DE102018123090B3

DE102018123090B3 - Teststand für Kristallbenetzung

Info

Publication number: DE102018123090B3
Application number: DE102018123090.7A
Authority: DE
Inventors: Christian Feiler; Manfred Weiss; Dirk Wallacher
Original assignee: Helmholtz Zentrum Berlin fuer Materialien und Energie GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Berlin fuer Materialien und Energie GmbH
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2019-11-28
Anticipated expiration: 2038-09-21

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Teststand für Kristallbenetzung, welcher mindestens einen Rahmen zur Anbringung einer Folie und eine erste und zweite Seite aufweist und mit 1. Ständern auf der ersten Seite und 2. Ständern auf der zweiten Seite versehen ist sowie eine Folie mit Perforierung aufweist.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Teststand zur Kristallbenetzung, der in der Proteinkristallographie in Zusammenhang mit der Kristallzüchtung, -benetzung und Präparation für die Charakterisierung mittels Röntgenbeugung zum Einsatz gelangt.
Stand der Technik
Die Struktur vieler Proteine kann mittels der Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt werden. Im Gegensatz zu kleinen organischen oder anorganischen Molekülen wie Zucker oder Salzen, die meist einfacher auskristallisieren, bilden die oft sehr großen Protein-Moleküle nur unter ganz bestimmten Bedingungen Kristalle, die in langen Versuchsreihen ermittelt werden müssen.
In der Praxis sieht es so aus, dass in einem Screening, beispielsweise in einer sogenannten 96-Well Mikrotiterplatte, eine Reihe von Bedingungen getestet werden, wobei die Bedingungen in den einzelnen Kavitäten (Wells) leicht variiert werden. Bedingungen in denen Kristallisationskeime gebildet wurden, werden anschließend systematisch optimiert. Ein für die Röntgenstrukturanalyse brauchbarer Kristall sollte in mindestens zwei Raumdimensionen 0,1 bis 0,2 mm groß sein. Ein Beispiel für eine Mikrotiterplatte ist in der WO 2003/062508 A1 offenbart.
Neben der Züchtung von Proteineinkristallen ist auch deren Probenpräparation im Vergleich zu anorganischen Kristallen aufwändiger. Die meist sehr fragilen Proteinkristalle zerfallen leicht unter mechanischem Druck aber auch bei Änderung äußerer Parameter, wie z.B. pH-Wert, Temperatur, relativer, umgebender Feuchtigkeit. Zur Präparation werden die Kristalle manuell, also im Wesentlichen mechanisch oder durch spülen vereinzelt und, beispielsweise mit einer Schlaufe, einem sogenannten Loop, auf einem Probenhalter zur Montage auf einem Goniometerkopf präpariert. Die Entfernung der Mutterlösung von den Kristallen ist dabei wesentliche Voraussetzung für die Röntgendiffraktion, da diese dort einen störenden Untergrund erzeugt. Da die Aufnahme von Röntgendiffraktionsbildern am Einkristall üblicherweise bei Temperaturen um 100 Kelvin stattfindet, bedarf es eines weiteren Manipulationsschrittes. Der präparierte Proteinkristall muss vor der Montage auf das Goniometer und der Exposition mit Röntgenstrahlung bei 100 Kevin mit einem Frostschutzmittel behandelt werden. Hiernach kann auch der Bedarf der Entfernung überschüssigen Frostschutzmittels entstehen.
Die US 2016/0019994 A1 offenbart einen Probenhalter für die Untersuchung von Proben mit Röntgenstrahlung, der geeignet ist, auch Proben im flüssigen Zustand aufzunehmen. Der Probenhalter weist dabei als wesentliche Elemente ein Gitter auf, auf dem für Röntgenstrahlung transparente Fenster angeordnet sind, auf welchen die zu untersuchenden Proben aufgebracht werden. Der Probenhalter ist kompatibel für die Aufnahme in einer magnetischen Basis.
In der WO 2005/056813 A2 wird eine Vorrichtung zur Züchtung von Kristallen offenbart, die auf dem Prinzip der Mikrotiterplatten beruht. In diesen Mikrotiterplatten werden die einzelnen Kavitäten durch permeable Membrane getrennt, wobei die Kavitäten in unterschiedlicher Größe ausgebildet sein können, um die Kristallisation unter den Bedingungen der Mirkofluidik zu beeinflussen. Entsprechende Vorrichtung sind auch in der US 2017/0268966 A1 und der WO 2009/150549 A2 offenbart, wobei letztere auch der in situ Beobachtung der Proben (Kristalle) mit Röntgenstrahlung dient.
Eine weitere, an spezielle Bedingungen des Kristallwachstums -in Gel stabilisierte Lösungen- angepasste Vorrichtung, die im Wesentlichen einer Mirkotiterplatte entspricht, ist in der EP 1 666 646 A1 offenbart.
