DE102019120435A1

DE102019120435A1 - Abbaubare antimikrobielle Polymere

Info

Publication number: DE102019120435A1
Application number: DE102019120435.6A
Authority: DE
Inventors: Jörg Christian Tiller; Sylvia Trump; Christian Krumm
Original assignee: Technische Universitaet Dortmund
Current assignee: Technische Universitaet Dortmund
Priority date: 2018-07-30
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2020-01-30

Abstract

Die Erfindung betrifft Synthese und Charakterisierung von spaltbaren und antimikrobiell wirksamen Polyionen auf Basis von zwei Aminoalkoholen und Säurechloriden. Alle Polymere konnten zu hundert Prozent mittels einer NaOH-Lösung chemisch verseift werden. Zudem war es möglich eine fünf- bis zwanzigprozentige Hydrolyse an y,x,y-Polyester insbesondere am 3,6,3-Polyester durchzuführen. Neben der chemischen Hydrolyse erfolgte eine enzymatische Hydrolyse des 3,6,3-Polyesters mittels Lipase B Candida antarctica. Es wurden für alle y,x,y-Polyester Tests auf die minimale inhibierende Konzentration (MIC) durchgeführt. Es fiel auf, dass eine Verlängerung im Säurechlorid einen Unterschied in den MIC-Werten ergab. Je hydrophober das Polymer desto besser wurden die MIC Werte gegen beide Keime.

Description

Die Erfindung betrifft antimikrobiell wirkende Polymere der allgemeinen Formel (1), ein Verfahren zu deren Herstellung sowie die Verwendung der antimikrobiell oder biozid wirkenden Polymere als Zusatz in Farben und Wandaufbauten und/oder als Bestandteil von bioziden Beschichtungen für Oberflächen
Antimikrobielle Polymere können in die drei Kategorien eingeteilt werden, polymerisierte Biozide, biozide Polymere und biozid-freisetzende Polymere. Bei den polymerisierten Bioziden sind die Polymere aus niedermolekularen Bioziden aufgebaut und wirken nach dem gleichen Mechanismus wie niedermolekulare Analoga. Biozide Polymere weisen als Ganzes eine antimikrobielle Wirkung auf, wohingegen biozid-freisetzende Polymere Träger für Biozide darstellen und nicht direkt antimikrobiell wirksam sind Anders als Antibiotika, welche entweder die Proteinbiosynthese der Mikroorganismen unterbinden, Transportproteine der Zellmembranen blockieren oder die DNA Replikation verhindern, führen biozide Polymere zu einer Destabilisierung der Zellmembran und dadurch zu einem Absterben der Bakterien Aus diesem Grund ist es möglich, resistente Bakterien wie MRSA ohne Unterschied zum beispielsweise nicht resistenten Staphylococcus aureus (S. aureus) abzutöten.
Die antimikrobielle Aktivität von Polymeren wird durch die Bestimmung des MIC-Wertes (Minimal Inhibitory Concentration) beschrieben. Die MIC gibt dabei diejenige Biozid-Konzentra tion an, bei der 99% der Bakterien im Wachstum gehemmt werden.
Abgesehen von der Aktivität ist die Selektivität der Polymere in ihren antimikrobiellen Wirkungen von weiterem Interesse, wobei sich die Selektivität auf die Unterscheidung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen bezieht. Bakterien und Archaeen sind Prokaryoten, besitzen also keinen Zellkern, wohingegen Lebewesen, deren Zellen einen Zellkern besitzen, Eukaryoten genannt werden. Um zu bestimmen, ob ein Stoff hämolytisch aktiv ist, wird ein HC₅₀ Test durchgeführt, welcher Aufschluss darüber gibt, bei welcher Wirkstoffkonzentration 50 % der eukaryotischen Zellen lysiert worden sind. Hohe HCsoWerte beschreiben dabei hämolytisch nicht aktive Stoffe. Die Selektivität (HC₅₀/MIC) eines Polymers ist dann definiert als Verhältnis des HC₅₀ und des MIC-Wertes.
Es ist festzustellen, dass nicht nur die antimikrobielle Aktivität und die Hämokompatibilität eines Polymers von Interesse sind, sondern auch deren biokompatibler Abbau durch beispielsweise eine Hydrolyse. Eine Anwendung für solche Polymere wäre als Zusatz von Farben oder als Bestandteil von Beschichtungen als Teil von Oberflächenstrukturen denkbar, um bakterielles oder biogenes Wachstum auf Oberflächen zu hemmen. Der biozide Wirkstoff sollte dabei in Abhängigkeit von dem pH-Wert auf die Oberfläche eines beschichteten Untergrunds gelangen können und nach der Entfaltung seiner bioziden Wirkung keine Aktivität mehr besitzen, da beispielsweise sonst Bakterien in Klärwerken, welche im Belebungsbecken die Abwasserinhaltstoffe abbauen, ebenfalls abgetötet würden.
Aus dem Stand der Technik sind bislang nur wenige ionische Polymere bekannt, bei denen jedoch keine kombinierte antimikrobielle/biokompatiblen Wirkung dargestellt wird.
So wird in der JP53131985 A ein kationisches Polymer zur Behandlung von Abwasser beschrieben.
Ferner ist in der JP552098800 A ein kationisches Polymer offenbart, das über eine Menshutkin Reaktion erhalten wird.
Aufgabe der Erfindung ist die Synthese und Charakterisierung von antimikrobiellen Polyionenen, welche sich in einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung in optimaler Weise vollständig hydrolysieren lassen und dadurch ihre biozide Aktivität verlieren und sich umweltneutral verhalten.
Die Aufgabe wird mit Hilfe der Merkmale der unabhängigen Ansprüche 1 und 6 gelöst.
Die synthetisierten Polymere haben die allgemeine Struktur der Formel (1)
wobei P das Polymer bezeichnet
mit n=2 bis ∞
und Y=2 oder 3
und X=2 bis 8
Insbesondere wurden Polymere gefunden, die eine Struktur nach den Formeln (2) bis (7) aufweisen.
wobei P das Polymer bezeichnet
mit n=2 bis ∞
wobei P das Polymer bezeichnet
mit n=2 bis ∞
wobei P das Polymer bezeichnet
mit n=2 bis ∞
wobei P das Polymer bezeichnet
mit n=2 bis ∞
wobei P das Polymer bezeichnet
mit n=2 bis ∞
wobei P das Polymer bezeichnet
mit n=2 bis ∞
Bei der Polymernomenklatur gilt vorliegend zu beachten, dass nicht die Kohlenstoffstoffatome, sondern die Methylengruppen (-CH₂-) gezählt werden. Das bedeutet, dass sich die Namen wie folgt darstellen P_2,4,2 mit den Carbonylkohlenstoffatomen entspricht einem Polymer mit P_2,2,2, wobei nur die Methylengruppen gezählt werden. Analog ergibt sich dazu: P_3,4,3 zu P_3,2,3, P_2,6,2 zu P_2,4,2, P_3,6,3 zu P_3,4,3, P_2,10,2 zu P_2,8,2 und P_3,10,3 zu P_3,8,3.

Die verwendeten Polymere sind in Tabelle 1 dargestellt. Die folgende Tabelle 1 gibt einen Überblick über die Ergebnisse der Wiederholungseinheiten, der molaren Massen und des Polydispersitätsindexes der gesamten y,x,y-Polyester.

Polyester	DP_NMR	M_n,NMR [g/mol]	M_w,DLS [g/mol)	PDI_NMR
2,4,2	21.5	7 285	13 700	1.956
3,4,3	12.75	4 920	11 800	1.927
2,6,2	12	4 320	4 120	1.923
3,6,3	12	5 030	3 860	1.923
2,10,2	11.5	5 195	4 230	1.920
3,10.3	12,25	5 870	3 120	1.925

In Tabelle 1 fällt auf, dass fast alle Polymere über Wiederholungseinheiten von 11.5 bis 12.75 aufweisen. Einzige Ausnahme bildet der 2,4,2-Polyester mit seinen 21.5 Wiederholungseinheiten. Dies könnte daran liegen, dass er bei der Synthese reaktiver ist als die anderen Polymere, da er sowohl im Aminoalkohol als auch im Säurechlorid die kürzeste Kettenlänge besitzt:

Alle Polymere können zu 100 Prozent chemisch verseift werden, wobei die Stoffmengenkonzentration der Natriumhydroxid-Lösung an die Wiederholungseinheiten n des jeweiligen Polymers angepasst wurde.

