DE102019122467B4

DE102019122467B4 - Verfahren zur Durchführung von in vitro-Freisetzungsstudien

Info

Publication number: DE102019122467B4
Application number: DE102019122467.5A
Authority: DE
Inventors: Andreas Koch
Original assignee: LTS Lohmann Therapie Systeme AG
Current assignee: LTS Lohmann Therapie Systeme AG
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2024-06-06
Anticipated expiration: 2039-08-22
Also published as: DE102019122467A1

Abstract

Verfahren zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen umfassend(i) Bereitstellen eines Einsatzes umfassend einen polygonalen, ovalen oder kreisförmigen Hohlzylinder mit einer inneren Mantelfläche (a) und einer äußeren Mantelfläche (b), einer Bodenfläche (c) und einer Öffnung (d), wobei die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) parallel zueinander angeordnet sind, wobei die Öffnung (d) das erste Ende des Hohlzylinders bildet, und die Bodenfläche (c) des Hohlzylinders von einer Membran gebildet wird und das zweite Ende des Hohlzylinders bildet, wobei die Membran eine kunststoffbasierte Membran ist, und wobei die äußere Mantelfläche (b) ein Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter aufweist, und wobei das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter mindestens einen flanschartigen Vorsprung auf der äußeren Mantelfläche (b) darstellt;(ii) Bestücken des Einsatzes mit einem inhaltsstoffhaltigen Medium;(iii) Platzieren des Einsatzes in einen Behälter, der ein Akzeptormedium erhält, wobei die Membran des Einsatzes mit dem Akzeptormedium in Kontakt steht;(iv) Inkubation;(v) Bestimmung der Inhaltsstoffmenge in dem Akzeptormedium.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen filmförmiger, schnell zerfallender pharmazeutischer Darreichungsformen, sowie die Verwendung einer dafür geeigneten Vorrichtung. Die Miniaturform und ein einfaches Design ermöglichen eine sehr schnelle Probeentnahme.
Bei der Entwicklung von filmförmigen, schnell zerfallenden pharmazeutischen Darreichungsformen (auch oral thin film = OTF, fast dissolving strips, „wirkstoffhaltiger Film“ oder wafer genannt) stellt die Durchführung von in vitro-Freisetzungsstudien eine große Herausforderung dar. Die Standards für die Durchführung von in vitro-Freisetzungsstudien für die Entwicklung und Qualitätskontrolle von wirkstoffhaltigen Filmen sind die in der United States Pharmacopeia (USP) beschriebenen Methoden Testapparatur USP 1 „Rotating Basket“ und USP 2 „Rotating Paddle“ (USP 41-NF 38, Chapter 711 „Dissolution“, 2018). Wesentliches Merkmal dieser beiden Methoden ist es, dass diese apparativ sehr aufwendig sind, relativ große Mengen an Freisetzungsmedien benötigen und aufgrund ihrer Funktionsweise nur eingeschränkt eine schnelle Probeentnahme in kurzen Intervallabständen zulassen. In vielen Anwendungsfällen hat sich beispielsweise der wirkstoffhaltige Film nach Start der Apparatur schon komplett aufgelöst, bevor überhaupt eine erste Probe entnommen werden kann, um das kinetische Freisetzungsverhalten zu untersuchen. Auch dauert allein das Procedere für die Probeentnahme, in der Regel mittels Pipetten oder Spritzen, zu lange. Deshalb wird in vielen Fällen auch nur die reine Auflösezeit eines wirkstoffhaltigen Films in Wasser oder einem wasserhaltigen Medium als Qualitätsmerkmal oder Kriterium für die Rezepturentwicklung betrachtet.
Für bestimmte Fragestellungen bei der Entwicklung von filmförmigen, schnell zerfallenden pharmazeutischen Darreichungsformen ist es erforderlich, das kinetische Freisetzungsverhalten zu erfassen. Hierfür müssen Konzentrationen als Funktion der Zerfallszeit bestimmt werden. Die reine Gehaltsbestimmung nach schnell erfolgter Auflösung der Darreichungsform reicht hierfür nicht aus. Die oben beschriebenen Apparaturen gemäß Stand der Technik benötigen jedoch alleine für die Bestückung dieser mit den Proben der Darreichungsformen (Justieren der Probe im Probengefäß, Befüllung dieser mit Freisetzungsmedium und Justierung des technischen Rührerteiles) letztendlich so viel Zeit, dass sich die Probe bis zur theoretisch möglichen ersten Probeentnahme bereits vollständig aufgelöst hat.
Ein weiteres Problem dieser Freisetzungsapparaturen ist das Problem des Floatierens. Unter Floatieren versteht man das Problem, das die zu untersuchende Probe aufgrund ihres geringen Gewichts und/oder wegen der Oberflächenspannung des Akzeptormediums darauf schwebt oder schwimmt. Dieses Problem tritt insbesondere bei schnell zerfallenden, wirkstoffhaltigen Filmen auf. Zur Vermeidung dieses Problems müssen diese Proben zusätzlich in einem Freisetzungsgefäß fixiert werden, z.B. in der USP 2-Apparatur mit Hilfe sogenannter „sinker“, was aber zusätzlich wertvolle Zeit kostet und unter Umständen die Probe beschädigen kann.