Eine Aufgabe ist es demnach, Kristalle bei der Probenpräparation nicht zu zerstören oder zu beschädigen damit Sie einer Röntgenstrukturanalyse zur Verfügung stehen. Diesem Problem zu begegnen sucht die WO 2007/089 658 A2 . Darin ist beschrieben einen flexiblen Probenträger in Form einer möglichst dünnen Folie bereitzustellen, auf dem die Kristalle bereits wachsen und somit nicht aus der Mutterlösung entnommen werden müssen. In der DE 10 2017 129 761 B3 wird ein Probenhalter für die Montage auf einem Goniometerkopf offenbart, der zugleich auch als Abdeckung von Wells in Mikrotiterplatten dient und an dem die Kristalle direkt auf einer Folie aufwachsen. Für die Entfernung von Mutterlösung oder anderen überschüssigen Lösungen, wie Frostschutzmittel, wird hier vorgeschlagen, diese Rückseitig durch eine vorgefertigte Perforierung in der Folie mittels Absaugung, z.B. durch Kapillarkraft, zu entfernen. Die Präparation ist dabei zu Ungunsten der Stabilität der Kristalle mitunter zeitlich verzögert, da die Lösungen sich nur schwerlich absaugen lassen.
Aufgabenstellung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es eine Vorrichtung anzugeben, mit der die Absaugung von Lösungen im Vorfeld einer Kristallzüchtung optimiert werden kann.
Die Aufgabe wird durch den Anspruch 1 gelöst. Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus einem Teststand für Kristallbenetzung, der mindestens einen Rahmen zur Anbringung einer Folie aufweist. Der Rahmen kann dabei von beliebiger Form sein. Für die Anbringung einer Folie ist der Rahmen in vorteilhafter Weise mit einem inneren Rand versehen, auf dem dieselbe befestigt werden kann. Der Rahmen weist ein erste Seite und eine zweite Seite in seiner lateralen Erstreckung auf. Auf der ersten Seite sind 1. Ständer zur waagerechten Aufstellung des Rahmens angebracht. Auf der zweiten Seite sind 2. Ständer zur waagerechten Aufstellung des Rahmens angebracht. Diese Anordnung bietet den Vorteil, dass eine auf dem Rahmen angebrachte Folie von beiden Seiten zur Bearbeitung zugänglich ist. Die Ständer können beliebig ausgefertigt sein. In einer Ausführungsform ist zur Stabilisierung des Teststandes in dem Rahmen mindestens eine Querstrebe angebracht. In einer weiteren Ausführungsform ist in dem Rahmen ein Gitter angebracht. Der Teststand ist aus der nicht abschließenden Gruppe von Materialien umfassend Plastik, Keramik, Metall und Mischungen aus denselben und in vorteilhafter Weise aus Plastik gefertigt. Die Größe wird dem individuellen Bedarf angepasst, wobei die Maße in vorteilhafter Weise in dem Bereich 1 cm bis 30 cm liegen. Die Ständer können passend zur Aufnahme in eine Halterung gefertigt sein.
Eine auf dem Teststand anzubringende Folie entspricht in idealer Weise der Art nach einer Folie, wie sie auch in einer Kristallzüchtung verwendet wird, für die eine Optimierung der Präparation bezüglich der Absaugung von Flüssigkeiten vorgesehen ist. Folien, die für die Kristallzüchtung zum Einsatz kommen, sind dabei in üblicher Weise biologisch inert, röntgentransparent, dünn und möglichst lichttransparent, wie es z.B. für Polyimide, wie das mit Markennamen bezeichnete Kapton® (Du Pont), oder aber Cycloolefin-Copolymere (COC) gegeben ist. Die Folie ist mit mindestens einer Perforierung versehen. Eine Perforierung besteht aus mindestens zwei Poren. Die Durchmesser der Poren liegen dabei in vorteilhafter Weise in einem Bereich zwischen 0,1 µm und 1 mm. Poren gleicher Durchmesser sind örtlich gruppiert, wobei die örtliche Erstreckung begrenzt ist und in vorteilhafter Weise Durchmesser im Bereich von 0,1 mm - 30 mm aufweist. Die Folie kann mit mehreren Perforierungen unterschiedlicher Porendurchmesser versehen sein. Dies ist insbesondere Vorteilhaft, da es ermöglicht unterschiedliche Perforierungen auf ihre Eignungen für in Frage stehende Flüssigkeiten mit einem Teststand zu überprüfen.
Flüssigkeiten die entweder als Mutterlösung oder Frostschutzmittel oder zur anderweitigen Benetzung der Kristalle für einen Einsatz vorgesehen sind, können auf einer der zwei Seiten der Folie über einer oder mehreren Perforierungen appliziert werden. Die Menge der applizierten Flüssigkeit sollte der Tropfenbildung genügen und kann experimentell bestimmt werden. Der Teststand wird nach der Applikation von Flüssigkeit umgedreht und von der nunmehr als rückseitig anzusprechenden Seite die Flüssigkeiten abgesaugt, in vorteilhafter Weise unter Nutzung der Kapillarkraft eines geeigneten Mediums, wie z.B. Stoff oder Papier. Eine vorteilhafte Porengröße, die an die Viskosität der Flüssigkeit angepasst ist, ist so zu ermitteln. Auch ist in vorteilhafter Weise die Zeit ermittelbar, die benötigt wird um das applizierte Volumen durch die entsprechende Perforation hindurch zu saugen. Anschließend kann in der Durchführung einer Kristallzucht und/oder Probenpräparation, die ermittelte ideale Porengröße für die Perforierung von Folien von Probenhaltern genutzt werden, als auch ermittelte Zeiten für die Präparation berücksichtigt werden und so die Präparationszeiten insgesamt optimiert werden.
Ausführungsbeispiel
Die Erfindung soll in einem Ausführungsbeispiel und anhand von zwei Figuren näher erläutert werden.
Die Figuren zeigen:

