuge einer Impfstoffentwicklung programmunterstützte Parameterstudien (Design of Experiments) durchführen. Das ist ein konsequenter Schritt zu einer automatisierten Impfstoffentwicklung und könnte dazu beitragen, das Zulassungsverfahren für einen neuen Impfstoff zu verkürzen.
2 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel der Aufbereitungseinrichtung 52. Mit dem hier gezeigten, Ausführungsbeispiel wird aus der Folie 4 eine Phiole 53 oder eine Fertigspritze 54 hergestellt (siehe auch 2.1).
Aus der Folie 4 wird zunächst mithilfe einer Stanzeinrichtung 57 ein Folienstanzling 58 ausgestanzt. Dabei ist es von Vorteil, wenn die Folie in einem Stanzbereich nicht mit dem Film 5 bedruckt ist. Ein partielles Bedrucken der Folie lässt sich durch eine entsprechende Steuerung des Druckkopfes bewerkstelligen.
Nach einem optionalen Lyophilisierungsschritt mit einer Lyophilisierungseinrichtung 59 wird der Folienstanzling 58 mit einer Form- und Längsfügeeinrichtung 60 zu einem vorzugsweise zylinderförmigen Röhrchen 61 geformt und mittels einer Längsverbindung 62 verbunden. Abhängig von einem Folienwerkstoff kann dafür eine Klebe- oder Schweißverbindung eingesetzt werden. Der Film 5 befindet sich dabei auf der Innenseite des Röhrchens.
Nach dem Fügen der Längsverbindung wird ein Ende des Röhrchens mittels einer Fügeeinrichtung 63 mit einem Boden 64 verschlossen. Für eine Bodenbefestigung 65 am Röhrchen kann ebenfalls eine Klebe- oder Schweißverbindung zum Einsatz kommen. Ein Fügebereich 66 ist dabei vorzugsweise nicht bedruckt.
Nach dem Anbringen des Bodens wird das Röhrchen mit einer isotonischen Kochsalzlösung 67 und/oder einem Adjuvans 68 befüllt und das noch offene Ende mit einer Verschlusskappe 69 dicht verschlossen. Dafür kommen eine Fügeeinrichtung 70 und eine Befülleinrichtung 71 und eine zum Einsatz. Auf diese Weise entsteht, wie in 2.1 dargestellt, eine Phiole (Ampulle) 53.
Abschließend wird die Phiole mithilfe eines Schüttlers 72 aufgeschüttelt. Dabei löst sich der Film 5 und wird mit dem inaktivierten Virus 2 von der Kochsalzlösung und/oder dem Adjuvans aufgenommen. Ein beim Befüllen der Phiole eingeschlossenes Luftbläschen unterstützt dabei den Lösevorgang. Das Vakzin 1 ist damit fertig.
Analog lässt sich auch eine Fertigspritze 54 herstellen. Dazu weist der Boden des Röhrchens einen Konus zur Aufnahme einer Injektionskanüle auf und die Verschlusskappe wird durch eine Griffplatte und einen Kolben ersetzt.
An dieser Stelle sei noch erwähnt, dass die Applikationseinrichtung 24 zusätzlich einen Tinten- oder Laserdrucker aufweisen kann, mit dem auf der nach außen weisenden Folienrückseite 45 eine Röhrchenbeschriftung bzw. eine Graduierung angebracht wird.
2.1 zeigt schematisch einen Ablauf einer Phiolenherstellung mit der Aufbereitungseinrichtung 52. Erläuterungen finden sich in der Beschreibung zu 2.
3 zeigt schematisch ein weiteres Ausführungsbeispiel der Aufbereitungseinrichtung 52. Vorteile der hier gezeigten Ausführung sind zusätzliche Freiheitsgrade bzgl. Folienwerkstoff, Vorbeschichtung und Applikationshilfsstoff.
Die Aufbereitungseinrichtung enthält im Wesentlichen eine Trenneinrichtung 73 mit mindestens einer Düse 74 oder einem Schallschwinger 75. Zur Verbesserung einer Effizienz kann die Trennrichtung - anders als hier dargestellt - nicht nur aus einer Spülzone 76 bestehen, sondern in mehrere Spülzonen unterteilt sein, wobei sich von Spülzone zu Spülzone ein Konzentrationsgefälle ausbildet. Unter Wärmeeinwirkung lässt sich die Effizienz weiter verbessern.
Die Düse bzw. der Schallschwinger sind auf die Folie 4 gerichtet und beaufschlagen die Oberfläche 8 mit isotonischer Kochsalzlösung 67. Dabei reichert sich das inaktivierte Virus 2 in der Kochsalzlösung an. Durch Bestimmung eines Titers kann festgestellt werden, wie weit eine Anreicherung fortgeschritten ist. Erforderlichenfalls wird die angereicherte Kochsalzlösung in einer weiteren Zentrifuge 77 aufgereinigt und in einem Mischer 78 mit dem Adjuvans 68 gemischt.