Neben einer vollständigen Verseifung oder der hundertprozentigen Hydrolyse ist es von Interesse die Hydrolyse eines Polymers gezielt einzustellen. Dadurch kann zum Beispiel herausgefunden werden, wie viel Prozent hydrolysiert werden muss, um die antimikrobielle Aktivität eines Polymers zu deaktivieren.
Hierzu wurde in Abhängigkeit von 12 Wiederholungseinheiten des 3,4,3-Polyesters eine gewisse Zugabe an Natriumhydroxid-Lösung gewählt, um eine fünfprozentige, zehnprozentige und zwanzigprozentige Hydrolyse zu erreichen. Die Umsetzung der Reaktion dauert wenige Sekunden, die durch ein Senken des pH-Wertes von 12 auf 7 bestätigt wird. Tabelle 2 fasst die Ergebnisse der eingestellten Hydrolyse zusammen.

Angesetzte Hydrolyse [%] Erreichte Hydrolyse [%] Abweichung [%]

5 5.6 12

10 10.1 1

20 20.1 0.5
Es ist zu erkennen, dass es möglich ist, eine Hydrolyse des Polymers gezielt einzustellen. Dabei ist es umso schwieriger eine gezielte Hydrolyse von wenigen Prozent einzustellen, da die Abweichung hier am größten ist.
Zur enzymatischen Hydrolyse des 3,6,3-Polyesters werden 20 mg von diesem mit einem Milligramm Lipase B aus Candida antarctica in einem Milliliter Sörensen-Puffer mit einem pH von 7.0 umgesetzt. Diese Lösung wird anschließend drei bis 24 Stunden bei 37°C und 700 rpm im Thermomixer umgesetzt. Durch das Enzym soll die Hydrolyse katalysiert werden.
Es zeigte sich, dass es möglich ist mit dem Enzym Lipase B aus Candida antarctica den 3,6,3-Polyester zu hydrolysieren. Die Hydrolyse wird gemäß Formel (2) der gezielten Hydrolyse des 3,6,3-Polyesters berechnet, wobei die Wiederholungseinheiten des Polymers sich aus dem 1H-NMR-Spektrum zu 13 ergeben. Somit lässt sich eine enzymatische Hydrolyse von 5.8 Prozent innerhalb von drei Stunden feststellen. Folgende Tabelle 6 gibt die ermittelten Hydrolysen wieder. Tabelle 3: Hydrolyse des 3,6,3-Polyesters mit dem Enzym Lipase B aus Candida antarctica bei verschiedenen Zeiten

Stunden [h] Hydrolyse [%]

3 5.8

7 10.5

18 12.5

23 14.8
Aus den Werten bei 18 Stunden und 23 Stunden lässt sich feststellen, dass innerhalb von fünf Stunden circa 2.3 % hydrolysiert werden. Dies stimmt mit dem Ergebnis bei drei Stunden über ein, da hier somit 5,6% hydrolysiert sein sollten und 5.8% hydrolysiert worden sind. Eine Ausnahme ist jedoch bei sieben Stunden zu erkennen, da hier anstatt 10.5 % nur 8.1 % hydrolysiert werden sollten, was eine Abweichung von circa 30 % darstellt.
Zum Vergleich wird die Hydrolyse des Polymers ohne das Enzym in dem Sörensen - Puffer bei pH=7 bestimmt. Hier liegt die Hydrolyse nach einem Tag bei circa 5.5 Prozent und nach vier Tagen bei 12.8 Prozent. So kann insgesamt durch die Zugabe des Enzyms LipaseBaus Candida antarctica die Hydrolyse um das Vierfache beschleunigt werden. Daher ist für eine Hydrolyse mit circa 14 % keine vier Tage mehr nötig, sondern es reichen 23 Stunden.
Es werden jeweils 9-20 mg der y,x,y-Polyester im Nährmedium gelöst und 10 bis 13 Verdünnungsstufen hergestellt. Alle Polymere werden gegen den grampositiven Keim Staphylococcus aureus und den gramnegativen Keim Escherichia coli getestet, wobei die Polymere mit 10⁵ Zellen Bakterien beimpft werden. Durch die Bestimmung der minimalen inhibierenden Konzentration soll herausgefunden werden, ob es einen Einfluss gibt bei der Wahl der Kettenlänge im Säurechlorid und im Aminoalkohol bei der Herstellung der Ester und der daraus hergestellten Polyester.
Einen Einfluss der Verlängerung der Kettenlänge im Säurechlorid bei einer Verlängerung von 2 Methylengruppen ist nicht zu erkennen. Anders sieht es bei der Verlängerung um weitere vier Methylengruppen im Säurechlorid aus. Hier wird ein MIC-Wert sowohl bei dem 2,10,2- als auch dem 3,10,3-Polyester von circa 5 µg/ml erzielt.
Somit liegen die MIC-Werte vom 2,10,2- und 3,10,3-Polyester gegen S. aureus nach Fortuniak im exzellenten Bereich. Die Verlängerung des Aminoalkohols um eine Methylengruppe zeigt keinen gravierenden Unterschied bei allen Polyestern.
Die MIC-Ergebnisse gegen den gramnegativen Keim E. coli zeigen genauso wie gegen S. aureus keinen großen Unterschied bei der Verlängerung des Aminoalkohols um eine Methylengruppe. Jedoch ist eine Differenz bei der Verlängerung des Säurechlorids zu erkennen. Schon eine Verlängerung um zwei Methylengruppen im Säurechlorid beim 2,4,2-Polyester zum 2,6,2- Polyester zeigt einen besseren MIC-Wert und eine Verdünnungsstufe von circa 80 µg/ml auf 40 µg/ml. Eine weitere Verlängerung von vier Methylengruppen zeigt den gleichen Effekt der Verbesserung des MIC-Wertes. Somit kann mit dem 2,10,2- und 3,10,3-Polyester ein sehr guter MIC-Wert von circa 20 µg/ml erreicht werden.
Insgesamt ist zu erkennen, dass bei beiden Keimen keine Verbesserung der MIC-Werte durch eine Verlängerung des Aminoalkohols erzielt wurde. Jedoch kann durch eine Verlängerung des Säurechlorids eine Verbesserung des MIC-Wertes, vom kürzesten bis zum längsten Polyester, bis zu achtfach von 40 µg/ml auf 5 µg/ml gegen S. aureus und bis zu vierfach von 80 µg/ml auf 20 µg/ml gegen E. coli erreicht werden. Somit ist ein hydrophoberes Polymer aktiver gegen beide Keime. Jedoch ist auch zu erkennen, dass die Polymere aktiver gegen den grampositiven Keim als gegen den gramnegativen Keim sind, welches auch schon Strassburg et al. beschrieb [30]

Die Tabelle 4 gibt einen Überblick über die MIC-Werte und dessen Standardabweichungen von S. aureus und E. coli der y,x,y-Polyester in µg/ml.

	S. aureus		E. coli
Polyester	MIC Mittelwert [µg/ml]	MIC Standardabweichung [µg/ml]	MIC Mittelwert [µg/ml]	MIC Standardabweichung [µg/ml]
2,4,2	42	3.5	84	3.4
3,4,3	45	9.3	73	6.3
2,6,2	40	0.9	39	0.2
3,6,3	44	3.6	40	2.0
2,10,2	5	1.9	22	4.0
- 3,10,3	5	03	24	4.5

Folgend werden die MIC Ergebnisse von µg/ml auf µmol/ml umgerechnet. Damit kann direkt angegeben werden, wie viele Polymermoleküle nötig sind um 10⁵ Zellen Bakterien zu hemmen. So ist ein Polymer mit einem höheren MIC-Wert in µg/ml genauso aktiv, wenn dieses eine höhere molare Masse besitzt, als ein Polymer mit einem niedrigeren MIC-Wert in µg/ml, wenn dieses eine niedrigere molare Masse besitzt.

Auch von den hydrolysierten Polyestern wird die minimale inhibierende Konzentration gegen S. aureus und E. coli bestimmt, siehe Tabelle 5. Hierbei werden 20 mg im Nährmedium gelöst und bis zu fünf Verdünnungsstufen hergestellt. Es soll damit gezeigt werden, dass die Polymere mit ihrer MIC geschaltet werden können und die Hydrolyseprodukte keine antimikrobielle Aktivität mehr aufzeigen. Tabelle 5: MIC-Werte in µg/ml der hundertprozentigen Hydrolyse der y,x,y-Polyester

MIC [µg/ml]
(Hundertprozentig hydrolysierte Polyester)
	2,4,2	3,4,3	2,6,2	3,6,3	2,10,2	3,10,3
S. aureus	> 5 000	> 5 000	> 5 000	> 5 000	> 5 000	> 5 000
E. coli	> 5 000	> 5 000	> 5 000	> 5 000	> 5 000	> 5 000

Es fällt auf, dass sowohl die MIC-Werte aller Polyester gegen S. aureus als auch gegen E. coli über 5 000 µg/ml liegen. Somit kann mit einer hundertprozentigen Hydrolyse die antimikrobielle Aktivität vollständig deaktiviert werden. Dies kann auch über die MIC-Werte der dritten Hydrolyseprodukte bestätigt werden, da auch diese über 5 000 µg/ml gegen beide Keime liegen.
Die folgende Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse der eingestellten Hydrolyse des 3,6,3-Polyesters gegen S. aureus.