Die Druckschrift Berben, Philippe; Brouwers, Joachim; Augustijns, Patrick: Assesment of Passive Intestinal Permeability Using an Artificial Membrane Insert System. In: Journal of Phamaceutical Sciences, Vol. 107, 2018, No.1, S. 250-256 offenbart ein Verfahren, in dem Wirkstoffe in zwei unterschiedlichen Medien gelöst und in einen Donoreinsatz eines künstlichen Membraneinsatzsystems (AMI-System) eingebracht werden. Der Donoreinsatz besitzt Vorsprünge auf der Unterseite des Einsatzes und wird auf diesen Vorsprüngen stehend in eine Akzeptorkammer gestellt. In diesem AMI-System wird eine Cellulose Membran verwendet.
Die Druckschriften Bala, Rajni; Khanna, Sushil; Pawar, Pravin: Design Optimization and In Vitro-In Vivo Evaluation of Orally Dissolving Strips of Clobazam. In: Journal of Drug Delivery, 2014, S 1-15, Article ID 392783 und Arya, Arun [et al]: Fast Dissolving Oral Films: An Innovative Drug Delivery System and Dosage Form. In: International Journal of ChemTech Research, Vol. 2, 2010; No. 1 S. 576-583 betreffen in-vitro Auflösungsstudien bei denen unter anderem die Auflösung von wirkstoffhaltigen Filmen untersucht wird. In den dafür verwendeten Verfahren werden USP paddle / USP II paddle Apparaturen eingesetzt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ein Verfahren bereitzustellen, das eine schnelle Probeentnahme gewährleistet, ohne dass sich die zu untersuchende Probe bis zur ersten Probeentnahme aufgelöst hat, sowie eine dafür geeignete Vorrichtung.
Gelöst wird diese Aufgabe durch das Verfahren zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung. Dieses Verfahren umfasst, die Schritte

(i) Bereitstellung eines Einsatzes umfassend einen polygonalen, ovalen oder kreisförmigen Hohlzylinder mit einer inneren Mantelfläche (a) und einer äußeren Mantelfläche (b), einer Bodenfläche (c) und einer Öffnung (d), wobei die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) parallel zueinander angeordnet sind, wobei die Öffnung (d) das erste Ende des Hohlzylinders bildet, und die Bodenfläche (c) des Hohlzylinders von einer Membran gebildet wird und das zweite Ende des Hohlzylinders bildet, wobei die Membran eine kunststoffbasierte Membran ist, und wobei die äußere Mantelfläche (b) ein Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter aufweist, und wobei das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter mindestens einen flanschartigen Vorsprung auf der äußeren Mantelfläche (b) darstellt;
(ii) Bestücken des Einsatzes mit einem inhaltsstoffhaltigen Medium;
(iii) Platzieren des Einsatzes in einen Behälter, der ein Akzeptormedium erhält, wobei die Membran des Einsatzes mit dem Akzeptormedium in Kontakt steht;
(iv) Inkubation;
(v) Bestimmung der Inhaltsstoffmenge in dem Akzeptormedium.

Der Einsatz:
Der Einsatz ist ein Hohlzylinder mit einem Boden, wobei der Zylinder nicht streng röhrenförmig sein muss, sondern einen Kegelstumpf bilden kann, bei dem die Deckfläche dem Boden entspricht.
Erfindungsgemäß beträgt der Durchmesser der Bodenfläche (c) und der Durchmesser der Öffnung (d) unabhängig voneinander 6,3 bis 32 mm, bevorzugt von 9,5 bis 19 mm, besonders bevorzugt von 12,0 bis 13,7 mm. Es ist bevorzugt, dass die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) einen nahezu identischen Durchmesser besitzen. Nahezu identisch bedeutet, dass sich der Durchmesser der beiden Öffnungen um nicht mehr als 0,1 bis 7 mm, bevorzugt um nicht mehr als 0,5 bis 3 mm unterscheidet. Ganz besonders bevorzugt besitzen die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) einen identischen Durchmesser. Dadurch, dass die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) einen identischen Durchmesser besitzen, wird eine gute Sichtkontrolle ermöglicht. Dies hat den Vorteil hat, dass die Auflösung der inhaltsstoffhaltigen Darreichungsform durch die Öffnung (d) optisch leicht kontrolliert werden kann.
Der Abstand zwischen der inneren Mantelfläche (a) und der äußeren Mantelfläche (b) ist bevorzugt identisch. Erfindungsgemäß beträgt der Abstand zwischen innerer Mantelfläche (a) und äußerer Mantelfläche (b) 0,1 bis 5 mm, bevorzugt von 0,5 bis 2,5 mm, besonders bevorzugt von 1 bis 2 mm.
Die Höhe des Einsatzes kann zwischen 10 und 30 mm betragen, vorzugsweise zwischen 15 und 20 mm. Vorzugsweise werden Einsätze mit einer konstanten Höhe von 16,25 mm verwendet.
