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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion und/oder zur Quantifizierung wenigstens eines bestimmten Zelltyps, wobei wenigstens eine spezifisch an einen Nukleinsäureabschnitt des wenigstens einen Zelltyps bindende Sonde von wenigstens einem Sondentyp mit dem Nukleinsäureabschnitt in Verbindung gebracht wird, und wobei ein Nachweis der Sonde in einem Nachweisschritt indirekt zur Detektion und/oder zur Quantifizierung des wenigstens einen Zelltyps verwendet wird.
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Zum Nachweis von Nukleinsäuren in bestimmten Zelltypen, insbesondere in einzelnen Mikroorganismen, sind beispielsweise Verfahren wie In-Situ-Hybridisierung (ISH) sowie die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) bekannt. Dabei werden kurze synthetische Nukleinsäuresonden eingesetzt, welche über Basenpaarungen an die nachzuweisende Zielsequenz binden. Die In-Situ-Hybridisierung und die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung, bei welcher die Nukleinsäuresonden fluoreszent markiert sind, können zur spezifischen Detektion von Nukleinsäuren (DNA und/oder RNA Molekülen) verwendet werden.
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Die bekannten ISH-Nachweisverfahren weisen jedoch oft eine niedrige Signalstärke auf, welche durch biochemische Signalverstärkungsreaktionen oder multiple Markierung von Nachweissonden kompensiert werden kann. Dabei werden komplexe und zahlreiche Reagenzien und Sonden verwendet, die in das Zellinnere gebracht werden sollen, um eine In-Situ-Hybridisierung und eine Quantifizierung auf zellulärer Ebene zu ermöglichen. Dies steigt die Komplexität und beschränkt das Automatisierungspotential solcher Verfahren, die somit für eine schnelle und einfache Analytik nicht geeignet sind.
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Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Nachweis bestimmter Zelltypen, insbesondere einzelner Mikroorganismen, mittels In-Situ-Hybridisierung bereitzustellen, das eine Hybridisierungsreaktion mit komplexen Reagenzien ohne Einschleusen der Reagenzien in den Zelltyp ermöglicht.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale von Anspruch 1 gelöst. Insbesondere wird somit erfindungsgemäß zur Lösung der genannten Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art vorgeschlagen, dass der wenigstens eine Zelltyp zusammen mit dem wenigstens einen Sondentyp in einem Tröpfchen eingebracht wird, und dass eine Zellbegrenzung, insbesondere eine Zellmembran und/oder eine Zellwand, innerhalb des Tröpfchens zumindest teilweise zerfällt, insbesondere permeabilisiert und/oder komplett aufgelöst wird, so dass eine spezifische Bindung der wenigstens einen Sonde an den Nukleinsäureabschnitt erfolgt.
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Hierzu macht sich die Erfindung zunutze, dass eine In-Situ-Hybridisierung der einzelnen Zelltypen mit komplexen Reagenzien ohne Einschleusen der Reagenzien in die Zelltypen ermöglicht werden kann, indem der wenigstens eine Zelltyp zusammen mit dem wenigstens einen Sondentyp in einem Tröpfchen eingebracht wird und die Zellbegrenzung innerhalb des Tröpfchens zumindest teilweise zerfällt. Die Zellbegrenzung kann permeabilisiert werden. Alternativ kann die Zellbegrenzung komplett aufgelöst werden. Beispielsweise kann die Zellbegrenzung die Zellmembran und/oder eine Zellwand sein. Durch den teilweisen Zerfall, die Permeabilisierung und/oder komplette Auflösung der Zellbegrenzung können die Zellkomponente wie beispielsweise Proteine, Membranbestandteile, DNA, RNA und somit auch die Nukleinsäureabschnitte der Zielsequenzen freigesetzt werden, so dass eine spezifische Bindung der wenigstens einen Sonde an den Nukleinsäureabschnitt innerhalb des Tröpfchen erfolgen kann. Beispielsweise können Tröpfchen mit einer Düse und einem Hüllstrom erzeugt werden. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Erzeugung der Tröpfchen durch Mikrokavitäten erfolgt.