Erreichte Hydrolyse [%] MIC [µg/ml]

5.6 1 56

10.1 312.5

20.1 5000
Durch eine circa fünfprozentige Hydrolyse kann beim 3,6,3-Polyester die antimikrobielle Aktivität schon um zwei Stufen verringert werden. Die Verdopplung der Hydrolyse lässt sich die antimikrobielle Aktivität auf 312.5 µg/ml senken. Durch eine zwanzigprozentige Hydrolyse kann sogar die antimikrobielle Aktivität auf 5000 µg/ml deaktiviert werden. Somit muss dieses Polymer nicht zu 100 Prozent hydrolysiert werden, um die antimikrobielle Aktivität zu deaktivieren, sondern es reicht eine circa zwanzigprozentige Hydrolyse.
Die folgende Tabelle 7 zeigt die MIC-Wert Ergebnisse der Hydrolyse mit dem Enzym Lipase B aus Candida antarctica des 3,6,3-Polyesters gegen S. aureus.

Stunden Hydrolyse [%] MIC [µg/ml]

3 5.8 78

7 10.5 78

18 12.5 312.5

23 14.8 312.5
Diese Ergebnisse zeigen Gemeinsamkeiten mit der gezielten Hydrolyse auf. So zeigt die MIC bei 18 Stunden den gleichen MIC-Wert auf, wie bei der gezielten Hydrolyse. Auch hier ist zu erkennen, dass eine Hydrolyse von weniger als fünfzehn Prozent den MIC-Wert um vier Verdünnungsstufen von 44 µg/ml auf 312.5 µg/ml sinken lässt, wozu weniger als ein Tag notwendig ist. Es fällt jedoch auf, dass keine Deaktivierung des Polymers innerhalb von 24 Stunden erreicht wurde. Aus diesem Grund wurde die MIC von dem Polymer nach 24 Stunden erneut bestimmt, mit dem Unterschied, dass 2 mg Enzym hinzugegeben wurden. Dadurch konnte eine MIC größer 5000 µg/ml erzielt werden. Somit kann durch die Verdopplung der Enzymmasse die Hydrolyse auf über 20 % erhöht werden, wodurch das Polymer deaktiviert wird. Folglich kann über die eingesetzte Masse des Enzyms auch die Hydrolyse beschleunigt werden.
Aufgrund des Senkens des pH-Wertes von zwölf auf sieben bei der hundertprozentigen Hydrolyse und der Erkenntnis, dass die Polymere nicht hundertprozentig hydrolysiert werden müssen um die antimikrobielle Aktivität zu deaktivieren, wird folgend die Hydrolyse und die daraus entstandene antimikrobielle Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert und der Zeit bestimmt. Dabei wird die pH-Wert Studie an drei Polymeren ausgehend von der Hydrophilie dieser ermittelt.

Folgende Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse der pH-Wert Studie an dem hydrophilen 2,4,2-Polyester, der einen MIC-Wert von 42 µg/ml gegen S. aureus besitzt. Hierbei werden 20 mg des Polymers in einem Milliliter eines Puffers gelöst und die antimikrobielle Aktivität bei verschiedenen Zeiten gegen S. aureus bestimmt. Die Ergebnisse der MIC-Werte liegen dabei bei dem angegebenen Werten bei einer Abweichung einer Verdünnungsstufe. Die Hydrolyse der Polymere wird über die ¹H-Kemspinresonanzspektroskopie ermittelt, wobei die neu erzeugten Signale zur Berechnung verwendet werden. Tabelle 8: MIC-Werte [µg/ml} und Hydrolyse [%} des 2,4,2-Polyesters gegen S. aureus

	0 Tage	1 Tag		4 Tage		8 Tage
	MTC [µg/ml]	MIC [µg/ml]	Hydrol. [%]	MIC [µg/ml]	Hydrol. [%]	MIC [µg/ml]	Hydrol [%]
pH=5	39	78	3.35	156	5.36	156	8.29
pH=6	39	78	6.59	312.5	12.33	312.5	16.96
pH=7	39	1 250	23.99	> 5 000	42.20	-	-
pH=8	39	> 5 000	33.56	-	-	-	-
pH=9	156	1 250	21.47	-	-	-	-
pH=10	- 1250	> 5 000	44.51	-	-	-	-
pH=11	5 000	> 5 000	100	-	-	-	-

Hierbei wird deutlich, dass der 2,4,2-Polyester im sauren pH-Bereich von fünf und sechs über acht Tage relativ stabil bleibt, da sich der MIC-Wert nur um zwei Verdünnungsstufen verschlechtert. Der Grund ist, dass durch eine saure Hydrolyse ein protoniertes Sauerstoffatom des Carbonyl-Kohlenstoffes entstünde, welches ein nicht bevorzugtes dikationisches Zwischenprodukt bildet.
Schon bei den MIC-Wert Ergebnissen, welche sofort getestet werden, ist eine starke pH-Abhängigkeit zu beobachten. Bei den pH-Werten von fünf bis acht bleibt der MIC-Wert in einer kurzen Zeit stabil. Bei pH=9 verschlechtert sich der MIC-Wert um zwei Verdünnungsstufen und bei pH=11 ist die antimikrobielle Aktivität deaktiviert.
Nach vierundzwanzig Stunden ist schon bei pH=7 eine fortgeschrittene Hydrolyse zu erkennen. Es verschlechtert sich der MIC-Wert um fünf Verdünnungsstufen von 39 µg/ml auf 1250 µ/ml bei einer Hydrolyse von circa 24 Prozent. Nach vier Tagen kann die antimikrobielle Aktivität des 2,4,2-Polyesters bei einem neutralen pH von sieben und einer Hydrolyse von 42 Prozent vollständig deaktiviert werden. Dies ist sogar bei höheren pH-Werten nach einem Tag möglich. Einzige Auffälligkeit ist bei pH=9 zu sehen, da dieser nach einem Tag erst bei einem MIC-Wert von 1250 µg/ml liegt, obwohl bei pH=8 die antimikrobielle Aktivität deaktiviert wurde. Ein Grund könnte sein, dass bei pH=5 bis pH=8 ein Sörensen-Puffer und bei pH=9 ein Borax-Puffer mit Salzsäure verwendet wurde.
Zudem ist durch die pH-Wert Studie zu erkennen, dass es reicht den 2,4,2-Polyester zu circa 33 Prozent zu hydrolysieren, um die antimikrobielle Aktivität zu deaktivieren. Schon bei circa drei Prozent der Hydrolyse verschlechtert sich der MIC-Wert um eine Verdünnungsstufe und selbst unter neutralen Bedingungen ist eine Deaktivierung in vier Tagen möglich. Aufgrund dessen ist es sinnvoll die Polymere unter Feuchtigkeitsausschluss aufzubewahren, da ansonsten die Ergebnisse der Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität schwanken können, weil eine Hydrolyse schon stattgefunden hat.
Zusätzlich zu der Abhängigkeit des MIC-Wertes von der Zeit und des Puffers ist eine Abhängigkeit des MIC-Wertes von der Hydrolyse zu erkennen. Die nachfolgende Tabelle 9 gibt einen Überblick der erzielten MIC-Werte und der zugehörigen Hydrolyse. Dadurch kann grob abgeschätzt werden wie viel Polymer hydrolysiert werden muss, um einen bestimmten MIC-Wert zu erhalten. Dieses kann dann durch eine geeignete Wahl des Puffers, wie lange das Polymer aktiv bleiben soll, erfolgen.

Hydrolyse [%]

3.35-6.6 5.36-8.3 12.3-17.0 21.5 > 33

MIC [µg/ml] 78 156 312,5 1250 > 5 000

Die folgende Tabelle 10 zeigt die Ergebnisse der pH-Wert Studie an dem hydrophoberen 3,6,3- Polyester, der einen MIC-Wert von 44 µg/ml gegen S. aureus besitzt. Auch hier ist zu erkennen, dass das Polymer im sauren Bereich über acht Tage relativ stabil bleibt und die antimikrobielle Aktivität sich um zwei Verdünnungsstufen verschlechtert.