Das Innenvolumen eines Einsatzes kann zwischen 1 und 10 ml betragen. Vorzugsweise werden Einsätze verwendet, die ein Innenvolumen von 2 ml besitzen.
Hinsichtlich des Materials aus dem der Hohlzylinder und das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter bestehen, gibt es keine spezifischen Beschränkungen. Der Hohlzylinder und das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter können aus Glas, einem Kunststoff wie beispielsweise Polyethylen oder Polyethylenterephthalat oder einem Metall wie beispielsweise Edelstahl bestehen.
Die äußere Mantelfläche (b) des Einsatzes weist ein Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter auf. Aufnahme bedeutet in diesem Sinn, dass der Einsatz so in einem Behälter platziert wird, dass die Membran, die die Bodenfläche (c) bildet, mit dem Akzeptormedium, das sich in dem Behälter befindet in Kontakt kommt, sodass ein Inhaltsstoff aus einem inhaltsstoffhaltigen Medium, das sich auf der Membran befindet, durch die Membran hindurch in das Akzeptormedium gelangen kann.
Das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter stellt mindestens einen flanschartigen Vorsprung auf der äußeren Mantelfläche (b) dar.
Flanschartig im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass der Hohlzylinder an der äußeren Mantelfläche (b) einen Vorsprung aufweist, der sich horizontal zur äußeren Mantelfläche (b), von dem Körper weg erstreckt.
Bevorzugt beträgt die Länge des flanschartigen Vorsprungs, das heißt, die Länge ab der äußeren Mantelfläche (b) bis zum Ende des flanschartigen Vorsprungs von 2 bis 12 mm, besonders bevorzugt von 4 bis 6 mm.
Der flanschartige Vorsprung kann als ringförmige Verbreiterung ausgestaltet sein, sodass sich der flanschartige Vorsprung um den gesamten Umfang der äußeren Mantelfläche (b) erstreckt. Alternativ kann der flanschartige Vorsprung so ausgestaltet sein, dass er sich nur um einen Teilbereich des Umfangs der äußeren Mantelfläche (b) erstreckt. Wenn sich der flanschartige Vorsprung um einen Teilbereich des Umfangs der äußeren Mantelfläche (b) erstreckt, beträgt die Breite des flanschartigen Vorsprungs von 0,5 bis 8 mm, bevorzugt von 1 bis 5 mm, besonders bevorzugt von 2 bis 4 mm. Wenn sich der flanschartige Vorsprung um einen Teilbereich der äußeren Mantelfläche (b) erstreckt, stellt das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter bevorzugt mindestens zwei flanschartige Vorsprünge dar. Die Anzahl der flanschartigen Vorsprünge ist nicht begrenzt, wenn sich diese um einen Teilbereich der äußeren Mantelfläche (b) erstrecken. Das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter kann in diesem Fall 2, 3, 4, 5, 6, 7, oder mehr flanschartige Vorsprünge besitzen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter drei flanschartige Vorsprünge darstellt, die sich um einen Teilbereich des Umfangs der äußeren Mantelfläche (b) erstrecken.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter an der äußeren Mantelfläche (b) bevorzugt in der Höhe des ersten Endes des Körpers angebracht.
Der Einsatz kann auch einen stiel- oder bügelförmigen Griff zum leichteren Anfassen besitzen, der an der oberen Öffnung (d) bzw. an den flanschartigen Vorsprüngen ansetzt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können mehrere Einsätze miteinander verbunden sein, so dass diese nicht einzeln sondern gleichzeitig in den Behälter/die Behälter eingesetzt werden können. Um die Behälter miteinander zu verbinden, kommt jedes Mittel in Frage, das gewährleistet, dass die Behälter stabil miteinander verbunden sind. Das Mittel, das dazu dient die Einsätze miteinander zu verbinden, besteht bevorzugt aus demselben Material wie die Einsätze.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das inhaltsstoffhaltige Medium durch die Öffnung (d) auf der Membran des Einsatzes platziert. Der Einsatz erlaubt durch eine gute Sichtkontrolle ein gezieltes Bestücken des Einsatzes mit dem inhaltsstoffhaltigen Medium, d.h. ein gezieltes Platzieren des inhaltsstoffhaltigen Mediums auf der Membran die den Boden (c) des Hohlzylinders bildet. Durch die gute Sichtkontrolle ist es möglich zu prüfen, ob das inhaltsstoffhaltige Medium nach der Platzierung auf der Membran intakt ist oder während des Platzierens beschädigt wurde. Weiterhin ist es durch die gute Sichtkontrolle möglich zu beobachten wie schnell sich das inhaltsstoffhaltige Medium in dem Akzeptormedium auflöst.
Um einen Übergang des Inhaltsstoffes aus dem inhaltsstoffhaltigen Medium in das Akzeptormedium zu gewährleisten, stellt die Membran erfindungsgemäß keine Permeationsbarriere dar. Aus diesem Grund wird eine Membran verwendet, die Poren aufweisen. Bevorzugt wird eine mikroporöse Membran verwendet. Die Poren der Membran besitzen einen Durchmesser von 0,4 bis 8,0 µm, bevorzugt 0,6 bis 3,0 µm, besonders bevorzugt 0,8 bis 1,2 µm.