Das nunmehr fertige Vakzin wird mittels der Befülleinrichtung 71 in Phiolen (Ampullen) 53 oder Fertigspritzen 54 abgefüllt oder mit einer Lyophilisierungseinrichtung 59 gefriergetrocknet.
Die Folie lässt sich einer erneuten Verwendung oder einem Recycling zuführen. Prinzipiell sind auch Ausführungsvarianten mit einer Endlosschleife der Folie denkbar, sofern eine UV-Beständigkeit einen wiederholten Durchlauf der Folie durch die Vorrichtung zulässt.
4 zeigt schematisch eine Ausführungsvariante der Vorrichtung 3. Die hier gezeigte Ausführung ist für ein Labor bestimmt. Bei Impfstoffentwicklung und - zulassung werden lediglich geringe Impfstoffmengen benötigt, so dass sich ein Aufbau der Vorrichtung vereinfacht. Unterschiede zur 1 sind nachfolgend beschrieben.
Die Folie wird hier von einem Folienstapel 79 in einem Folienfach 80 zugeführt und mit einer Vereinzelungseinrichtung 81 vereinzelt. Im Gegensatz zu 1 bewegt sich die Folie lediglich in Vorbehandlungseinrichtung 16 und Applikationseinrichtung 24 mit Vorschub V. In der Inaktivierungseinrichtung 38 wird dagegen ohne Vorschub gearbeitet. Ein Transport zwischen Applikations- und Inaktivierungseinrichtung, hier angedeutet durch einen Pfeil, kann manuell oder mithilfe eines mechanisierten Feeders erfolgen.
Auch die Aufbereitungseinrichtung 52 vereinfacht sich. Im Labor kann das Vakzin aus Folienstreifen 82 gewonnen werden, indem die Streifen in einem Reagenzglas 83 oder einem anderen Behältnis unter Hinzufügen der Kochsalzlösung 67 und/oder dem Adjuvans 68 manuell oder mithilfe eines Laborschüttlers 84 aufgeschüttelt werden. Das Schneiden der Streifen erfolgt hier exemplarisch mit einem Foliencutter 85.
Vorbehandlungseinrichtung, Applikationseinrichtung und Inaktivierungseinrichtung haben ansonsten den gleichen Aufbau wie in 1. Das gleiche gilt für die Transmissionsmesseinrichtung 18, den Regler 34 mit Schichtdickenmessgerät 35 und den Regler 48 mit Strahlungsmessgerät 43.
Die Herstellung der Gewebekulturflüssigkeit entspricht den Ausführungen zu 1.
Abschließend sei noch auf eine mögliche Ausführungsvariante der Applikationseinrichtung hingewiesen. Bei dieser Variante bewegt sich nicht die Folie zum Druckkopf, sondern der Druckkopf zur Folie. Auch bei der Inaktivierungseinrichtung ist eine Variante denkbar, bei der sich nicht die Folie zur Leuchtdiode bewegt, sondern die Leuchtdiode zur Folie.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2005/003340 A2 [0026, 0027, 0035]
DE 102016110672 A1 [0028]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„A subcutaneously injected UV-inactivated SARS coronavirus vaccine elicits systemic humoral immunity in mice‟, erschienen in der International Immunology, Band 16, Ausgabe 10, Oktober 2004, Seiten 1423 bis 1430 [0022]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Vakzins (1) basierend auf einer Inaktivierung eines Virus (2), umfassend folgende Verfahrensschritte: (a) Herstellen einer das Virus (2) enthaltenden Gewebekulturflüssigkeit (6) (b) Erzeugen eines Films (5) aus der Gewebekulturflüssigkeit (6) (c) Inaktivieren des Virus (2) im Film (5) (d) Gewinnen des Vakzins (1) aus dem Film (5) dadurch gekennzeichnet, dass der Film (5) aus der Gewebekulturflüssigkeit (6) erzeugt wird, indem die Gewebekulturflüssigkeit mit einer Applikationseinrichtung (24) einer Vorrichtung (3) auf eine Oberfläche (8) einer Folie (4) appliziert wird, wobei eine Schichtdicke (19) des Films mithilfe eines ersten Reglers (34), eines Schichtdickenmessgeräts (35) und einer ersten Dosiereinrichtung (30) geregelt wird und dass das im Film (5) enthaltenen Virus (2) inaktiviert wird, indem der Film von einem UV-Licht (7) einer Inaktivierungseinrichtung (38) der Vorrichtung (3) mit einer Strahlungsdosis (47) beaufschlagt wird, wobei die Strahlungsdosis (47) mithilfe eines zweiten Reglers (48), einem Strahlungsmessgerät (43) und einer zweiten Dosiereinrichtung (50) geregelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebekulturflüssigkeit (6) mit der Applikationseinrichtung (24) auf die Oberfläche (8) der Folie appliziert wird, indem der Regler (34) ein Piezo-Element (32) der Dosiereinrichtung (30) mit einer Taktfrequenz (f) betätigt, wobei ein Tröpfchenvolumen (33) der Gewebekulturflüssigkeit aus einem Vorratsbehälter (23) der Applikationseinrichtung über eine Düse (29) eines Druckkopfes (28) auf die Oberfläche (8) gedruckt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die