	0 Tage	1 Tag		4 Tage		8 Tage
	MIC [µg/ml]	MIC [µg/ml]	Hydrol. [%]	MIC [µg/ml]	Hydrol. [%]	MIC [µg/ml]	Hydrol. [%]
pH=5	78	78	2.0	156	2.96	312.5	4.96
pH=6	78	156	2.31	156	327	312.5	4,17
pH=7	78	312.5	5.46	2 500	12.83	> 5 000	19.0
pH=8	78	625	11.03	5 000	23.23	>5 000	29.31
pH=9	39	2 500	21.84	2500	78.67	-	-
pH=10	78	> 5 000	54.93	> 5 000	57.83	-	-
pH=11	156	> 5 000	91.44	-	-	-	-

Es fällt auf, dass im Vergleich zum hydrophilen 2,4,2-Polyester die antimikrobielle Aktivität bei pH=7 nach einem Tag erst bei 312,5 µg/ml ist. Die Hydrolyse liegt bei etwa 5.5 Prozent, welche fast zwanzig Prozent weniger ist. Dies bedeutet, dass es schwieriger ist den hydrophoberen 3,6,3- Polyester zu hydrolysieren als ein hydrophileres Polymer. Nach vier Tagen ist bei pH=7 erst ein MIC-Wert von 2500 µg/ml und nach acht Tagen ist das Polymer deaktiviert.
Bei höheren pH-Werten zeigt das Polymer nahezu das gleiche Verhalten wie beim 2,4,2-Polyester. Bei pH=10 fällt auf, dass nach einem Tag eine Hydrolyse von circa 55 Prozent erfolgt ist und nach vier Tagen eine Hydrolyse von 57 Prozent. Dies könnte daran liegen, dass die Kapazität des Puffers nicht ausreichend ist und der pH-Wert der Lösung abgesenkt wird, wodurch die Hydrolyse abgeschwächt wird. Zusätzlich ist ersichtlich, dass lediglich 23 Prozent nötig sind, um einen MIC-Wert von 5000 µg/ml zu erreichen. Dieses Ergebnis stimmt mit dem der gezielten Hydrolyse des 3,6,3- Polyesters mit einer Hydrolyse von 20.1 % überein.
In der folgenden Tabelle 11 ist eine Zusammenfassung der Ergebnisse wie viel Hydrolyse für einen bestimmten MIC-Wert notwendig ist. Dabei wurden Unstimmigkeiten bei der Hydrolyse und dem erzielten MIC-Wert außer Acht gelassen, zum Beispiel die Hydrolyse des Polymers bei einem Tag in einem pH=9 Puffer.

Hydrolyse [%]

0-2.0 2.3-3.3 4.1-5.5 11 12.8 > 19

MIC [µg/ml] 78 156 312.5 625 2 500 5000
Bei dem Vergleich mit dem 2,4,2-Polyester ist zu erkennen, dass dieses Polymer stabiler ist, da es länger dauert, um hydrolysiert zu werden, jedoch ist auch weniger Hydrolyse in Prozent nötig, um dieses zu deaktivieren.

Die folgende Tabelle 12 zeigt die Ergebnisse von dem hydrophoben 3,10,3-Polyester. Die Auswertung im sauren Bereich bleibt analog zu den beiden Polymeren zuvor, wobei die MIC-Werte [µg/ml] und Hydrolyse [%} des 3,10,3-Polyesters gegen S. aureus angegeben sind.

	0 Tage	1 Tag		4 Tage		8 Tage
	MIC [µg/ml]	MIC [µg/ml]	Hydrol. [%]	MIC [µg/ml]	Hydrol. [%]	MIC [µg/ml]	Hydrol. [%]
pH=5	10	20	1.77	39	1.89	78	4.80
pH=6	10	20	2.36	78	3.95	78	3.13
pH=7	20	39	3.56	156	7.79	156	18-61
pH=8	20	78	8.10	156	18.06	312.5	24.24
pH=9	20	156	22.65	2500	72.74	-	-
pH=10	20	2 500	53.63	2 500	60. 16	-	-
pH=11	156	> 5 000	85.34	-	-	-	-

In einem neutralen Bereich bei pH=7 ist es innerhalb von acht Tagen nicht möglich die antimikrobielle Aktivität zu deaktivieren. Trotz einer Hydrolyse von knapp 19 Prozent, bei der die anderen Polymere fast deaktiviert wurden, sinkt der MIC-Wert lediglich um drei Verdünnungsstufen von 20 g/ml auf 156 µg/ml.
Auch hier ist analog zum 3,6,3-Polyester bei pH=10 zu erkennen, dass die Pufferkapazität nicht ausreichend ist, da nach einem Tag eine Hydrolyse von circa 54 Prozent und nach vier Tagen von 60 Prozent stattgefunden hat.
Zusätzlich ist zu sehen, dass als einziges mit dem pH-Wert von elf nach einem Tag die antimikrobielle Aktivität deaktiviert werden kann, wozu eine Hydrolyse von knapp 85 Prozent benötigt wird. So führt eine Verlängerung von vier Methylengruppen im Säurechlorid zu einem stabileren Polymer, wodurch die Hydrolyse erschwert wird. Somit muss im Vergleich zum 3,6,3-Polyester fast eine dreifache Hydrolyse durchgeführt werden um einen MIC-Wert von größer 5000 µg/ml zu erreichen.
Die folgende Tabelle 13 fasst die Ergebnisse der Hydrolyse und der MIC-Werte zusammen, wobei die Abhängigkeit des MIC-Wertes von der Hydrolyse des 3,10,3-Polyesters dargestellt ist.

Hydrolyse [%]