Es gibt keine spezifischen Voraussetzungen dafür auf welche Art die Membran an dem Hohlzylinder angebracht ist, vorausgesetzt es ist gewährleistet, dass die Membran geeignet ist, um das inhaltsstoffhaltige Medium zu tragen und sich nicht während des erfindungsgemäßen Verfahrens von dem Hohlzylinder löst. Bevorzugt ist die Membran mittels siegeln an der Innenseite (a) befestigt.
Die Membran ist eine kunststoffbasierte Membran. Die kunststoffbasierte Membran umfasst Polymere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonaten, Polyethylenterephthalat (PET), regenerierte Cellulose, Polyethersulfone, Celluloseacetat, Nylon, Polyvinylendifluorid und Polypropylen (PP). Bevorzugt sind Polycarbonate.
Eine mikroporöse kunststoffbasierte Membran, die aus Polycarbonaten aufgebaut ist hat den Vorteil, dass sie adhäsive Eigenschaften besitzt. Dadurch wird das Floatieren des inhaltsstoffhaltigen Mediums verringert oder gar ganz vermieden. Membranen aus Polyethylenterephthalat (PET), regenerierter Cellulose, Polyethersulfonen, Celluloseacetat, Nylon und Polyvinylendifluorid weisen diesen Effekt auch auf.
Eine weitere Möglichkeit um das Floatieren des inhaltsstoffhaltigen Mediums zu verhindern ist die Verwendung von inerten Geweben. Daher umfasst das Bestücken des Einsatzes mit einem inhaltsstoffhaltigen Medium gemäß Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens das Abdecken des inhaltsstoffhaltigen Mediums mit einem inerten Gewebe. Dabei wird zunächst das inhaltsstoffhaltige Medium auf der Membran platziert und anschließend wird ein inertes Gewebe so auf dem inhaltsstoffhaltigen Medium platziert, dass das inerte Gewebe das inhaltsstoffhaltige Medium abdeckt. Durch das Eigengewicht des inerten Gewebes wird das Floatieren des wirkstoffhaltigen Mediums verhindert. Als inertes Gewebe kann beispielsweise eine Gaze aus Polypropylen verwendet werden. Solche Gaze sind kommerziell erhältlich, z.B. Optilene^® Mesh der Fa. B. Braun aus Melsungen, Deutschland. Auch Gewebe aus Polyethylenterephthalat (PET), regenerierter Cellulose, Polyethersulfonen, Celluloseacetat, Nylon, Polyvinylendifluorid und Metall sind denkbar.
Das inhaltsstoffhaltige Medium ist bevorzugt ein wirkstoffhaltiges Medium. Wirkstoff ist in diesem Sinne vorzugsweise ein Arzneistoff, d.h. der pharmazeutisch aktive Bestandteil (= „active pharmaceutical ingredient“) eines Medikaments. Als wirkstoffhaltiges Medium kann ein wirkstoffhaltiger Film, eine wirkstoffhaltige Lösung, eine wirkstoffhaltige Salbe oder Creme, oder ein transdermales therapeutisches System verwendet werden. Das inhaltsstoffhaltige Medium, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist bevorzugt ein wirkstoffhaltiger Film, d.h. eine filmförmige, schnell zerfallende pharmazeutische Darreichungsform, auch oral thin film (OTF), fast dissolving strips oder wafer genannt. Derartige Produkte sind detailliert in Borges et al., J. Control. Release, 206, (2015) 1-19 beschrieben.
Nach dem Bestücken des Einsatzes mit dem inhaltsstoffhaltigen Medium wird der Einsatz in einem Behälter platziert, der ein Akzeptormedium erhält, wobei die Membran des Einsatzes mit dem Akzeptormedium in Kontakt steht. Das Platzieren des Einsatzes geschieht mit Hilfe des Mittels zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter.
Zu dem Bestücken des Einsatzes mit dem inhaltsstoffhaltigen Medium gehört auch das einmalige Zugeben einer Flüssigkeit, insbesondere dann, wenn es sich bei dem inhaltsstoffhaltigen Medium um einen Festkörper handelt. Diese Flüssigkeit sorgt dann dafür, dass sich die feste Probe auflöst und während der nachfolgenden Inkubation der Inhaltsstoff durch Diffusion an das Akzeptormedium abgegeben werden kann. Als geeignete Flüssigkeiten können Wasser und pharmazeutisch unbedenkliche Lösungsmittel wie Alkohole (z.B. Ethanol), Ester und Öle in Frage kommen. Vorzugsweise, insbesondere bei der Untersuchung von schnell löslichen wirkstoffhaltigen Filmen werden Wasser enthaltende Lösungen, aber auch pHgepufferte wässrige Lösungen, natürlicher und/oder synthetischer Speichel verwendet. Der pH-Wert solcher gepufferten Lösungen kann zwischen 3,5 und 10 liegen, vorzugsweise zwischen 6,4 und 7,4 und im Idealfall bei 7,0. In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Flüssigkeit mit dem Akzeptormedium identisch.