1: Schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Teststands für Kristallbenetzung in schräger Aufsicht.
2: Schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Teststands für Kristallbenetzung in Seitenansicht.

Die 1 zeigt schematisch die Darstellung eines erfindungsgemäßen Teststands für Kristallbenetzung in schräger Aufsicht. Der Rahmen R ist in dem Ausführungsbeispiel rund. Er ist mit drei 1. Ständern St1 auf der ersten Seite S1 versehen und mit drei 2. Ständern St2 auf der zweiten Seite (siehe 2). Im Ausführungsbeispiel sind die Ständer stabförmig ausgeführt. Die Folie F ist auf der ersten Seite S1 angebracht und mit einer Perforierung P1 einer ersten Porengröße und einer Perforierung P2 einer zweiten, zur ersten verschiedenen Porengröße versehen. Die Darstellung der Porengrößen ist nicht maßstabsgerecht und die Anzahl der Perforierungen nur beispielhaft, dies auch insbesondere in ihrer Verteilung, die idealer Weise homogen über die gesamte Fläche erfolgt. Der Rahmen R ist mit einem Gitter G zur Stabilisierung versehen. Das Gitter ermöglicht auch, eine optische Einteilung der Fläche der Folie in Bereiche mit verschiedenen Perforationen, so dass Verwechslungen und Kontaminationen minimiert werden.
Zur Veranschaulichung der Funktionsweise des Teststands ist ein auf die Folie F über einer Perforation P2 applizierter Tropfen T einer Flüssigkeit mit in die Darstellung aufgenommen.
Die 2 zeigt schematisch die Darstellung eines erfindungsgemäßen Teststands für Kristallbenetzung in Seitenansicht. Hier ist auch die zweite Seite S2 mit in der Darstellung enthalten.
Der Teststand für Kristallbenetzung ist in dem Ausführungsbeispiel aus Plastik und im Spritzgussverfahren gefertigt. Die Folie ist eine Kapton® (DuPont) Folie. Der Rahmen hat einen Durchmesser von 30 mm.

Claims

Teststand für Kristallbenetzung mindestens aufweisend einen Rahmen (R) zur Anbringung einer Folie (F), wobei der Rahmen (R) eine erste Seite (S1) und eine zweite Seite (S2) und, zur jeweils waagerechten Aufstellung des Rahmens, 1. Ständer (St1) auf der ersten Seite (S1) und 2. Ständer (St2) auf der zweiten Seite (S2) und die Folie (F), welche perforiert ist, aufweist.
Teststand für Kristallbenetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Rahmen (R) mindestens eine Querverstrebung angebracht ist.
Teststand für Kristallbenetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Rahmen (R) ein Gitter (G) angebracht ist.