1.8-2.4 3.6-4 4,8-8.1 7.8-22.6 24.2 53.6-72.7 85.3

MIC [µg/ml] 20 39 78 156 312.5 2500 > 5 000
Durch die pH-Wert Abhängigkeit kann gezeigt wird, dass ein Polymer stärker hydrolysiert werden muss, wenn es hydrophober ist, um den MIC-Wert zu senken.
Aufgrund der schnellen Hydrolyse durch erhöhte pH-Werte bei den Polymeren, wäre dies eine geeignete Eigenschaft, bei der die Polymere eine kurze Zeit antimikrobiell wirksam sein sollen und danach ihre Wirksamkeit verlieren. Zunächst werden die Monomere für die Polymersynthese hergestellt.
Da die einzelnen Bis[2-(dimethylamino)alkyl]ester mit dem schematischen Aufbau die gleichen Syntheserouten mit unterschiedlichen Edukten aufzeigen und die Auswertung der Polymere analog mittels ¹H-NMR-Spektroskopie stattfindet, wird im Folgenden beispielhaft für alle Ester die Synthese des 3,6,3-Ester erläutert.
Zur Synthese des 3,6,3-Esters werden 1 mol Adipoyldichlorid und 2.2 mol 3-(Dimethyl-amino)-1-propanol unter Zugabe von 2.1 mol Triethylamin in Diethylether bei einer Temperatur von 0°C umgesetzt. Bei dieser Kondensationsreaktion fängt das Triethylamin das entstandene HCI auf, wobei Triethylammoniumchlorid entsteht, welches in Diethylether als Salz ausfällt.
Nach der Reaktion wird der Diethylether entfernt, die Estherphase in Toluol aufgenommen und erst mit einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung und dann mit einer gesättigten Natriumcarbonat-Lösung extrahiert, um noch vorhandene Edukte zu entfernen. Danach wird das Toluol durch Feintrocknung entfernt.
Die einzelnen y,x,y-Polyester (P_y,x,y) werden durch die gleichen Syntheserouten aus den entsprechenden zugehörigen y,x,y-Estern hergestellt und mittels ¹H-Kernspinresonanzspektroskopie ausgewertet. Folgend wird beispielhaft die Darstellung am 3,6,3-Polyester erläutert.
Der 3,6,3-Polyester wird mit dem 3,6,3-Ester und äquimolarer Zugabe von trans 1,4-Dibromo-2-Buten (DBB) bei einer Temperatur von 0 °C und unter Argonatmosphäre in Aceton synthetisiert. Der 3,6,3-Polyester wird nach der Reaktion filtriert und mit Aceton gespült, um noch vorhandene Monomere zu entfernen.
Eine Anwendung für solche Polymere ist als antimikrobieller oder biozider Zusatz in Farben und Wandaufbauten wie beispielsweise Putz, Fassaden-Systemen, Beschichtungen für Markisen oder Lamellenstrukturen wie Jalousien möglich.
Der Begriff antimikrobieller oder biozider Zusatz wurde gewählt, da sich der Befall von außen liegenden Oberflächen mit organischen Organismen aus heutiger Sicht eher als ein Konglomerat aus Algen, Pilzen und Bakterien darstellt und der sich als Biofilm beschreiben ließe. Diese Biofilme stellen Biotope dar, die sich zum Teil erheblich unterscheiden. Was sich im Befall der Untergründe zeigt. Algen sind eher auf organischen gebundenen Putzen und Farben zu finden und Pilze bei anorganischen Fassaden-Systemen. Um das Problem der Algenbildung zu lösen, wurden nach dem Stand der Technik den Fassadenfarben starke Biozide zur Filmkonservierung zugegeben. Die Wirkung war meist nicht von langer Dauer, da die Biozide ausgewaschen, nicht abgebaut werden und so in der Umwelt verbleiben. Dies führt oft zur Ausbildung resistenter Keime, die ein großes Problem in der Medizin darstellen. Der Umstand das der Wasserhaushalt auf einer Fassadenoberfläche eine wesentliche Rolle bei der Ansiedlung von Algen spielt, führte zur Entwicklung von Fassadenfarben und Putzen die entweder starke hydrophobe oder hydrophile Eigenschaften haben. Beide Eigenschaften haben das Ziel, die Feuchtigkeit an der Oberfläche länger fernzuhalten. Wobei hydrophobe Eigenschaften bei Regen und hydrophile Eigenschaften bei hoher Luftfeuchtigkeit eine höhere Wirksamkeit haben. In der praktischen Anwendung hat sich gezeigt, dass die einseitige Ausrichtung der hygrischen Eigenschaft der Beschichtungen nicht ausreicht, um außen liegende Oberflächen physikalisch vor mikrobiellem Befall zu schützen.
Einige Mikroorganismen bilden Biofilme, die klebrige Oberflächen haben. So können Aerosole auf der Oberfläche anhaften und bilden ein Nährboden für Algen, Pilze und Bakterien. Um dieses zu vermeiden ist die Anwendung von Bioziden notwendig. Hier ist das Problem bei der Anwendung von Bioziden. Auf der einen Seite müssen sie wasserlöslich sein, um zu wirken und auf der anderen Seite werden diese nach kurzer Zeit wieder ausgewaschen. Um diesen Vorgang weitgehend zu vermeiden, werden die erfindungsgemäßen Polymer Biozide in einer Grundbeschichtung verankert, um das auswaschen der Biozide zu verhindern. Diese Grundbeschichtung wirkt nun wie ein Depot, das nur bei Bedarf die bioziden Wirkstoffe frei gibt. So kann beispielsweise der Einsatz von Bioziden unter Berücksichtigung der zeitlichen Haltbarkeit von Fassaden so gering wie möglich gehalten werden.
So ist vorgesehen die erfindungsgemäßen Polymere als Bestandteil einer Schutzbeschichtung für Fassaden und Außenbauteilen auf Basis einer wässrigen Acrylat Dispersion als Bindemitteleinzusetzen. Der Beschichtung sind Additive zugesetzt die in Abhängigkeit von Feuchte und Temperatur die Struktur des Beschichtungsfilmes (Kapillarbildung) verändert. Daraus ergibt sich eine variable Diffusionsfähigkeit und ein variablen Wasseraufnahme-Koeffizient in Abhängigkeit von Untergrund- und Umgebungsfeuchtigkeit, sowie von Temperaturunterschieden. Diese technische Eigenschaft, die eine Membrancharakter ähnliche Wirkung aufweist, unterstützt beispielsweise Wandputz bei der Rücktrocknung von mineralischen monolithischen Wandaufbauten. Dabei wird auch das Verhältnis der zeitlichen Haltbarkeit einer Beschichtung gegenüber deren bioziden Eigenschaften verbessert. So lässt bei den meisten Fassadenbeschichtungen nach dem Stand der Technik die biozide Eigenschaft schneller nach wie die technische Haltbarkeit der Farbe. Dies führt zu Sanierungsintervallen an Faßaden die farblich noch nicht notwendig wären, aber durchgeführt werden, um die biozide Eigenschaft der Fassadenfarbe wieder zu gewährleisten. Dies führt in der Summe zu einer Umweltentlastung, da die spezielle Verwendung der erfindungsgemäßen Polymere die nicht nur den reduzierten Einsatz von Bioziden und die Verwendung neuartiger Biozide ermöglicht, sondern auch eine verbesserte CO² Bilanz nach sich zieht, da beispielsweise Fassadenbeschichtungen länger haltbar bleiben.

Um zu gewährleisten, dass die y,x,y-Polyester selektiv gegen Bakterien wirken, werden von allen die Hämokompatibilität bestimmt. Hierzu werden 80 mg der Polymere in 1.6 ml CPD-Puffer gelöst und acht Verdünnungsstufen durchgeführt. Nach Beimpfen mit 0.2 ml Erythrozyten-Konzentrat und einer Stunde Inkubation bei 37°C mit anschließender Zentrifugation, wird die Lyse am Überstand bestimmt. Die folgende Tabelle zeigt die Lyse, den HC₅₀ Wert und die Selektivität gegen S. aureus und E. coli der y,x,y-Polyester an. Die Lyse gibt dabei den maximalen, innerhalb der acht Verdünnungsstufen, gemessen Wert an. Tabelle 15: Zusammenfassung der max. Lyse [%], HC₅₀ [µg/ml] und Selektivitäten gegen S. aureus und E. coli der y,x,y Polyester

Polyester	max. Lyse [%]	HC₅₀ [µg/ml]	S_S.aureus	S_E.coli
2,4,2	5.6	> 40 000	> 950	> 450
3,4,3	1.6	> 40 000	> 850	> 550
2,6,2	2.9	> 40 000	> 1 000	> 1 000
3,6,3	4.0	> 40 000	> 900	> 1 000
2,10,2	5.2	> 40 000	> 8 000	> 1 800
3,10,3	11.0	> 40 000	> 8 000	> 1600

Es ist zu erkennen, dass die maximalen Lysen, bis auf den 3,10,3-Polyester, unter sechs Prozent liegen. Da die Erythrozyten von den Polymeren nicht annähernd zu 50 Prozent lysiert wurden, besitzen alle y,x,y-Polyester einen HC₅₀-Wert von > 40000 µg/ml. Die Selektivitäten [HC₅₀/MIC] können somit für die besten 2,10, 2- und 3,10,3-Polyester zu > 8000 für S. aureus und > 1800/ > 1600 für E. coli bestimmt werden.
Auch von den hundertprozentig hydrolysierten Polymeren und den dritten Hydrolyseprodukten wurden HC₅₀-Tests durchgeführt. Hiermit sollte sichergestellt werden, dass die niedermolekularen Produkte der Hydrolyse keine Lyse auslösen. Die Lyse wird erneut aus den maximalen, innerhalb der acht Verdünnungsstufen, gemessenen Wert berechnet. Zusammenfassend wurde eine maximale Lyse aller Proben zu 8.9 Prozent berechnet, wodurch alle einen HC₅₀-Wert größer 40000 besitzen.
Ausführungsbeispiele
Aufreinigung von trans 1,4-Dibromo-2-Buten
Es werden 100 ml n-Hexan am Rotationsverdampfer abrotiert. In einem Glaskolben werden 60 ml des n-Hexans vorgelegt und es wird eine gesättigte Lösung mit trans-1,4- Dibromo-2-Buten hergestellt. Anschließend werden 10-20 ml n-Hexan hinzugegeben. Die Lösung wird in einen Rundkolben filtriert und zum Kristallisieren in den Gefrierschrank gestellt. Nach der Kristallisation wird das n-Hexan dekantiert und die Kristalle werden erneut mit abrotiertem n-Hexan gelöst. Die Lösung wird zur Kristallisation erneut in den Gefrierschrank gestellt. Das n-Hexan wird anschließend dekantiert und die Kristalle werden zum Trocknen an das Feinvakuum gehangen.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) = 5.98 (q, 2·1H, Br-CH₂-CH-CH-CH₂-Br), 3.95 (d, 2·2H, Br-CH₂-CH-CH-CH₂-Br)
Synthesen der Ester

Alle Ester-Synthesen erfolgen analog der folgenden Beschreibung mit den Edukten und Einwaagen aus Tabelle 16. In einem 250 ml Rundkolben werden 100 ml Diethylether (Et₂0) vorgelegt. Anschließend werden 7.5 ml Triethylamin (TEA) und 6 ml Dimethylaminoethanol (DMAE) hinzugegeben. Dieser Rundkolben wird in Eiswasser gestellt und unter Argonatmosphäre gesetzt. Anschließend wird ein Tropftrichter auf den Rundkolben gesetzt, wobei alle Schliffe gefettet sein sollten, um ein Feuchtigkeitsausschluss zu gewährleisten. In einem Rollrandglas werden 21 ml Et₂0 vorgelegt und es wird unter Argonatmosphäre 4 ml Adipoyldichlorid hinzugefügt. Die resultierende 25 ml Adipoyldichlorid-Et₂O-Lösung wird innerhalb einer halben Stunde unter Rühren mittels des Tropftrichters in den 250 ml Rundkolben der ersten Lösung hinzugetropft. Dabei ist zu achten, dass sich keine feste Schicht bildet, auf die getropft werden kann. Die trüb gewordene Lösung rührt 18 Stunden, wobei das Eiswasser schmilzt. Danach wird die Suspension filtriert. Aus der gewonnenen Lösung wird der Diethylether mittels Rotationsverdampfung entfernt und die Lösung wird anschließend in circa 70 ml abrotiertem Toluol aufgenommen. Die Lösung wird einmal mit 100 ml gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 100 ml gesättigter Natriumcarbonatlösung und noch einmal mit 100 ml gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat oder Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Toluol wird am Rotationsverdampfer entfernt. Anschließend wird das Produkt am Feinvakuum 12 Stunden getrocknet, um das restliche Toluol zu entfernen. Nachfolgend sind die Angaben der Tabelle 16 aufgeführt.