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass das Tröpfchen ein Lysereagenz aufweist, durch welches sich die Zellbegrenzung auflöst. Vorteilhaft ist dabei, dass durch diese Auflösung bzw. Lyse der Zellbegrenzung die Zielsequenzen freigelegt werden, so dass eine Hybridisierungsreaktion mit komplexen Reagenzien ermöglicht werden kann, ohne dass diese Reagenzien in die Zelltypen eingeschleust werden müssen. Somit ist auch eine größere Auswahl bei der Wahl von Farbstoffen in Verbindung mit den Sonden erreichbar, da diese nicht durch die Zellpermeabilität eingeschränkt ist. Alternativ oder zusätzlich kann das Tröpfchen ein Lysereagenz aufweisen, durch welches die Zellbegrenzung wenigstens teilweise zerfällt bzw. permeabilisiert wird.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass pro Tröpfchen genau ein Zelltyp eingeschlossen wird. Dadurch, dass ein Tröpfchen nur ein Zelltyp enthält, kann dieses Tröpfchen als Äquivalent eines Zelltyps betrachtet werden. Von Vorteil ist dabei, dass im nachfolgenden Nachweisschritt durch die Detektion einzelner Tröpfchen die Quantifizierung auf zellulärer Ebene ermöglicht werden kann. Vorzugsweise werden Tröpfchen ohne Zelltyp bei der Durchführung des Nachweisschritts unberücksichtigt bleiben. Die Tröpfchen ohne Zelltyp können auch vor Durchführung des Nachweisschritts entfernt werden. Die Generierung von Tröpfchen mit mehreren Zelltypen oder größeren Tröpfchen kann bei dem Tröpfchen-Generierungsprozess vermieden werden. Durch diese Vorsortierung der Tröpfchen anhand bestimmter Eigenschaften ist erreichbar, dass nur ein Bruchteil des gesamten initialen Messvolumens mittels erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht wird. Somit können Reagenzien gespart und die Reaktionszeit reduziert werden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass das Tröpfchen mit einem vordefinierten Tröpfchenvolumen ausgebildet wird. Beispielsweise kann das Tröpfchenvolumen so vordefiniert werden, dass die Enkapsulierung einzelner Zelltypen begünstigt und mehrerer Zelltypen pro Tröpfchen verhindert wird. Vorzugsweise wird das Tröpfchenvolumen noch vor einer Fusion mit einem weiteren Tröpfchen vordefiniert.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass die wenigstens eine Sonde von wenigstens einem Sondentyp wenigstens einen Marker aufweist. Durch einen Nachweis des wenigstens einen Markers kann ein Nachweis des Nukleinsäureabschnitts vorgenommen werden. Vorzugsweise kann der wenigstens eine Marker erst durch eine Bindung der wenigstens einen Sonde an den Nukleinsäureabschnitt aktiviert oder aktivierbar werden. Die wenigstens eine Sonde kann beispielsweise mehrere Marker aufweisen. Als Marker kann wenigstens ein Molekül oder eine Kombination aus zwei oder mehreren Molekülen ausgewählt aus einem Reportermolekül, Farbstoff, vorzugsweise Fluorophor, chemiluminiszenter Substanz, photoaktivierbarem Reagenz, Affinitätsmarker, Substanzen für bioorthogonale Markierung und/oder einem Enzym verwendet werden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass der Zelltyp ein einzelliger oder mehrzelliger Mikroorganismus, vorzugsweise ein Bakterium ist. Als Zelltyp kann beispielsweise eine eukaryotische Zelle, vorzugsweise eine somatische Zelle, vorgesehen sein. Beispielsweise kann die somatische Zelle eine Blutzelle sein. Vorzugsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines Zelltyps, insbesondere eines einzelligen oder mehrzelligen Mikroorganismus, in einer Probe verwendet werden. Somit können einzelne Mikroorganismen nachgewiesen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch beispielsweise zum Nachweis einer somatischen Zelle, insbesondere einer Blutzelle, vorgesehen sein.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass wenigstens eine Zusatzsubstanz in das Tröpfchen in einem Fusionsschritt eingebracht wird. Beispielsweise kann das Tröpfchen während des Fusionsschritts mit einem weiteren Tröpfchen, das die Zusatzsubstanz enthält, fusionieren. Besonders zweckmäßig kann es dabei sein, wenn das Tröpfchen mit einem weiteren Tröpfchen vor Durchführung des Nachweisschritts fusioniert wird. Es kann weiterhin alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Zusatzsubstanz in das Tröpfchen durch Injektion eingebracht wird. Vorzugsweise wird dabei als Zusatzsubstanz wenigstens eine Substanz oder eine Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen ausgewählt aus der Sonde, einem oder dem Lysereagenz, Enzymsubstrat, Nährmedium, Vitalitätsfarbstoff und Wachstumsindikatoren, insbesondere für Bakterien, verwendet. Durch das gezielte Verschmelzen zweier Tröpfchen oder Injektion von Reagenzien ist eine Kombination verschiedener Färbeverfahren bzw. Nachweisverfahren erreichbar.