Die einmalige Zugabe dieser zum Auflösen der festen Probe (z.B. des wirkstoffhaltigen Films) benötigten Flüssigkeit erfolgt unmittelbar vor dem Platzieren des Einsatzes in den Behälter, der das Akzeptormedium enthält oder unmittelbar danach. So ist auf jeden Fall gewährleistet, dass mit dem Beginn der Inkubation die Abgabe des Inhaltsstoffs an das Akzeptormedium erfolgen kann.
Der Behälter:
Bezüglich des Materials und der Gestaltung des Behälters gibt es keine Beschränkungen, vorausgesetzt der Behälter ist dazu geeignet ein Akzeptormedium zu beinhalten, den Einsatz aufzunehmen und zur Inkubation verwendet zu werden. Geeignete Behälter bestehen beispielsweise aus Glas, Polyolefin oder Polystyrol. In der einfachsten Ausführungsform stellt der Behälter ein Becherglas oder eine Petrischale dar. Die Größe des Behälters wird erfindungsgemäß in Abhängigkeit von der Größe des Einsatzes gewählt. Als Behälter eignen sich besonders gut Mikrotiterplatten, die auch Multi Well Plates genannt werden, die 6, 12, 24 oder 48 Näpfe für die Aufnahme der Einsätze besitzen. Entsprechend dieser Zahl Näpfe beträgt das Volumen eines einzelnen Napfes 2 bis 16 ml (6 Näpfe), 2 bis 6,5 ml (12 Näpfe), 0,5 bis 3,3 ml (24 Näpfe) bzw. 0,5 bis 1,7 ml (48 Näpfe). Ein besonders bevorzugter Behälter ist eine Mikrotiterplatte mit 6 Näpfen, die ein Volumen von jeweils 10 ml besitzen.
Die Abmessungen einer solchen, erfindungsgemäßen Apparatur sind mit 26 x 40 x 47 (Länge x Höhe x Tiefe in cm) deutlich kleiner als der Platzbedarf einer Apparatur entsprechend USP 2 „Rotating Paddle“, welche in kleinster Ausführung ca. 55 x 40 x 50 (Länge x Höhe x Tiefe in cm) bei manueller Probennahme benötigt.
Für die vorzugsweise verwendete Multititerplatte beträgt der Platzbedarf nur 12,5 x 3,5 x 8,5 (Länge x Höhe x Tiefe in cm).
Das Verfahren:
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können eine, zwei oder mehrere Messungen zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen parallel durchgeführt werden. Das bedeutet, dass eine Vielzahl von Einsätzen gleichzeitig verwendet werden kann. Werden mehrere Messungen parallel durchgeführt oder soll der Behälter während eines Verfahrens mehrfach gewechselt werden, ist es bevorzugt, dass als Behälter eine Multititerplatte verwendet wird. Beispiele für eine solche Multititerplatten sind 6-Well und 12-Well Deep-Well-Platten der Firma Greiner Bio One, die 6 bzw. 12 Näpfe zur Aufnahme eines Einsatzes besitzen.
Nachdem der mindestens eine Einsatz in einem ersten Napf des ersten Behälters platziert wurde, findet die Inkubation statt. Die Inkubation findet bei einer konstanten Temperatur in einem Bereich von 30 bis 42°C, bevorzugt von 33 bis 40°C, besonders bevorzugt von 36 bis 38°C statt. Ganz besonders bevorzugt ist eine konstante Temperatur von 37°C, wie sie in der Mundhöhle eines Menschen herrscht. Während der Inkubation tritt der Inhaltsstoff aus dem inhaltsstoffhaltigen Medium aus und wird von dem Akzeptormedium im ersten Napf aufgenommen.
Die Inkubation wird bevorzugt so durchgeführt, dass das Akzeptormedium in dem Behälter bewegt wird, um eine gleichmäßig Durchmischung des Akzeptormediums zu gewährleisten. Um eine solche Durchmischung zu erreichen, ist es bevorzugt, dass der Behälter ein Mittel zum gleichmäßigen Durchmischen des Akzeptormediums umfasst. Dieses Mittel kann beispielsweise ein Rührfisch sein, der zusammen mit einem Magnetrührer verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt mindestens einen Wechsel des Akzeptormediums bzw. des Behälters. Dies geschieht, indem der Einsatz aus dem ersten Napf eines ersten Behälters, der inzwischen das inhaltsstoffhaltige Akzeptormedium enthält entnommen und in einen zweiten bzw. weiteren Napf des ersten Behälters, der vorzugsweise ein mit dem Akzeptormedium des ersten Napfes identisches Akzeptormedium enthält, eingesetzt wird. Im Anschluss an den mindestens einen Wechsel des Akzeptormediums bzw. des Behälters findet erneut eine Inkubation bei einer identischen Temperatur in einem Bereich von 30 bis 42°C, bevorzugt von 33 bis 40°C, besonders bevorzugt von 36 bis 38°C, und ganz besonders bevorzugt bei einer konstanten Temperatur von 37°C statt.