Ester	Aminoalkohol	Säurechlorid	TEA [ml]	Ausbeute [%]
2,4,2	5.68 ml DMAE + 95 ml Et₂O	2.84 ml Succinyldichlorid + 15 ml Et₂O	7.16	33.5
3,4,3	5.04 ml DMAP + 77 ml Et₂O	2.13 ml Succinyldichlorid + 11 ml Et₂O	5.37	38.4
2,6,2	6 ml DMAE + 100 ml Et₂O	4 ml Adipoyldichlorid + 21 ml Et₂O	7.5	53.7
3,6,3	7.1 ml DMAP + 100 ml Et₂O	4 ml Adipoyldichlorid + 21 ml Et₂O	7.5	50.2
2,10,2	4.6 ml DMAE + 77.5 ml Et₂O	4.45 ml Sebacinsäuredichlorid + 22.5 ml Et₂O	5.8	75.3
3,10,3	5.45 ml DMAP + 83.75 ml Et₂O	4.45 ml Sebacinsäuredichlorid + 23.38 ml Et₂O	5.8	56.1

Exemplarisch für alle x,y,x-Ester am Beispiel des 3,6,3-Esters
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ (ppm) = 4.11 (t, 2·2H, N(CH₃)₂-CH₂-CH₂-CH₂-0-CO-CH₂-CH₂-), 2.31 (bt, 4·2H, N(CH₃)₂-CH₂-CH₂-CH₂-0-CO-CH₂-CH₂-), 2.21 (bs, 2·6H, N(CH₃)₂-CH₂-CH₂-CH₂-0-CO-CH₂-CH₂-), 1.78 (m, 2·2H, N(CH₃)₂-CH₂-CH2-CH₂-0-CO-CH₂-CH₂-),1.65 (m, 2·2H, N(CH₃)₂-CH₂-CH₂-CH₂-0-CO-CH₂-CH₂-)
Polymersynthese

Alle Polymersynthesen erfolgen analog zu der folgenden Beschreibung mit den Einwaagen und Edukten aus Tabelle 17. Es werden in einem 50 ml Rundkolben 0.5 g trans-1,4-Dibromo-2-Buten (DBB) in 15 ml abrotierten Aceton gelöst. Der Kolben wird unter Argon mit einem Septum verschlossen und in Eiswasser gestellt. Wenn die Lösung 0°C erreicht hat, wird unter starkem Rühren 0.6741 g des 2,6,2-Esters hinzugegeben. Die Reaktionslösung rührt eine Stunde im Eiswasser und anschließend 18 Stunden bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre mittels eines Argonballons. Im Anschluss wird die Suspension filtriert und fünf Mal mit 20 ml Aceton gewaschen. Falls das Polymer klebrig ist, wurde dieses nach Spülen mit Aceton im Kolben sofort in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Ansonsten wird das Polymer zusammen mit dem Filter in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und für zwei Stunden am Feinvakuum getrocknet. Anschließend wird das Polymer aus dem Filter in das Zentrifugenröhrchen gegeben, wobei darauf geachtet werden muss, dass dieses nicht mit dem Filter verklebt. Klebriges Polymer am Filter wird verworfen. Das Polymer wird erneut für zwei Stunden an das Feinvakuum gehangen. Danach wird das Zentrifugenröhrchen in Stickstoff eingefroren, währenddessen mit einem Spatel das Polymer klein gestoßen beziehungsweise gemahlen wird. Nach erneuter zweistündiger Trocknung am Feinvakuum wird das Polymer unter Feuchtigkeitsausschluss in einem Kühlschrank gelagert. Tabelle 17: Synthesevorschriften der x,y,x-Polyester

Polyester	Ester	DBB	Ausbeute [%]
2,4,2	0.6085 g 2,4,2-Ester	0.5 g	88.9
3,4,3	0.6741 g 3,4,3-Eser	0.5 g	85.2
2,6,2	0.6741 g 2,6,2-Ester	0.5 g	89.7
3,6,3	0.7397 g 3,6,3-Ester	0.5 g	88.0
2,10,2	0.8053 g 2,10,2-Ester	0.5 g	87.0
3,10,3	0.8709 g 3,10,3-Ester	0.5 g	86.7

Exemplarisch für alle y,x,y-Polyester am Beispiel des 3,6,3-Polyesters
¹H-NMR (400 MHz, D₂O): δ (ppm) = 6.42 (bm, 2n·1H, -CH₂-(N⁺(CH₃)₂)-CH₂-CH-CH-CH2(N(CH3)2))-CH2-), 6.35 (q, 2·1H, Br-CH₂-CH-CH-CH_z-(N⁺(CH₃)₂))-), 6.01 (q, 2·1 H, Br-CH₂CH-CH-CH_z-(N⁺(CH₃)₂))-), 4.20 (bt, 2·2H + 2n·2H, -(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-CH₂-CH₂-0-CO-CH₂CH₂-), 4.14 (bm, 2n ·2H, -CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-CH-CH-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-), 3.40-3.48 (bm, 2·2H + 2n·2H, -(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-CH₂-CH₂-O-CO-CH₂-CH₂-), 3.08-3.13 (s, 4·3H + 4n·3H, -(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-CH₂-CH₂-O-CO-CH₂-CH₂-), 2.44 (bt, 2·2H + 2n-2H, -(N⁺(CH₃)₂))CH₂-CH₂-CH₂-O-CO-CH₂-CH₂-), 2.21 (2·2H + 2n·2H, -(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-CH₂-CH₂-O-COCH₂-CH₂-), 1.63 (2·2H + 2n·2H, -(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-CH₂-CH₂-O-CO-CH₂-CH₂-)
Bestimmung der minimalen inhibierenden Konzentration (Minimal Inhibitory Concentration, MIC)
Die antimikrobielle Aktivität von Polymeren wird durch die Bestimmung des MIC-Wertes (Minimal Inhibitory Concentration) beschrieben. Die MIC gibt dabei diejenige Konzentration an Biozid an, bei der 99 % der Bakterien im Wachstum gehemmt werden. Dabei liegt der MICWert immer zwischen den Werten der angegeben und der nächstniedrigeren Verdünnungsstufe. Für erste Verdünnungsstufe: 20 mg Polymer in 4 ml Nährmedium lösen, Zugabe des Bakteriums, Verdünnungsreihe erstellen für alle Proben bis auf Negativprobe und mit 20 ml Bakteriensuspension animpfen, 24 h Inkubation bei 37°C. Die letzte klare Probe liefert die Minimal Inhibitory Concentration (MIC)
Die MIC-Tests werden mit einer Standard-I-Nährlösung durchgeführt. Hierfür werden in einem Liter bi-destilliertem Wasser 25 g Standard-I-Nährboullion gelöst und im Autoklav bei 120°C für 20 Minuten autoklaviert. Anschließend wird der pH-Wert gemäß Tabelle 19 mit steril-filtrierter ein molarer Natriumhydroxid-Lösung eingestellt. Tabelle 18: Verwendete Bakterien mit ihren Kultivierungsbedingungen