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass im Nachweisschritt ein Analyt einer Nachweisreaktion innerhalb des Tröpfchens gemessen wird. Beispielsweise kann ein Analyt einer Nachweisreaktion innerhalb des Tröpfchens optisch gemessen werden. Insbesondere kann ein Analyt einer Nachweisreaktion mittels Zytometrie gemessen werden. Alternativ oder zusätzlich kann die optische Messung mittels eines Bildauswerteverfahrens erfolgen, wobei die Grenzen der Tröpfchen erkannt werden. Vorteilhaft ist dabei, dass eine Zählung oder Quantifizierung einzelner Tröpfchen und somit auch einzelner Zelltypen, insbesondere einzelner Mikroorganismen, in einer Probe ermöglicht werden kann.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass eine oder die Nachweisreaktion innerhalb des Tröpfchens durchgeführt wird. Von Vorteil ist dabei, dass das Reaktionsvolumen auf das Tröpfchenvolumen reduziert werden kann. Das reduzierte Reaktionsvolumen ermöglicht eine Reduktion der Reaktionszeit und damit auch die Markierungszeit. Durch die reduzierte Reaktionszeit ist ein schneller Nachweis eines Zelltyps, insbesondere eines Mikroorganismus, in einer Probe erreichbar.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass als wenigstens eine Sonde wenigstens eine Nukleinsäureprobe verwendet wird. Beispielsweise werden dabei wenigstens eine oder mehrere Nukleinsäureproben verwendet, ausgewählt aus Molecular Beacons, FRET Proben und/oder Quenched autoligated Proben. Durch die Verwendung der genannten Nukleinsäureproben mit Sekundärstruktur sind eine höhere Fluoreszenzintensität sowie ein besseres Signal-RauschVerhältnis erreichbar, was insbesondere für eine automatisierte Anwendung vorteilhaft ist.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass auf eine multiple Markierung des wenigstens einen Sondentyps zurückgegriffen wird. Insbesondere kann eine multiple Markierung von Nukleinsäuren mittels DOPE-Probes und/oder Tetra-Probes ermöglicht werden. Somit ist eine hohe Signalstärke erreichbar, die eine optische Detektion der Tröpfchen-Signale ermöglicht. Beispielsweise kann eine multiple Markierung dadurch erreicht werden, dass der oder ein erster Sondentyp einen ersten Farbstoff und der oder ein zweiter Sondentyp einen zweiten Farbstoff aufweist. Vorteilhaft ist dabei, dass durch den Einsatz verschiedener Farbstoffe der Nachweis einer bestimmten Farbkombination und somit Charakterisierung unterschiedlicher Merkmale eines enkapsulierten Zelltyps, insbesondere Mikroorganismus, ermöglicht werden kann.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass wenigstens eine Signalverstärkungssubstanz im Nachweisschritt verwendet wird. Insbesondere kann eine Signalverstärkung durch ein CARD-FISH-Verfahren, ein in-situ-PCR-Verfahren und/oder RNAScope Technologie erfolgen. Vorzugsweise kann dabei die wenigstens eine Signalverstärkungssubstanz vor Durchführung des Nachweisschritts ins Tröpfchen eingebracht werden. Die Signalverstärkungssubtanz kann auch durch Fusion mit einem weiteren Tröpfchen oder Injektion eingebracht werden. Eine Signalverstärkung kann auch durch Vermehrung von Mikroorganismen innerhalb der Tröpfchen ermöglicht werden, wenn diese Mikroorganismen vor der Vermehrung durch die Verkapselung vereinzelt worden sind. Vorteilhaft ist dabei, dass der Nullnachweis, also der Nachweis, dass sicher keine lebenden Mikroorganismen vorhanden sind, schneller durchgeführt werden kann.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Detektion und/oder Quantifizierung mittels einer Methode oder einer Kombination aus einer oder mehreren Methoden ausgewählt aus Durchflusszytometrie, Solid-Phase Zytometrie, Mikroskopie und Bildauswerteverfahren vorgenommen wird. Durch die genannten optischen Verfahren kann der Nachweis bestimmter Eigenschaften von Mikroorganismen oder Zellpopulationen auf Einzelzellebene ermöglicht werden. Von Vorteil ist dabei, dass eine Automatisierung und eine hohe Auswertegeschwindigkeit erreichbar sind.