Im Anschluss an jede Inkubation wird die Menge an Inhaltsstoff im Akzeptormedium des jeweiligen Näpfchens bestimmt. Diese Bestimmung erfolgt mittels gängiger Methoden der quantitativen chemischen Analyse, beispielsweise mittels HPLC. Methoden, um die freigesetzte Menge an Inhaltsstoff quantitativ in dem Akzeptormedium zu bestimmen, sind dem Fachmann bekannt.
Somit umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte,

(vi) Entnahme des Einsatzes aus dem ersten Napf eines ersten Behälters und Platzieren des Einsatzes in einen zweiten (bzw. jeden weiteren) Napf des ersten Behälters;
(vii) Inkubation;
(viii) Bestimmung der Inhaltsstoffmenge im Akzeptormedium.

Die Schritte (vi) bis (viii) können prinzipiell beliebig oft wiederholt werden, so dass entsprechend viele Näpfe mit Inhaltsstoff im Akzeptormedium untersucht werden können. Dabei wird die Anzahl der möglichen Wechsel des Akzeptormediums durch die Zeit bis zur kompletten Auflösung des inhaltsstoffhaltigen Mediums begrenzt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, bereits nach sehr kurzer Zeit, d. h. nach wenigen Sekunden den Einsatz aus dem ersten Napf zu entnehmen und in den zweiten (bzw. jeden weiteren) Napf zu platzieren. Der Zeitraum, der eine Inkubation gemäß Schritt (vii) dauert, sollte jedoch vorzugsweise konstant sein, um die Auswertung der Resultate zu erleichtern. Geeignet ist ein Zeitraum von 10, 20, oder 30 Sekunden bzw. ein Vielfaches davon.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Vorrichtung zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen in einem Verfahren zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen.
Die Vorrichtung zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen umfassend

a) einen Einsatz umfassend einen polygonalen, ovalen oder kreisförmigen Hohlzylinder mit einer inneren Mantelfläche (a) und einer äußeren Mantelfläche (b), einer Bodenfläche (c) und einer Öffnung (d), wobei die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) parallel zueinander angeordnet sind, wobei die Öffnung (d) das erste Ende des Hohlzylinders bildet, und die Bodenfläche (c) des Hohlzylinders von einer Membran gebildet wird und das zweite Ende des Hohlzylinders bildet wobei die Membran eine kunststoffbasierte Membran ist, und wobei die äußere Mantelfläche (b) ein Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter aufweist, und wobei das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter mindestens einen flanschartigen Vorsprung auf der äußeren Mantelfläche (b) darstellt; und
b) einen Behälter, der ein Akzeptormedium erhält.

Bei der Vorrichtung handelt es sich um die Vorrichtung, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen verwendet wird.
Der Durchmesser der Bodenfläche (c) und der Durchmesser der Öffnung (d) betragen unabhängig voneinander 6,3 bis 32 mm, bevorzugt von 9,5 bis 19 mm, besonders bevorzugt von 12,0 bis 13,7 mm. Es ist bevorzugt, dass die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) einen nahezu identischen Durchmesser besitzen. Ganz besonders bevorzugt besitzen die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) einen identischen Durchmesser
Der Abstand zwischen der inneren Mantelfläche (a) und der äußeren Mantelfläche (b) ist bevorzugt identisch. Erfindungsgemäß beträgt der Abstand zwischen innerer Mantelfläche (a) und äußerer Mantelfläche (b) 0,1 bis 5 mm, bevorzugt von 0,5 bis 2,5 mm, besonders bevorzugt von 1 bis 2 mm.
Der Hohlzylinder und das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter können aus Glas, einem Kunststoff wie beispielsweise Polyethylen oder Polyethylenterephthalat oder einem Metall wie beispielsweise Edelstahl bestehen.
Die äußere Mantelfläche (b) des Einsatzes weist ein Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter auf. Das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter stellt mindestens einen flanschartigen Vorsprung auf der äußeren Mantelfläche (b) dar.
Bevorzugt beträgt die Länge des flanschartigen Vorsprungs, das heißt, die Länge ab der äußeren Mantelfläche (b) bis zum Ende des flanschartigen Vorsprungs von 2 bis 12 mm, besonders bevorzugt von 4 bis 6 mm.
Wenn sich der flanschartige Vorsprung um einen Teilbereich des Umfangs der äußeren Mantelfläche (b) erstreckt, beträgt die Breite des flanschartigen Vorsprungs von 0,5 bis 8 mm, bevorzugt von 1 bis 5 mm, besonders bevorzugt von 2 bis 4 mm. Wenn sich der flanschartige Vorsprung um einen Teilbereich der äußeren Mantelfläche (b) erstreckt, stellt das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter bevorzugt mindestens zwei flanschartige Vorsprünge dar. Die Anzahl der flanschartigen Vorsprünge ist nicht begrenzt, wenn sich diese um einen Teilbereich der äußeren Mantelfläche (b) erstrecken. Das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter kann in diesem Fall 2, 3, 4, 5, 6, 7, oder mehr flanschartige Vorsprünge besitzen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter drei flanschartige Vorsprünge darstellt, die sich um einen Teilbereich des Umfangs der äußeren Mantelfläche (b) erstrecken.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter an der äußeren Mantelfläche (b) bevorzugt in der Höhe des ersten Endes des Körpers angebracht.