applizierte Gewebekulturflüssigkeit (6) einen Applikationshilfsstoff (22) enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Druckkopf (28) die Gewebekulturflüssigkeit zeilenweise auf die Oberfläche druckt, wobei der Druckkopf feststeht oder mittels einer Reversiereinheit (27) quer zur Folie (4) vor und zurück bewegt wird und wobei die Folie nach dem Drucken einer Zeile (31) mit einer Vorschubeinheit (14) um die gedruckte Zeile weitertransportiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke (19) geregelt wird, indem der Regler (34) die Schichtdicke (19) mit dem Schichtdickenmessgerät (35) misst, mit einer Soll-Schichtdicke (36) vergleicht und bei einer Abweichung das Tröpfchenvolumen (33) über die Taktfrequenz (f) korrigiert, sofern die Abweichung größer ist als eine Schichtdickentoleranz (Δ_d).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Folie (4) aus einem Kunststoff mit einer Transmission (17) für das UV-Licht (7) besteht und mit einer Transmissionsmesseinrichtung (18) vor dem Bedrucken gemessen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (8) vor dem Bedrucken mit einer Plasma- oder einer Corona- oder einer Flammvorbehandlung (15a) vorbehandelt und/oder mit einer Vorbeschichtung (15b) vorbeschichtet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungsdosis (47) des UV-Lichts (7) geregelt wird, indem der Regler (48) mit dem Strahlungsmessgerät (43) auf einer Folienrückseite (45) eine Strahlungsdosis (46) misst, mit einem Sollwert (49) vergleicht und bei einer Abweichung die Strahlungsdosis (47) über eine Pulsweitenmodulation des UV-Lichts mit der Dosiereinrichtung (50) korrigiert, sofern die Abweichung größer ist als eine Strahlungstoleranz (Δ_s), wobei die Transmission (17) vom Regler berücksichtigt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Vakzin (1) aus dem Film (5) gewonnen wird, indem die Oberfläche der Folie mit einer isotonischen Kochsalzlösung (67) und/oder einem Adjuvans (68) beaufschlagt wird, wobei die Kochsalzlösung und/oder das Adjuvans das inaktivierte Virus aufnimmt und zum Vakzin (1) wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Folie (4) vor dem Beaufschlagen mit der Kochsalzlösung und/oder das Adjuvans zuerst zu einem Röhrchen (61) geformt und zu einer Phiole (53) oder einer Fertigspritze (54) gefügt wird.
Vorrichtung (3) zur Herstellung eines Vakzins (1) basierend auf einem inaktivierten Virus (2), dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (3) eine mit einem ersten Regler (34), einem Schichtdickenmessgerät (35) und einer ersten Dosiereinrichtung (30) geregelte Applikationseinrichtung (24) für eine Erzeugung eines aus einer Gewebekulturflüssigkeit (6) bestehenden Films (5) auf einer Folie (4) enthält, wobei eine Schichtdicke (19) des Films mit dem Regler (34) geregelt ist und dass die Vorrichtung darüber hinaus eine mit einem zweiten Regler (48), einem Strahlungsmessgerät (43) und einer zweite Dosiereinrichtung (50) geregelte Inaktivierungseinrichtung (38) mit einem UV-Licht (7) enthält, wobei eine Strahlungsdosis (47) des UV-Lichts mit dem Regler (48) geregelt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zudem eine Zuführeinrichtung (13) mit einer Folienhaspel (12) oder einem Folienstapel (79), eine Vorschubeinheit (14), eine Vorbehandlungseinrichtung (16), eine Aufbereitungseinrichtung (52), eine programmierbare Vorrichtungssteuerung (55) und einen Datenlogger (56) enthält und mit einer Einhausung (9) mit einer Filtereinrichtung (11) zumindest teilweise gekapselt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Applikationseinrichtung (24) ein Drucker (25) ist, umfassend einen zu einer Druckerpatrone (26) ausgebildetem Vorratsbehälter (23) mit der Gewebekulturflüssigkeit (6), den Regler (34), die Dosiereinrichtung (30) mit einem Piezo-Element (32) und einen Druckkopf (28) mit mindestens einer Düse (29), wobei der Druckkopf in einer Breite der Folie druckt und feststehend ist oder mit einer Reversiereinheit (27) quer zur Folie bewegt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Inaktivierungseinrichtung (38) zur Erzeugung des UV-Lichts (7) mindestens eine auf eine Oberfläche (8) der Folie gerichtete und mit dem Regler (48), dem Strahlungsmessgerät (43) und der Dosiereinheit (50) über eine Pulsweitenmodulation geregelte Leuchtdiode (39) aufweist, wobei das UV-Licht mindestens eine Wellenlänge zwischen 250 und 300 Nanometer aufweist.