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Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben, ist aber nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt. Weitere Ausführungsbeispiele ergeben sich durch Kombination der Merkmale einzelner oder mehrerer Schutzansprüche untereinander und/oder mit einzelnen oder mehreren Merkmalen der Ausführungsbeispiele.
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Es zeigt:
- 1 eine erste Ausführungsvariante eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einer schematischen Darstellung,
- 2 eine weitere Ausführungsvariante eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einer schematischen Darstellung,
- 3 eine weitere Ausführungsvariante eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einer schematischen Darstellung,
- 4 das Verfahren gemäß 1 in einer detaillierten Darstellung,
- 5 das Tröpfchen mit positivem Signal aus 4 in einer Detailansicht,
- 6 das Tröpfchen mit negativem Signal aus 4 in einer Detailansicht.
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In den 1 bis 4 ist ein Verfahren zum Nachweis wenigstens eines Zelltyps in verschiedenen Ausführungen gezeigt.
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1 zeigt eine erste Ausführungsvariante eines erfindungsgemäßen Verfahrens 1 zur Detektion und/oder zur Quantifizierung wenigstens eines Zelltyps 2, umfassend die folgenden Schritte: Tröpfchengenerierung 3 durch Enkapsulierung von Zelltypen 2 in Tröpfchen zusammen mit Reagenzien (Hybridisierungsmix, Lyse-Reagenzien); Lyse von Zelltypen mit den Lyse-Reagenzien und Hybridisierung mit Sonden aus dem Hybridisierungsmix, wobei die Schritte der Lyse und der Hybridisierung in einem Verfahrensschritt 4 erfolgen; Nachweis 5 der Sonde aus dem Verfahrensschritt 4 durch Detektion einzelner Tröpfchensignale.
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2 und 3 zeigen weitere Ausführungsvarianten eines erfindungsgemäßen Verfahrens 1 zur Detektion und/oder zur Quantifizierung wenigstens eines Zelltyps 2.
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Nach dem Schritt der Tröpfchengenerierung 3 durch Enkapsulierung von Zelltypen 2 in Tröpfchen zusammen mit Reagenzien werden die Tröpfchen mit Nährmedium, Vitalitätsfarbstoffen und/oder Nährmedium mit Indikatoren von bakteriellem Wachstum prä-inkubiert 6 oder mit Leben/Tot Farbstoffen prä-inkubiert 8.
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Anschließend erfolgt eine Tröpfchen-Fusion oder Tröpfchen-Injektion 7, um weitere Substanzen wie Hybridisierungsmix und Lyse-Reagenzien in die Tröpfchen zu integrieren. Danach werden die Zelltypen mit den Lyse-Reagenzien lysiert und mit Sonden aus dem Hybridisierungsmix hybridisiert, wobei die Schritte der Lyse und der Hybridisierung in einem Verfahrensschritt 4 erfolgen. Nach dem Verfahrensschritt 4 folgt der Nachweis 5 der Sonde 16 durch Detektion einzelner Tröpfchensignale 14.
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Aus 3 ist weiterhin ersichtlich, dass nach dem Schritt der Prä-Inkubation 8 mit Leben/Tot Farbstoffen ein optionaler Nachweis und/oder Selektion 9 der Tröpfchen 3 mit positiver Reaktion erfolgt (Primär-Positive Tröpfchen). Als Lebend/Tot Farbstoffen können beispielsweise Fluorescein-Diacetat oder Carboxyfluorescein-Diacetat verwendet werden.
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Der Nachweis 5 der Sonde 16 aus dem Verfahrensschritt 4 wird durch Detektion einzelner Tröpfchensignale (Sekundär-Positive Tröpfchen) beispielsweise mittels Durchflusszytometrie durchgeführt.
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4 zeigt das Verfahren gemäß 1 in einer detaillierten Darstellung. Die Mischpopulation von Zelltypen 10 enthält sowohl Ziel-Zelltypen 13 als auch Nichtziel-Zelltypen 11. Bei dem Schritt der Enkapsulierung 3 von einzelnen Zelltypen in Tröpfchen mit Hybridisierungs-/Lyse-Reagenzien und Sonden werden Tröpfchen mit Nichtziel-Zelltypen 11, Tröpfchen ohne Zelltypen 12 und Tröpfchen mit Ziel-Zelltypen 13 generiert.