Batterienstamm Kultivierungsbedingungen Gram-Färbung

Escherichia coli 37 °C; pH = 6.8 Standard-Nährmedium Negativ

Staphylococcus aureus 37 °C; pH = 7.3 Standard-Nährmedium Positiv
Die Bakterienstammkulturen der einzelnen Bakterien werden unter sterilen Bedingungen mit 25 ml der Nährlösung in einem 500 ml Erlenmeyerkolben und 50 µl der Gefrierkultur der Bakterien hergestellt. Diese müssen bei 37°C und 100 rpm für 18 Stunden inkubieren.
Für die MIC-Tests werden in sterilen Zentrifugenröhrchen (15 ml) 10-13 Verdünnungsstufen durchgeführt. In dem ersten Zentrifugenröhrchen werden 10-20 mg Polymer abgewogen. Hierbei wird die Einwaage genommen, welche zuerst hineingefüllt wurde, da die Polymere sehr leicht verkleben. Zwischen jeder Einwaage wird der Spatel gewaschen und mit Papier getrocknet. Das Polymer wird in 4 ml Nährmedium gelöst. In den restlichen Verdünnungsstufen werden jeweils 2 ml Nährmedium gefüllt. Außerdem werden jeweils 2 ml in zwei zusätzliche Zentrifugenröhrchen gegeben, die die Positiv- und die Negativprobe darstellen. Es werden nun 2 ml, angefangen vom ersten Röhrchen, in das Nächste gegeben, wobei sich die Konzentration der Probe halbiert.
Zum Animpfen der Proben wird die Bakterienanzahl in der Bakterienstammkultur durch das UV/Vis Spektrometer bestimmt. Hierzu wird die Bakterienstammlösung 1:10 mit Nährmedium verdünnt. Anschließend wird mit Gleichung (i) errechnet, wie viele µl der Bakterienstammlösung in (10 ml - V/_Bakterien) Nährmedium gegeben werden muss, um eine Bakterienanzahl von 10⁷ Zellen/ml zu erreichen. $V_{Bakterien} = \frac{Csoll \cdot Vsoll}{C i s t}$
Anschließend werden 20 µl aus diesem Ansatz in jede Verdünnungsstufe und in die Positiv-Probe injiziert, um die Verdünnungsstufen mit 10⁵ Zellen Bakterien zu beimpfen. Diese werden dann 24 Stunden bei 37°C und 150 rpm inkubiert. Nach 24 Stunden zeigt die letzte nicht bewachsene Verdünnungsstufe den MIC-Wert an.
Hierzu können gegebenenfalls die Proben mit einer Triphenyltetrazoliumchloridlösung (TTCLösung) angefärbt werden. In den Röhrchen, in denen Bakterien gewachsen sind, wird das farblose Triphenyltetrazoliumchlorid zum wasserunlöslichen roten Farbstoff 1,3,5-Triphenylformazan reduziert. Die restlichen Verdünnungsstufen ohne Bakterienwachstum bleiben unverändert. Dazu werden die Zentrifugenröhrchen mit 200 µl einer 10-³ molaren TTC-Lösung beimpft und für eine weitere Stunde in den Inkubator gestellt.
Bestimmung der Hämokompatibilität (HC₅₀) von Polymeren
Zur Bestimmung der Hämokompatibilität werden 10 ml frisches Schweineblut in einem Zentrifugenröhrchen bei 4000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert. Der Blutplasmaüberstand wird dekantiert und der Erythrozytenrückstand wird vorsichtig mit 10 ml isotonischer Natriumchloridlösung gewaschen. Dieser wird erneut bei 4000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert und anschließend wird der Überstand wieder dekantiert. Dieser Aufreinigungsschritt wird dreimal wiederholt bis der Überstand nur noch eine leichte rötliche Färbung aufweist. Darauffolgend wird der Erythrozytenrückstand auf 10 ml mit CPD-Puffer gefüllt (Erythrozytenlösung).
In einem 2 ml Eppendorf Tube werden 1,6 ml steriler CPD-Puffer und 80 mg des zu untersuchenden Polymers vorgelegt. In weiteren neun Eppendorf Tubes werden 0.8 ml steriler CPDPuffer gegeben. Es wird eine Verdünnungsreihe mit 8 Verdünnungsstufen durchgeführt, wobei sich die Konzentration der Probe halbiert. Anschließend werden in den acht Tubes mit jeweils 0.8 ml Probe und einer Positiv- und Negativprobe mit sterilem CPD-Puffer 0.2 ml Erythrozytenlösung hinzugegeben. Die Positivprobe wird zusätzlich mit 3 µl Triton X versetzt. Alle Proben werden eine Stunde bei 37°C inkubiert und darauffolgend bei 13500 rpm für fünf Minuten zentrifugiert.
Die Überstände werden am UV/Vis Sepktrometer bei 25°C und 541 nm vermessen. Dazu werden 0.025 ml des Überstands mit 0.975 ml CPD-Puffer verdünnt, um eine Extinktion kleiner als Eins zu erhalten. Die gemessene Extinktion ist proportional zum Hämolysegrad. Der HC₅₀-Wert ergibt sich nun aus der interpolierten Konzentration, bei der 50 % der Erythrozyten zerstört werden. Die Extinktion der Positivprobe liefert dabei die vollständige Hydrolyse, welche als Referenz verwendet wird.
Hydrolyse der Polymere
Für die alkalische Hydrolyse werden in einem 50 ml Rundkolben 200 mg Polymer vorgelegt und 10 ml einer gemäß der nachfolgenden Tabelle NaOH Lösung hinzugegeben. Die Stoffmengenkonzentration der NaOH-Lösung wurde über die Anzahl der Ester der y,x,y-Polyester ermittelt. Die Suspension rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur. Falls der pH-Wert im alkalischen Bereich liegt, wird das Gemisch gegebenenfalls mit einer 0.1 mol/l HCI-Lösung auf pH 7.0 eingestellt. Anschließend wird die wässrige Phase mittels Gefriertrocknung sublimiert. Tabelle 19: Hydrolysebedingungen der y,x,y-Polyester

Polymer 2,4,2 3,4,3 2,6,2 3,6,3 2,10,2 3,10,3

NaOH [mol/l] 0.2 0.135 0.08 0.074 0.08 0.06
Für die enzymatische Hydrolyse des 3,6,3-Polyesters werden 20 mg des Polymers in einem Sörensenpuffer mit pH 7.0 gelöst. Anschließend wird ein Milligramm Lipase B aus Cadida antarctica hinzugegeben. Diese Lösung wird anschließend drei oder sieben Stunden in einem Thermomixer (Comfort, Eppendorf) bei 37°C und 700 rpm inkubiert. Zur Bestimmung des MICWertes wird 1 ml in ein Zentrifugenröhrchen überführt, wobei 3 ml Nährmedium hinzugegeben wird. Zur Auswertung via ¹H-Kernspinresonanzspektroskopie wird die Probe lyophilisiert.
Exemplarisch für alle hundertprozentigen Hydrolysen am Beispiel des hydrolysierten 3,6,3-Polyesters
¹H-NMR (400 MHz, D20): δ (ppm) = 6.37 (bm, 2n · 1H, -CH₂-(N⁺(CH₃)₂)-CH₂-CH-CH-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-), 6.30 (q, 2·1H, Br-CH₂-CH-CH-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-), 4.10 (bm, 2n·2H, -CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-CH-CH-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-), 3.68 (t, 2n-2H, HO-CH₂-CH₂-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-), 3.41 (bt, 2n·2H, HO-CH₂-CH₂-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-), 3.10 (s, 4·3H + 4n·3H, BrCH₂-CH-CH-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))- + -CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-CH-CH-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-CH₂-), 2.16 (bt, 2(n+1)·2H, O^-CO-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO^-O· ), 2.02 (bt, 2n-2H, HO-CH₂-CH₂-CH₂-(N⁺(CH₃)₂))-), 1.52 (bm, 2(n+1)·2H, O^-CO-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO^-O^-)
Gezielte Hydrolyse des 3,6,3-Polyesters
Zur gezielten Hydrolyse des 3,6,3-Esters werden 20 mg des Polymers in einem Milliliter einer Natriumhydroxid-Lösung gemäß Tabelle 22 gelöst. Hierbei wird davon ausgegangen, dass das Polymer Wiederholungseinheiten aufweist und mit einer 0.074 mol/l NaOH-Lösung eine vollständige Hydrolyse erreicht wird. Die Reaktion dauert wenige Sekunden, was durch eine Senkung des pH-Wertes durch Lackmuspapier bestätigt werden kann. Anschließend wird zur Bestimmung des MIC-Wertes 1 ml in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 3 ml Nährmedium hinzugegeben. Zur Auswertung via ¹H-Kernspinresonanzspektroskopie wird die Probe lyophilisiert. Tabelle 20: Bedingungen der gezielten Hydrolyse

Angesetzte Hydrolyse [%] NaOH-Lösung [mol/l]

5 0.00375

10 0.0075

20 0.015
Herstellen von Puffern
Für die pH-Werte fünf bis acht wird ein Sörensen-Puffer hergestellt. Hierfür werden zwei Stammlösungen A und B hergestellt. Für die Stammlösung A werden 1.82 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) in 200 ml bi-destilliertem. Wasser gelöst und für die Stammlösung B werden 2.38 g Di natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na₂HPO₄·2H₂O) in 200 ml bi-destilliertem Wasser gelöst. Gemäß folgender Tabelle werden die Stammlösungen A und B gemischt und mit einem pH-Meter eingestellt, falls der pH-Wert abweicht. Tabelle 21: Herstellung des Sörensen-Puffers mit verschiedenen pH-Werten

pH Stammlösung A [ml] Stammlösung B [ml]