Die in der Vorrichtung verwendete Membran weist Poren auf. Bevorzugt wird eine mikroporöse Membran verwendet. Die Poren der Membran besitzen einen Durchmesser von 0,4 bis 8,0 µm, bevorzugt 0,6 bis 3,0 µm, besonders bevorzugt 0,8 bis 1,2 µm.
Die Membran ist eine kunststoffbasierte Membran. Die kunststoffbasierte Membran umfasst Polymere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonaten, Polyethylenterephthalat (PET), regenerierte Cellulose, Polyethersulfone, Celluloseacetat, Nylon, Polyvinylendifluorid und Polypropylen (PP). Bevorzugt sind Polycarbonate.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem Verfahren zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen.
Beispiele
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne diese hierauf zu beschränken. Vielmehr sind alle genannten Merkmale in jeder für den Fachmann als geeignet erscheinenden Form frei kombinierbar, und alle diese Formen werden von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Beispiel 1
In allen Beispielen wurden zwei wirkstoffhaltige Filme mit unterschiedlichen Formulierungen getestet. Als Wirkstoff wurde in beiden Fällen „Substanz A“, ein Hormon aus der Klasse der Katecholamine, in einem Gehalt von 50 Gew.-% eingesetzt. Die beiden wirkstoffhaltigen Filme unterschieden sich hinsichtlich der Zusammensetzung des Trägermaterials:

Film 1: Trägermaterial: 50 Gew.-% Polyvinylalkohol mit einem Hydrolysegrad von über 98%.
Film 2: Trägermaterial: 50 Gew.-% Polyvinylacetat-Polyethylenglycol-PfropfCopolymer.

Aus den wirkstoffhaltigen Filmen wurden mit Hilfe von Henkellocheisen runde Stanzlinge mit einer Fläche von 0,287 cm² ausgestanzt. Ein erfindungsgemäßer Einsatz mit den Maßen 13,85 mm x 16,25 mm x 15,85 mm (Innendurchmesser x Höhe x Außendurchmesser) wurde mit einem Stanzling aus Film 1 bestückt und ein weiterer erfindungsgemäßer Einsatz wurde mit einem Stanzling aus Film 2 bestückt, indem die Stanzlinge auf der Membran des jeweiligen Einsatzes platziert wurden. Die Näpfe von zwei 12-Well Deep-Well-Platten mit den Maßen 12,5 x 3,5 x 8,5 (Länge x Höhe x Tiefe in cm) wurden mit jeweils 4 mL Akzeptormedium (Phosphatpuffer mit pH 7,4) befüllt, wobei sich in jeder der 12 Näpfe ein Rührfisch befand. Anschließend wurden die mit dem Stanzling bestückten Einsätze in einen ersten Napf der zwei 12-Well-Deep Well-Platten platziert und es wurden 250 µl Akzeptormedium zu jedem Stanzling in den Einsatz gegeben.
Die zwei 12-Well Deep-Well Platten wurde auf einen Magnetrührer in einen Wärmeschrank gestellt und bei 37°C inkubiert. Nach 5 Minuten, 10 Minuten und 20 Minuten wurden die Einsätze aus dem ersten Napf herausgenommen und in einen zweiten bzw. weiteren Napf platziert.
Zur Bestimmung der Wirkstoffmenge im Akzeptormedium wurden die entnommenen Proben über einen Spritzenvorsatzfilter mit 0,45 µm Porengröße (PVDF-Membran) filtriert, in HPLC Vials umgefüllt und mittels HPLC der Gehalt an „Substanz A“ bestimmt.
Die kumuliert permeierte Menge dieses Wirkstoffs im Akzeptormedium ist in 1 dargestellt.
Beispiel 2
In Beispiel 2 wurden analog zu Beispiel 1 Stanzlinge aus den Filmen 1 und 2 hergestellt und analog mit der Apparatur USP2 gemessen.
Die kumuliert permeierte Menge des Wirkstoffs im Akzeptormedium ist in 2 dargestellt.
Ein Vergleich der 1 und 2 zeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens die Bestimmung der Wirkstoffmenge im Akzeptormedium zu unterschiedlichen Zeitpunkten möglich ist. 2 hingegen ist zu entnehmen, dass sich bei dem Verfahren aus dem Stand der Technik der Stanzling bereits nach 1 Minute aufgelöst hat. Das bedeutet, der Stanzling hat sich aufgelöst bevor eine erste Probeentnahme durchgeführt werden konnte.
Beispiel 3
Beispiel 3 wurde analog zu Beispiel 1 durchgeführt. Der einzige Unterschied liegt darin, dass bereits nach 30 Sekunden, 1 Minute, 2 Minuten, 3 Minuten, 4 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten die Einsätze aus den Näpfen herausgenommen und in jeweils einen neuen Napf platziert wurden.