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Bei dem anschließenden Verfahrensschritt 4 der Lyse von Zelltypen in Tröpfchen und der Hybridisierung mit Sonden aus dem Hybridisierungsmix werden die positiven Signale 14 von Tröpfchen mit Ziel-Zelltypen 13 entwickelt.
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5 zeigt ein Tröpfchen 14 mit positivem Signal aus 4 in einer Detailansicht. Die gequenchten Sonden 16 mit einem daran gebundenen Marker 17 für spezifische Detektion können sich an die Zielsequenz im Tröpfchen-Inneren binden. Dabei werden die Doppelstrang-Hybride 18 aus Sonde und Ziel-Nukleinsäure gebildet.
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6 zeigt ein Tröpfchen 15 mit negativem Signal aus 4 in einer Detailansicht. Die Bindung der gequenchten Sonden 16 mit einem daran gebundenen Marker 17 an die Nukleinsäuren im Tröpfchen-Inneren findet nicht statt, da diese Tröpfchen Nichtziel-Zelltypen oder keine Zelltypen enthalten.
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In einer bevorzugten Anwendung wird zunächst die Untersuchungsprobe mit Zelltypen 2 zusammen mit Reagenzien (Hybridisierungsmix, Lyse-Reagenzien) in Tröpfchen enkapsuliert 3. Durch die Enkapsulierung 3 der Zelltypen in Tröpfchen kann eine In-Situ-Hybridisierung der einzelnen Zelltypen mit komplexen Reagenzien ohne Einschleusen der Reagenzien in die Zelltypen ermöglicht werden. Nun werden die Zelltypen innerhalb der Tröpfchen mit den Lyse-Reagenzien lysiert 4 und mit Sonden aus dem Hybridisierungsmix hybridisiert 4. Anschließend wird die Nachweisreaktion 5 durch die Detektion der Tröpfchen-Signale mittels Durchflusszytometrie durchgeführt.
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Erfindungsgemäß wird somit vorgeschlagen, ein Verfahren 1 zur Detektion und/oder zur Quantifizierung wenigstens eines Zelltyps 2, insbesondere einer somatischen Zelle und/oder eines einzelligen oder mehrzelligen Mikroorganismus, bereitzustellen, wobei wenigstens eine spezifisch an einen Nukleinsäureabschnitt des wenigstens einen Zelltyps 2 bindende Sonde 16 mit diesem in Verbindung gebracht wird 4, und wobei ein Nachweis der Sonde in einem Nachweisschritt 5 indirekt zur Detektion und/oder zur Quantifizierung des wenigstens einen Zelltyps 2 verwendet wird, wobei der wenigstens eine Zelltyp 2 zusammen mit dem wenigstens einen Sondentyp in einem Tröpfchen eingebracht wird 3, und dass eine Zellbegrenzung, insbesondere eine Zellmembran und/oder eine Zellwand, innerhalb des Tröpfchens permeabilisiert und/oder komplett aufgelöst wird, so dass eine spezifische Bindung 4 der wenigstens einen Sonde 16 an den Nukleinsäureabschnitt erfolgt.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- erfindungsgemäßes Verfahren
- 2
- Zelltypen
- 3
- Enkapsulierung in Tröpfchen
- 4
- Lyse von Zelltypen in Tröpfchen und Hybridisierung
- 5
- Detektion
- 6
- Prä-Inkubation mit Nährmedium, Vitalitätsfarbstoffen, und/oder Nährmedium mit Indikatoren von bakteriellem Wachstum
- 7
- Tröpfchen-Fusion oder Tröpfchen-Injektion
- 8
- Prä-Inkubation mit Leben/Tot Farbstoffen
- 9
- Optionale Messung oder Tröpfchen Selektion
- 10
- Mischpopulation von Zelltypen
- 11
- Tröpfchen mit Nichtziel-Zelltyp
- 12
- Tröpfchen ohne Zelltyp
- 13
- Tröpfchen mit Ziel-Zelltyp
- 14
- Tröpfchen mit positivem Signal
- 15
- Tröpfchen mit negativem Signal
- 16
- gequenchte Sonde
- 17
- Marker
- 18
- Doppelstrang-Hybride aus Sonde und Ziel-Nukleinsäure