5 0.19 19.81

6 2.42 17.58

7 12.24 7.76

8 19.38 0.62
Für die pH-Werte neun und zehn wird ein Borax-Puffer hergestellt. Für pH=9 wird 0.477 g Di-Natriumtetraborat-Decahydrat (Na₂B₄O₇·10H₂0) in 4.6 ml HCI-Lösung (c=0,1 mol/l) gelöst und mit bi-destilliertem Wasser auf 100 ml aufgerollt. Für pH=10 wird 0.477 g Na2B4ÜT10H20 in 18.3 ml NaOH-Lösung (c=O.l mol/1) gelöst und auch auf 100 ml mit bi-destilliertem Wasser aufgefüllt.
Für den pH-Wert elf werden 0.785 g Glycin (C₂H₅NO₂), 0.611 g NaCl und 10 ml NaOH-Lösung (c=1 mol/l) gemischt und auf 100 ml mit bi-destilliertem Wasser aufgefüllt. Alle Puffer werden vor weiterer Verwendung mit einem 0.2 µm PP-Spritzenvorsatzfilter filtriert.
pH-Wert Studie
Es wird für pH=5 bis pH=8 ein Sörensen-Puffer, für pH=9 und pH=10 ein Borax-Puffer und für pH=11 ein Glycin-Puffer hergestellt. Die Sörensen-Puffer werden mit einem pH-Messgerät +/- 0.1 pH eingestellt, die anderen Puffer werden nur gemessen. In 2 ml Eppendorf-Tubes werden 20-30 mg Polymer eingewogen und es wird so viel Pufferlösung mit Eppendorf Pipetten hinzugegeben, dass eine Konzentration von 20 mg/ml Puffer entsteht. Falls nicht sofort die antimikrobielle Aktivität gemessen werden sollte, werden die Polymere in den Eppendorf-Tubes in den Thermomixer bei 37°C und 650 rpm gestellt. Nach Ablauf der Zeit wird für den MIC-Test aus den Eppendorf-Tubes 1 ml in ein Zentrifugenröhrchen überführt und es werden 3 ml Nährmedium hinzugegeben. Zur Messung via ¹H-Kemspinresonanzspektroskopie wird das Polymer in ein 5 ml Gläschen gegeben, falls notwendig mit 0.1 mol/l HCI-Lösung neutralisiert und die wässrige Phase mittels Gefriertrocknung sublimiert.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren nochmals eingehend erläutert:

Die 1 gibt die MIC-Werte in Abhängigkeit der Zeit wieder. Hierbei gibt die Legende an den Datenpunkten zuerst den MIC-Wert in [µg/ml] und dann die ermittelte Hydrolyse in Prozent an. Dabei ist zu erkennen, dass das Polymer als einziges im sauren Bereich seine antimikrobielle Aktivität innerhalb von acht Tagen nicht vollständig verliert. Falls eine Deaktivierung des Polymers gewollt ist, ist es möglich das Polymer vier Tage in pH = 7 oder einen Tag in pH = 8 oder pH = 10 zu behandeln. Somit kann die Wirkdauer des Polymers vom Hersteller nach Wünschen vorgegeben werden, wobei allgemein bei dem hydrophilen Polymer diese bei wenigen Stunden beziehungsweise Tagen liegt. Da sich das Polymer sehr schnell bei hohen pH-Werten hydrolysiert, würde hier eine pH-Wert Studie in einem Bereich von wenigen Stunden sinnvoll erscheinen.

2 gibt die MIC-Werte in Abhängigkeit der Zeit wieder. Hierbei gibt die Legende an den Datenpunkten zuerst den MIC-Wert in [µg/ml] und dann die ermittelte Hydrolyse in Prozent an. Hierdurch kann individuell angegeben werden, welcher pH-Wert für einen bestimmten MIC Wert verwendet werden kann. So wird ein MIC von 312.5 µg/ml erreicht, indem dass Polymer einen Tag mit einem pH= 7 Puffer oder acht Tage mit einem pH=5 beziehungsweise pH=6 Puffer umgesetzt wird. Genauso wird ein Puffer mit pH=9 einen Tag benötigt um die antimikrobielle Aktivität auf 5000 µg/ml zu senken, wobei dieses auch über vier Tage mit einem pH=8 Puffer geschieht. Infolgedessen kann je nach Anwendungsfall, ob dieses Polymer kürzer oder länger über Tage seine antimikrobielle Aktivität vorweisen soll, das Polymer mit verschiedenen Puffern behandelt werden, wobei dieses im Vergleich zum 2,4,2-Polyeser stabiler ist bei pH=7 und pH=8. Es fällt jedoch in 2 auf, dass die Kurven bei pH=7 und pH=5 über die Tage einen asymptotischen Verlauf annehmen. Es kann zum einen sein, dass die Pufferkapazität der Puffer nicht für vier beziehungsweise acht Tage ausreicht, wodurch der pH-Wert in den sauren Bereich abgesenkt wird. Andererseits könnte der MIC-Wert von > 5000 µg/ml schon eher als die vier oder acht Tage erreicht sein. Daher wäre es sinnvoll, kleinere Intervalle an Tagen, an den die Ergebnisse gemessen werden, zu nehmen.
3 zeigt die Ergebnisse der MIC-Werte in Abhängigkeit der Zeit, des Puffers und der Hydrolyse. Hierbei wird deutlich, dass innerhalb von null bis fünf Prozent der Hydrolyse die MIC-Werte von 10 µg/ml auf 78 µg/ml fallen, welches drei Verdünnungsstufen darstellt. Ab einer Hydrolyse von circa acht Prozent und einem MIC-Wert von 156 µg/ml ist es schwieriger das Polymer zu hydrolysieren. Obwohl das Polymer weitere 14 Prozent hydrolysiert wird, bleibt der MIC-Wert bei 156 µg/ml. Durch eine Hydrolyse von knapp 25 Prozent kann dieses Polymer erst auf einen MIC-Wert von 312.5 µg/ml abgesenkt werden, bei der die anderen Polymere schon vollständig deaktiviert wurden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

JP 53131985 A [0007]
JP 552098800 A [0008]

Claims

Antimikrobiell wirkende Polymere der allgemeinen Formel (1)
wobei P das Polymer bezeichnet mit n=2 bis ∞ und Y=2 oder 3 und X=2 bis 8 ist.
Antimikrobiell wirkende Polymere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere die Struktur mit den Formeln
wobei P das Polymer bezeichnet mit n=2 bis ∞ oder
wobei P das Polymer bezeichnet mit n=2 bis ∞ oder
wobei P das Polymer bezeichnet mit n=2 bis ∞ oder
wobei P das Polymer bezeichnet mit n=2 bis ∞ oder
wobei P das Polymer bezeichnet mit n=2 bis ∞ oder
wobei P das Polymer bezeichnet mit n=2 bis ∞ aufweisen.
Antimikrobiell wirkende Polymere nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die antimikrobielle Wirkung mit wachsender Kettenlänge von Formel (1) bis Formel (7) zunimmt.
Antimikrobiell wirkende Polymere nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die antimikrobielle Wirkung der Polymere durch Hydrolyse deaktiviert wird.
Antimikrobielle wirkende Polymere nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrolytische Deaktivierung der Polymere mit zunehmenden pH-Wert steigt.
Verfahren zur Herstellung antimikrobieller Polymere der allgemeinen Formel (1), wobei die antimikrobielle Wirkung der Polymere bei nachfolgender Hydrolyse deaktiviert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere durch Umsetzung von Bis[2-(dimethylamino)alkyl]estern mit trans 1-4 Dibromo-2-Buten (DBB) erhalten werden.
Verfahren zur Herstellung antimikrobieller Polymere der allgemeinen Formel (1) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bis[2-(dimethylamino)alkyl]ester durch Reaktion von Dicarbonsäurechloriden mit (Dimethylamino)-1-alkylalkoholen erhalten werden.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad der Hydrolyse durch den Zusatz von NaOH oder Enzymen gesteuert wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass den Polymeren zur hydrolytischen Deaktivierung das Enzym Lipase B zugesetzt wird.
Verwendung von antimikrobiell wirkenden Polymeren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, als antimikrobieller oder biozider Zusatz in Farben und Wandaufbauten und/oder als Bestandteil von bioziden Beschichtungen von Oberflächen.