Die kumuliert permeierte Menge des Wirkstoffs im Akzeptormedium ist in 3 dargestellt.
3 zeigt, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine sehr frühe erste Probenentnahme möglich ist (hier nach 30 Sekunden) und die Probeentnahmen in einem kurzen zeitlichen Abstand durchgeführt werden können.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen umfassend (i) Bereitstellen eines Einsatzes umfassend einen polygonalen, ovalen oder kreisförmigen Hohlzylinder mit einer inneren Mantelfläche (a) und einer äußeren Mantelfläche (b), einer Bodenfläche (c) und einer Öffnung (d), wobei die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) parallel zueinander angeordnet sind, wobei die Öffnung (d) das erste Ende des Hohlzylinders bildet, und die Bodenfläche (c) des Hohlzylinders von einer Membran gebildet wird und das zweite Ende des Hohlzylinders bildet, wobei die Membran eine kunststoffbasierte Membran ist, und wobei die äußere Mantelfläche (b) ein Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter aufweist, und wobei das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter mindestens einen flanschartigen Vorsprung auf der äußeren Mantelfläche (b) darstellt; (ii) Bestücken des Einsatzes mit einem inhaltsstoffhaltigen Medium; (iii) Platzieren des Einsatzes in einen Behälter, der ein Akzeptormedium erhält, wobei die Membran des Einsatzes mit dem Akzeptormedium in Kontakt steht; (iv) Inkubation; (v) Bestimmung der Inhaltsstoffmenge in dem Akzeptormedium.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Bodenfläche (c) und der Durchmesser der Öffnung (d) unabhängig voneinander 6,3 bis 32 mm, bevorzugt von 9,5 bis 19 mm, besonders bevorzugt von 12,0 bis 13,7 mm beträgt, wobei die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) bevorzugt einen nahezu identischen Durchmesser besitzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen innerer Mantelfläche (a) und äußerer Mantelfläche (b) 0,1 bis 5 mm, bevorzugt von 0,5 bis 2,5 mm, besonders bevorzugt von 1 bis 2 mm beträgt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran Poren aufweist, wobei die Poren einen Durchmesser von 0,4 bis 8,0 µm, bevorzugt 0,6 bis 3,0 µm, besonders bevorzugt 0,8 bis 1,2 µm besitzen.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran mittels Versiegeln an der Innenseite (a) befestigt ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Inkubation einmalig eine Flüssigkeit zu dem inhaltsstoffhaltigen Medium gegeben wird, welche zum Auflösen des inhaltsstoffhaltigen Mediums befähigt ist und welche die Abgabe des Inhaltsstoffs an das Akzeptormedium gewährleistet, vorzugsweise unmittelbar vor oder nach dem Platzieren des Einsatzes in den Behälter, der das Akzeptormedium enthält.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestücken des Einsatzes mit einem inhaltsstoffhaltigen Medium gemäß (ii) das Abdecken des inhaltsstoffhaltigen Mediums mit einem inerten Gewebe umfasst.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das inhaltsstoffhaltige Medium ein wirkstoffhaltiges Medium ist, bevorzugt ein wirkstoffhaltiger Film ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter eine Multititerplatte ist, die vorzugsweise mit 6, 12, 24 oder 48 Näpfen ausgestattet ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter ein Mittel zum gleichmäßigen Durchmischen des Akzeptormediums umfasst.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einer konstanten Temperatur von 30 bis 42°C, bevorzugt von 33 bis 40°C, besonders bevorzugt von 36 bis 38°C und ganz besonders bevorzugt bei 37°C stattfindet.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 weiter umfassend, (vi) Entnahme des Einsatzes aus dem ersten Napf des Behälters und Platzieren des Einsatzes in einem zweiten (bzw. weiteren) Napf des Behälters; (vii) Inkubation; (viii) Bestimmung der Inhaltsstoffmenge im Akzeptormedium.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (vi) bis (viii) mehrfach durchgeführt werden.
Verwendung einer Vorrichtung umfassend a) einen Einsatz umfassend einen polygonalen, ovalen oder kreisförmigen Hohlzylinder mit einer inneren Mantelfläche (a) und einer äußeren Mantelfläche (b), einer Bodenfläche (c) und einer Öffnung (d), wobei die Bodenfläche (c) und die Öffnung (d) parallel zueinander angeordnet sind, wobei die Öffnung (d) das erste Ende des Hohlzylinders bildet, und die Bodenfläche (c) des Hohlzylinders von einer Membran gebildet wird und das zweite Ende des Hohlzylinders bildet, wobei die Membran eine kunststoffbasierte Membran ist, und wobei die äußere Mantelfläche (b) ein Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter aufweist, und wobei das Mittel zur Aufnahme des Einsatzes in einen Behälter mindestens einen flanschartigen Vorsprung auf der äußeren Mantelfläche (b) darstellt; und b) einen Behälter, der ein Akzeptormedium erhält; in einem Verfahren zur Bestimmung der in vitro freigesetzten Menge von Inhaltsstoffen.